CN116426616A - 基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法 - Google Patents
基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116426616A CN116426616A CN202310245720.3A CN202310245720A CN116426616A CN 116426616 A CN116426616 A CN 116426616A CN 202310245720 A CN202310245720 A CN 202310245720A CN 116426616 A CN116426616 A CN 116426616A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- microsphere
- nucleic acid
- primer
- pcr
- amino
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 title claims abstract description 99
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 43
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 14
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 12
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 12
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 claims description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 108700002099 Coronavirus Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 claims description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 3
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 claims description 3
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 claims description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 3
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 claims description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 8
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 8
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028292 Aladin Human genes 0.000 description 1
- 101710065039 Aladin Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 241000251511 Holothuroidea Species 0.000 description 1
- 101100281953 Homo sapiens GAPDH gene Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- -1 for example Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基于微球固相PCR技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法，属于生物技术领域，本发明根据所需检测的基因进行引物设计，并在上游引物和下游引物的5’端处用功能基团修饰，通过共价偶联引物，制备引物微球复合物。对所需检测的样品进行核酸提取，并使用微量分光光度计进行纯度和浓度测定。按照常规PCR/RT‑PCR试剂盒配制扩增体系，使用普通PCR仪器进行扩增。扩增后观察并计数带有扩增产物的微球，从而实现核酸的绝对定量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种核酸扩增方法，具体涉及一种基于微球固相PCR技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是一种体外放大特定核酸的反应，在疾病诊断、现场取证等方面具有重要的应用领域。目前RNA分子定量检测的常见方法有Real time q-PCR和数字PCR两种，而Real time q-PCR只能进行相对定量的分析，并不能精确反应样本中RNA的实际数量。数字PCR是最新的一种绝对定量技术，使用微流控或微滴化的方法使单个微滴的核酸模板数少于或等于1个，有模板的微滴通过PCR反应产生荧光信号，通过数荧光信号既能得到样本的RNA个数。由于数字PCR的仪器昂贵、配套试剂耗材成本高，因此还未能被广泛应用。因此，开发一种快速检测、经济、便捷的核酸绝对定量方法仍被迫切需要。
发明内容
为了克服Real time q-PCR结果精确度不高和数字PCR成本昂贵的问题，本发明的目的是提供一种基于微球固相PCR技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法，通过读取微球核酸荧光信号数目得到样本初始核酸浓度。
本发明采用的具体方案为：
基于微球固相PCR技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法，包括以下步骤：
步骤一、制备引物微球复合物：根据靶序列设计引物，在上游引物和下游引物的5’端均修饰功能基团Ⅰ；在微球表面修饰有与功能基团Ⅰ偶联的功能基团Ⅱ；通过偶联将引物连接在微球上，制备引物微球复合物；
步骤二、采用引物微球复合物代替引物，通过常规PCR/RT-PCR方法进行核酸扩增，将目标核酸在微球表面进行扩大复制，使微球表面固定的扩增产物达到被检测的数量；
步骤三、对扩增反应后微球上的扩增产物进行检测，通过计数的方式进行核酸分子的绝对定量。
优选地，步骤一中，所述微球为聚合物或无机材料微球。进一步地，所述微球为聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球或磁性微球。
优选地，步骤一中，所述微球的直径大小为0.1-30μm，优选为0.2-5μm。
优选地，步骤二中，所述核酸扩增的体系中，微球浓度为102-105个/μl，优选103个/μl。
优选地，所述检测为基于核酸杂交的固相检测、基于荧光的微球计数法或电化学检测。更进一步地，所述检测方法是对微球上的扩增产物进行核酸染料染色、使用带荧光标记的dNTP渗入产物链中进行标记或使用带电化学/化学信号分子标记的dNTP渗入产物链中进行标记。
优选地，步骤一中，所述偶联方式为羧基与氨基偶联、巯基与氨基偶联。进一步地，所述功能基团Ⅰ为氨基，所述功能基团Ⅱ为羧基，两者进行共价偶联。
优选地，步骤一中，所述靶序列为结核杆菌IS6110的DNA序列，上游引物是在SEQID NO：1所示序列的5’端修饰氨基，下游引物是在SEQ ID NO：2所示序列的5’端修饰氨基。
优选地，步骤一中，所述靶序列为新冠病毒N蛋白的RNA序列，上游引物是在SEQ IDNO：3所示序列的5’端修饰氨基，下游引物是在SEQ ID NO：4所示序列的5’端修饰氨基。
有益效果：本发明将引物偶联在固相微球上，制备引物微球复合物，采用所述引物微球复合物代替引物进行核酸扩增，最后通过计数带有扩增产物的微球，即可实现核酸的绝对定量。
附图说明
图1是PCR固相微球扩增原理图；
图2是5’端带氨基GAPDH引物2％琼脂糖电泳图；
图3是HUVEC细胞中提取的DNA微量分光光度计图；
图4是PCR扩增体系液成分图。
图5是染色后结核杆菌PCR固相微球荧光显微镜图.
图6是染色后新冠PCR固相微球荧光显微镜图。
具体实施方式
一种基于微球固相PCR/RT-PCR技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法的构建，使用修饰有扩增引物的微球及PCR/RT-PCR扩增体系，扩增结束后对含有扩增产物的微球进行计数。
所述的微球可以为聚合物或无机材料微球，微球材质包括但不限于聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、磁性微球等。其密度与扩增体系密度接近，微球大小介于0.1-30μm之间，优选0.2-5μm，微球表面修饰有用于目的核酸扩增的引物。
由于底物和引物有限，扩增后核酸产物浓度也有一定限度。微球的直径不应过大，否则微球表面整体核酸分子浓度低，不利于荧光显微镜观察，微球的直径大小优选0.2-5μm。
所述的PCR扩增体系包括修饰有引物的微球、扩增Buffer、dNTP、适量扩增模板、聚合酶等构成，微球浓度为102-105个/μl，优选103个/μl。扩增模板为待测样本的核酸，包括DNA和RNA。
所述修饰有引物的微球，前向和后向引物同时共价修饰在微球上，两者浓度为1：1。
所述的微球扩增后对微球上扩增的产物进行可见光或荧光等检测，计数含有扩增产物的微球数量。检测方法包括但不限于基于核酸杂交的固相检测或基于荧光的微球计数法。检测是对扩增微球产物进行核酸染料染色或使用带荧光标记的dNTP渗入产物链中进行标记。总之，一切对扩增产物发光、显色或电化学检测的方法都可以被用作微球扩增产物的检测手段。
引物的一端连接带修饰的基团与微球表面的基团进行共价偶联，微球与引物共价偶联方式包括但不限于羧基与氨基偶联，巯基与氨基偶联等。
工作原理：首先根据所需检测的基因进行引物设计，并在上游引物和下游引物的5端处用功能基团修饰，通过共价偶联引物，制备引物微球复合物。对所需检测的样品进行核酸提取，并使用微量分光光度计进行纯度和浓度测定。按照常规PCR/RT-PCR试剂盒配制扩增体系，使用普通PCR仪器进行扩增。扩增后观察并计数带有扩增产物的微球，从而实现核酸的绝对定量。原理如图1所示。
为了验证5’端带氨基的引物偶联在羧基聚苯乙烯微球表面后能否实现有效扩增，采用从人HUVEC细胞中提取的DNA为模板，对人GAPDH基因进行扩增。引物为GAPDH-F：5’-Amino-TTTTTTTTTTTTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3’和GAPDH-R：5’-Amino-TTTTTTTTTTTTGATGACCCTTTTGGCTCCC-3’。所用模板的浓度和纯度如图3所示。扩增结果如图2所示，通过该图2的凝胶电泳结果表明合成的5’端带氨基修饰核酸引物能照常扩增目的基因。
下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。
羧基聚苯乙烯微球购自Macklin L815966-5ml、Macklin L815965-5ml、MacklinL815973-5ml、Aladdin P107806-5ml、Perfemiker PA57041-5ml、YUAN BIOTECH YM0002。
5’端带氨基修饰的引物由上海艾基生物合成。
如未特别提及，本申请所用试剂均为常规市售试剂，所用方法均为常规操作方法。
实施例1一种用于结核杆菌DNA定量的微球固相PCR方法
取100μl直径为2μm的羧基聚苯乙烯微球(Macklin L815966-5ml)加到1.5ml无酶EP管中，进行漩涡振荡，超声分散若干秒(每次离心都需重复该步骤)，用离心机进行4℃，10000rpm，离心2min。(以下离心条件以此为准)
加入500μl MES缓冲液(PH4.5)，重复2～3次，加入200μl MES缓冲液(PH4.5)，加入15μl 5’端氨基修饰的结核杆菌IS6110序列(IS6110-F：5’-Amino-TTTTTTTTTTTCTCTGGCGTTGAGCGTAGTA-3’，IS6110-R：5’-Amino-TTTTTTTTTTTATCGAGCAAGCCATCTGGAC-3’)引物混合物，最后加入15μl10mg/ml配制的EDC水溶液(现配现用)，超声若干秒分散体系，震荡孵育1小时。孵育结束后，离心弃上清后，加500μl MES缓冲液(PH4.5)分散，离心重复2～3次，加入500μlPBS重悬分散微球，离心，最后加入100μl PBS重悬分散微球。
参考PCR试剂盒，向200μl无酶EP管中加入PCR mix和结核杆菌DNA后，用常规PCR仪设置程序进行PCR扩增。PCR体系如图4所示。扩增结束后，对扩增后的微球加入1％100×SYBR GreenⅠ核酸染料进行染色。取5μl～10μl染色后的微球滴在载玻片上，盖上盖玻片用荧光显微镜进行观察计数，荧光图如图5所示。
实施例2一种用于新冠N蛋白RNA定量的微球固相PCR方法
取100μl直径为2μm的羧基聚苯乙烯微球(Macklin L815966-5ml)加到1.5ml无酶EP管中，进行漩涡振荡，超声分散若干秒(每次离心都需重复该步骤)，用离心机进行4℃，10000rpm，离心2min。(以下离心条件以此为准)
加入500μl MES缓冲液(PH4.5)，重复2～3次，加入200μl MES缓冲液(PH4.5)，加入15μl 5’端氨基修饰的新冠病毒N蛋白序列(N-F:5’-Amino-TTTTTTTTTTTGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’,N-R：5’-Amino-TTTTTTTTTTTCAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’)引物混合物，最后加入15μl10mg/ml配制的EDC水溶液(现配现用)，超声若干秒分散体系，震荡孵育1小时孵育结束后，离心弃上清后，加500μl MES缓冲液(PH4.5)分散，离心重复2～3次，加入500μl PBS重悬分散微球，离心，最后加入100μl PBS重悬分散微球。
参考RT-PCR试剂盒(Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNAdigester plus)翌圣生物)，向200μl无酶EP管中加入PCR mix、新冠N蛋白引物微球和新冠病毒RNA样本后，用常规PCR仪设置程序进行反转录和PCR扩增。反应结束后，对扩增后的微球加入1％100×SYBR GreenⅠ核酸染料进行染色。取5μl～10μl染色后的微球滴在载玻片上，盖上盖玻片用荧光显微镜进行观察计数，荧光图如图6所示，微球扩增20个循环后即可被检测到，因此靶核酸浓度为阳性微球数/20。
本发明提供一种羧基聚苯乙烯PCR/RT-PCR微球，包括聚苯乙烯微球、微球表面有高密度功能基团修饰，如羧基可以与带氨基的核酸引物偶联，每个微球表面共价偶联针对靶核酸的上游引物和下游引物。通过使用所述微球代替引物，用常规PCR/RT-PCR方法进行扩增，通过反复变性、复性、延伸的手段，将目标核酸在微球便面进行扩大复制，使微球表面固定的扩增产物达到能被检测的数量。使用核酸染料，如SYBR GreenⅠ、DAPI、荧光标记的dNTP、电化学(化学)信号分子标记的dNTP等，对PCR后的微球进行信号激发，通过计数的方式实现核酸分子的绝对定量。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.基于微球固相PCR技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、制备引物微球复合物：根据靶序列设计引物，在上游引物和下游引物的5’端均修饰功能基团Ⅰ；在微球表面修饰有与功能基团Ⅰ偶联的功能基团Ⅱ；通过偶联将引物连接在微球上，制备引物微球复合物；
步骤二、采用引物微球复合物代替引物，通过常规PCR/RT-PCR方法进行核酸扩增，将目标核酸在微球表面进行扩大复制，使微球表面固定的扩增产物达到被检测的数量；
步骤三、对扩增反应后微球上的扩增产物进行检测，通过计数的方式进行核酸分子的绝对定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述微球为聚合物或无机材料微球。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述微球的直径大小为0.1-30μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤二中，所述核酸扩增的体系中，微球浓度为102-105个/μl。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤三中，所述检测为基于核酸杂交的固相检测、基于荧光的微球计数法或电化学检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述检测是对微球上的扩增产物进行核酸染料染色、使用带荧光标记的dNTP渗入产物链中进行标记或使用带电化学/化学信号分子标记的dNTP渗入产物链中进行标记。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述偶联方式为羧基与氨基偶联、巯基与氨基偶联。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述功能基团Ⅰ为氨基，所述功能基团Ⅱ为羧基，两者进行共价偶联。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述靶序列为结核杆菌IS6110的DNA序列，上游引物是在SEQ ID NO：1所示序列的5’端修饰氨基，下游引物是在SEQ IDNO：2所示序列的5’端修饰氨基。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤一中，所述靶序列为新冠病毒N蛋白的RNA序列，上游引物是在SEQ ID NO：3所示序列的5’端修饰氨基，下游引物是在SEQ IDNO：4所示序列的5’端修饰氨基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310245720.3A CN116426616A (zh) | 2023-03-15 | 2023-03-15 | 基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310245720.3A CN116426616A (zh) | 2023-03-15 | 2023-03-15 | 基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116426616A true CN116426616A (zh) | 2023-07-14 |
Family
ID=87078727
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310245720.3A Pending CN116426616A (zh) | 2023-03-15 | 2023-03-15 | 基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116426616A (zh) |
-
2023
- 2023-03-15 CN CN202310245720.3A patent/CN116426616A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106434871B (zh) | 用于检测目标核酸的方法与组合物 | |
| US6201112B1 (en) | Method for 3′ end-labeling ribonucleic acids | |
| EP2107117B1 (en) | Methods for quantitative cDNA analysis in single-cell | |
| JPH11514850A (ja) | 特異的捕捉および検出が可能なヌクレオチドプローブを用いた核酸検出法 | |
| CN111855990B (zh) | 一种基于CRISPR/Cas系统的通用比色核酸检测方法及试剂盒与应用 | |
| Wang et al. | Recent advances in the rapid detection of microRNA with lateral flow assays | |
| CN112280829B (zh) | 一种试剂盒、样本标记方法、单细胞测序方法 | |
| CN105525010A (zh) | 一种茎环结构组合探针及其应用 | |
| CN108220400A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定量法 | |
| CN113755558A (zh) | 一种基于液态芯片技术的核酸检测方法 | |
| EP2256217A1 (en) | Magnetic particles for nucleic acid sequencing and method of sequencing nucleic acid using the same | |
| JP3789317B2 (ja) | 特定の核酸を検出定量するための等長プライマー伸長法およびキット | |
| CN112813142B (zh) | 一种MicroRNA捕获磁珠、制备方法及MicroRNA的检测方法 | |
| US6620586B2 (en) | Methods and compositions for analyzing nucleic acids | |
| CN116426616A (zh) | 基于微球固相pcr技术实现核酸绝对定量的核酸扩增方法 | |
| CN116445594A (zh) | 适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用 | |
| CN113026112A (zh) | 用于构建人单细胞bcr测序文库的试剂盒及其应用 | |
| CN113026111A (zh) | 用于构建人单细胞tcr测序文库的试剂盒及其应用 | |
| CN114317684B (zh) | 一种基于tna分子的细胞内镁离子成像的方法 | |
| CN110938675B (zh) | siRNA定向自组装量子点生物传感器及其检测方法和应用 | |
| CN113943776A (zh) | 一种基于个人血糖仪读数的核酸即时检测方法及其试剂盒 | |
| CN111154836A (zh) | 靶向核酸捕获和检测方法 | |
| US20050064481A1 (en) | Method for reducing background contamination | |
| JP4580104B2 (ja) | リポータ遺伝子及びそのｉｎｖｉｔｒｏでの発現に必要な配列による標的物質の標識づけを含む、標本中の標的物質のｉｎｖｉｔｒｏ検出方法 | |
| EP4174189A1 (en) | Enzyme directed biomolecule labeling |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |