CN116406446A - Amh和/或抑制素b作为提高男性生育力的治疗效果的生物标志物 - Google Patents

Amh和/或抑制素b作为提高男性生育力的治疗效果的生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于例如血清或精浆的生物样本中AMH或抑制素B的水平来确定使用RANKL拮抗剂或抑制剂提高男性生育力治疗的可能效果的方法。

Description

AMH和/或抑制素B作为提高男性生育力的治疗效果的生物标 志物
技术领域
本发明涉及AMH和/或抑制素B作为提高男性受试者生育力治疗效果的生物标志物。
背景技术
精液质量下降是男性不育的主要因素。精液质量是精液完成受精的能力的衡量指标。如今，男性生育潜力的评估是通过精液分析来确定的。精液分析评估男性精液和精液中所含精子的某些特征。目前精液分析测试所测得的特征只是精液质量的一些临床重要因素。评估精子质量最常用的变量是：精子数量、活力和形态。其他变量为体积、DNA碎片指数、果糖水平和pH值。
WO 2011/137906公开了一种用于预测雄性哺乳动物生育潜力的方法。特别地，所述发明涉及一种通过确定精液样本中维生素D代谢机制的至少一种蛋白质的表达来预测雄性哺乳动物的生育潜力的方法。
EP3244911 B1公开了一种用于确定提高男性生育力的治疗的可能效果的方法，所述方法包括确定血清样本中OPG的水平。
WO 2015/018421公开了用于治疗男性不育的RANKL靶向抗体。
特别地，进行一项测试，预测男性受试者是否会受益于提高男性生育能力的治疗，将大有裨益。因此，开发一种可以指导医生选择的标志物将有明显的好处。
发明内容
本发明涉及作为强生物标志物的AMH和/或抑制素B的鉴定，以预测男性受试者是否会受益于提高男性生育能力的治疗，特别是与使用RANKL的拮抗剂或抑制剂相关的治疗(参见例如实施例1和图2+5)。当包括其他生物标志物或生物标志物比值时，预测值可以进一步增加。
因此，本发明的一个目的涉及提供改进的生物标志物，可帮助确定男性受试者是否将受益于提高男性生育力的治疗。
因此，本发明的一个方面涉及用于确定提高男性生育力的治疗的可能效果的方法，所述方法包括：
·确定来自男性受试者的生物样本中AMH和/或抑制素B的水平；
·将所述确定的AMH水平与相应的基准水平进行比较；并
·确定所述受试者将
o从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述水平等于或高于所述相应的基准水平；或
o不能从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述水平低于所述相应的基准水平。
本发明的另一方面涉及AMH和/或抑制素B作为生物标志物用于确定提高男性生育力的治疗的可能效果的用途。
本发明的另一方面是提供一种包括RANKL的拮抗剂或抑制剂的组合物，用于治疗受试者的男性不育症，其中所述受试者的AMH水平为：
·血清中AMH高于30pmol/l，例如AMH至少35pmol/l或例如AMH至少40pmol/l；和/或
·精浆中AMH高于5pmol/l。
附图说明
图1显示了所进行的临床研究(RCT)方案的概况。
图2显示了血清AMH水平是RANKL抑制对男性生育力影响的预测标志物。A)Delta总精子数量，B)Delta进行性活动精子(prog.motile sperm)。C)Delta活动精子(motilesperm)。
图3显示了自然受孕。与安慰剂相比，用地舒单抗治疗诱导少精子症男性明显更多的自然受孕。
图4显示了血清AMH>30的男性引发的怀孕情况。在血清AMH>30pmol/l的男性中，用地舒单抗治疗诱导明显更多的自然受孕。
图5显示了基于AMH血浆水平的亚组分析：A)精子浓度。B)活动精子总数。用地舒单抗治疗最高血清AMH(三分之一)，精子浓度较高的男性，有83％的男性产生了有益的反应。
图6显示了基于血清AMH>35+血清RANKL前50％的亚组分析。A)精子浓度，B)精子总数，C)活动精子总数，D)进行性精子活动性，E)形态正常的精子。与安慰剂相比，对血清AMH>35pmol/l和血清RANKL50％高的男性进行地舒单抗治疗可显著提高精子浓度和活动精子总数，有效率为90至100％。
图7显示了基于OPG/sRANKL比值的亚组分析。如果你希望在80天内精子产生量增加100至600％，那么由精浆中低OPG/RANKL比值，反过来讲，高RANKL/OPG比值定义的高RANKL活性是有益的。
图8显示了基于RANKL(精浆中低OPG/RANKL比值)和AMH的亚组分析。A)精子浓度，B)精子总数，C)进行性精子活动性，D)活动精子总数，E)形态正常的精子。由精浆中低OPG/RANKL比值，反过来讲，高RANKL/OPG比值定义的高AMH和高RANKL活性的男性在80天内精子产量显著增加。
图9显示了AMH/抑制素B比值上限和最高的血清RANKL/OPG比值50％。
图10显示了注射地舒单抗(60mg)后不育男性精液质量随时间的变化，在开始治疗前，用抑制素B对所述不育男性进行分级，并通过第80天活动精子总数/进行性活动精子总数的百分比变化评估治疗反应。基线以治疗开始前提供的两份精液样本的平均值计算。
图11显示了注射地舒单抗(60mg)后不育男性精子浓度随时间的变化，在开始治疗前，用血清中A)RANKL；B)睾酮；C)磷酸盐；D)AMH；E)AMH/睾酮比值；和F)AMB/抑制素B的比值水平对所述不育男性进行分级。
图12显示了注射地舒单抗(60mg)后不育男性精子浓度随时间的变化，在开始治疗前，用精液中A)AMH(R2线性＝0.004；Y＝-0.16-4.22E-3*x)；B)抑制素B；和C)OPG：RANKL比值和D)OPG水平对所述不育男性进行分级。
现在将在下文中更详细地描述本发明。
具体实施方式
定义
在进一步详细讨论本发明之前，将首先定义以下术语和约定：
少精子症
在本文中，所述术语“少精子症(oligospermia)”或“少精子症(oligozoospermia)”或“精子数量低”是指精液中精子浓度低，其是男性不育的常见现象。通常，精子浓度降低的精液也可能表现出精子形态和活力的显著异常(专业上是少弱畸精子症)。人们关注用更多的定量信息取代精液分析中使用的描述性术语。
抗缪勒管激素(AMH)
抗缪勒管激素(AMH)，也称为苗勒氏管抑制激素(MIH)，是一种糖蛋白激素，结构上与转化生长因子β超家族的抑制素和激活素相关。
RANKL
核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)，也称为肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)、肿瘤坏死因子相关激活诱导细胞因子(TRANCE)、骨保护素配体(OPGL)和破骨细胞分化因子(ODF)，是人体中由TNFSF11基因编码的蛋白质。
RANKL被称为II型膜蛋白，是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员。RANKL已被鉴定为影响免疫系统并控制骨再生和重塑。RANKL是凋亡调节基因，是骨保护素(OPG)的结合伴侣，是RANK受体的配体，通过改变Id4、Id2和cyclin D1的蛋白水平来控制细胞增殖。
RANKL在多种组织和器官中表达，包括骨骼肌、胸腺、肝脏、结肠、小肠、肾上腺、成骨细胞、乳腺上皮细胞、前列腺和胰腺。几个器官中RANKL浓度水平的变化再次确认了RANKL在组织生长(尤其是骨骼生长)和体内免疫功能中的重要性。
对人类睾丸和维生素D受体(VDR)敲除小鼠的研究表明，几种骨因子如Runx2、osterix和骨钙素在正常睾丸和睾丸癌中表达。其中一个因子是NF-κB配体(RANKL)的受体激活剂。RANKL系统是骨吸收的强大调节器，包括三个组分：RANKL，跨膜配体，与邻近细胞上的受体RANK结合后，随后激活NF-κB并调节细胞周期，即增殖、分化和凋亡。跨膜RANKL蛋白存在于骨细胞中并激活未成熟破骨细胞中的RANK，从而诱导破骨细胞生成并促进骨吸收。骨保护素(OPG)是内源性分泌的诱饵受体，所述诱饵受体与RANKL结合并阻断其信号传导，从而阻止破骨细胞分化和活化。RANKL还被发现于循环中，表明所述蛋白质具有假定的内分泌功能。事实上，最近已经提出了RANKL的新的骨骼外功能，包括调节血糖稳态。
在人类曲细精小管中，发现了RANKL、RANK和OPG的显著的转录表达。RANKL的三种亚型均在人类睾丸中表达，跨膜和可溶形式的RANKL均以中高水平表达。通过使用靶向跨膜或细胞外结构域的抗体，分别在成年支持细胞和男性生殖细胞中发现RANKL的表达。RANKL的表达水平在样本中有所不同，但在大多数支持细胞、精母细胞和精子细胞中都可以检测到。
在本文中，所述术语“可溶型RANKL”或“sRANKL”是指RANKL的游离部分。sRANKL不与OPG结合。
RANK
核因子κB受体活化因子(RANK)，也称为TRANCE受体或TNFRSF11A，是肿瘤坏死因子受体(TNFR)分子亚家族的成员。RANK是RANK配体(RANKL)的受体，也是调节破骨细胞分化和活化的RANK/RANKL/OPG信号通路的一部分。它与骨重塑和修复、免疫细胞功能、淋巴结发育、热调节和乳腺发育有关。骨保护素(OPG)是RANK的诱饵受体，通过竞争RANKL来调节RANK信号通路的刺激。RANK的胞浆区与TRAF1、2、3、5和6结合，将信号传递到下游靶点，如NF-κB和JNK。
在小鼠中，在16-18周龄时在睾丸中在转录和蛋白质水平检测到RANKL、RANK和OPG。RANKL在成熟支持细胞的细胞质/膜以及精母细胞和精子细胞中表达。RANK仅在生殖细胞的细胞质中表达，在精原细胞中表达最多。OPG在管周细胞的细胞质、支持细胞和精原细胞之间的连接处以及精子细胞中表达。
OPG
骨保护素(OPG)，也称为破骨细胞生成抑制因子(OCIF)或肿瘤坏死因子受体超家族成员11B(TNFRSF11B)，是由TNFRSF11B基因编码的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的细胞因子受体。
在人体内，RANK仅在生殖细胞的细胞质/膜中表达，在精原细胞中表达最多，而OPG主要在管周细胞的细胞质中或精原细胞的边缘和精子细胞中表达。RANKL的可溶性同种异构体(sRANKL，在27-31kDa处观察到)的表达水平高于跨膜同种异构体(45kDa)。两种形式的RANKL与RANK和OPG一起在精子生成正常的样本中强烈表达。
生育力/生育潜力
在本文中，如果人的精子数量高(超过4000万)，活动精子50％以上和形态正常精子12％以上，则此人被视为具有正常的生育潜力。
在本文中，如果人的精子数量低(低于4000万)，活动精子低于50％或形态正常精子低于12％，则此人被认为不具有正常的生育潜力。
当男性被认为有正常生育力时，本领域技术人员知道如何进行这种分析，并设定不同的临界值。
这不是对男性生育潜力的准确估计，且精液分析的结果并不总是与生育能力相关。世界卫生组织最近改变了参考水平的事实，也说明了这一点(因为很大比例的男性群体将被视为生育潜力低于正常水平)。目前还没有预测男性生育潜力的精确方法。
在丹麦，超过9％的婴儿是通过辅助生殖方法出生的，并且全球范围内不育的发生率正在增加。约50％的情况归因于男性伴侣，临床评估的第一步涉及精液分析，以评估男性生育潜力。临床医生通过分析来决定合适的生殖方法。
据估计，全世界每年进行约1.400000次精液分析。
精液分析目前是繁琐冗长的过程。精液分析是通过标准显微镜进行的，基于对三个关键参数的主观分析：活力、形态和精子总数。这种分析有几个缺点，因为它需要训练有素的医护人员、患者的新鲜精液样本(1小时内)、实验室设施等，使其成为一个昂贵且耗时的程序。从逻辑上讲，所述分析要求患者在进行测试的实验室提供精液样本，这对于许多患者来说被认为相当尴尬。此外，由于对关键参数的主观评估，使用当前方法进行的精液分析很容易出现观察者内部和观察者之间的差异，这会严重影响分析的实用性，因此临床医生在指导夫妇使用相关的辅助生殖方法方面遇到困难。
由于当前使用的方法存在上述问题，因此很需要新的精液分析方法，所述方法能够准确客观地评估男性的生育潜力，以便将患者分级采用正确的生殖方法。世界卫生组织2010年的最新建议说明了现有分析存在的问题，其中正常精液分析的参考值发生了变化，并在全球生育与男科学会会议上引发了巨大的争议。
男性受试者
提及“男性受试者”或“受试者“或“个体”包括人类或非人类哺乳动物物种，包括灵长类动物、家畜动物(例如绵羊、奶牛、猪、马、驴、山羊)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、仓鼠)和伴侣动物(例如狗、猫)。因此，本发明在人类医学中以及用于家畜、兽医和野生动物时具有适用性。在优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。在特别优选的实施方案中，所述哺乳动物是男性人类。
精液样本
精液是排出的液体和细胞的混合物。这种液体也称为精浆,其通常含有精子。它由雄性或雌雄同体动物的生殖腺(性腺)和其他性器官分泌，并且可能使雌性卵子受精。在人类的精液中，除了精子外，还可能含有几种成分：蛋白水解酶和其他酶以及果糖是精浆中的元素，它们促进精子的存活，并提供一种介质，通过其使精子成熟并获得移动或“游泳”的能力。使得精液排出的过程称为射精。
在优选的实施方案中，所述精液样本应理解为包括精液和/或源自精液的成分的样本。
在优选的实施方案中，所述精液样本是包括精子的样本。在临床上，很少有受试者的精液样本中包括极少数精子或甚至不含精子，此类受试者样本仍然值得关注，因为此类样本确实是一种表现低生育潜力的样本，因此被包括在所述样本库的当前定义中。
所述精液样本可在射精后，从睾丸、附睾抽吸后，或睾丸活检或睾丸显微解剖后获得。
在最优选的实施方案中，所述精液样本是在射精后获得的。
在特别优选的实施方案中，所述精液样本是包括精子和/或源自精液的成分的样本。
从人类或动物(例如农场动物)收集精液样本的程序在文献中有详细描述，并且对于本领域技术人员来说是公知的。
在本发明的另一个实施方案中，在测量表达水平之前，最少的样本处理步骤是必需的。
在本文中，主题“处理步骤”涉及在确定维生素D代谢机制的至少一种蛋白质的表达水平之前对精液样本的任何类型的预处理。预处理程序包括洗涤、裂解、免疫捕获、细胞离心涂片(cytospin)、固定、分离、离心、过滤、稀释、蒸馏、浓缩、干扰化合物的灭活、离心、加热、固定、添加试剂或化学处理。
在优选的实施方案中，所述精液样本是射精液。
在实施方案中，所述射精液可以定向射精到含有化合物的容器中，所述化合物可以使射精液被分解、固定或以其他方式改变。
在实施方案中，可以通过使用例如Percoll梯度离心法的梯度离心来使样本高度浓缩。在另一个优选的实施方案中，可以通过无梯度离心将样本高度浓缩。
在优选的实施方案中，所述预处理程序包括将所述精子样本与磷酸盐缓冲液混合,随后样本离心沉淀。
在特别优选的实施方案中，在确定生物标志物的表达水平之前，对新鲜提供的精液样本进行离心并收集细胞沉积物。所述细胞沉积物可以使用合适的固定剂固定，例如但不限于乙醇或甲醛。
精子可以通过密度梯度离心或不涉及离心的“定向向上游动”技术“洗涤”。
在另一个实施方案中，将所述精子与精液分离,然后确定维生素代谢机制的至少一种蛋白质的表达水平。
在特别优选的实施方案中，不需要对样本进行预处理。在另一个特别优选的实施方案中，所述样本是未改变的原始精液样本。所述未改变的原始精液样本可能是新鲜的。如上所述，由于本发明所述的方法适合家庭使用，因此优选的不需要预处理。
本发明的一个方面涉及一种方法，其中所述精液样本可在储存几天后确定表达水平。在优选的实施方案中，样本的预处理(例如但不限于样本的细胞离心涂片)延长了样本可被储存的时间。
在优选实施方案中，所述样本可储存至少一天，例如至少7天，例如至少30天。在另一个优选的实施方案中，在检测表达水平之前，所述样本可以储存几年，例如至少1年，例如至少2年，例如至少5年，例如至少10年。
在一个实施方案中，促进储存的化学品被添加到所述精液样本中。
因此，本发明的一个实施方案使得所述男性个体能够在其自己家私密制备精液样本，并随后将样本送至实验室用于确定生育潜力。
表达水平
本文所用的“表达水平”或“水平”是指给定样本中蛋白质的绝对或相对量。因此，所述表达水平是指样本中蛋白质的量。通常使用常规检测方法检测所述表达水平。
在另一个优选的实施方案中，所述表达水平是指精液样本中所述蛋白质的总蛋白质水平。
本发明的抗体包括多克隆、单特异性多克隆、单克隆、重组、嵌合、人源化、全人源化、单链和/或双特异性抗体。抗体片段包括与RANKL多肽上的表位结合的抗RANKL抗体部分。此类片段的示例包括Fab F(ab′)、F(ab)′、Fv和sFv片段。所述抗体可通过酶切全长抗体或通过重组DNA技术产生，例如表达含有编码抗体可变区的核酸序列的重组质粒。
多克隆抗体是源自用抗原免疫的动物血清的抗体分子的异质群体。抗原是能够与抗体结合的分子或分子的一部分，其能够另外地诱导动物产生能够与该抗原的表位结合的抗体。抗原可以具有一个或多个表位。上面提到的特异性反应意味着抗原将以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不是与可由其他抗原诱发的多种其他抗体反应。
针对RANKL多肽的多克隆抗体通常通过多次皮下或腹腔注射RANKL和佐剂在动物(例如兔子或小鼠)中产生。
单克隆抗体(mAb)包括抗原特异性抗体的基本均一群体，该群体包括基本相似的表位结合位点。这种抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何亚类。制备本发明单克隆抗体的杂交瘤可以在体外、原位或体内培养。体内或原位高滴度制备是优选的制备方法。
针对OPGbp/RANKL的单克隆抗体可使用任何方法制备，该方法可通过培养中的连续细胞系产生抗体分子。制备单克隆抗体的合适方法的示例包括Kohler等人的杂交瘤方法，Nature 256,495-497(1975)和人B细胞杂交瘤方法(the human B-cell hybridomamethod)，Kozbor,J.Immunol.133,3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques andApplications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1987)；以及Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory(1988)；其内容通过引用全部并入本文。
制备定向于OPGbp/RANKL的单克隆抗体的特别优选的方法包括如Green，LL,J.Immunol.Methods(1999),Vol.231,11-25所述的用OPGbp/RANKL肽，例如全长人RANKL蛋白免疫XenoMouse的方法。
优选的抗RANKL或抗RANK抗体包括单克隆抗体，其将部分或完全抑制人RANKL与其同源受体RANK，或具有基本相同的特异性结合特性的抗体，以及其片段和区域结合。通过竞争抑制确定单克隆抗体特异性和亲和力的优选的方法参见Harlow等人，Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)；Colligan等人，eds.,Current Protocols in Immunology,GreenePublishing Assoc and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)和Muller，Meth.Enzymol.,92:589-601(1983)。
嵌合抗体是其不同部分源自不同动物品种的分子，例如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。
本文使用的术语“嵌合抗体”包括单价、二价或多价免疫球蛋白。单价嵌合抗体是由嵌合H链与嵌合L链通过二硫键连接而形成的二聚体(HL)。二价嵌合抗体是由通过至少一个二硫键连接的两个HL二聚体形成的四聚体(H2L2)。多价嵌合抗体也可以例如通过使用聚集的CH区(例如，来自IgM H链或[micro]链)制备。
本发明的小鼠和嵌合抗体、片段和区域可包括单独的重(H)和/或轻(L)免疫球蛋白链。嵌合H链包括源自RANKL特异性非人抗体的H链的抗原结合区，其与人H链C区(CR)的至少一部分(例如CH1或CH2)连接。
根据本发明的嵌合L链包括源自RANKL特异性非人抗体的L链的抗原结合区，其与人L链C区(CL)的至少一部分连接。
也可以根据已知的方法步骤，通过单个多肽链的适当连接制备具有相同或不同可变区结合特异性的嵌合H链和L链的选择性结合剂，例如抗体、片段或衍生物，例如根据Ausubel等人，eds.Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,N.Y.(1993)和Harlow等人，Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。这些参考文献的内容通过引用全部并入本文。通过这种方法，表达嵌合H链(或其衍生物)的宿主与表达嵌合L链(或其衍生物)的寄主分别培养，免疫球蛋白链被分别回收，然后连接。可选地，可以共培养宿主，并允许所述链在培养基中自发结合，然后回收组装的免疫球蛋白、片段或衍生物。
基准水平
在本发明的上下文中，术语“基准水平”涉及与数量相关的标准，其他值或特征可以与之进行比较。
在本发明的一个实施方案中，可以通过调查来自健康受试者(在本文中为可育男性受试者)的样本中的精浆RANKL水平来确定基准水平。通过应用不同的统计手段，例如多元分析，可以计算一个或多个基准水平。
根据这些结果，可以得出显示检测到的水平与有风险患者之间的关系的临界值。因此，所述临界值可用于例如确定精液RANKL水平，其对应于例如不育风险的增加。
风险评估
本发明人成功地开发了预测男性受试者不育风险的新方法。为了确定患者不育风险是否增加，必须确定临界值(基准水平)。所述临界值可由实验室、医生或根据每个患者的具体情况确定。
可使用多种方法确定临界值水平，包括：多元统计检验(如偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、随机森林、支持向量机等)、百分位数、平均值±标准差；中值；倍数变化。
多元判别分析和其他风险评估可以在免费或市售的所述多元判别分析(SAS、SPSS、Matlab、R等)或本领域技术人员已知的其他统计软件包或筛选软件上进行。
如本领域技术人员显而易见的，在上述任何实施方案中，改变风险临界值水平可以改变每个受试者的判别分析结果。
统计数据可以评估每个水平的重要性。应用于数据集的常用统计检验包括t检验、f检验，甚至更先进的检验和比较数据的方法。使用这种测试或方法能够确定两个或多个样本是否显著不同。
显著性可以通过本领域技术人员已知的标准统计方法来确定。
所选择的基准水平可能会根据用于测试的哺乳动物/受试者而改变。
优选地，根据本发明的受试者是人类受试者，例如被认为有不育风险的男性受试者。
如果期望给出与本领域已知不同的特异性或灵敏度，可以改变所选的基准水平。灵敏度和特异性是广泛使用的统计数据，用于描述和量化生物标志物或诊断测试的良好和可靠程度。灵敏度评估生物标志物或诊断测试在检测疾病方面的良好程度，而特异性评估个体(即对照、无疾病患者)被正确识别为无风险的可能性。在描述灵敏度和特异性时使用了几个术语：真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阴性(FN)和假阳性(FP)。如果疾病被证明存在于患病患者中，诊断测试的结果被认为是TP。如果个体(即对照组、无疾病患者)中未患有疾病，并且诊断测试确认无疾病，则测试结果为TN。如果诊断测试表明无疾病患者中患有疾病，则检测结果为FP。最后，如果诊断测试表明在患病患者中未患有疾病，则测试结果为FN。
灵敏度
如本文所用，灵敏度指的是被正确鉴定为阳性的实际阳性比例的度量。
通常，测试的灵敏度可以被描述为患有目标疾病，即生育潜力低于正常值的总数中真阳性的比例。所有患有目标疾病的患者是(检测到的)真阳性(TP)和(未检测到)假阴性(FN)的总和。
特异性
如本文所用，特异性是指被正确鉴定为阴性的比例的度量。理想的诊断测试是具有100％特异性且无假阳性结果的测试。100％灵敏度，即检测出所有低于正常水平的哺乳动物，因而无假阴性结果。
对于任何测试，每个度量之间通常都会进行权衡。例如，在一个正在进行故障测试的制造环境中，人们可能愿意冒险丢弃功能部件(低特异性)，以增加识别几乎所有故障部件的机会(高灵敏度)。这种权衡可以使用ROC曲线图形化表示。
选择灵敏度和特异性可以在检测方法中获得最佳结果。在确定区分具有低于正常生育潜力的哺乳动物的鉴别值时，本领域技术人员必须预先确定特异性水平。理想的诊断测试是具有100％特异性的测试，即仅检测生育潜力低于正常值的哺乳动物，因而没有假阳性结果。100％灵敏度，即检测出所有生育潜力低于正常值的哺乳动物，因而没有假阴性结果。然而，由于生物多样性，不能期望任何方法具有100％的灵敏度而不包括基本数量的假阴性结果。
通过给定机构，所选的特异性确定了给定研究/人群可接受的假阳性病例的百分比。通过降低特异性，实现了灵敏度的提高。一个示例是95％的特异性将导致5％的假阳性病例。在筛查人群中，给定的患病率为1％，例如生育潜力低于正常值，95％的特异性意味着，如果测试的灵敏度为100％，5名个体将接受进一步的检查，以检测出一名个体(1)的生育潜力低于正常值。
本领域技术人员将普遍理解，用于筛查生育潜力的方法是决策过程，因此所选择的特异性和灵敏度取决于给定机构/临床人员认为的最佳结果。
用于确定提高男性生育力的治疗的可能效果的方法
如上所述，本发明提供了新的生物标志物，其可被用于确定提高男性生育力的治疗的可能效果。因此，本发明的一个方面涉及用于确定提高男性生育力的治疗的可能效果的方法，所述方法包括：
·确定来自男性受试者的生物样本中AMH和/或抑制素B的水平；
·将所述确定的AMH和/或抑制素B水平与相应的基准水平进行比较；并
·确定所述受试者将
o从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述水平等于或高于所述相应的基准水平；或
o不能从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述水平低于所述相应的参考水平。
在优选的实施方案中，所述基准水平为：
·血清中AMH高于30pmol/l，例如AMH至少35pmol/l或例如AMH至少40pmol/l，或例如AMH至少50pmol/l；和/或
·精浆中AMH高于5pmol/l。
在另一个优选的实施方案中，至少确定AMH的水平。
在又一个实施方案中，至少确定抑制素B的水平。
从实施例1和图5中可以看出，当男性受试者血清中AMH水平例如高于30或高于40pmol/lAMH时，RANKL拮抗剂或抑制剂治疗的效果(与提高男性生育参数相关)比AMH水平低的男性受试者高很多。自然受孕(男性生育力的最终标志)也是如此，与安慰剂相比，血清AMH>30pmol/用RANKL抑制剂治疗的不育男性的自然受孕更高(图4)。
AMH水平可以通过不同的方法确定。因此，在实施方案中，所述AMH水平的确定使用的方法选自免疫组化、免疫细胞化学、FACS、ImageStream、免疫蛋白印迹、qPCR、RT-PCR、qRT-PCR、ELISA、Luminex、Multiplex、免疫印迹、TRF测定、免疫层析侧流试验、酶放大免疫测定技术、RAST试验、放射免疫试验、免疫荧光、LC-MS/MS和免疫干胶分析(immunologicaldry stick assay)，优选地为侧流试验。
在优选的实施方案中，所述确定通过免疫细胞化学进行。在另一个优选的实施方案中，所述确定通过ELISA、LC-MS/MS或侧流试验进行。
临床医生可以根据期望的特异性和灵敏度来选择不同的基准水平。因此在实施方案中：
·血清中AMH的所述基准水平在30至100pmol/l的范围内，例如在30至90pmol/l的范围内，例如在30至80pmol/l的范围内，例如在35至80pmol/l的范围内，例如在40至80pmol/l的范围内，或例如在50至80pmol/l的范围内；和/或
·精浆中AMH的所述基准水平在5-5000pmol/l的范围内，例如5-1000pmol/l、例如5-600pmol/lAMH、例如5-100pmol/l(数据未示出)。
存在不同类型的RANKL拮抗剂或抑制剂。因此，在另一个实施方案中，所述RANKL的拮抗剂或抑制剂是对RANKL具有结合亲和力的分子，例如其中RANKL结合部分与可溶型RANKL结合，例如与全长RANKL或截短型RANKL结合，例如与截短型RANKL的C端或N端结合，优选地与RANKL的C端结合。
在又一个实施方案中，所述RANKL的拮抗剂或抑制剂对RANKL具有结合亲和力，在与地舒单抗或OPG相同的表位处结合RANKL。
在另一个实施方案中，所述对RANKL具有结合亲和力的RANKL拮抗剂或抑制剂以类似于地舒单抗或OPG的结合亲和力与RANKL结合，或以高于地舒单抗或OPG的结合亲和力与RANKL结合。
在又一个实施方案中，所述RANKL的拮抗剂或抑制剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2分子、全人源化抗体、人源化抗体、嵌合抗体和单域抗体(sdAb)(纳米抗体)以及抑制RANKL功能的小分子。
在又一个实施方案中，所述RANKL抑制剂选自地舒单抗或其片段(能够与RANKL结合)、OPG或其片段(能够与RANKL结合)。在提供的示例数据中，RANKL抑制剂地舒单抗已被测试。地舒单抗先前已被证明在治疗男性不育方面有效(WO 2015/018421)。
在评估中包括其他生物标志物可以提高所述测试的预测值。因此，在一个实施方案中，所述方法进一步包括：
·测定来自男性受试者的生物样本中抑制素B、和/或RANKL、和/或OPG、和/或RANKL/OPG比值(或反比)、和/或AMH/抑制素B比值(或反比)、和/或AMH/睾酮比值(或反比)的水平；
·将所述确定的抑制素B、和/或RANKL、和/或OPG、和/或RANKL/OPG比值、AMH/抑制素B比值(或反比)、和/或AMH/睾酮比值(或反比)的水平与相应的基准水平进行比较；并
·确定所述受试者将
o从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述一个或多个水平等于或高于所述相应的基准水平；或
o不能从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述一个或多个水平低于所述相应的基准水平。
如实施例1所示，抑制素B和/或RANKL和/或OPG和/或RANKL/OPG比值(或反比)和/或AMH/抑制素B比值(或反比)都可以提高所述测试的预测值，尽管与单独使用的其他列示的生物标记物相比，单独使用AMH似乎具有更强的预测性。本领域技术人员知道如何将这种多变量分析引入到测试中。进一步的，EP3244911 B1公开了一种用于确定提高男性生育力治疗的可能效果的方法，所述方法包括确定血清样本中OPG的水平。
在相关实施方案中，在与确定AMH水平相同的样本或样本类型中确定所述另外一个或多个水平。
其他生物标志物的相关基准水平为：
·血清中抑制素B的所述基准水平为至少50IU/ml，例如至少100IU/ml或例如至少200IU/ml，或例如在100IU/ml至500IU/ml的范围内，或例如在500IU/ml至500IU/ml的范围内(图10显示了抑制素B的数据)；和/或
·精浆中抑制素B的所述基准水平为至少20IU/ml，例如至少100IU/ml或例如至少200IU/ml，或例如在20至500IU/ml的范围内，或例如在100至1000IU/ml的范围内；和/或(见图12)。
和/或
·血清中OPG的所述基准水平在2至5pmol/l的范围内，例如在3-5pmol/l的范围内，例如在3-4pmol/l的范围内(EP3244911 B1公开了OPG的数据)；和/或
·精浆中的OPG的所述基准水平为在0至220pmol/l的范围内，或例如在10至400pmol/l的范围内，或例如在10至700pmol/l的范围内(图12D)。
和/或
·血清中的可溶型RANKL(sRANKL)的所述基准水平在0.1至0.5pmol/l的范围内，例如在0.2-0.4pmol/l的范围内(见图11)；和/或
·精浆中的sRANKL的所述基准水平在5至50pmol/l的范围内，例如在10至40pmol/l的范围内。(图7显示了OPG/RANKL比例的数据)和/或
·血清中OPG/RANKL的所述基准水平为低于30，例如低于20，或例如低于15；和/或
·精浆中OPG/RANKL的所述基准水平为低于30，例如低于20，或例如低于15(见图12)。
在优选的实施方案中，RANKL水平是sRANKL的水平。在相关的实施方式中，所述精浆sRANKL的基准水平在1-76pmol/L的范围内，例如20-76pmol/L、40-76pmol/L、1-50pmol/L、1-30pmol/L或1-20pmol/L。
在另一个实施方案中，血清睾酮和/或血清磷酸盐的水平也可以包括在所述方法中。
因此，在更具体的实施方案中，所述方法进一步包括：
·确定来自男性受试者的生物样本中睾酮和/或磷酸盐的水平；
·将所述确定的睾酮和/或磷酸盐的水平与相应的基准水平进行比较；并
·确定所述受试者将
o从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述一个或多个水平等于或高于所述相应的基准水平；或
o不能从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述一个或多个水平低于所述相应的基准水平。
在另一个实施方案中，血清睾酮的基准水平为＞10nmol/l，例如在10-40nmol/l的范围内。因此，在一个实施方案中，血清睾酮>10nmol/l可以选择出能从治疗中受益的男性，例如在10-40nmol/l的范围内(见图11)。因此，AMH和睾酮的组合可以是从使用RANKL拮抗剂或抑制剂的治疗中受益的强有力的预测组合。
在又一个实施方案中，血清磷酸盐的基准水平为＞0.6mmol/l，例如在0.6-1.0mmol/l的范围内。因此，在一个实施方案中，血清磷酸盐>0.6mmol/l可以选择出能从治疗中受益的男性，例如在0.6-1.0mmol/l的范围内(见图11)。因此，AMH和磷酸盐的组合可以是从使用RANKL拮抗剂或抑制剂治疗中受益的强有力的预测组合。
当然，应当理解的是，AMH可以与本文所示的其他预测标记物组合。
当然，还应当理解，抑制素B可以与本文所示的其他预测标记物组合。
不同的样本类型可在使用前进行处理。因此，在一个实施方案中，精液样本是未改变、稀释、洗涤或纯化的精液样本，优选地为未改变的精液样本。
男性不育可能有不同的原因。因此，在优选的实施方案中，所述受试者患有少精子症。
在根据本发明的评估后认为受试者可接受治疗的情况下，可以开始治疗。因此，在一个实施方案中，如果所述AMH水平等于或高于所述基准水平，则所述方法还包括向需要治疗的所述受试者施用RANKL拮抗剂或抑制剂。
用途
在另一个方面，本发明涉及AMH和/或抑制素B作为生物标记物用于确定提高男性生育力治疗的可能效果的用途。
在一个实施方案中，所述治疗通过使用RANKL的拮抗剂或抑制剂进行。
在又一个实施方案中，血清中AMH的水平高于30pmol/l，表明用RANKL拮抗剂或抑制剂治疗可能对男性不育产生积极效果。
在另一个实施方案中，血清中抑制素B的水平至少为50IU/ml，例如至少为100IU/ml或例如为至少200IU/ml，或例如在100至500IU/ml范围内，或例如在50至500IU/ml范围内，表明用RANKL拮抗剂或抑制剂治疗可能对男性不育产生积极效果(图10示出了抑制素B的数据)；
和/或
精浆中的抑制素B水平为至少20IU/ml，例如至少为100IU/ml或例如至少为200IU/ml，或例如为在20至1000IU/ml的范围内，或例如为在100至5000IU/ml的范围内，表明用RANKL拮抗剂或抑制剂治疗可能对男性不育产生积极效果(图12示出了抑制素B的数据)。
当然，应当理解的是，AMH和/或抑制素B可以与本文中提到的其他预测标记物组合。因此，本发明的其他方面的实施方案可以与该方面相结合。
不育男性亚组的治疗
在本发明中，如上所述和在实施例部分所述，鉴定了对使用RANKL拮抗剂或抑制剂作为药物的不育治疗更敏感的特定的不育男性亚组。
因此，本发明的另一方面涉及包括于治疗受试者的男性不育的RANKL拮抗剂或抑制剂的组合物，其中所述受试者具有：
·血清中AMH高于30pmol/l，例如为至少35pmol/l的AMH或例如为至少40pmol/l的AMH；和/或
·精浆中AMH高于5pmol/l；
和/或
·血清中的抑制素B的水平为至少50IU/ml，例如至少100IU/ml或例如至少200IU/ml，或例如在100-500IU/ml的范围内，或例如在50-500
IU/ml的范围内；和/或
·精浆中的抑制素B的水平为至少20IU/ml，例如至少100IU/ml或例如至少200IU/ml，或例如在20至1000IU/ml的范围内，或例如在100至5000IU/ml的范围内。
如上所述，存在不同类型的RANKL拮抗剂或抑制剂。因此，在另一个实施方案中，所述RANKL的拮抗剂或抑制剂是对RANKL具有结合亲和力的分子，例如其中RANKL结合部分与可溶型RANKL结合，例如与全长RANKL或截短型RANKL结合，例如与截短型RANKL C端或N端结合，优选地与RANKL C端结合。
在又一个实施方案中，所述RANKL的拮抗剂或抑制剂对RANKL具有结合亲和力，在与地舒单抗或OPG在RANKL的相同的表位处结合。
在又一个实施方案中，所述对RANKL具有结合亲和力的RANKL拮抗剂或抑制剂以类似于或以高于地舒单抗或OPG的结合亲和力与RANKL结合。
在又一个实施方案中，所述RANKL的拮抗剂或抑制剂是与RANKL结合的地舒单抗或OPG或其活性片段或变体。在一个实施方案中，所述RANKL的拮抗剂或抑制剂是生物类似物。
在本文中，生物类似物被理解为在结合功能上与地舒单抗高度相似的产品。优选地，所述生物类似物是RANKL结合分子(例如蛋白质)，其以类似于地舒单抗的方式与RANKL结合。示例为与地舒单抗一样，针对RANKL上相同的表位的开发的纳米抗体。
在又一个实施方案中，所述RANKL的拮抗剂或抑制剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2分子、全人源化抗体、人源化抗体、嵌合抗体和单域抗体(sdAb)(纳米抗体)或抑制RANKL的小分子。
当然，应当理解的是，AMH和/或抑制素B可以与本文中提到的其他预测标记物组合，以确定将包括RANKL拮抗剂或抑制剂的组合物用于治疗受试者的男性不育有益的受试者亚组。因此，本发明的其他方面的实施方案可以与该方面相结合。
进一步的方面
在另一个方面，本发明涉及治疗有需要的受试者中男性不育的方法，所述方法包括向所述受试者施用RANKL拮抗剂或抑制剂，如果所述受试者的AMH水平为：
·血清中高于30pmol/l，例如至少35pmol/l的AMH或例如至少40pmol/l的AMH；和/或
·精浆中高于5pmol/l。
和/或
·血清中至少50IU/ml的抑制素B，例如至少100IU/ml的抑制素B或例如至少200IU/ml的抑制素B，或例如在50至500IU/ml的范围内的抑制素B，或例如在200至500IU/ml的抑制素B；和/或
·精浆中至少20IU/ml的抑制素B，例如至少100IU/ml的抑制素B或例如至少200IU/ml的抑制素B，或例如在20至500IU/ml的范围内的抑制素B，或例如在20至10000IU/ml的抑制素B。
当然，应当理解的是，来自本发明的另一方面的基准水平也可以在本方面中使用。
应当注意，在本发明的一个方面的上下文中描述的实施方案和特征也适用于本发明的其他方面。
本申请中引用的所有专利和非专利参考文献通过引用全部并入本文。
现在将在以下非限制性实施例中进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1——地舒单抗与男性不育：一项随机对照双盲干预研究
研究目的
为了确定全身RANKL抑制对男性生殖的意义，对不育男性进行了一项临床随机对照双盲干预研究，调查地舒单抗(Prolia)是否能提高精液质量，并调查哪些不育男性亚组可能从治疗中受益。
材料和方法
设计：
单中心前瞻性随机双盲*临床对照干预。
患者和方法：
95名在其他方面健康的不孕男性，被招募到Rigshopitalet医院，生长与生殖科门诊接受不育调查。无论其选择参加还是拒绝，都不会影响进一步的门诊治疗。
95名参与者被随机分配接收
皮下注射地舒单抗60mg×1，或
皮下注射安慰剂，氯化钠×1
所有参与者在干预前后提供精液样本、血液样本并进行DXA扫描。所有人都接受维生素D和钙的补充，以避免低钙血症，这是地舒单抗已知的一过性副作用。
*双盲研究要求安慰剂和活性物质是相同的。安慰剂只能从安进(Amgen)获得，我们无法获得或购买安慰剂。相反，这项研究对患者、医生和所有参与数据处理和分析的人都是双盲的——只有一名提供药物的护士是非盲的。她知道自己注射活性物质还是安慰剂。
研究设计概述如图1所示。
入选标准：
因不育而需要进一步检查的18岁以上男性，其：
精子浓度≥0.05mio./ml
精子浓度<15mio./ml或
活动精子(ABC)<40％或
形态正常精子(严格标准)＜4％。
排除标准：
患有慢性疾病(糖尿病、甲状腺疾病、需要治疗的内分泌疾病、恶性疾病或已知受维生素D补充剂影响或干扰的疾病(肉芽肿性疾病，如结节病、肺结核、韦格纳病、血管炎以及炎症性肠病，如chron's疾病或溃疡性结肠炎等)的男性。
患有活动性或既往恶性疾病的男性，
任何有睾丸活检指征的病例，
总钙<2.14mmol/l
25-OH维生素D<25nmol/L
牙齿状况不佳或种植牙
患有阻塞性少精子症或已施行输精管结扎术的男性
血清抑制素B<30pg/ml
异常核型
过度运动的患者
样本量计算和统计：
在5％的测试水平(显著性水平)下，每组80％，即40名男性中75％能够检测到活动精子总数的变化，以及25％能检测到精子浓度的变化(与基线值相关)。
考虑到中途退出的可能性，我们预计总共包括95名男性。这相当于10％的退出率，如果退出率较低，发现显著差异的机会将超过80％。
亚组分析在本研究中至关重要，因为我们预计约60％的男性将受益于地舒单抗治疗。因此，分为亚组后的分析将用于确定选择可以受益于治疗的男性的标志物。根据受试者血清AMH、抑制素B、抑制素B/AMH比值、OPG和/或RANKL、RANKL/OPG比值以及开始干预前的DNA碎片指数将其进行分组。随后，将对治疗反应第80天和第160天的其他潜在预测因子，如BMI、S-钙、S-磷酸盐、BMD、精液质量、抑制素b、FSH进行检测。对于血清OPG，这种分级可分为两组，例如3pg/ml或三组，<3、3-4和大于4pg/ml。同样，对RANKL和RANKL/OPG比值以及对于DNA碎片指数的分级也可以分为两组，例如40％的DFI。亚组分析将根据正常临床实践进行，并根据临床或最高/最低组在适当组中分级。
效果评估
治疗终点：
主要治疗终点
·精液产量的变化(活动精子总数、进行性运动精子、精子计数、精子浓度)
次要治疗终点
精液质量的变化(-活力、-形态、精液体积)
精子DNA碎片率的变化
血清抑制素B的变化
血清生殖激素(FSH、LH、AMH、睾酮、雌二醇和SHBG)水平的变化血清催乳素水平的变化
空腹血糖水平的变化
空腹胰岛素水平的变化
c肽的变化
HbA1c的变化
脂质分布的变化
DXA评估的骨密度变化。
血清中非活性维生素D、1,25(OH)2D3、25-OHD3、24,25(OH)2D3、PTH、碱性磷酸酶、游离钙、磷酸盐、FGF23、Klotho、骨钙素、基质gla、骨桥蛋白、降钙素、pnp、III型前胶原、OPG、RANKL、硬骨素以及其他骨标志物水平的变化。
辅助生殖辅助技术选择和怀孕的变化
自然受孕率的变化
活产率变化
表达RANKL的精子数量的变化
精液pH、HCO3-、钙、锌、磷酸盐、RANKL、RANK、OPG、FGF23、Klotho、骨钙素、骨桥蛋白、VDB、24,25OH2的变化。
两组感染率的差异
设置、科学规划和招募
参与者将被纳入到Rigshospitalet(RH)生长和生殖科(GR科)用于评估男性不育的男性
这是一项前瞻性、双盲、双臂随机对照试验。干预组：每名男性在第1天接受地舒单抗60mg×1sc；仅接受安慰剂组：遵循相同的事件链，但是地舒单抗被盐水替代。
所有男性在开始进行地舒单抗或安慰剂治疗之前服用相同的维生素D和钙补充剂：维生素D15微克，钙400毫克，每天一次。
参与者
100名男性被纳入研究，一半将被随机分配进行积极治疗。研究人员预测，由于积极性高且无不良作用，退出率将较小(<5)。
分析和干预
生殖激素和精液在Rigshospitalet医院的GR科进行分析。
伦理和副作用
所有患者在完成他们的检查后，被邀请参加研究。他们会被告知可能的副作用，并且可以在任何时候退出试验，而不产生任何后果。
地舒单抗在几项随机研究中被证明是安全的，并已获得FDA和EMA的批准。所有副作用都受到密切监测和登记，如果出现意外的副作用频率或意外的临床并发症，将予以公布。
根据我们科室以往的生育研究，我们预计大部分门诊患者将愿意参加。在我们看来，所概述的研究是合乎伦理的，并且我们认为为了产生进一步的建议，随机临床试验是必要的。
研究类型：干预的
研究阶段：1期/2期
研究设计分配：随机分配
干预模型：平行分配
0.9％NaCl注射液被用作安慰剂
其他名称：Prolia
活性药物对照组：地舒单抗
皮下注射60mg地舒单抗一次
干预：药物：地舒单抗
安慰剂对照组：安慰剂
皮下注射NaCl一次
干预：药物：地舒单抗
生化分析：
所有血液样本均在早晨空腹采集(上午8.00至10.00)。为了确定FSH和LH的水平，我们使用了时间分辨免疫荧光分析法(Delfia；Wallac，图尔库，芬兰)，对于抑制剂B，我们使用特异性双侧酶联免疫分析法，(抑制素B genII,贝克曼库尔特,美国)。SHBG、FSH、LH和抑制素B的CV分别小于6％、<4％、<4％和<11％。使用贝克曼库尔特酶免疫分析法(Immunotech，贝克曼库尔特，马赛，法国)测量AMH，其CV<8％。使用用化学发光免疫分析(Access，贝克曼库尔特，美国)分析睾酮和性激素结合球蛋白(SHBG)，并使用放射免疫分析(Coat-a-Count，西门子和Pantex，圣莫尼卡,加利福尼亚州)分析雌二醇水平，CV分别为6％、8％和13％。使用Biomedica试剂盒测量血清和精浆中的OPG和可溶型RANKL(CV 3％，CV5％)。
结果
双臂中几乎所有的男性均完成了这项研究
·与安慰剂相比，地舒单抗增加了血清AMH>30pmol/l和AMH>40pmol/l的男性的自然受孕率(图2和图4)。
·与安慰剂相比，地舒单抗增加了精子浓度>1500万/ml男性的自然受孕率(图3)。
·将男性按AMH三分位数(tertiles)分级后发现，安慰剂治疗的男性在不同的AMH三分位数上有相同的有益应答率(精液质量较基线有提高)。而地舒单抗治疗的男性在高AMH组中的有益应答率更高，而在低AMH组的应答率最低(图5A和5B)。对于活动精子总数也是如此。这表明AMH是应答的良好预测标志。
·如果我们将AMH与具有最高血清RANKL/OPG比值或最多精浆的男性相结合，与安慰剂治疗的男性相比，地舒单抗治疗的男性在精子生成量的所有变量显著更高(图6-8)。
·在AMH/抑制素B比值高且通过血清RANKL/OPG比值定义的高RANKL活性的男性中，精子生成量在80天内显著增加(图9)。
·治疗开始前血清中的抑制素B是精子质量的生物标志物(图10)。
·治疗开始前血清中RANKL、睾酮和磷酸盐可作为辅助生物标志物，以提高精子质量的统计值(图11)。
·开始治疗前精液中的AMH、抑制素B、OPG/RANKL比值和OPG是精子质量的生物标志物(图12)。
结论
AMH水平是一个强生物标志物，可以预测男性受试者是否会受益于提高男性生育力的治疗，尤其是与使用RANKL拮抗剂或抑制剂(如地舒单抗)相关的治疗。抑制素B也是一种强生物标志物。当包括其他生物标志物或生物标志物比值时，所述预测值可以进一步增加。
实施例2
前言
不孕是一个普遍的问题，影响全球7-26％的夫妻。精液质量受损约占所有病例的50％，但除低促性腺激素性性腺机能不全症和精索静脉曲张患者外，大多数不育男性没有提高精液质量的治疗方案。精子浓度降低、活力降低和精子形态异常的机制尚不完全清楚，但支持细胞功能起着核心作用。在黄体生成素(LH)的控制下，睾丸间质细胞产生的睾酮强烈影响精子生成，而支持细胞分泌的抗缪勒管激素(AMH)和抑制素B则受到促卵泡激素(FSH)的刺激。对人类睾丸和维生素D受体(Vdr)敲除小鼠的研究表明，几种骨因子如Runt相关转录因子2(RUNX2)、Osterix和骨钙素在正常睾丸和睾丸生殖细胞瘤(TGCT)中均有表达。这突出表明，这些假定的“内分泌骨因子”中的一些可能在性腺中局部作用并影响睾丸功能。其中一个因子是NF-κB配体(RANKL)的受体激活剂。
RANKL系统是骨吸收的强大调节因子，包括三个组分：RANKL，与邻近细胞上的受体RANK结合的跨膜配体，激活NF-κB并调节细胞周期，即增殖、分化和凋亡。跨膜RANKL存在于骨形成细胞中并激活未成熟破骨细胞中的RANK，从而诱导破骨细胞生成并促进骨吸收。骨保护素(OPG)是分泌型诱饵受体，可结合RANKL，阻断RANK活化，并阻止破骨细胞分化和活化。RANKL也被发现存在于血清中，表明假定的内分泌功能，例如调节葡萄糖稳态。此外，最近的一项研究表明，当可溶性RANK结合RANKL并诱导信号传导时，会发生反向RANKL信号传导。在这里，我们发现RANKL、RANK和OPG在睾丸的不同细胞类型中表达，这表明精子发生中尚未被认识的调控作用。这些发现可能最终具有临床意义，因为FDA/EMA批准的特定RANKL抑制剂地舒单抗正在被用于治疗女性和男性的骨质疏松症。OPG最初用于临床，但由于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)的脱靶抑制和短半衰期而停用。地舒单抗是为了避免脱靶效应而开发的，其具有更长的半衰期，这意味着患者只需要每六个月注射一次来治疗骨质疏松症。在这里，我们发现骨骼、免疫系统和雄性性腺共享RANKL/RANK/OPG信号系统；通过使用RANKL在小鼠支持细胞中的系统性和特异性的外源性和基因抑制以及描述性和功能性人类研究，我们深入了解了RANKL作为男性生殖功能的可修饰调节因子的相关性。
材料和方法
TNFSF11抑制和生育：前瞻性干预研究NCT02422108：为了解决RANKL抑制对人类男性生殖的相关性问题，向12名不育男性注射60mg地舒单抗(Prolia)一次，并监测精液质量180天(另见上述实施例1)。
该研究由当地伦理委员会H-15001992批准，并根据GCP标准进行和监测。12名不育男性全部精液质量受损，严重程度从轻度到重度少精子症不等。DXA评估的骨健康显示BMD正常，血清钙、磷酸盐、碱性磷酸酶、25-OHD和PTH水平均正常处于基线水平。所有男性在治疗开始前提供了2份精液样本，并测量了生殖激素和促钙激素在基线时，血清的RANKL和OPG(S表)。共22名男性接受了筛查，其中12名男性被纳入。所有男性在治疗前都接受了钙和维生素D补充。治疗开始后，要求所有12名男性在第5、20、40、80、120和180天提供精液和血液样本。包括“早期时间点”以避免由于在人离体模型和野生型小鼠中观察到的RANKL抑制的快速应答而错过假定的抗凋亡作用。
生化分析：
使用经验证的方法在所有时间点分析禁食血清样本和精浆。在上午8:00至10:00之间采集空腹血液样本。立即分析血清中的钙(总钙和游离钙)、磷酸盐和PTH。其余分析是对解冻的血清样本进行的。
精液分析：
精液样本被送到门诊诊所的相邻房间，并获得了禁欲时间、发烧时间和溢出量的信息。两个精液样本在治疗开始前间隔10-16天提供，并完全按照先前详细描述进行分析。简而言之，通过称重确定精液体积，使用Bürker-Türk血细胞仪确定精子浓度，并计算精子总数。根据巴氏染色涂片的严格标准评估精子形态。将精子运动分为进行性运动(世界卫生组织A+B类)、非进行性运动(C类)或静止性运动(D类)，并重复确认两次，并呈现AB或ABC运动。在SPZ实验室(丹麦哥本哈根)对基线和干预后20天和120天的精子DNA碎片进行了研究。简而言之，用TNE缓冲液稀释0.5mL精液，然后混合并直接在液氮中冷冻，直到根据精子染色质结构测定方案进行荧光染色，然后使用FACSCalibur(BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)流式细胞仪进行分析。所有样本均以盲法重复进行，并在5000次事件后停止记录。
统计数据：
每种基因型使用5-18只16-17周龄的雄性小鼠，以达到统计学显著性——这个数字是根据之前的经验计算(检验效能计算)所得。所有分析均由对基因型和/或治疗不知情的技术人员或研究人员进行。所有值均被表示为平均值±SEM。p<0.05被认为具有统计学意义。对以下表型变量：精子计数、器官重、活力和基因表达(一些对数转换)，采用学生t检验或单向方差分析(ANOVA)进行测试，用Dunnett检验调整以进行多重比较。分析中未排除异常值。哥本哈根骨性腺研究的横截面数据，除了精子浓度和总精子数(中位数)，均表示为平均值±SEM。对所有精液变量进行BMI、年龄和禁欲时间的自然对数转换和调整后，进行RANKL和OPG的血清或精浆水平与精液质量和生殖激素之间的关联。随后，根据世界卫生组织精液质量变量标准对所有男性进行分级。通过绘制残差来评估高斯分布，将以下变量进行自然对数转换：精浆RANKL、血清RANKL、精浆/血清RANKL比值、精子总数、精液浓度、进行性活动精子浓度、形态正常精子浓度。在与激素的线性回归分析中，精浆RANKL水平被设置为依赖性，而在与精浆参数的线性回归中，其被设置为独立性。将不育男性的RANKL水平、激素水平和精浆参数与不育男性和健康男性的水平进行比较，然后对所有男性进行汇总分析。所有激素分析均根据BMI进行了调整，精液质量分析也根据禁欲时间进行了调整。
TNFSF11抑制和生育力：
主要治疗终点是与基线相比，第80天及以后精子生成量的变化。还评估了以下预定义的次要治疗终点：精子DFI、FSH、抑制素B、AMH、血清OPG和sRANKL。根据预先指定的统计分析，从第80天开始，通过配对t检验将每个时间点与基线进行比较。将访视第1天之后第180天之前终止参与的受试者纳入数据分析。分析中包括发烧超过38.5℃的发烧发作3个月后的男性。男性精子发生需要74天，最初的研究是确定所有时间点的差异，计算第80、120和180天的平均值，并与基线值进行比较，以确定RANKL抑制在整个精子发生后的效果。在治疗前根据BMI、血清RANKL和OPG将受试者分级为预定义的亚组后进行后续分析。
结果
RANKL、RANK和OPG在人睾丸中表达并调节生殖细胞凋亡。
在睾丸组织中发现RANKL、RANK和OPG的显著转录表达(数据未示出)。RANKL的三种亚型全部都在人睾丸中表达，包括跨膜型和可溶型蛋白。通过使用靶向跨膜或细胞外结构域的抗体，我们发现RANKL在SOX9阳性支持细胞和血睾屏障管腔部位的一些生殖细胞中表达。RANKL的表达水平在样本之间有所不同，但主要在支持细胞的细胞质/膜和一些精母细胞和精子细胞中检测到，但在精原细胞中没有检测到。RANK在生殖细胞的细胞质/膜中表达，精原细胞中表达最为显著，而OPG主要在精原细胞内表达，在管周细胞或管周细胞与精原细胞之间的边界以及一些精子细胞中表达较少。RANKL的可溶型同种异构体(sRANKL，在27-31kDa处观察到)和跨膜型同种异构体(45kDa)均在睾丸中表达。两种亚型的RANKL、RANK和OPG在精子发生正常的样本中都有强烈表达。离体培养人睾丸组织以保持功能完整性并支持持续的细胞-细胞信号传导，以研究RANKL抑制对生殖细胞凋亡的影响。大多数被纳入的样本都含有生精停滞或部分萎缩的小管。尽管精子发生完全的小管数量很低，但与空载对照相比，用地舒单抗或OPG处理48小时后，凋亡细胞的数量(根据每个区域分裂的PARP+细胞数量评估)减少了30％(p<0.05)。地舒单抗或OPG治疗对生殖细胞增殖没有显著影响(由每区域BrdU+细胞的数量确定)，尽管观察到增加的趋势。有趣的是，与空载处理相比，地舒单抗或OPG处理显著减少了sRANKL向培养基中的释放(p<0.05)。
地舒单抗抑制不育男性精浆中RANKL水平，增加循环抑制素B。
为了测试RANKL抑制在不育男性中的有效性和安全性，向12名不育男性皮下注射单剂量地舒单抗(
Figure BDA0004113510030000291
60mg)。在注射后的第5、20、40、80、120和180天评估精液质量、生殖激素、钙稳态、sRANKL和OPG，以避免错过早期抗凋亡作用(第5、第20、第40天)，但最重要的是评估第80天精子发生全周期(74天)后的精液质量。因此，预先指定的统计分析表明，最初应在第80天开始的时间点与基线进行直接比较，以避免进行多次调整。精液质量变量和激素被标准化为治疗开始前两个样本的平均值。一名男性未进行随访，一名男性在试验开始时发高烧，因此按照方案排除在分析之外，剩下10名男性参与研究。
下面将对结果进行详细解释。
第80天，血清中AMH和抑制素B的水平显著高于基线水平(p＝0.003和p＝0.018)。第80天，除一名男性外，所有男性的抑制素B水平相比基线均有所增加。血清FSH水平没有变化，但抑制素B/FSH比值在第80天显著增加(p＝0.02)。血清雌二醇浓度在第180天显著降低(p＝0.001)，而睾酮、SHBG和LH浓度保持不变。第80天时，精子总数、精子浓度、精子活力和进行性活动精子总数都没有增加。然而，在第80天，与基线相比，进行性活动精子(p＝0.057)和活动精子(p＝0.071)的数量趋于增加。有趣的是，与基线相比，在亚组中60％男性的进行性活动的精子数量增加(100-500％)。令人惊讶的是，其余40％的男性进行性活动精子数量显著减少。这一初步发现可能表明，地舒单抗的疗效取决于患者的特定基线特征。对基线时的临床和生化差异的评估表明，治疗前血清AMH、抑制素B、AMH/抑制素B和RANKL/OPG比值高是地舒单抗治疗反应阳性的最佳预测因子。OPG水平>3.0pmol/L的男性在接受地舒单抗治疗后第80天，活动精子总数和进行性活动精子总数显著增加(两者均p<0.05)。血清抑制素B和AMH也是很好的预测因子，而血清RANKL、1,25(OH)2D3、Klotho和磷酸盐是地舒单抗诱导的进行性活动精子总数或抑制素B增加的最佳负预测因子。OPG高或RANKL高的男性也具有较高的抑制素B和AMH水平。值得注意的是，注射地舒单抗后，除了一名男性，所有男性血清中的sRANKL浓度立即被完全抑制，并且在第120天或第180天被再次检测到。相反，在注射地舒单抗后第20天和第40天，OPG增加，然后恢复到基线水平。此外，地舒单抗降低了精浆中的sRANKL水平，但在第80天和第120天，大多数男性的精浆sRANKL浓度没有被完全抑制，仍然可以检测到并高于血清水平。值得注意的是，参加并完成这项研究的10名男性中，有2人在研究期间他们的配偶自然受孕，生有两个健康的活胎。
讨论
本实施例证明了RANKL系统在小鼠和人类的雄性生殖器官中的存在。支持细胞、精母细胞和精子细胞中RANKL的表达、精原细胞和精子细胞中的受体RANK以及精原细胞与管周细胞中的抑制剂OPG的表达突出了密切的细胞间相互作用的依赖性，如骨骼中的RANKL信号所示。重要的是，RANKL信号的睾丸表达模式在小鼠和人类之间是保守的，人类睾丸组织的离体培养使我们能够比较OPG和地舒单抗治疗对人类生殖细胞凋亡和增殖的影响。OPG和地舒单抗对人类生殖细胞的类似抗凋亡作用以及对释放到培养基的RANKL的抑制支持了刺激作用由RANKL信号而不是TRAIL介导的观点。此外，地舒单抗和OPG并未显著增加离体培养中增殖生殖细胞的数量，这表明对精子计数的影响很可能是生殖细胞凋亡减少的结果。
与血清相比，精浆中sRANKL的浓度高100倍，这支持了RANKL可能是从生殖道上皮细胞分泌、分裂或释放的生物学作用，因为血清和精浆中sRANKL的浓度之间没有联系。此外，与血清睾酮和雌二醇的强关联表明，性类固醇可能会影响附睾和前列腺中RANKL的活性和释放。精浆RANKL的生物学作用通过精浆sRANKL浓度与所有精液质量变量(包括进行性活动精子总数和形态正常的精子总数)之间的负相关来表明，形态正常的精子总数指的是成熟和功能性精子的数量，而不仅仅是精子数量。精液质量变量与精浆RANKL水平之间的相关性不强，这意味着FSH和睾酮等其他调节因子对精子发生和精子成熟的调节作用可能比精浆RANKL浓度更强。根据世界卫生组织关于正常精液质量的参考资料，对男性进行分级研究，结果表明，精液质量差的男性，包括精子数量少、活力低或形态异常的精子，其精浆sRANKL高于精液质量正常的男性。精浆/血清RANKL比值的AUC更高，是除精子活力外所有精液质量变量的更好指标。尚未发现精浆中RANKL直接负面影响的因果证据，地舒单抗是否能进入睾丸或附睾管腔部位，并由于血-睾丸和血-附睾屏障而降低精浆RANKL水平仍然存疑。
我们在不孕男性中使用标准骨质疏松剂量的地舒单抗(60mg，一次)进行了一项小型干预试验。这导致血清sRANKL立即受到抑制，而OPG保持高水平。有趣的是，在用骨质疏松症标准剂量方案治疗后，精浆中sRANKL浓度降低，但未完全抑制。由于骨质疏松症和男性生殖功能提高所需的最佳剂量可能不同，因此更有效地抑制精浆sRANKL浓度是否会导致治疗应答增加尚不得而知。本试验包括多个时间点的分析，以避免错过早期抗凋亡作用，但预先指定的统计分析表明，我们应首先将精子发生一段时间(74天)后的治疗终点与基线进行比较，以避免对多重比较进行调整。地舒单抗在80天后诱导血清AMH和抑制素B升高。亚组分析显示，在血清AMH、抑制素B、RANKL和OPG水平高的不育男性中，地舒单抗增加了进行性活动精子总数，这支持了RANKL在男性生殖中的调节作用。精浆sRANKL浓度与血清雌二醇呈正相关，与血清睾酮呈负相关。这一观察结果很有意义，因为不育男性的睾酮/雌二醇比值往往低于正常男性，这可能有助于提高精浆sRANKL水平，并且与性类固醇对骨骼中RANKL和OPG的调节作用一致。值得注意的是，在不育男性中，地舒单抗治疗对血清促性腺激素或睾酮浓度没有影响，但血清雌二醇在后期增加。
此外，几乎所有不育男性的AMH和抑制素B水平都有所增加，但只有60％的男性能够将这些内分泌变化转化为进行性活动精子数量增加。我们无法解释这一差异，但这可能是由于不育病因的异质性所致。AMH和抑制素B可能是最好的阳性预测标志物，这表明睾丸残余功能最好的不育男性更有可能从治疗中受益。
结论
这项研究表明，RANKL信号是一种新的男性生殖功能调节因子，通过介导睾丸和男性生殖道中支持-生殖-管周细胞之间的相互作用，影响精液质量和男性生育力。

Claims (30)

1.一种用于确定提高男性生育力的治疗的可能效果的方法，所述方法包括：
·确定来自男性受试者的生物样本中AMH和/或抑制素B的水平；
·将所述确定的AMH和/或抑制素B水平与相应的基准水平进行比较；并
·确定所述受试者将
ο从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述水平等于或高于所述基准水平；或
ο不能从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述水平低于所述基准水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中至少AMH的水平是确定的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基准水平是
·血清中的AMH高于30pmol/l，例如至少35pmol/l AMH或例如至少40pmol/l AMH；和/或
·精浆中AMH高于5pmol/l。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AMH水平的确定使用的方法选自免疫组化、免疫细胞化学、FACS、ImageStream、免疫蛋白印迹、qPCR、RT-PCR、qRT-PCR、ELISA、Luminex、Multiplex、免疫印迹、TRF测定、免疫层析侧流试验、酶放大免疫测定技术、RAST试验、放射免疫测定、免疫荧光和免疫干胶分析，优选地为侧流试验。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述确定是通过免疫细胞化学、ELISA LC-MS/MS或侧流试验进行的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中
·血清中所述基准水平为在30-100pmol/l范围内的AMH，例如在30-80pmol/l范围内的AMH；和/或
·精浆中所述基准水平为在5pmol/l-1000pmol/l范围内的AMH。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RANKL的拮抗剂或抑制剂是对RANKL具有结合亲和力的分子，例如其中RANKL结合部分与可溶型RANKL结合，例如与全长RANKL或截短型RANKL结合，例如与截短型RANKL的C端或N端结合，优选地与RANKL的C端结合。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RANKL的拮抗剂或抑制剂对RANKL具有结合亲和力，在与地舒单抗或OPG相同的表位处结合RANKL。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RANKL的拮抗剂或抑制剂对RANKL具有结合亲和力，以类似于地舒单抗或OPG的结合亲和力与RANKL结合，或以高于地舒单抗或OPG的结合亲和力与RANKL结合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RANKL的拮抗剂或抑制剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2分子、全人源化抗体、人源化抗体、嵌合抗体和单域抗体(sdAb)(纳米抗体)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RANKL抑制剂选自地舒单抗或其片段(能够与RANKL结合)、OPG或其片段(能够与RANKL结合)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括
·确定来自男性受试者的生物样本中OPG和/或抑制素B、和/或RANKL、和/或RANKL/OPG比值、和/或AMH/抑制素B比值、和/或AMH/睾酮比值的水平；
·将所述确定的OPG和/或抑制素B、和/或RANKL、和/或RANKL/OPG比值、和/或AMH/抑制素B比值、和/或者AMH/睾酮比值水平与相应的基准水平进行比较；并
·确定所述受试者将
ο从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述一个或多个水平等于或高于所述基准水平；或
ο不能从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述一个或多个水平低于所述基准水平。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一个或多个水平或比值在与确定AMH水平相同的样本或样本类型中被确定。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中
·血清中的所述基准水平为至少50IU/ml抑制素B，例如至少100IU/ml抑制素B或例如至少200IU/ml抑制素B，或例如在50至500IU/ml范围内的抑制素B或例如在200-500IU/ml范围内的抑制素B；和/或
·精浆中的所述基准水平为至少20IU/ml抑制素B，例如至少100IU/ml抑制素B或例如至少200IU/ml抑制素B，或例如在20-500IU/ml范围内的抑制素B，或例如20-10000IU/ml范围内的抑制素B；
和/或
·血清中的所述基准水平为在2-5pmol/l范围内的OPG，例如在3-5pmol/l范围的OPG或例如在3-4pmol/l范围内的OPC；和/或
·精浆中的所述基准水平为在5-50pmol/l范围内的OPG，例如在10-40pmol/l范围内的OPG；
和/或
·血清中的所述基准水平为在0.1-0.5pmol/l范围内的可溶型RANKL，例如在0.2-0.44pmol/l范围内的RANKL；和/或
·精浆中的所述基准水平为在1-76pmol/L范围内的精浆sRANKL，例如20-76pmol/L的精浆sRANKL、40-76pmol/L的精浆sRANKL、1-50pmol/L的精浆s-RANKL、1-30pmol/L的精浆sRANKL或1-20pmol/L的精浆sRANKL。
和/或
·血清中的所述基准水平为OPG/RANKL低于30，例如低于20，或例如低于15；和/或
·血液精浆中的所述基准水平为OPG/RANKL低于30、例如低于20或例如低于15。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括
·确定定来自男性受试者的生物样本中睾酮和/或磷酸盐的水平；
·将所述确定的睾酮和/或磷酸盐水平与相应的基准水平进行比较；和
·确定所述受试者将
ο从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述一个或多个水平等于或高于所述基准水平；或
ο不能从使用RANKL的拮抗剂或抑制剂的治疗中受益，如果所述一个或多个水平低于所述基准水平。
16.根据权利要求15所述的方法，其中血清睾酮的所述基准水平大于10nmol/l，例如在10-40nmol/l的范围内。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中血清磷酸盐的所述基准水平大于0.6mmol/l，例如在0.6-1.0mmol/l的范围内。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述精液样本是未改变、稀释、洗涤或纯化的精液样本，优选地为未改变的精液样本。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有少精子症。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括如果所述AMH水平等于或高于所述基准水平，则向需要治疗的所述受试者施用RANKL拮抗剂或抑制剂。
21.AMH和/或抑制素B作为生物标志物在确定提高男性生育力治疗的可能效果中的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述治疗通过使用RANKL拮抗剂或抑制剂进行。
23.根据权利要求21或22所述的用途，其中血清中AMH的水平高于30pmol/l，表明用RANKL拮抗剂或抑制剂治疗可能对男性不育产生积极效果，和/或精浆中AMH的水平高于5pmol/l，表明用RANKL拮抗剂或抑制物治疗可能对男性不育产生积极效果。
24.一种包括RANKL拮抗剂或抑制剂的组合物，用于治疗受试者中的男性不育症，其中所述受试者的AMH水平为：
·血清中高于30pmol/l，例如至少35pmol/l的AMH或例如至少40pmol/l的AMH；和/或
·精浆中高于5pmol/l的AMH。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述RANKL拮抗剂或抑制剂是对RANKL具有结合亲和力的分子，例如其中RANKL结合部分与可溶型RANKL结合，例如与全长RANKL或截短型RANKL结合，例如与截短型RANKL的C端或N端结合，优选地与RANKL的C端结合。
26.根据权利要求24或25所述的组合物，其中RANKL拮抗剂或抑制剂对RANKL具有结合亲和力，在与地舒单抗或OPG相同的表位结合RANKL。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的组合物，其中所述RANKL拮抗剂或抑制剂对RANKL具有结合亲和力，以类似于地舒单抗或OPG的结合亲和力与RANKL结合，或以高于地舒单抗或OPG的结合亲和力与RANKL结合。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的组合物，其中所述RANKL拮抗剂或抑制剂是与RANKL结合的地舒单抗或OPG或其活性片段或变体。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的组合物，其中所述RANKL拮抗剂或抑制剂是地舒单抗的生物类似物。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的组合物，其中所述RANKL拮抗剂或抑制剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、重链和轻链通过柔性接头连接的抗体、Fv分子、抗原结合片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab’)2分子、全人源化抗体、人源化抗体、嵌合抗体和单域抗体(sdAb)(纳米抗体)。
CN202180057944.0A 2020-07-03 2021-06-30 Amh和/或抑制素b作为提高男性生育力的治疗效果的生物标志物 Pending CN116406446A (zh)

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