CN116448896B - 五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法与结构鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，包括如下步骤：获取五灵脂标准汤剂的提取物；将提取物进行第一次反相层析、第二次反相层析、第三次反相层析、第一次凝胶层析、第四次反相层析与第五次反相层析；将Fr.A1‑3‑7进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；将Fr.A1‑3‑11进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2与化合物3；将Fr.A1‑4‑2进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5；将Fr.A1‑4‑4进行第二次凝胶层析，采用甲醇洗脱，制备化合物6；将Fr.A2‑3进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物7。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析及药物质量控制技术领域，特别是涉及一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法与结构鉴定方法。
背景技术
中药五灵脂(Faeces Trogopterori)为鼯鼠科动物复齿鼯鼠(Trogopterusxanthipes Milne-Edwards)的干燥粪便，具有止痛与活血化瘀等功效，常用于淤血所致的痛经与心绞痛等症。在临床上，五灵脂可应用于妇科、心脑血管科及消化系统疾病的治疗。近代药理学研究证明其具有抗血小板凝聚、促进纤维蛋白溶解、抗炎抗溃疡、抗毒性抑制真菌和结核杆菌、提高免疫力以及清除自由基抗氧化等多方面的作用。五灵脂主产于陕西、河南、河北、山西与湖北等地，野生收集不易，目前多为人工饲养采集，是较为常用的中药。
由于五灵脂为复齿鼯鼠的排泄物，五灵脂所含成分与复齿鼯鼠的生活习性和环境关系密切，随意性较大，可控性较差，因此该药材的化学成分和质量控制研究工作还远远落后于其它中药。目前对五灵脂的化学成分研究多集中在对五灵脂药材中黄酮、酚酸、三萜、酚酸及挥发油上，这些成分以脂溶性居多，分离与纯化较为容易，但是对五灵脂的水溶性较大的化学成分的研究则非常少。从中国药典到地方标准，对五灵脂的质量控制仍缺少专属性较强的含量测定指标，说明五灵脂化学成分的研究仍不完善，也尚未见到有关五灵脂木脂素类化学成分的分离、结构鉴定以及药理活性的研究报道。
此外，中药五灵脂的临床使用以汤剂为主，汤剂中的化学成分是五灵脂发挥临床药效的物质基础，因此，有必要对五灵脂汤剂中的化学成分展开系统的研究，丰富五灵脂的化学成分组成，寻找专属性较强的水溶性成分，解决五灵脂标准汤剂、五灵脂中药制剂质量控制的难题。
发明内容
基于此，本发明提供了一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，成功从五灵脂标准汤剂中分离纯化出7个化合物，化合物含量较高，均为从五灵脂中首次分离得到。
本发明通过如下技术方案实现。
一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，包括如下步骤：
获取五灵脂标准汤剂的提取物；
将所述提取物进行第一次反相层析，第一次分段收集流分，制备流分Fr.A、Fr.B与Fr.C；其中，第一次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从40％变化至100％；
将Fr.A进行第二次反相层析，第二次分段收集流分，制备子流分Fr.A1、Fr.A2、Fr.A3与Fr.A4；其中，第二次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从0％变化至50％；
将Fr.A1进行第三次反相层析，第三次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-1、Fr.A1-2、Fr.A1-3与Fr.A1-4；其中，第三次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与质量分数为0.1％的甲酸溶液，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3％变化至20％；
将Fr.A1-3进行第一次凝胶层析，第四次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-3-1、Fr.A1-3-2、Fr.A1-3-3、Fr.A1-3-4、Fr.A1-3-5、Fr.A1-3-6、Fr.A1-3-7、Fr.A1-3-8、Fr.A1-3-9、Fr.A1-3-10、Fr.A1-3-11、Fr.A1-3-12与Fr.A1-3-13；其中，第一次凝胶层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用等度洗脱，甲醇的体积百分数为65％～75％；
将Fr.A1-4进行第四次反相层析，第五次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-4-1、Fr.A1-4-2、Fr.A1-4-3、Fr.A1-4-4与Fr.A1-4-5；其中，第四次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与质量分数为0.08％～0.12％的甲酸溶液，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3％变化至50％；
将Fr.A2进行第五次反相层析，第六次分段收集流分，制备子流分Fr.A2-1、Fr.A2-2、Fr.A2-3、Fr.A2-4与Fr.A2-5；其中，第五次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与水，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从5％变化至70％；
将Fr.A1-3-7进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；
将Fr.A1-3-11进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2与化合物3；
将Fr.A1-4-2进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5；
将Fr.A1-4-4进行第二次凝胶层析，采用甲醇洗脱，制备化合物6；
将Fr.A2-3进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物7。
在其中一个实施例中，所述五灵脂标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：
将所述五灵脂标准汤剂的冻干粉，与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声，然后过滤，取滤液，浓缩。
在其中一个实施例中，第一次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(8～12):(88～92)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
在其中一个实施例中，第二次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(13～17):(83～87)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
在其中一个实施例中，第三次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(23～27):(73～77)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
在其中一个实施例中，第四次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(38～42):(58～62)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
在其中一个实施例中，第一次反相层析中，洗脱液为体积百分数为40％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A；和/或
洗脱液为体积百分数为70％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.B；和/或
洗脱液为体积百分数为95％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.C。
在其中一个实施例中，第二次反相层析中，洗脱液为水，收集流分，制备流分Fr.A1；和/或
洗脱液为体积百分数为10％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A2；和/或
洗脱液为体积百分数为30％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A3；和/或
洗脱液为体积百分数为50％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A4。
在其中一个实施例中，第三次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第一次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-1、Fr.A1-2、Fr.A1-3与Fr.A1-4；
其中，第一次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1％的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～28min，流动相A的体积百分数从5％变化至15％；28min～50min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；50min～58min，流动相A的体积百分数保持为20％；58min～63min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5mL/min～1.5mL/min；检测波长为260nm～280nm。
在其中一个实施例中，第四次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第二次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-3-1、Fr.A1-3-2、Fr.A1-3-3、Fr.A1-3-4、Fr.A1-3-5、Fr.A1-3-6、Fr.A1-3-7、Fr.A1-3-8、Fr.A1-3-9、Fr.A1-3-10、Fr.A1-3-11、Fr.A1-3-12与Fr.A1-3-13；
其中，第二次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1％的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～28min，流动相A的体积百分数从5％变化至15％；28min～50min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；50min～58min，流动相A的体积百分数保持为20％；58min～63min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5mL/min～1.5mL/min；检测波长为260nm～280nm。
在其中一个实施例中，第五次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第三次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-4-1、Fr.A1-4-2、Fr.A1-4-3、Fr.A1-4-4与Fr.A1-4-5；
其中，第三次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1％的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～28min，流动相A的体积百分数从5％变化至15％；28min～50min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；50min～58min，流动相A的体积百分数保持为20％；58min～63min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5mL/min～1.5mL/min；检测波长为260nm～280nm。
在其中一个实施例中，第六次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第四次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A2-1、Fr.A2-2、Fr.A2-3、Fr.A2-4与Fr.A2-5；
其中，第四次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1％的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～28min，流动相A的体积百分数从5％变化至15％；28min～50min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；50min～58min，流动相A的体积百分数保持为20％；58min～63min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5mL/min～1.5mL/min；检测波长为260nm～280nm。
本发明还提供一种五灵脂标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，包括如下步骤：
获取如上所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法所分离得到的化学成分；所述化学成分包括所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6与化合物7中的一种或多种；
将所述化学成分进行高效液相色谱与质谱联用测定；
其中，所述高效液相色谱的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为水；采用等度洗脱，乙腈的体积百分数为40％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.3mL/min～0.5mL/min；在200nm～400nm范围内进行全波扫描。
在其中一个实施例中，所述质谱的条件包括：采用电喷雾离子源；采用负离子模式扫描；毛细管电压为0.7kV～0.9kV；锥孔电压为12V～18V；脱溶剂气温为420℃～480℃；离子源温度为120℃～180℃；扫描范围为m/z100～m/z1250；采样频率为8Hz～12Hz。
在其中一个实施例中，所述化合物1为马尿酸；
所述化合物2为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸；
所述化合物3为间羟基苯甲酸；
所述化合物4为(+)-(1S,5R)-Verbenon-10-oic acid；
所述化合物5为4-hydroxymyrtenic acid；
所述化合物6为苯甲酸；
所述化合物7为3-(3-hydroxy-5-(1-hydroxy-3-(3-hydroxyphenyl)propan-2-yl)phenyl)propanoic acid。
与现有技术相比较，本发明所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法具有如下有益效果：
本发明反复运用反相层析、凝胶层析和半制备高效液相色谱分离技术，并限定每次反相层析与凝胶层析的洗脱条件，成功从五灵脂标准汤剂中分离纯化出7个水溶性较大的化合物，生物活性基本明确，含量较高，且均为从五灵脂中首次分离得到，为五灵脂标准汤剂化学成分的深入研究提供依据，进一步地，为五灵脂药材、饮片及其制剂质量标准的提高提供有益参考。
附图说明
图1为本发明提供的化合物1的ESI-MS图谱；
图2为本发明提供的化合物1在DMSO-d6(400MHz)条件下的1H NMR图谱；
图3为本发明提供的化合物1在DMSO-d6(100MHz)条件下的13C NMR图谱；
图4为本发明提供的化合物1在DMSO-d6(100MHz)条件下的13C NMR与DEPT-135图谱；
图5为本发明提供的化合物2的ESI-MS图谱；
图6为本发明提供的化合物2在MeOD(400MHz)条件下的1H NMR图谱；
图7为本发明提供的化合物2在MeOD(100MHz)条件下的13C NMR图谱；
图8为本发明提供的化合物2在MeOD(100MHz)条件下的13C NMR与DEPT-135图谱；
图9为本发明提供的化合物3的ESI-MS图谱；
图10为本发明提供的化合物3在MeOD(400MHz)条件下的1H NMR图谱；
图11为本发明提供的化合物3在MeOD(100MHz)条件下的13C NMR图谱；
图12为本发明提供的化合物3在MeOD100MHz)条件下的13C NMR与DEPT-135图谱；
图13为本发明提供的化合物4的ESI-MS图谱；
图14为本发明提供的化合物4在MeOD(400MHz)条件下的1H NMR图谱；
图15为本发明提供的化合物4在MeOD(100MHz)条件下的13C NMR图谱；
图16为本发明提供的化合物4在MeOD(100MHz)条件下的13C NMR与DEPT-135图谱；
图17为本发明提供的化合物5的ESI-MS图谱；
图18为本发明提供的化合物5在DMSO-d6(400MHz)条件下的1H NMR图谱；
图19为本发明提供的化合物5在DMSO-d6(100MHz)条件下的13C NMR图谱；
图20为本发明提供的化合物5在DMSO-d6(100MHz)条件下的13C NMR与DEPT-135图谱；
图21为本发明提供的化合物5在DMSO-d6条件下的1H-1H COSY图谱；
图22为本发明提供的化合物5在DMSO-d6条件下的HSQC图谱；
图23为本发明提供的化合物5在DMSO-d6条件下的HMBC图谱；
图24为本发明提供的化合物5在DMSO-d6条件下的NOESY图谱；
图25为本发明提供的化合物6的ESI-MS图谱；
图26为本发明提供的化合物6在DMSO-d6(400MHz)条件下的1H NMR图谱；
图27为本发明提供的化合物6在DMSO-d6(100MHz)条件下的13C NMR图谱；
图28为本发明提供的化合物6在DMSO-d6(100MHz)条件下的13C NMR与DEPT-135图谱；
图29为本发明提供的化合物7的ESI-MS图谱；
图30为本发明提供的化合物7在MeOD(400MHz)条件下的1H NMR图谱；
图31为本发明提供的化合物7在MeOD(100MHz)条件下的13C NMR图谱；
图32为本发明提供的化合物7在MeOD(100MHz)条件下的13C NMR与DEPT-135图谱；
图33为本发明提供的化合物7在MeOD条件下的1H-1H COSY图谱；
图34为本发明提供的化合物7在MeOD条件下的HSQC图谱；
图35为本发明提供的化合物7在MeOD条件下的HMBC图谱；
图36为本发明提供的化合物7在MeOD条件下的NOESY图谱；
图37为本发明提供的化合物7的平面结构。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。
本发明中的词语“优选地”、“更优选地”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
除非另外指明，在本文中所有的分子量都是以道尔顿为单位表示的重均分子量。
除非另外指明，在本文中所有配制和测试发生在25℃的环境。
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组份、步骤或限制项组成。本文中术语“效能”、“性能”、“效果”、“功效”之间不作区分。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，包括如下步骤：
获取五灵脂标准汤剂的提取物；
将提取物进行第一次反相层析，第一次分段收集流分，制备流分Fr.A、Fr.B与Fr.C；其中，第一次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从40％变化至100％；
将Fr.A进行第二次反相层析，第二次分段收集流分，制备子流分Fr.A1、Fr.A2、Fr.A3与Fr.A4；其中，第二次反相层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从0％变化至50％；
将Fr.A1进行第三次反相层析，第三次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-1、Fr.A1-2、Fr.A1-3与Fr.A1-4；其中，第三次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与质量分数为0.1％的甲酸溶液，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3％变化至20％；
将Fr.A1-3进行第一次凝胶层析，第四次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-3-1、Fr.A1-3-2、Fr.A1-3-3、Fr.A1-3-4、Fr.A1-3-5、Fr.A1-3-6、Fr.A1-3-7、Fr.A1-3-8、Fr.A1-3-9、Fr.A1-3-10、Fr.A1-3-11、Fr.A1-3-12与Fr.A1-3-13；其中，第一次凝胶层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用等度洗脱，甲醇的体积百分数为65％～75％；
将Fr.A1-4进行第四次反相层析，第五次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-4-1、Fr.A1-4-2、Fr.A1-4-3、Fr.A1-4-4与Fr.A1-4-5；其中，第四次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与质量分数为0.08％～0.12％的甲酸溶液，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3％变化至50％；
将Fr.A2进行第五次反相层析，第六次分段收集流分，制备子流分Fr.A2-1、Fr.A2-2、Fr.A2-3、Fr.A2-4与Fr.A2-5；其中，第五次反相层析的条件包括：洗脱液为乙腈与水，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从5％变化至70％；
将Fr.A1-3-7进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；
将Fr.A1-3-11进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2与化合物3；
将Fr.A1-4-2进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5；
将Fr.A1-4-4进行第二次凝胶层析，采用甲醇洗脱，制备化合物6；
将Fr.A2-3进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物7。
在一个具体的示例中，五灵脂标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：
将五灵脂标准汤剂的冻干粉，与质量分数为60％～80％的甲醇混合，超声，然后过滤，取滤液，浓缩。
更具体地，五灵脂标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：
将五灵脂标准汤剂的冻干粉，与质量分数为70％的甲醇混合，超声提取，然后过滤，取滤液，减压浓缩。
更为具体地，五灵脂标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：
取五灵脂标准汤剂冻干粉200g，加入70％甲醇水3.2L，超声提取30min，过滤，取续滤液，减压浓缩，得70％甲醇提取物80g(WZ部位)。
在一个具体的示例中，五灵脂饮片标准汤剂的冻干粉的制备包括如下步骤：
取五灵脂饮片2000g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加8倍量水，浸泡30分钟后，武火(500W)煮沸后，文火(200W)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次煎煮加6倍量水，武火(500W)煮沸后，文火(200W)保持微沸25分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得到五灵脂标准汤剂冻干粉。
在一个具体的示例中，第一次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(8～12):(88～92)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。更具体地，洗脱剂为体积分数为10:90的乙腈与水的混合物。
在一个具体的示例中，第二次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(13～17):(83～87)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。更具体地，洗脱剂为体积分数为15:85的乙腈与水的混合物。
在一个具体的示例中，第三次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(23～27):(73～77)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。更具体地，洗脱剂为体积分数为25:75的乙腈与水的混合物。
在一个具体的示例中，第四次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(38～42):(58～62)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。更具体地，洗脱剂为体积分数为40:60的乙腈与水的混合物。
在一个具体的示例中，第一次半制备高效液相色谱分离的条件还包括：流速为2ml/min；和/或
第二次半制备高效液相色谱分离的条件还包括：流速为2ml/min；和/或
第三次半制备高效液相色谱分离的条件还包括：流速为2ml/min；和/或
第四次半制备高效液相色谱分离的条件还包括：流速为2ml/min。
在一个具体的示例中，第一次反相层析中，洗脱液为体积百分数为40％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A；和/或
洗脱液为体积百分数为70％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.B；和/或
洗脱液为体积百分数为95％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.C。
在一个具体的示例中，第二次反相层析中，洗脱液为水，收集流分，制备流分Fr.A1；和/或
洗脱液为体积百分数为10％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A2；和/或
洗脱液为体积百分数为30％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A3；和/或
洗脱液为体积百分数为50％的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A4。
在一个具体的示例中，第三次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第一次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-1、Fr.A1-2、Fr.A1-3与Fr.A1-4；
其中，第一次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1％的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～28min，流动相A的体积百分数从5％变化至15％；28min～50min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；50min～58min，流动相A的体积百分数保持为20％；58min～63min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5mL/min～1.5mL/min；检测波长为260nm～280nm。
在一个具体的示例中，第四次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第二次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-3-1、Fr.A1-3-2、Fr.A1-3-3、Fr.A1-3-4、Fr.A1-3-5、Fr.A1-3-6、Fr.A1-3-7、Fr.A1-3-8、Fr.A1-3-9、Fr.A1-3-10、Fr.A1-3-11、Fr.A1-3-12与Fr.A1-3-13；
其中，第二次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1％的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～28min，流动相A的体积百分数从5％变化至15％；28min～50min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；50min～58min，流动相A的体积百分数保持为20％；58min～63min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5mL/min～1.5mL/min；检测波长为260nm～280nm。
在一个具体的示例中，第五次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第三次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-4-1、Fr.A1-4-2、Fr.A1-4-3、Fr.A1-4-4与Fr.A1-4-5；
其中，第三次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1％的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～28min，流动相A的体积百分数从5％变化至15％；28min～50min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；50min～58min，流动相A的体积百分数保持为20％；58min～63min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5mL/min～1.5mL/min；检测波长为260nm～280nm。
在一个具体的示例中，第六次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第四次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A2-1、Fr.A2-2、Fr.A2-3、Fr.A2-4与Fr.A2-5；
其中，第四次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1％的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min～28min，流动相A的体积百分数从5％变化至15％；28min～50min，流动相A的体积百分数由15％变化至20％；50min～58min，流动相A的体积百分数保持为20％；58min～63min，流动相A的体积百分数由20％变化至38％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.5mL/min～1.5mL/min；检测波长为260nm～280nm。
本发明还提供一种五灵脂标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，包括如下步骤：
获取上述五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法所分离得到的化学成分；化学成分包括化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6与化合物7中的一种或多种；
将化学成分进行高效液相色谱与质谱联用测定；
其中，高效液相色谱的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为水；采用等度洗脱，乙腈的体积百分数为40％；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃～35℃；流速为0.3mL/min～0.5mL/min；在200nm～400nm范围内进行全波扫描。
在一个具体的示例中，质谱的条件包括：采用电喷雾离子源；采用负离子模式扫描；毛细管电压为0.7kV～0.9kV；锥孔电压为12V～18V；脱溶剂气温为420℃～480℃；离子源温度为120℃～180℃；扫描范围为m/z100～m/z1250；采样频率为8Hz～12Hz。
更具体地，质谱的条件包括：采用电喷雾离子源；采用负离子模式扫描；毛细管电压为0.8kV；锥孔电压为15V；脱溶剂气温为450℃；离子源温度为150℃～180℃；扫描范围为m/z100～m/z1250；采样频率为10Hz。
在一个具体的示例中，化合物1为马尿酸；
化合物2为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸；
化合物3为间羟基苯甲酸；
化合物4为(+)-(1S,5R)-Verbenon-10-oic acid；
化合物5为4-hydroxymyrtenic acid；
化合物6为苯甲酸；
化合物7为3-(3-hydroxy-5-(1-hydroxy-3-(3-hydroxyphenyl)propan-2-yl)phenyl)propanoicacid。
本发明采用ODS色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱结合制备液相色谱，成功从五灵脂标准汤剂中分离出7个化合物，经结构解析，分别为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸、间羟基苯甲酸、苯甲酸、(+)-(1S,5R)-verbenon-10-oic acid、3-(3-hydroxy-5-(1-hydroxy-3-(3-hydroxyphenyl)propan-2-yl)phenyl)propanoic acid、马尿酸、4-hydroxymyrtenicacid，其中3-(3-hydroxy-5-(1-hydroxy-3-(3-hydroxyphenyl)propan-2-yl)phenyl)propanoic acid为新化合物，3-羟基-4-甲氧基苯甲酸、(+)-(1S,5R)-verbenon-10-oicacid、马尿酸、4-hydroxymyrtenic acid系首次从五灵脂中分离得到，丰富了五灵脂标准汤剂的化学组成，为五灵脂标准汤剂和五灵脂中药制剂的质量控制提供重要参考。
以下结合具体实施例对本发明的五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法与结构鉴定方法做进一步详细的说明。以下实施例中所用的原料，如无特别说明，均为市售产品。
实施例1
本实施例提供一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，具体如下：
一、仪器与试药
仪器：Waters Arc UHPLC-DAD-QDa联用仪(美国Waters公司)；岛津LC-20AR制备液相(日本岛津公司)；Bruker AvanceⅢ400MHz核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；超纯水系统Milli-Q Direct(德国默克公司)；Waters Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱；；Waters Xselect HSS T3 C18(2.1mm×100mm,2.5μm)色谱柱；万分之一天平ME204E(瑞士梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器KQ-500DE(中国昆山市超声仪器有限公司)；试剂：甲醇(色谱纯，德国默克公司)；水为自制超纯水；其它试剂均为分析纯。试药：五灵脂饮片。
二、实验过程
1、五灵脂标准汤剂冻干粉的制备
取五灵脂饮片2000g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮加8倍量水，浸泡30分钟后，武火(500W)煮沸后，文火(200W)保持微沸30分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却；第二次煎煮加6倍量水，武火(500W)煮沸后，文火(200W)保持微沸25分钟，煎液经350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次滤液，减压浓缩，冷冻干燥，得到五灵脂饮片标准汤剂冻干粉。
2、五灵脂标准汤剂化学成分的提取与分离
取五灵脂标准汤剂冻干粉200g，加入70％甲醇水3.2L，超声提取30min，过滤，取续滤液，减压浓缩，得70％甲醇提取物80g(WZ部位)；
WZ部位进行ODS柱层析，采用甲醇-水(40：60-100：0，v/v)梯度洗脱，得到40％、70％和95％三个洗脱部位(Fr.A～Fr.C)；
对Fr.A部位进行ODS柱层析，采用甲醇-水(0：100-50：50，v/v)梯度洗脱，得到纯水、10％、30％和50％四个洗脱部位(Fr.A1～Fr.A4)；
Fr.A1部位经ODS柱层析进行分离，采用乙腈-0.1％甲酸溶液(3:97-20:80，v/v)梯度洗脱，采用高效液相色谱法对分段流分进行分析，色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～28min,5％～15％A；28～50min,15％～20％A；50～58min,20％A；58～63min,20％～38％A)；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min，进样量为10μl，合并相同流分，得到Fr.A1部位4个子流分(Fr.A1-1～Fr.A1-4)；
将子流分Fr.A1-3部位进行Sephadex LH-20凝胶柱分离，采用70％甲醇水等度洗脱，采用高效液相色谱法对分段流分进行分析，色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～28min,5％～15％A；28～50min,15％～20％A；50～58min,20％A；58～63min,20％～38％A)；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min，进样量为10μl，合并相同流分，得到13个子流分(Fr.A1-3-1～Fr.A1-3-13)；
将子流分Fr.A1-3-7部位经半制备高效液相色谱分离纯化，色谱仪器为岛津LC-20AR制备液相，色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)，洗脱剂为乙腈-水，比例为10:90，等度洗脱，流速为2ml/min，分离纯化得到化合物1(10.3mg)；
将子流分Fr.A1-3-11部位经半制备高效液相色谱分离纯化，色谱仪器为岛津LC-20AR制备液相，色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)，洗脱剂为乙腈-水，比例为15：85，等度洗脱，流速为2ml/min，分离纯化得到化合物2(5.4mg)和化合物3(10.6mg)；
Fr.A1-4部位经ODS柱层析分离，采用乙腈-0.1％甲酸(3:97-50:50，v/v)梯度洗脱，采用高效液相色谱法对分段流分进行分析，色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～28min,5％～15％A；28～50min,15％～20％A；50～58min,20％A；58～63min,20％～38％A)；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min，进样量为10μl，合并相同流分，得到5个子流分(Fr.A1-4-1～Fr.A1-4-5)；
Fr.A1-4-2部位经半制备高效液相色谱分离纯化，色谱仪为岛津LC-20AR制备液相，色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)，洗脱剂为乙腈-水，比例为25:75，等度洗脱，流速为2ml/min，得到化合物4(10.1mg)和化合物5(10.0mg)。Fr.A1-4-4部位进行Sephadex LH-20凝胶柱层析进行分离，甲醇洗脱，得到化合物6(11.4mg)。
Fr.A2部位进行ODS柱层析，采用乙腈-水(5：95-70：30，v/v)梯度洗脱，采用高效液相色谱法对分段流分进行分析，色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)，以乙腈为流动相A，0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～28min,5％～15％A；28～50min,15％～20％A；50～58min,20％A；58～63min,20％～38％A)；检测波长为270nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min，进样量为10μl，合并相同流分，得到5个子流分(Fr.A2-1～Fr.A2-5)；
Fr.A2-3部位经半制备高效液相色谱分离纯化，色谱仪为岛津LC-20AR制备液相，色谱柱为Xselect HSS T3 C18(4.6mm×250mm,5μm)，洗脱剂为乙腈-水，比例为40：60，等度洗脱，流速为2ml/min，分离纯化得到目标化合物7(7.4mg)。
实施例2
本实施例提供一种五灵脂标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，具体如下：
一、实验过程
采用400MHz核磁共振波谱仪采集样品氢谱和碳谱，样品溶剂为DMSO-d6和MeOD；采用Waters Arc UHPLC-DAD-QDa液相色谱质谱联用仪采集样品色谱图和质谱图，色谱柱为Waters Xselect HSS T3 C18(2.1mm×100mm,2.5μm)，流动相为乙腈-水，比例为40:60，等度洗脱，在200nm～400nm范围内进行全波扫描，柱温为30℃；流速为0.4ml/min，进样量为2μl；质谱离子源：电喷雾离子源(ESI)；负离子模式扫描；毛细管电压为0.8kv，锥孔电压为15V，脱溶剂气温度为450℃，离子源温度为150℃，扫描范围为m/z100–m/z1250，采样频率为10Hz，对化合物1～7进行结构鉴定。
化合物1～7的结构鉴定谱图如图1～图36所示。
二、结构鉴定结果
1、化合物1
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无色针晶(甲醇-水)；ESI-MS m/z:178[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:8.83(1H,t,J＝6.0Hz,H-3),7.88(2H,dd,J＝7.0,1.7Hz,H-6,10),7.54(1H,m,H-8),7.48(2H,dd,J＝8.1,6.3Hz,H-7,9),3.94(2H,d,J＝5.9Hz,H-2)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:171.8(C-1),167.0(C-4),134.3(C-5),131.9(C-8),128.8(C-7,9),127.7(C-6,10),42.8(C-2)。鉴定化合物1为马尿酸(hippuric acid)。
2、化合物2
白色粉末(甲醇)；ESI-MS m/z:167[M-H]-。1H-NMR(400MHz,MeOD)δ:7.54(1H,br s,Hz,H-2),7.53(1H,br s,Hz,H-6),6.83(1H,d,J＝8.2Hz,H-5),3.88(3H,s,4-OCH3)；13C-NMR(100MHz,MeOD)δ:152.6(C-4),148.7(C-3),125.4(C-6),115.9(C-2),114.0(C-5),56.4(4-OCH3)。鉴定化合物2为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸(3-hydroxy-4-methoxybenzoic acid)。
3、化合物3
淡黄色粉末(甲醇)；ESI-MS m/z:137[M-H]-。1H-NMR(400MHz,MeOD)δ:7.50(1H,dt,J＝7.6,1.3Hz,H-6),7.44(1H,m,H-2),7.27(1H,t,J＝7.9Hz,H-5),7.01(1H,dd,J＝8.2,2.7Hz,H-4)；13C-NMR(100MHz,MeOD)δ:170.0(COOH),158.7(C-3),133.1(C-1),130.4(C-5),121.9(C-6),121.0(C-4),117.2(C-2)。鉴定化合物3为间羟基苯甲酸(3-hydroxybenzoicacid)。
4、化合物4
淡黄色针晶(甲醇)；ESI-MS m/z:179[M-H]-。1H-NMR(400MHz,MeOD)δ:6.51(1H,brs,H-3),3.08(1H,td,J＝5.9,1.5Hz,H-1),2.97(1H,dt,J＝9.6,5.6Hz,H-7β),2.69(1H,td,J＝5.8,1.8Hz,H-5),2.07(1H,d,J＝9.6Hz,H-7α),1.57(3H,s,8-CH3),0.96(3H,s,9-CH3)；13C-NMR(100MHz,MeOD)δ:205.9(C-4),168.4(C-10),159.1(C-2),129.2(C-3),59.9(C-5),55.7(C-6),45.2(C-1),41.9(C-7),26.8(C-8),22.3(C-9)。鉴定化合物4为(+)-(1S,5R)-Verbenon-10-oic acid。
5、化合物5
无色油状物(甲醇)；ESI-MS m/z:181[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:6.55(1H,dt,J＝3.1,1.6Hz,H-3),4.27(1H,t,J＝3.1Hz,H-4),2.65(1H,td,J＝5.6,1.4Hz,H-1),2.24(1H,dt,J＝9.0,5.6Hz,H-7a),2.04(1H,tdd,J＝5.6,3.1,1.6Hz,H-5),1.32(3H,s,H-8),1.26(1H,d,J＝9.0Hz,H-7b),0.75(3H,s,H-9)；13C NMR(100MHz,DMSO)δ:167.2(C-10),140.7(C-2),135.8(C-3),67.9(C-4),46.4(C-5),45.1(C-6),41.5(C-1),28.1(C-7),26.3(C-8),20.4(C-9)。鉴定化合物5为4-hydroxymyrtenic acid。
6、化合物6
无色针晶(甲醇)；ESI-MS m/z:121[M-H]-。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.88(1H,brs,COOH),7.97(2H,m,H-2,6),7.60(1H,m,H-4),7.46(2H,dd,J＝8.4,7.0Hz,H-3,5)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:167.5(C＝O),132.9(C-4),130.9(C-1),129.4(C-2,6),128.6(C-3,5)。鉴定化合物6为苯甲酸(Benzoic acid)。
7、化合物7
1H-NMR、13C-NMR和DEPT谱显示其有18个碳，分别为4个亚甲基碳，8个次甲基碳和6个季碳。结合1H-1H COSY、HSQC、HMBC谱信息，可以对该化合物的1H-NMR(400MHz,MeOD)和13C-NMR(100MHz,MeOD)数据予以归属，如表1所示。
1H-NMR谱显示，在低场区δH 6.98–6.47有七个芳香质子信号，一个与二芳基相连的CH2–CH–CH2OH结构片段[δH 2.98(1H,dd,J＝13.1,6.0Hz,H-7′a),2.70(1H,dd,J＝13.1,8.4Hz,H-7′b),2.89(1H,m,H-8′),3.68(2H,d,J＝6.5Hz,H-9′)]，一组CH2–CH2质子信号[δH2.78(2H,t,J＝7.7Hz,H-7),2.52(2H,t,J＝7.7Hz,H-8)]。1H-1H COSY显示，H-7和H-8，H-8′和H-7′/H-9′存在氢氢直接相关，进一步证明了CH2–CH2和CH2–CH–CH2OH结构片段的存在。HMBC谱中，H-7(δH 2.78)与C-2(δC 119.3)/C-6(δC 112.9)/C-9(δC 175.7)，H-8(δH 2.52)与C-1(δC142.0)/C-9(δC 175.7)有碳氢远程相关，证实CH2–CH2片段连在C-1位上；H-8′(δH2.89)与C-2(δC 119.3)/C-4(δC 112.7)，H-7′b(δH 2.70)/H-9′(δH 3.68)与C-3(δC 144.2)有碳氢远程相关，可推测C-3与C-8′相连。同时，HMBC谱显示，H-4(δH 6.46)与C-2(δC119.3)/C-6(δC 112.9)存在碳氢远程相关，结合1H-NMR谱中的3个芳香质子信号[δH 6.51(1H,overlapped,H-2),6.46(1H,overlapped,H-4),6.47(1H,overlapped,H-6)]，可推测化合物中存在一个1,3,5-三取代苯环。此外，HMBC谱显示，H-7′a(δH 2.98)与C-6′(δC 120.2)/C-2′(δC 115.6)有碳氢远程相关，可推测C-7′与C-1′相连；HMBC谱显示，H-5′(δH 6.98)与C-1′(δC 141.9)/C-3′(δC 156.6)，H-2′(δH 6.51)与C-4′(δC 112.4)/C-6′(δC 120.2)有碳氢远程相关，结合1H-NMR谱中的4个芳香质子信号[δH6.51(1H,overlapped,H-2′),6.53(1H,overlapped,H-4′),6.98(1H,t,J＝7.8Hz,H-5′),6.53(1H,overlapped,H-6′)]，可推测化合物中存在一个1,3-二取代苯环。综合以上信息，可以确定化合物7的平面结构(图37)，为3-(3-hydroxy-5-(1-hydroxy-3-(3-hydroxyphenyl)propan-2-yl)phenyl)propanoicacid。根据SciFinder Scholar数据库检索，该化合物尚无文献记载，是1个新的新木脂素类化合物，命名为五灵脂素A。
表1化合物7的氢谱和碳谱数据a
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以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (8)
1.一种五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取五灵脂标准汤剂的提取物；所述五灵脂标准汤剂的提取物的制备包括如下步骤：将所述五灵脂标准汤剂的冻干粉，与质量分数为60%~80%的甲醇混合，超声，然后过滤，取滤液，浓缩；
将所述提取物进行第一次ODS柱层析，第一次分段收集流分，制备流分Fr.A、Fr.B与Fr.C；其中，第一次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从40%变化至100%；
第一次ODS柱层析中，洗脱液为体积百分数为40%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A；和
洗脱液为体积百分数为70%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.B；和
洗脱液为体积百分数为95%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.C；
将Fr.A进行第二次ODS柱层析，第二次分段收集流分，制备子流分Fr.A1、Fr.A2、Fr.A3与Fr.A4；其中，第二次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为甲醇与水，采用梯度洗脱，甲醇的体积百分数从0%变化至50%；
第二次ODS柱层析中，洗脱液为水，收集流分，制备流分Fr.A1；和
洗脱液为体积百分数为10%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A2；和
洗脱液为体积百分数为30%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A3；和
洗脱液为体积百分数为50%的甲醇水溶液，收集流分，制备流分Fr.A4；
将Fr.A1进行第三次ODS柱层析，第三次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-1、Fr.A1-2、Fr.A1-3与Fr.A1-4；其中，第三次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为乙腈与质量分数为0.1%的甲酸溶液，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3%变化至20%；
第三次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第一次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-1、Fr.A1-2、Fr.A1-3与Fr.A1-4；
其中，第一次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1%的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min~28min，流动相A的体积百分数从5%变化至15%；28min~50min，流动相A的体积百分数由15%变化至20%；50min~58min，流动相A的体积百分数保持为20%；58min~63min，流动相A的体积百分数由20%变化至38%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.5mL/min~1.5mL/min；检测波长为260nm~280nm；将Fr.A1-3进行第一次凝胶层析，第四次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-3-1、Fr.A1-3-2、Fr.A1-3-3、Fr.A1-3-4、Fr.A1-3-5、Fr.A1-3-6、Fr.A1-3-7、Fr.A1-3-8、Fr.A1-3-9、Fr.A1-3-10、Fr.A1-3-11、Fr.A1-3-12与Fr.A1-3-13；其中，第一次凝胶层析的条件包括：凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液为甲醇与水，采用等度洗脱，甲醇的体积百分数为65%~75%；
第四次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第二次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-3-1、Fr.A1-3-2、Fr.A1-3-3、Fr.A1-3-4、Fr.A1-3-5、Fr.A1-3-6、Fr.A1-3-7、Fr.A1-3-8、Fr.A1-3-9、Fr.A1-3-10、Fr.A1-3-11、Fr.A1-3-12与Fr.A1-3-13；
其中，第二次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1%的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min~28min，流动相A的体积百分数从5%变化至15%；28min~50min，流动相A的体积百分数由15%变化至20%；50min~58min，流动相A的体积百分数保持为20%；58min~63min，流动相A的体积百分数由20%变化至38%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.5mL/min~1.5mL/min；检测波长为260nm~280nm；
将Fr.A1-4进行第四次ODS柱层析，第五次分段收集流分，制备子流分Fr.A1-4-1、Fr.A1-4-2、Fr.A1-4-3、Fr.A1-4-4与Fr.A1-4-5；其中，第四次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为乙腈与质量分数为0.08%~0.12%的甲酸溶液，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从3%变化至50%；
第五次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第三次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A1-4-1、Fr.A1-4-2、Fr.A1-4-3、Fr.A1-4-4与Fr.A1-4-5；
其中，第三次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1%的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min~28min，流动相A的体积百分数从5%变化至15%；28min~50min，流动相A的体积百分数由15%变化至20%；50min~58min，流动相A的体积百分数保持为20%；58min~63min，流动相A的体积百分数由20%变化至38%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.5mL/min~1.5mL/min；检测波长为260nm~280nm；
将Fr.A2进行第五次ODS柱层析，第六次分段收集流分，制备子流分Fr.A2-1、Fr.A2-2、Fr.A2-3、Fr.A2-4与Fr.A2-5；其中，第五次ODS柱层析的条件包括：洗脱液为乙腈与水，采用梯度洗脱，乙腈的体积百分数从5%变化至70%；
第六次分段收集流分后还包括如下步骤：
采用第四次高效液相色谱分析，合并相同流分，制备子流分Fr.A2-1、Fr.A2-2、Fr.A2-3、Fr.A2-4与Fr.A2-5；
其中，第四次高效液相色谱分析的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为质量分数为0.1%的磷酸溶液；采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：0min~28min，流动相A的体积百分数从5%变化至15%；28min~50min，流动相A的体积百分数由15%变化至20%；50min~58min，流动相A的体积百分数保持为20%；58min~63min，流动相A的体积百分数由20%变化至38%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.5mL/min~1.5mL/min；检测波长为260nm~280nm；
将Fr.A1-3-7进行第一次半制备高效液相色谱分离，制备化合物1；
将Fr.A1-3-11进行第二次半制备高效液相色谱分离，制备化合物2与化合物3；
将Fr.A1-4-2进行第三次半制备高效液相色谱分离，制备化合物4与化合物5；
将Fr.A1-4-4进行第二次凝胶层析，采用甲醇洗脱，制备化合物6；
将Fr.A2-3进行第四次半制备高效液相色谱分离，制备化合物7。
2.根据权利要求1所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第一次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(8~12):(88~92)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
3.根据权利要求1所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第二次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(13~17):(83~87)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
4.根据权利要求1所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第三次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(23~27):(73~77)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
5.根据权利要求1所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法，其特征在于，第四次半制备高效液相色谱分离的条件包括：洗脱剂为体积分数为(38~42):(58~62)的乙腈与水的混合物；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱。
6.一种五灵脂标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取如权利要求1~5任一项所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的分离方法所分离得到的化学成分；所述化学成分包括所述化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6与化合物7中的一种或多种；
将所述化学成分进行超高效液相色谱与质谱联用测定；
其中，所述超高效液相色谱的条件包括：流动相A为乙腈，流动相B为水；采用等度洗脱，乙腈的体积百分数为40%；色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25℃~35℃；流速为0.3mL/min~0.5mL/min；在200nm~400nm范围内进行全波扫描。
7.根据权利要求6所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，其特征在于，所述质谱的条件包括：采用电喷雾离子源；采用负离子模式扫描；毛细管电压为0.7kV~0.9kV；锥孔电压为12V~18V；脱溶剂气温为420℃~480℃；离子源温度为120℃~180℃；扫描范围为m/z100~m/z1250；采样频率为8Hz~12Hz。
8.根据权利要求6~7任一项所述的五灵脂标准汤剂的化学成分的结构鉴定方法，其特征在于，所述化合物1为马尿酸；
所述化合物2为3-羟基-4-甲氧基苯甲酸；
所述化合物3为间羟基苯甲酸；
所述化合物4为(+)-(1S,5R)-Verbenon-10-oic acid；
所述化合物5为4-hydroxymyrtenic acid；
所述化合物6为苯甲酸；
所述化合物7为3-(3-hydroxy-5-(1-hydroxy-3-(3-hydroxyphenyl)propan-2-yl)phenyl) propanoic acid。
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