CN116406285A - 用于疫苗释放的组合物和装置及其用途 - Google Patents

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E·L·博尔科夫斯基
C·L·考迪尔
M·迪克斯
N·W·哈特曼
L·瓦伦蒂
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Abstract

本文描述了用于持续经皮递送冠状病毒和/或流感疫苗的、包含可植入尖端(例如，丝基尖端)的微针和微针装置，试剂盒，以及制造和使用其的方法。在其他实施方式中，还描述了用于受控或持续施用冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以向受试者提供改善的免疫原性和/或广谱免疫的组合物和方法。

Description

用于疫苗释放的组合物和装置及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年5月21日提交的美国临时申请号63/028,390的优先权，其全部内容通过引用明确地并入本文。
政府支持
本发明是在联邦政府的支持下进行的，该联邦政府的资助号为1R44AI142948-01A1，由国家过敏和传染病研究所(NIAID)作为小型商业创新研究资助(SBIR)，该联邦政府的资助号为75A50120C 00160，由生物医学高级研究和开发机构(BARDA)资助，生物医学高级研究和开发机构(BARDA)是美国卫生和人类服务部(HHS)的预备和响应助理秘书办公室的组成部分。美国政府拥有本发明的某些权利。
发明领域
本发明大体上涉及经配置以释放疫苗(例如冠状病毒疫苗(例如SARS-CoV-2疫苗、SARS-CoV疫苗和/或MERS-CoV疫苗)和/或流感疫苗)的微针(例如基于丝素蛋白的微针)，以及制造和使用所述微针的方法。
背景技术
将抗原持续递送到皮肤中以模拟天然感染可以驱动有效的免疫应答，然而由于皮肤最外层角质层的高效屏障性质，实现这种递送是困难的。使用传统材料的微针已经在治疗剂(包括疫苗)的递送中进行了研究，但通常与损害其生产和限制其性能的各种限制相关(参见例如Donnelly等，Drug Deliv.17(4):187-207,2010)。
仍然强烈需要有效的疫苗递送组合物，装置(例如丝基微针)，以及能够控制和/或维持疫苗释放以增强受试者中的免疫应答的方法，以及制造此类组合物和装置的改进方法。另外，随着由冠状病毒引起的感染的日益增长的威胁，包括最近的冠状病毒疾病2019(COVID-19)大流行，和流感的现有威胁，需要有效地保护冠状病毒和流感病毒。
发明内容
本公开的特征在于包含丝素蛋白的微针和微针装置，其可被配置成向有需要的受试者递送有效量的治疗剂，诸如疫苗。
在一个方面，本公开的特征在于微针(例如，基于丝素蛋白的微针)和微针装置(例如，基于丝素蛋白的微针装置)，其被配置成向受试者(例如，人类受试者)释放(例如，施用)有效量的冠状病毒疫苗，抗原，和/或免疫原和/或流感疫苗，抗原，和/或免疫原。在一些实施方式中，微针和微针装置包含冠状病毒疫苗、流感疫苗或其组合。本公开至少部分地基于以下发现：例如，与单剂量施用或推注施用疫苗相比，经由例如包含如本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原的受控释放和/或持续释放组合物和装置(例如，微针，例如丝基微针，和微针装置)调节抗原呈递的动力学可在受试者中驱动更有效和/或持久的免疫应答(例如，更有效和/或持久的细胞免疫应答和/或体液免疫应答)。在一些实施方式中，如本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原的控制释放或持续释放可用于在受试者中实现广谱免疫，和/或防止菌株漂移(例如，通过感染模拟)。在不受理论束缚的情况下，通过注射到非屏障组织中施用的传统疫苗通常在例如少于两天内从身体快速清除。这通常不足以使免疫细胞产生最佳的、广泛的体液或细胞免疫应答，类似于通过持续的、天然暴露于感染而发生的。因此，在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可被配置成通过将淋巴组织持续暴露于疫苗抗原来增强受试者对病毒的免疫应答，以更接近地模拟对感染的自然暴露。
在另一方面，本公开的特征在于微针和微针装置，其使冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的单剂量、双剂量或多剂量施用能够在受试者中提供针对例如冠状病毒和/或流感病毒感染的保护。冠状病毒疫苗和/或流感疫苗可以作为贴片，例如单一贴片，施用一次或多次以实现免疫。贴片可以由健康护理专业人员施用或可以自施用。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置是耐储存的，例如，微针或微针装置内的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在各种环境条件下储存一段时间后，例如在室温(约25℃)下储存至少2周的一段时间后可保持活性(例如免疫原性)。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置稳定并维持包封的mRNA的活性，例如在室温(约25℃)下至少2周的时间。
在某些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可被配置成递送含佐剂或不含佐剂的疫苗。在某些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可被配置成递送佐剂化或未佐剂化冠状病毒疫苗、抗原和/或免疫原。在某些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可被配置成递送含佐剂或不含佐剂的流感疫苗、抗原和/或免疫原。
在特定的实施方式中，微针和微针装置包含不含佐剂的疫苗。在特定的实施方式中，微针和微针装置包含冠状病毒疫苗、抗原和/或免疫原，其不含佐剂。在特定的实施方式中，微针和微针装置包含不含佐剂的流感疫苗、抗原和/或免疫原。
具体而言，本文所述的微针和微针装置可被配置成递送无佐剂的基于重组蛋白的疫苗以实现与使用传统单剂量或推注施用含佐剂疫苗所实现的免疫应答基本相似或更大的免疫应答。具体地，本文所述的微针和微针装置可被配置成递送无佐剂的基于重组蛋白的冠状病毒疫苗以实现与使用传统单剂量或推注施用含佐剂的冠状病毒疫苗所实现的免疫应答基本相似或更大的免疫应答。具体地讲，本文所述的微针和微针装置可被配置成递送无佐剂的基于重组蛋白的流感疫苗，以实现与使用传统单剂量或推注施用佐剂化流感疫苗所实现的免疫应答基本相似或更大的免疫应答。
不受理论的束缚，与使用含佐剂的疫苗相比，使用传统的单剂量或快速浓注给药递送的无佐剂的基于重组蛋白的疫苗在实现最佳的、广泛的体液或细胞免疫应答方面通常不太有效。例如，目前作为疫苗抗原研究的病原体的许多重组分子或亚基显示很少或没有固有的免疫刺激性质，因此通常与可增加和指导疫苗特异性免疫的有效免疫佐剂组合施用。因此，在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置消除了使用佐剂与基于重组蛋白的疫苗组合以实现免疫应答的需要。
在某些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可包含mRNA，例如mRNA疫苗。在具体的实施方式中，本文所述的微针和微针装置可包含编码冠状病毒抗原或免疫原和/或流感抗原或免疫原的mRNA。不受理论的束缚，mRNA治疗剂通常与不稳定和低效的体内递送相关，这限制了其用于治疗人类疾病的可用性。特别地，mRNA疫苗制剂通常需要在-80℃的温度下超冷储存以确保稳定性并防止在储存、运输和施用期间的降解，这对于大规模维持可能是有挑战性的，特别是在大流行的时候。
因此，在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可通过防止和/或减少mRNA在长期储存期间的降解来改善mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性。在特定实施方式中，本文所述的微针和微针装置可通过防止和/或减少mRNA在约4℃、约25℃、约37℃和/或约45℃的温度下长期储存期间的降解来改善mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性。在一些实施方式中，与在不存在本文所述的微针或微针装置的情况下储存的mRNA治疗剂相比，本文所述的微针和微针装置可通过在约4℃、约25℃、约37℃和/或约45℃的温度下长期储存期间防止和/或减少mRNA降解至少约50％(例如，约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)来改善固有不稳定的mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可改善固有不稳定的mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性，使得mRNA在例如约4℃、约25℃、约37℃和/或约45℃的温度下储存2周或更多周后保留其原始生物活性(例如表达编码氨基酸序列的能力)的至少约50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可改善mRNA冠状病毒疫苗的储存稳定性，例如通过防止和/或减少mRNA冠状病毒疫苗在约4℃、约25℃、约37℃和/或约45℃的温度下长期储存期间的降解。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可改善mRNA流感疫苗的储存稳定性，例如通过防止和/或减少mRNA流感疫苗在约4℃、约25℃、约37℃和/或约45℃的温度下长期储存期间的降解。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同物。此类等同物旨在被以下实施方式(E)涵盖。
E1.一种包含多个微针的微针装置(例如，微针贴片)，其中所述多个微针包含：
包含冠状病毒抗原(例如，一种或多种冠状病毒抗原，例如SARS-CoV-2抗原)或其疫苗制剂(“冠状病毒疫苗”)的第一微针；和
任选地，包含流感抗原(例如，一种或多种流感抗原，或其疫苗制剂(“流感疫苗”))的第二微针；
任选地，其中所述微针装置被配置为例如以足以诱导免疫应答(例如，体液和/或细胞免疫应答)的量向受试者递送所述冠状病毒抗原或所述冠状病毒疫苗，和任选地所述流感抗原或所述流感疫苗。
E2.根据实施方式E1所述的微针装置，其中所述多个微针中的所述第一微针和/或所述第二微针包含：
(i)基质(例如，可溶性基质)；
(ii)应用于所述基质的尖端(例如，可植入尖端)；和
(iii)(任选的)应用于所述基质的背衬。
E3.多个微针，其包含：
包含冠状病毒抗原(例如一种或多种冠状病毒抗原，例如SARS-CoV-2抗原)或其疫苗制剂(“冠状病毒疫苗”)的第一微针；和
任选地，包含流感抗原(例如，一种或多种流感抗原，或其疫苗制剂(“流感疫苗”))的第二微针；
任选地，其中所述第一微针和所述第二微针被配置成以足以诱导免疫应答(例如体液和/或细胞免疫应答)的量向受试者递送所述冠状病毒抗原或所述冠状病毒疫苗，和任选地所述流感抗原或所述流感疫苗。
E4.前述实施方式中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述第一微针和/或所述第二微针包含丝素蛋白，例如再生丝素蛋白和/或重组丝素蛋白。
E5.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述微针尖端是丝素蛋白尖端(例如，可植入的丝素蛋白尖端)。
E6.一种微针(例如，第一微针)，其包含：
(i)基质(例如，可溶性基质)；
(ii)丝素蛋白尖端(例如，可植入的丝素蛋白尖端)，其包含应用于所述基质的丝素蛋白；和
(iii)(任选的)应用于所述基质的背衬；
其中所述丝素蛋白尖端包含丝素蛋白，例如再生丝素蛋白和/或重组丝素蛋白；和
其中所述微针包含冠状病毒抗原，例如，一种或多种冠状病毒抗原(例如，以下的一种或多种：SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原、或MERS-CoV抗原)，或其疫苗制剂(“冠状病毒疫苗”)，和
任选地，所述微针被配置成例如以足以诱导免疫应答(例如体液和/或细胞免疫应答)的量向受试者递送所述冠状病毒抗原或所述冠状病毒疫苗。
E7.一种微针装置或多个微针，其包含根据实施方式E6所述的微针，并且任选地进一步包含一个或多个第二微针，其包含流感抗原(例如一种或多种流感抗原或其疫苗制剂(“流感疫苗”))。
E8.一种微针装置(例如，微针贴片)，其包含多个基于丝素蛋白的微针，其中：
所述多个微针(例如，多个第一微针)包含冠状病毒抗原，例如，一种或多种冠状病毒抗原(例如，以下中的一种或多种：SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原、或MERS-CoV抗原)，或其疫苗制剂(“冠状病毒疫苗”)；和
任选地，其中所述微针装置被配置成例如以足以诱导免疫应答(例如，体液和/或细胞免疫应答)的量向受试者递送所述冠状病毒抗原或所述冠状病毒疫苗。
E9.根据实施方式E8所述的微针装置，其中所述微针包含：
(i)基质(例如，可溶性基质)，
(ii)丝素蛋白尖端(例如，可植入丝素蛋白尖端)，其包含应用于所述基质的丝素蛋白；和
(iii)任选地应用于所述基质的背衬。
E10.根据实施方式E8或E9所述的微针装置，其中所述微针装置进一步包含一个或多个第二微针，其包含流感抗原，例如流感疫苗。
E11.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端包含所述冠状病毒疫苗或所述流感疫苗。
E12.根据实施方式E1-E5、E7或E10中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述微针尖端包含所述冠状病毒疫苗和所述流感疫苗。
E13.根据实施方式E1-E5、E7或E10中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述微针基质(例如可溶性基质)包含所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗。
E14.根据实施方式E1-E5或E7-E13中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述第一微针和/或所述第二微针包含一种抗原/微针，例如一种疫苗/微针。
E15.根据实施方式E1-E5或E7-E13中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述第一微针包含来源于相同冠状病毒(例如SARS-CoV-2抗原的组合)或来源于不同冠状病毒(例如不同β冠状病毒)的抗原的组合。
E16.根据实施方式E1-E5、E7、E10-E13或E15中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述第二微针包含来源于相同流感病毒或来源于不同流感病毒的抗原的组合。
E17.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E16中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述装置或多个装置进一步包含多个附加的微针(“附加的多个”)，其中所述多个附加的微针中的一个或多个微针(例如每个微针)包含流感疫苗，例如一种、两种、三种、四种或更多种流感疫苗。
E18.根据实施方式E17所述的微针装置或多个微针，其中所述附加的多个包含一个或多个微针，所述微针在同一微针中包含与所述冠状病毒疫苗组合，例如共同配制，的所述流感疫苗。
E19.根据实施方式E18所述的微针装置或多个微针，其中所述附加的多个微针中的每个微针在同一微针中包含所述冠状病毒疫苗和所述流感疫苗，例如一种、两种、三种、四种或更多种流感疫苗。
E20.根据实施方式E17所述的微针装置或多个微针，其中所述多个(例如，每一个)附加的微针包含两种、三种、四种或更多种附加流感疫苗，所述附加流感疫苗在同一微针中组合存在，例如共同配制，例如与所述冠状病毒疫苗分开存在。
E21.根据实施方式E17所述的微针装置或多个微针，其中所述一种或多种流感疫苗和所述冠状病毒疫苗中的每一种独立配制到单个微针中。
E22.根据实施方式E1-E5或E7-E21中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种抗原(例如，至少5种抗原)。
E23.根据实施方式E22所述的微针装置或多个微针，其中所述多个中的部分或全部微针是相同的。
E24.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E23中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含所述冠状病毒抗原和所述流感抗原，例如至少一种、两种、三种、四种或五种或更多种流感抗原，例如至少4种流感抗原。
E25.根据实施方式E24所述的微针装置或多个微针，其中所述多个中的部分或每个微针包含所述冠状病毒抗原和所述流感抗原，例如至少一种、两种、三种、四种或五种或更多种流感抗原，例如至少4种流感抗原，的组合。
E26.根据实施方式E25所述的微针装置或多个微针，其中所述多个中的每个微针包含所述组合，例如所述冠状病毒和所述流感抗原是共同配制的，例如所有微针是相同的。
E27.根据实施方式E24所述的微针装置或多个微针，其中至少两种、三种、四种或五种或更多种所述抗原，例如每种抗原，被单独配制，例如一种抗原/微针。
E28.根据实施方式E27所述的微针装置或多个微针，其包含至少五种不同的微针，每种微针包含至少一种不同的抗原。
E29.根据实施方式E1-E5、E7、E10-E28中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述多个包含至少一种冠状病毒抗原和至少两种、三种、四种或五种或更多种流感抗原，例如至少4种流感抗原。
E30.根据实施方式E29所述的微针装置或多个微针，其中所述抗原中的每一种是单独配制的。
E31.根据实施方式E1-E5或E7-E30中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如至少20％)的包含所述冠状病毒抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原，的微针。
E32.根据实施方式E1-E5、E7或E10-30中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如至少80％)的包含流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原，的微针。
E33.根据实施方式E1-E5或E7-32中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含：
(i)至少10％的各自包含所述冠状病毒抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原，的微针；和至少90％的包含所述流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原，的微针；
(ii)至少20％的各自包含所述冠状病毒抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原，的微针；和至少80％的包含所述流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原，的微针；或
(iii)至少30％的各自包含所述冠状病毒抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原，的微针；并且至少70％的包含所述流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原，的微针。
E34.根据任一实施方式所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2-S1或其亚基)、MERS-CoV抗原(例如MERS-CoV-S1或其亚基)、SARS-CoV抗原(例如SARS-CoV-S1或其亚基)或其组合。
E35.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2疫苗，例如SARS-CoV-2基因产物(例如SARS-CoV-2蛋白，或编码SARS-CoV-2蛋白的核酸(例如mRNA、DNA))，病毒或病毒颗粒(例如灭活或减毒的SARS-CoV-2病毒)，或病毒载体，或其组合。
E36.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述SARS-CoV-2疫苗选自SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基，SARS-CoV-2核壳蛋白，灭活病毒(例如灭活的SARS-CoV-2，例如UV灭活的SARS-CoV-2)，病毒载体(例如非复制型病毒载体或复制型病毒载体)，病毒样颗粒，DNA(例如DNA质粒)，RNA(例如信使RNA(mRNA)，自扩增mRNA(saRNA)，核苷修饰的mRNA(modRNA)或含尿苷的mRNA(uRNA))和/或腺病毒载体(例如5型腺病毒载体，例如Ad5-nCoV)或其组合。
E37.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含活病毒(例如活的经修饰的病毒，例如活的经修饰的正痘病毒，如马痘病毒，其包含冠状病毒抗原)。
E38.根据实施方式E1-E36中任一项所述的微针装置、多个微针或微针，其中所述冠状病毒疫苗不包含活病毒。
E39.根据实施方式E1-E36中任一项所述的微针装置、多个微针或微针，其中所述冠状病毒疫苗选自冠状病毒刺突蛋白(例如融合前SARS-CoV-2刺突蛋白)，灭活的SARS-CoV-2(例如UV灭活的SARS-CoV-2或PiCoVacc)；mRNA(例如，编码冠状病毒蛋白的mRNA，例如，编码SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的mRNA，例如，mRNA-1273)；腺病毒载体(例如，表达冠状病毒蛋白(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基)的5型腺病毒载体，例如，Ad5-nCoV)；DNA质粒(例如，编码SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的DNA质粒)，例如，INO-4800)；树突细胞(例如，用慢病毒载体修饰以表达SARS-CoV-2小基因的树突细胞)，例如，LV-SMENP-DC)；和/或人工抗原呈递细胞(aAPC)，例如，用慢病毒载体修饰以表达SARS-CoV-2小基因的aAPC，或其组合。
E40.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含刺突蛋白，例如融合前SARS-CoV-2刺突蛋白；或其亚基。
E41.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含：
(i)完整刺突蛋白，稳定刺突蛋白，锁定刺突蛋白，刺突蛋白亚基或来自刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)；或
(ii)载体(例如5型腺病毒载体)，RNA(例如mRNA、saRNA、modRNA或uRNA)或DNA(例如DNA质粒)，其编码刺突蛋白或其亚基，例如完整刺突蛋白，稳定刺突蛋白，锁定刺突蛋白，刺突蛋白亚基或来自刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。
E42.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含融合前SARS-CoV-2刺突蛋白。
E43.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含灭活的SARS-CoV-2，例如UV灭活的SARS-CoV-2。
E44.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含UV灭活的SARS-CoV-2。
E45.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含重组蛋白，例如重组SARS-CoV-2刺突蛋白，或其亚基。
E46.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含冠状病毒衍生的蛋白，例如融合前SARS-CoV-2刺突蛋白，所述冠状病毒衍生的蛋白包含三聚体结构。
E47.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含脂质纳米颗粒(LNP)制剂，例如由LNP包封的冠状病毒疫苗，例如由LNP包封的mRNA疫苗。
E48.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含mRNA-1273、BNT162、INO-4800、Ad26SARS-CoV-2、TNX-1800或PiCoVacc，或其组合。
E49.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2-S1、SARS-CoV-2-S1fRS09，或其组合。
E50.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗包含MERS-S1、MERS-S1f、MERS-S1fRS09、或MERS-S1ffliC，或其组合。
E51.根据实施方式E1至E5、E7或E10至E50中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述流感疫苗包含一价(例如单价)或多价流感疫苗(例如二价、三价、四价(quadrivalent/tetravalent)或五价流感疫苗)。
E52.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E51中任一项所述的微针装置或多个微针，其被配置成递送(例如释放)两种或更多种流感抗原(例如三种或更多种，或四种或更多种抗原)，例如以针对两种或更多种不同的流感病毒提供保护。
E53.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E52中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含第三微针，所述第三微针包含不同于所述第二微针中的所述流感抗原的流感抗原。
E54.根据实施方式E53所述的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含第四微针，所述第四微针包含不同于所述第二微针和所述第三微针中的所述流感抗原的流感抗原。
E55.根据实施方式E53或E54的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含第五微针，所述第五微针包含与所述第二微针、所述第三微针和所述第四微针中存在的所述流感抗原不同的流感抗原。
E56.根据实施方式E53-E55中任一项所述的微针装置或多个微针，其中：
(i)所述第二微针和所述第三微针中的流感抗原的组合包含二价流感疫苗；
(ii)所述第二微针、所述第三微针和所述第四微针中的流感抗原的组合包含三价流感疫苗；和/或
(iii)所述第二微针、所述第三微针、所述第四微针和所述第五微针中的流感抗原的组合包含四价流感疫苗。
E57.根据实施方式E1至E5、E7或E10至E56中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述流感疫苗包含甲型流感疫苗、乙型流感疫苗、丙型流感疫苗和/或丁型流感疫苗。
E58.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E57中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述流感疫苗包含甲型流感疫苗，任选地其中所述甲型流感疫苗：
(i)是H1N1(例如A/Michigan和/或A/California)疫苗；和/或
(ii)H3N2疫苗(例如，A/Hong Kong和/或A/Switzerland)。
E59.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E58中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述流感疫苗包含乙型流感疫苗，任选地其中所述乙型流感疫苗：
(i)是B/Yamagata谱系(例如B/Phuket)；和/或
(ii)是B/Victoria谱系(例如B/Brisbane)疫苗。
E60.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E59中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述流感疫苗包含甲型流感疫苗(例如H1N1疫苗和/或H3N2疫苗)和乙型流感疫苗(例如B/Yamagata谱系和/或B/Victoria谱系疫苗)。
E61.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E60中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述多个微针包含4:1比率的流感疫苗与冠状病毒疫苗。
E62.根据实施方式E1-E5，E7或E10-E61中任一项所述的微针装置或多个微针，其中冠状病毒疫苗和流感疫苗的组合包含五价疫苗。
E63.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针或微针，其被配置成产生对冠状病毒和/或流感病毒的单剂量保护，例如免疫力。
E64.根据实施方式E1-E5、E7或E10-63中任一项所述的微针装置或多个微针，其中所述微针装置被配置成向所述受试者递送足以诱导免疫应答例如体液和/或细胞免疫应答的量的流感疫苗。
E65.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针被配置成刺穿生物屏障(例如皮肤)。
E66.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针被配置成将微针尖端(例如丝素蛋白尖端)植入受试者的生物屏障(例如皮肤)中。
E67.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针被配置成实现将冠状病毒疫苗和/或流感疫苗局部和/或全身递送(例如释放)至受试者。
E68.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针被配置成向受试者递送有效量的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗。
E69.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述丝素蛋白包含再生丝素蛋白和/或重组丝素蛋白。
E70.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述装置被配置用于所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗的持续释放。
E71。根据实施方式E70所述的微针装置、多个微针、或微针，其中持续释放包括冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的基本上连续的低剂量施用，例如，在包括至少约4天(例如，约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天或更多天，例如，约5天至约25天、约10天至约20天、约10天至约15天、约12天至约16天、或约14天至约15天)的时间段内释放约1ug至约500ug的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗。
E72.根据实施方式E70或E71所述的微针装置、多个微针、或微针，其中持续释放包括持续施用微针尖端中存在的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗总量的约大于0％部分至约100％部分。
E73.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针被配置成在包括至少约4天(例如，约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天或更多天，例如，约5天和约25天之间，约10天和约20天之间，约10天和约15天之间，约12天和约16天之间，或约14天和约15天之间)的时间段内将冠状病毒疫苗和/或流感疫苗释放到受试者的皮肤中。
E74.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针被配置成在包括约1周至约2周(例如，约7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)的时间段内将冠状病毒疫苗和/或流感疫苗释放到受试者的皮肤中。
E75.根据实施方式E1至E5、E7或E10至E74中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗的释放以与所述流感疫苗的释放基本上相同的速率(例如，同时)发生。
E76.根据实施方式E1至E5、E7或E10至E74中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗的释放以与所述流感疫苗的释放不同的速率发生，使得所述冠状病毒疫苗基本上在所述流感疫苗的释放之前或基本上之后释放。
E77.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗通过所述微针稳定，例如在例如室温(例如约25℃)下储存2周或更多周后保留其原始生物活性(例如免疫原性)的至少70％。
E78.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗在约25℃下储存2周后保留其原始生物活性(例如免疫原性)的至少70％，80％或90％；在约25℃下储存4周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少70％，80％或90％；在约25℃下储存8周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少70％，80％或90％；和/或在约25℃下储存12周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少70％，80％或90％。
E79.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗在约37℃下储存2周后保留其原始生物活性(例如免疫原性)的至少60％，70％或80％；在约37℃下储存4周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少50％，60％或70％；在约37℃下储存8周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少50％，60％或70％；和/或在约37℃下储存12周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少30％，40％或50％。
E80.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗在约45℃下储存2周后保留其原始生物活性(例如免疫原性)的至少50％，60％或70％；在约45℃下储存4周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少30％，40％或50％；在约45℃下储存8周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少30％，40％或50％；和/或在约45℃下储存12周后其原始生物活性(例如免疫原性)的至少30％，40％或50％。
E81.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述免疫应答是体液免疫应答，所述体液免疫应答包括：
(i)在受试者的血液中可检测到的提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的特异性抗体)，例如在免疫后至少3，4、5或6天，或至少1、2、3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和/或16周可检测到的；和/或
(ii)在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5和/或6个月可检测到。
E82.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中在免疫后的完整冠状病毒季节期间，在所述受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基特异性的抗体)。
E83.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述免疫应答是包括受试者血液中冠状病毒特异性抗体分泌细胞(例如SARS-CoV-2特异性抗体分泌细胞)水平增加的细胞免疫应答，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周。
E84.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中免疫应答是体液免疫应答，所述体液免疫应答包括：
(i)在受试者的血液中可检测到的提高的血细胞凝集抑制(HAI)抗体滴度，例如在免疫后至少3、4、5、6天或至少1、2、3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和/或16周可检测到的；和/或
(ii)在受试者的血液中可检测到的提高的抗流感IgG滴度，例如在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5和/或6个月可检测到。
E85.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中在免疫后的完整流感季节期间，在所述受试者的血液中可检测到提高的血凝抑制(HAI)抗体滴度。
E86.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中免疫应答是细胞免疫应答，所述细胞免疫应答包括所述受试者的血液中IFNγ分泌细胞的水平的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周。
E87.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述免疫应答是细胞免疫应答，所述细胞免疫应答包括在免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周受试者血液中每预选数目的细胞产生IFNγ的增加。
E88.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针包含一剂量，例如标准剂量的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗。
E89.根据实施方式E88所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗的剂量包含约0.5μg至约500μg(例如，约1至约400μg，约1至约300μg，约1至约250μg，约5至约200μg，约10至约150μg，约1至约50μg，约1至约25μg，约10至约100μg，约20至约80μg，约40至约70μg，约100至约150μg，或约150至约200μg)。
E90.根据实施方式E88或E89所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述冠状病毒疫苗的剂量包含至少约0.5μg(例如，约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、900、950或1000μg)。
E91.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针包含至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％或更多。
E92.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中每个微针包含介于约0.002μg和约5μg之间的所述冠状病毒疫苗(例如，至少约0.003μg、0.004μg、0.005μg、0.01μg、0.02μg、0.05μg、0.06μg、0.07μg、0.08μg、0.09μg、0.1μg、0.12μg、0.14μg、0.16μg、0.18μg、0.2μg、0.25μg、0.3μg、0.35μg、0.4μg、0.45μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1.0μg、1.2μg、1.8μg、2.0μg、2.5μg、3.0μg、3.5μg、4.0μg、4.5μg或5μg的所述冠状病毒疫苗)。
E93.根据实施方式88所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述流感疫苗的标准剂量包括约0.5μg至约65μg/株(例如，约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65μg/株)。
E94.根据实施方式E88所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述流感疫苗的标准剂量包含约15μg/株。
E95.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置，所述多个微针或所述微针，其中所述多个微针包含所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗的标准剂量的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％或更多。
E96.根据实施方式E1-E5、E7或E10-E95中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述多个包含约0.1μg至约65μg的流感疫苗(例如，约0.1μg、约0.2μg、约0.3μg、约0.4μg、约0.5μg、约0.6μg、约0.7μg、约0.8μg、约0.9μg、约1μg、约1μg至约10μg、约10μg至约20μg、约20μg至约30μg、约30μg至约40μg、约40μg至约50μg、约50μg至约65μg的流感疫苗)。
E97.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置，所述多个微针或所述微针，其中所述微针包含应用于可溶解基质的可植入持续释放尖端。
E98.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述背衬选自固体支撑物，例如纸基材料，塑料材料，聚合材料或聚酯基材料(例如Whatman903纸，聚合带，塑料带，粘合剂背衬的聚酯带或其他医用带)。
E98a.据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述背衬包含粘合剂，例如包含(例如浸渍)固体载体(例如多孔载体基质)的粘合剂，或不含固体载体的粘合剂。
E98b.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述背衬包含例如通过温度，氧化和/或UV照射处理的粘合剂。
E98c.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述背衬包含提供与固体支撑物(例如，多孔支撑物基质)的连接的粘合剂。
E99.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含浓度为约1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v的丝素蛋白，或具有根据图4的分子量分布的丝素蛋白，或包含量为约20μg至约245μg的丝素蛋白，例如每121个微针阵列)。
E100.根据实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如，丝素蛋白尖端)包含约1％w/v至约10％w/v(例如，约1％w/v、2％w/v、3％w/v、4％w/v、5％w/v、6％w/v、7％w/v、8％w/v、9％w/v或10％w/v)的10MB丝素蛋白溶液或根据图4的丝素蛋白溶液。
E101.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素尖端)包含约1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)的60MB丝素溶液或图4的丝素溶液，例如100kDa至200kDa(例如约153kDa)的丝素溶液。
E102.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素尖端)包含约1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)的120MB丝素溶液或图4的丝素溶液，例如70kDa至150kDa(例如约100kDa)的丝素溶液。
E103.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素尖端)包含约1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)的180MB丝素溶液或图4的丝素溶液，例如36kDa至100kDa(例如约71kDa)的丝素溶液。
E104.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素尖端)包含约1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)的480MB丝素溶液或图4的丝素溶液，例如1kDa至60kDa(例如约16kDa)的丝素溶液。
E105.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)被配置成用于持续释放并且包含介于约1％至约10％w/v之间的10MB丝素蛋白溶液。
E106.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)被配置成用于持续释放并且包含介于约1％至约10％w/v之间的60MB丝素蛋白溶液。
E107.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)被配置成用于持续释放并且包含介于约1％至约10％w/v之间的120MB丝素蛋白溶液。
E108。根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)被配置成用于持续释放并且包含介于约1％至约10％w/v之间的180MB丝素蛋白溶液。
E109。根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)被配置成用于持续释放并且包含介于约1％至约10％w/v之间的480MB丝素蛋白溶液。
E110.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述基质(例如可溶性基质)包含以下的两种或更多种：
(i)多糖(例如，葡聚糖)；
(ii)二糖(例如蔗糖、麦芽糖和海藻糖)；
(iii)聚合物(例如，甲基纤维素、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)和透明质酸)；
(iv)蛋白质(例如明胶)；
(v)增塑剂(例如，甘油、丙二醇)；以及
(vi)表面活性剂(例如辛基酚乙氧基化物(例如Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)。
E111.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置，所述多个微针或所述微针，其中所述基质包含明胶，葡聚糖，甘油，聚乙二醇(PEG)(例如，包括低分子量PEG)，蔗糖，海藻糖，麦芽糖，羧甲基纤维素(CMC)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，透明质酸，甲基纤维素和/或表面活性剂(例如，辛基苯酚乙氧基化物(例如，Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆P188)和/或聚乙氧基化醇)中的一种或多种，任选地其中所述微针被配置成用于持续释放。
E112.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述基质包含葡聚糖，蔗糖，甘油和表面活性剂，任选地被配置成用于持续释放。
E113.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其配置用于持续释放，所述微针装置，所述多个微针或所述微针包含：
(i)约20％至约40％之间(例如30％)的70kDa葡聚糖；
(ii)约5％至约15％之间(例如约10％)的蔗糖；
(iii)约0.5％至约2.5％之间(例如约1％)的甘油；和
(iv)约0.001％至约1％之间(例如约0.01％)的Triton-X；
(任选地，其中这是用于浇铸和/或用于干燥、固化的基质的组合物的溶液)。
E114.根据实施方式E110-E113中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述右旋糖酐具有约30kD至约600kDa之间的分子量。
E115.根据实施方式E110-E114中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述右旋糖酐衍生自肠膜明串珠菌。
E116.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述基质不包含聚(丙烯酸)(PAA)。
E117.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含：
(i)二糖(例如蔗糖、麦芽糖和海藻糖)；
(ii)聚合物(例如，甲基纤维素、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素(CMC)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、透明质酸)；
(iii)氨基酸(例如苏氨酸)；
(iv)增塑剂(例如，甘油、丙二醇)；
(v)缓冲液(例如PBS)；
(vi)表面活性剂(例如辛基酚乙氧基化物(例如Triton-X)、聚山梨醇酯(例如Tween 20)、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)；和/或
(vii)佐剂。
E118.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含赋形剂(例如本文所述的赋形剂)。
E119.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含佐剂(例如本文所述的佐剂)。
E120.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含羧甲基纤维素(CMC)，蔗糖和苏氨酸中的一种或多种。
E121.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含缓冲液，任选地磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
E122.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针(例如，微针尖端和/或基质)不包含羧甲基纤维素，或者如果存在CMC，其以35％w/w或更少的量存在。
E123.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针(例如，所述微针尖端)包含小于35％w/w的羧甲基纤维素(例如，小于30％w/w，29％w/w，28％w/w，27％w/w，26％w/w，23％w/w，22％w/w，21％w/w，20％w/w，19％w/w，18％w/w，15％w/w，14％w/w，13％w/w，11％w/w，10％w/w，9％w/w，8％w/w，7％w/w，6％w/w，5％w/w，2％w/w，1％w/w，0.5％w/w，0.3％w/w，0.2％w/w或0.1％w/w的羧甲基纤维素)。
E124.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其基本上仅包含可溶解材料，例如基本上仅包含聚合物基和/或糖基材料。
E125.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其被配置成施加到对象的生物屏障(例如，皮肤)，并留在适当位置以完全溶解。
E126.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针被配置成以介于约100μm和约1mm之间(例如介于约100μm和600μm之间)的深度(例如尖端的远侧部分的最大穿透深度)将持续释放尖端植入受试者(例如人类受试者)的皮肤中。
E127。根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针的长度介于约350μm至约1500μm之间。
E128.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)的高度可延伸到所述微针的整个高度的约一半。
E129.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)的高度为约75μm-约475μm。
E130.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包括介于约0.5μm至约100μm之间的尖端半径。
E131.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包括介于约5μm至约10μm之间的尖端半径。
E132.根据前述实施方式中任一项所述的微针装置、多个微针、或微针，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包括在大约5度和大约45度之间的角度。
E133.一种在受试者中提供对病毒(例如SARS-CoV-2、SARS-CoV，MERS-CoV和/或流感)的免疫性，例如广谱免疫性的方法，包括使受试者的皮肤与微针装置，多个微针或前述实施方式中任一个的微针接触。
E134.一种在受试者中提供抗原，例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗(例如SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原、MERS-CoV抗原和/或流感抗原、或其疫苗制剂)的控制释放或持续释放的方法，包括使受试者的皮肤与微针装置，多个微针或实施方式E1-132中任一个的微针接触。
E135.一种在受试者中增强对病毒(例如冠状病毒(例如SARS-CoV-2、SARS-CoV和/或MERS-CoV)和/或流感病毒)的免疫应答的方法，包括使受试者的皮肤与根据实施方式E1-132中任一项所述的微针装置、多个微针或微针接触。
E136.根据实施方式E133-E135中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是体液和/或细胞免疫应答，其包括：
(i)在受试者的血液中可检测到的提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如，5、6天，或至少1、2、3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，和/或16周可检测到的，的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的特异性抗体)；
(ii)在受试者的血液中可检测到的提高的抗冠状病毒IgG(例如，抗SARS-CoV-2IgG)滴度，例如，在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5和/或6个月可检测到；
(iii)在免疫后完整的冠状病毒季节期间，在受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基特异性的抗体)；
(iv)受试者血液中IFNγ分泌细胞水平的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周；和/或
(v)受试者血液中每预选数目的细胞产生IFNγ的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周。
E137.根据实施方式E133-E136中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是体液和/或细胞免疫应答，其包括：
(i)在受试者的血液中可检测到的提高的血细胞凝集抑制(HAI)抗体滴度，例如在免疫后至少3、4、5、6天或至少1、2、3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和/或16周可检测到的；
(ii)在受试者的血液中可检测到的提高的抗流感IgG滴度，例如在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5和/或6个月可检测到。
(iii)在免疫后的完整流感季节期间，在受试者的血液中可检测到提高的血凝抑制(HAI)抗体滴度；
(iv)受试者血液中IFNγ分泌细胞水平的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周；和/或
(v)受试者血液中每预选数目的细胞产生IFNγ的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周。
E138.一种在受试者中提供对冠状病毒(例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV、和/或MERS-CoV)和/或流感病毒的广谱免疫的方法，所述方法包括使受试者的皮肤与微针装置，多个微针，或实施方式E1-E132中任一个的微针接触，例如，在受试者中引起对冠状病毒和/或流感病毒的漂移株的免疫应答(例如，细胞免疫应答和/或体液免疫应答)。
E139.根据实施方式E133-E138中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗以足以导致以下中的一种或多种的量(例如，剂量)和/或时间段施用：
(i)在受试者中暴露于一定量和/或时间段的冠状病毒和/或流感疫苗中的一种或多种抗原以在受试者中引起广谱免疫，例如引起针对冠状病毒和/或流感病毒的漂移株的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)；或
(ii)受试者中一种或多种抗原的水平基本上稳定，例如约20％、15％、10％、5％或1％至导致针对所述一种或多种抗原的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)所需的量，例如最小量。
E140.根据实施方式E133-E139中任一项所述的方法，其中施用所述冠状病毒疫苗和流感疫苗以便将每种疫苗的剂量(例如抗原浓度)维持足以在所述受试者中引起广谱免疫的时间段，例如引起针对所述冠状病毒的漂移病毒株(例如漂移的SARS-CoV-2，SARS-CoV和/或MERS-CoV病毒)和/或流感病毒的漂移病毒株的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)(例如其中所述时间段为约1至21天，例如约5至25天或约10至15天，例如约1、2、3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，16，17)，18，19，20，21，22，23，24或25天)。
E141.根据实施方式E133-E140中任一项所述的方法，其中所述微针装置，所述多个微针或所述微针在持续的时间段内维持所述受试者中的抗原释放和/或水平。
E142.根据实施方式E133-E141中任一项所述的方法，其中所述微针装置，所述多个微针或所述微针在持续的时间段内维持向所述受试者的连续或非连续的抗原释放。
E143.根据实施方式E133-E142中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在包括至少约一周，例如约1-2周，约1-3周或约1-4周的时间段内施用，例如通过所述微针装置，所述多个微针或所述微针释放。
E144.根据实施方式E133-E143中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在包括至少约4天(例如，约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天或更长)的时间段内施用，例如通过微针装置，多个微针或微针释放。
E145.根据实施方式E133-E144中任一项所述的方法，其中冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的剂量的至少大约1％(例如，剂量的至少大约0.5％到大约10％，至少大约5％到大约15％，至少大约10％到大约20％)，例如，通过微针装置，多个微针，或微针释放到受试者中，维持包括至少大约4天(例如，大约4，5、6、7、8、9、10、11，12，13，或14天，或更多，例如，在大约5天和大约25天之间，在大约10天和20天之间，或在大约14天和15天之间)的时间段。
E146.根据实施方式E133-E145中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在一段时间内以总剂量(例如，标准剂量)的多个部分剂量施用，例如，通过所述微针装置，所述多个微针或所述微针释放，例如，使得实现免疫应答和/或广谱免疫。
其中在每个部分剂量中施用的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的量不超过1/X，其中X是任何数字，例如其中X是疫苗总剂量，例如标准剂量，的0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1、2、3、4、5、6、7、8、9，10，15，20，30，40，50，60，70，80，90或100或更多。
E147.根据实施方式E133-E146中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以等于总剂量的百分比(例如，标准剂量的百分比)的多个剂量施用，例如，通过所述微针装置，所述多个微针或所述微针释放，例如，进入受试者的皮肤，持续一段时间，例如，使得实现广谱免疫。
其中在多个剂量的每一个中施用的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的量是约X％，其中X是任何数字，例如，其中X是疫苗的总剂量(例如，标准剂量)的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400或500或更多。
E148.根据实施方式E133-E147中任一项所述的方法，其中施用冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以实现广谱免疫，例如实现免疫应答，例如对漂移的病毒株(例如漂移的冠状病毒病毒株，例如漂移的SARS-CoV-2病毒株，和/或漂移的流感病毒株)的细胞免疫和/或体液免疫应答。
E149.根据实施方式E133-E148中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以2，3、4、5、6，7，8，9，10或更多个分剂量施用。
E150.根据实施方式E133-E149中任一项所述的方法，其中施用所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的总剂量(例如，标准剂量)以实现广谱免疫。
E151.根据实施方式E133-E149中任一项所述的方法，其中施用少于总剂量(例如，标准剂量)的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以实现广谱免疫。
E152.根据实施方式E133-E149中任一项所述的方法，其中施用多于总剂量(例如，标准剂量)的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以实现广谱免疫。
E153.根据实施方式E146-E149中任一项所述的方法，其中在每个分次剂量中施用的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的量是相同的。
E154.根据实施方式E146-E149中任一项所述的方法，其中在每个分次剂量中施用的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的量是不同的。
E155.根据实施方式E146-E154中任一项所述的方法，其中所述多个分剂量通过肌内注射或皮内注射施用，例如以实现冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的控制释放或持续释放。
E156.根据实施方式E146-E155中任一项所述的方法，其中该多个分次剂量中的每个剂量在所述时间段的持续时间内每天至少一次或两次，每两天至少一次，每三天至少一次，每四天至少一次，每五天至少一次，每六天至少一次，每周至少一次或每月至少一次施用。
E157.根据实施方式E133-E156中任一项所述的方法，其中：
(i)所述冠状病毒疫苗包含与第一冠状病毒株相关的抗原，并且向所述受试者施用一定剂量的所述冠状病毒疫苗导致对不存在于所述组合物或所述疫苗中或与所述组合物或所述疫苗相关的第二冠状病毒株(例如，漂移的SARS-CoV-2株)的广谱免疫；
(ii)所述流感疫苗包含第一流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一流感病毒株导致对所述组合物或所述疫苗中不存在的第二流感病毒株(例如漂移的流感病毒株)的广谱免疫；
(ii)所述流感疫苗包含第一甲型流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一甲型流感病毒株导致对所述组合物或所述疫苗中不存在的漂移的流感病毒株(例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的广谱免疫；
(iii)所述流感疫苗包含第一乙型流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一乙型流感病毒株导致对所述组合物或所述疫苗中不存在的漂移的流感病毒株(例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的广谱免疫；
(iv)所述流感疫苗包含第一丙型流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一丙型流感病毒株导致对所述组合物或所述疫苗中不存在的漂移的流感病毒株(例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的广谱免疫；和/或
(v)流感疫苗包含第一丁型流感病毒株，并且向受试者施用第一丁型流感病毒株的剂量导致对组合物或疫苗中不存在的漂移的流感病毒株(例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的广谱免疫。
E158.根据实施方式E157所述的方法，其中所述第一甲型流感疫苗包含：
(i)H1N1(例如A/Michigan和/或A/California)疫苗；和/或
(ii)H3N2(例如，A/Hong Kong和/或A/Switzerland)疫苗。
E159.根据实施方式E157或E158的方法，其中所述漂移的甲型流感病毒株包含：
(i)H1N1菌株(例如A/Michigan和/或A/California)；和/或
(ii)H3N2菌株(例如，A/Hong Kong和/或A/Switzerland)。
E160.根据实施方式E157-159中任一项所述的方法，其中：
(i)第一甲型流感疫苗包含A/Michigan的H1N1疫苗，漂移的甲型流感病毒株包括A/California；和/或
(ii)第一种甲型流感疫苗包含A/Hong Kong的H3N2疫苗，漂移的甲型流感病毒株是A/Switzerland。
E161.根据实施方式E157-160中任一项所述的方法，其中所述第一乙型流感疫苗包含：
(i)B/Yamagata谱系株(例如，B/Phuket)；和/或
(ii)B/Victoria谱系菌株(例如B/Brisbane)。
E162.根据实施方式E157-161中任一项所述的方法，其中：
(i)漂移的乙型流感病毒株是B/Yamagata谱系病毒株(例如B/Phuket)；和/或
(ii)漂移的乙型流感病毒株是B/Victoria谱系病毒株(例如B/Brisbane)。
E163.根据实施方式E157-162中任一项所述的方法，其中所述第一乙型流感疫苗针对B/Victoria谱系病毒株B/Brisbane，并且所述漂移的乙型流感病毒株是B/Yamagata谱系病毒株B/Phuket。
E164。根据实施方式E133-163中任一项所述的方法，其中所述免疫应答和/或广谱免疫包括细胞和/或体液免疫应答，其包括：
(i)在受试者的血液中可检测到的提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如，SARS-CoV-2特异性抗体，例如，SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的特异性抗体)，例如，免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更多可检测到的，任选地，其中提高的冠状病毒特异性抗体滴度是针对漂移
(ii)在受试者的血液中可检测到的提高的抗冠状病毒IgG(例如，抗SARS-CoV-2IgG)滴度，例如，在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个月或更长时间可检测到，任选地，其中所述提高的抗冠状病毒IgG滴度是针对漂移的冠状病毒株(例如，漂移的SARS-CoV-2株)；和/或
(iii)免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更长时间可检测的受试者骨髓中针对冠状病毒，例如SARS-CoV-2病毒，例如漂移的SARS-CoV-2株的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平。
E165.根据实施方式E133-164中任一项所述的方法，其中在免疫后完整的冠状病毒季节期间，在所述受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如，SARS-CoV-2特异性抗体，例如，对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基特异性的抗体)，任选地其中所述提高的冠状病毒特异性抗体滴度是针对漂移的冠状病毒株(例如，漂移的SARS-CoV-2株)。
E166.根据实施方式E133-165中任一项所述的方法，其中例如在免疫后6个月时，例如基于受试者血液中可检测到的提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基特异性的抗体)的血清转化百分比大于约20％(例如20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％或更多，例如100％)。
E167.根据实施方式E165所述的方法，其中与冠状病毒疫苗(例如SARS-CoV-2疫苗)的单次给药或快速浓注给药相比，提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的特异性抗体)，提高的抗冠状病毒IgG(例如抗SARS-CoV-2IgG)滴度，和/或抗冠状病毒(例如SARS-CoV-2病毒)的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平更高(例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍，或15倍或更高)。
E168.根据实施方式E133-167中任一项所述的方法，其中所述免疫应答和/或广谱免疫包括细胞和/或体液免疫应答，其包括：
(i)在受试者的血液中可检测到的提高的血细胞凝集抑制(HAI)抗体滴度，例如在免疫后至少3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43、44，45，46，47，48，49，51和/或52周或更多天可检测到，任选地其中提高的HAI抗体滴度是针对漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株；
(ii)在受试者的血液中可检测到的提高的抗流感IgG滴度，例如在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个月或更多可检测到，任选地其中提高的抗流感IgG滴度是针对漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株；和/或
(iii)免疫后至少1、2、3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，25，26，27，28，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43、44，45，46，47，48，49，51和/或52周或更多可检测到的受试者骨髓中的针对流感病毒(例如漂移的甲甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平。
E169.根据实施方式E168所述的方法，其中在免疫后的完整流感季节期间，在受试者的血液中可检测到提高的血细胞凝集抑制(HAI)抗体滴度，任选地其中提高的HAI抗体滴度针对漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株。
E170.根据实施方式E133-E169中任一项所述的方法，其中例如基于例如在免疫后6个月在受试者血液中可检测到的提高的HAI抗体滴度的血清转化百分比大于大约20％(例如20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多，例如100％)。
E171.根据实施方式E133-E170中任一项所述的方法，其中所述广谱免疫包括细胞免疫应答，所述细胞免疫应答包括受试者血液中IFNγ分泌细胞水平的增加，例如免疫后至少1、2、3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43、44，45，46，47，48，49，51和/或52周或更多。
E172.根据实施方式E133-E171中任一项所述的方法，其中所述广谱免疫包括细胞免疫应答，所述细胞免疫应答包括受试者血液中每预选数目细胞IFNγ产生的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更多。
E173.根据实施方式E168-E172中任一项所述的方法，其中与单剂量施用或快速浓注施用所述疫苗相比，所述受试者中可检测到的提高的HAI抗体滴度，提高的抗流感IgG滴度，针对所述病毒的抗体分泌浆细胞(ASC)水平，IFNγ分泌细胞水平和/或每预选数目的细胞产生IFNγ更大(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍或更大)。
E174.一种用于在受试者中提供对冠状病毒(例如，SARS-CoV-2，SARS-CoV，和/或MERS-CoV)和/或流感病毒的免疫应答(例如，细胞免疫应答和/或体液免疫应答)和/或广谱免疫的方法，所述方法包括使所述受试者的皮肤与微针装置，多个微针，或实施方式E1-E132中任一项所述的微针接触。
其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以足以在所述受试者中引发针对所述冠状病毒和/或所述流感病毒的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)的量(例如剂量)和/或在包括约5-25天(例如约10-20天，约12-18天或约14-15天)，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天的时间段内施用。
E175.根据实施方式E133-E174中任一项所述的方法，其中所述受试者(例如，人类受试者)是儿童受试者。
E176.根据实施方式E133-E174中任一项所述的方法，其中所述受试者(例如，人类受试者)是成人受试者。
E177.根据实施方式E133-E174中任一项所述的方法，其中所述受试者(例如，人类受试者)是老年受试者。
E178.根据实施方式E133-E177中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗预防性施用。
E179.根据实施方式E133-E178中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的单剂量施用提供针对受试者中例如冠状病毒和/或流感病毒的感染的保护。
E180.根据实施方式E133-E179中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗作为贴片，例如单一贴片施用。
E181.根据实施方式E180所述的方法，其中由健康护理专业人员(例如，医生或护士)将所述贴片施用至所述受试者。
E182.根据实施方式E180所述的方法，其中所述贴片是自我施用的。
E182a.根据实施方式E180-E182中任一项所述的方法，其中使用施用器施用所述贴片。
E183.根据实施方式E180-E182a中任一项所述的方法，其中所述受试者佩戴所述贴片持续小于1小时的时间段，例如约1分钟至约45分钟，约2分钟至约30分钟，约5分钟至约15分钟，例如约5分钟。
E184.根据实施方式E133-E183任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗季节性地施用，例如每冠状病毒季节或流感季节一次(例如每年一次)。
E185.根据实施方式E133-E184中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗以定期加强时间表，例如每年施用。
E186.根据实施方式E133-E185中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗提供针对冠状病毒疾病2019(COVID-19)，严重急性呼吸综合征(SARS)，中东呼吸综合征(MERS)，流感或其组合的保护(例如预防)，例如持续冠状病毒和/或流感季节。
E187.根据实施方式E133-E186中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗提供针对COVID-19和/或流感的保护(例如，预防)。
E188.一种生产微针装置的方法，所述方法包括：
提供包括模具本体的模具，所述模具本体具有形成在其中的针腔阵列，所述针腔具有预定形状，例如金字塔形和/或圆锥形针腔；
用组合物(例如，包含丝素蛋白的组合物)，冠状病毒抗原(例如，冠状病毒疫苗)(例如，以下中的一种或多种：SARS-CoV-2抗原，SARS-CoV抗原，或MERS-CoV抗原，或其疫苗制剂)，和/或流感抗原，例如流感疫苗(例如一种或多种流感抗原，或其疫苗制剂)；
干燥针腔的填充尖端以产生微针尖端(例如丝素蛋白尖端)，并任选地退火微针尖端；
用基质(例如可溶性基质)溶液填充模具的针腔；
干燥所述基质溶液以产生用于所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)的基层；以及
任选地将背衬施加到基层上以产生微针装置。
E189.根据实施方式E188所述的方法，其还包括任选地在施加所述背衬之前将所述微针装置从所述模具移除。
E190.根据实施方式E188或E189所述的方法，其中通过将所述模具弯曲远离所述微针装置来移除所述微针装置。
E191.根据实施方式E188-E190中任一项所述的方法，其还包括将微针装置包装在具有低湿气透过率的容器中，所述容器具有干燥剂以维持包装内约0％至约50％(例如约0％至10％，约10％至约20％，约20％至约30％，约30％至约40％，或约40％至50％，例如约25％)的相对湿度。
E192.根据实施方式E188-E191中任一项所述的方法，其中所述组合物(例如包含丝素蛋白的组合物)，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗溶液通过纳升印刷分配到模具中的每个针腔中。
E193.根据实施方式E188-E192中任一项所述的方法，其中填充针腔的尖端包括将溶液例如丝素蛋白，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗溶液分配到每个针腔中。
E194.根据实施方式E188-E193中任一项所述的方法，其中填充所述针腔的尖端包括将冠状病毒疫苗溶液分配到一个或多个针腔的第一部分中，和将第一流感疫苗溶液分配到一个或多个针腔的第二部分中。
E195.根据实施方式E194所述的方法，其中填充针腔的尖端还包括将第二流感疫苗溶液分配到一个或多个针腔的第三部分中。
E196.根据实施方式E195所述的方法，其中填充针腔的尖端还包括将第三流感疫苗溶液分配到一个或多个针腔的第四部分中。
E197.根据实施方式E196所述的方法，其中填充所述针腔的尖端还包括将第四流感疫苗溶液分配到一个或多个针腔的第五部分中。
E198.根据实施方式E194-E197中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三和/或第四流感疫苗包含甲型流感疫苗(例如H1N1疫苗和/或H3N2疫苗)和/或乙型流感疫苗(例如B/Yamagata谱系和/或B/Victoria谱系疫苗)。
E199.根据实施方式E194-E198中任一项所述的方法，其中所述第一、第二、第三和/或第四流感疫苗的组合包含四价流感疫苗，和/或其中所述冠状病毒疫苗与所述第一，第二，第三和第四流感疫苗的组合包含五价疫苗。
E200.根据实施方式E188-E199中任一项所述的方法，其中填充针腔的尖端提供包含4：1比例的流感疫苗与冠状病毒疫苗的微针装置。
E201.根据实施方式E188-E200中任一项所述的方法，其中干燥针腔的填充尖端包括一次干燥步骤和二次干燥步骤。
E202.根据实施方式E188-E201中任一项所述的方法，其中干燥所述基质(例如可溶性基质)溶液包括使所述模具经受3900rpm的离心2分钟并用50μL基质溶液顶出所述针腔。
E203.根据实施方式E188-E202中任一项所述的方法，其中所述基质填充以纳升(nL)分散进行。
E204.根据实施方式E188-E203中任一项所述的方法，还包括在填充针腔的尖端之后(例如，在填充基部之前)的退火步骤。
E205.根据实施方式E188-E204中任一项所述的方法，还包括在填充针腔的尖端之后(例如，在填充基部之前)的水退火步骤。
E206.根据实施方式E188-E205中任一项所述的方法，其中所述背衬层包括纸背衬层和粘性塑料带中的一种。
E207.根据实施方式E1-E206中任一项所述的微针、微针装置或方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗是佐剂化的。
E208.根据实施方式E1-E206中任一项所述的微针、微针装置或方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗是无佐剂的。
附图说明
该专利或申请文件包含至少一张彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由办公室在请求和支付必要费用后提供。
图1是示出根据本发明的示例的示例性微针制造工艺的示意图。
图2示出具有施加到背衬或“手柄”层上的微针阵列的示例性微针装置。
图3示出了包括多个微针的示例性微针装置，所述微针具有足够的机械特性(例如强度)和合适的几何形状(例如尖端锐度、尖端夹角、长度和针间间距)以刺穿生物屏障(例如皮肤)，从而实现将疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗、流感疫苗或其组合)递送至受试者。
图4示出了可用于制造本文所述的微针或微针装置的示例性心蛋白溶液的各种分子量分布。
图5是显示制造成在不同微针中包括不同制剂的示例性微针装置的一部分的放大视图的图像。
图6显示了从收集自Balb/c小鼠(n＝5/组)的血液样品获得的刺突特异性IgG滴度的比较，所述Balb/c小鼠用1μg或5μgSARS-CoV-2重组蛋白疫苗以4周的间隔免疫两次，所述免疫通过推注肌内注射(IM)，推注皮内注射(ID)，或在10天内等效的每日分剂量ID以模拟持续释放动力学(10dSR)。报告为几何平均值±95％置信区间；对对数转换值进行Tukey事后分析的单向ANOVA*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001(仅绘制关键比较)。
图7显示了从收集自Balb/c小鼠(n＝5/组)的血液样品获得的刺突特异性IgG滴度的比较，所述Balb/c小鼠用5μg SARS-CoV-2重组蛋白疫苗以4周间隔通过团注肌内注射(IM；纯的或浓缩的疫苗)或经由微针装置(MIMIX；浓缩疫苗)接种两次。报告为几何平均值±95％置信区间；用Tukey事后分析对log转化值进行双向重复测量ANOVA*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图8显示从收集自Balb/c小鼠(n＝5/组)的血液样品获得的刺突特异性IgG滴度的比较，所述Balb/c小鼠用5μg、10μg或15μgSARS-CoV-2重组蛋白疫苗以4周间隔通过团注肌内注射(IM)免疫两次或通过微针装置(MIMIX)免疫一次。报告为几何平均值±95％置信区间；对log转换值进行
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事后分析的双向ANOVA*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图9显示了从通过微针装置(MIMIX)用5μgSARS-CoV-2重组蛋白疫苗免疫的Balb/c小鼠(n＝5/组)采集的血液样品中获得的刺突特异性IgG滴度的比较，所述微针装置使用在室温，10％RH下储存8周的贴片或新鲜制备的贴片。报告为几何平均值±95％置信区间；对数转换值的非配对t检验；p＝0.7915。
具体实施方式
本文提供微针(例如，基于丝素蛋白的微针)和微针装置(例如，基于丝素蛋白的微针装置)，包括微针贴片，其经配置以并入有效量的治疗剂(例如疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗，流感疫苗或其组合))并随后将其释放(例如投与)到个体中(例如，进入和/或穿过个体的生物屏障，例如皮肤)。在某些实施方式中，本文所述的微针和装置被配置成包封和释放核酸分子，例如mRNA。在一些实施方式中，mRNA编码疫苗抗原。使用本文所述的微针和微针装置(包括微针贴片)可导致受试者对病毒(例如冠状病毒和/或流感病毒)的免疫力(例如广谱免疫力)。
本公开内容至少部分基于以下发现：调节抗原呈递的动力学以模拟天然感染(例如，病毒感染)的抗原呈递的动力学可驱动更有效的免疫应答，例如更有效的细胞和/或体液免疫应答(参见，例如，Tam等，PNAS.113:E6639-E6648,2016；和Schipper等，J.ControlRelease.242:141-147,2016)。不希望受理论束缚，本文所述的微针和微针装置可通过使病毒衍生的抗原，免疫原和/或疫苗能够释放(包括控制释放或持续释放)到受试者中，例如释放到受试者的真皮皮肤层中来模拟抗原呈递(例如病毒抗原呈递)的天然过程。这种抗原的持续释放可以提供优于常规疫苗递送方法的许多优点，包括但不限于实现剂量节约和/或在淋巴结内提供增加的抗原可用性，如在生发中心内的B细胞亲和力成熟期间。通过本文所述的制剂，组合物、制品、装置、制剂、微针和微针装置实现的控制释放或持续释放可在受试者中诱导更大的免疫原性，增强的免疫应答，其特征可在于更有效的细胞和/或体液免疫应答，和/或广谱免疫，与疫苗如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的单剂量施用或推注施用(例如鼻内或皮下施用)相比。
在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置包括可植入的控释或缓释微针尖端(例如，丝基微针尖端)，其包封和/或稳定治疗剂，例如疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)；以及支撑远侧微针尖端的基层(例如，溶解基层)。在将微针或微针装置施用于受试者的生物屏障时，基质层可溶解并且微针尖端(例如，丝基微针尖端)可以预定深度(例如，尖端的远侧部分的最大穿透深度)植入生物屏障(例如，皮肤的真皮层，例如，在约100μm和约800μm之间的深度)内。在一些实施方式中，整个尖端以介于约100μm和约800μm之间的深度嵌入在例如皮肤的真皮层内。然后，植入的微针尖端可以在足够长的时间段内缓慢释放治疗剂，该时间段足够长以能够对病毒产生免疫力，防止病毒感染和/或治疗病毒感染。在一些实施方式中，治疗剂(例如疫苗)的时间段和释放动力学可模拟病毒的天然感染的时间段和释放动力学。在一些实施例中，植入尖端可在至少约4天(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12，13或14天或更多天，例如，约5天与约25天之间，约4天与约14天之间，约10天与约20天之间，约10天与约15天之间，约14天与约16天之间，约14天与约15天之间，例如，约1-2周，约1-3周或约1-4周，例如，约一周，约两周，约三周，约四周，约五周)的时间段内释放治疗剂，例如疫苗。或约六周或更多周)。
在一些实施方式中，可以调节丝素蛋白基质，例如可植入的控释或缓释微针尖端的各种性质，包括例如结晶度，β-折叠含量和分子量，以调节(例如改变和/或修饰)疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从微针尖端的释放动力学(例如释放速率)。在一些实施方式中，可植入控释或缓释微针尖端包含例如基于“结晶度指数”(例如本领域已知的“结晶度指数”)介于约10％和约60％之间(例如约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％)的β-片层含量。
在另一个方面，本公开的特征在于微针(例如，基于丝素蛋白的微针)和微针装置(例如，基于丝素蛋白的微针装置)，其被配置成根据各种释放动力学释放疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗，流感疫苗或其组合)，诸如突发释放(例如，在施用于生物屏障(诸如皮肤)时，微针的立即或快速溶解，通常在几分钟内发生)和/或持续释放。持续释放的实例包括但不限于零级释放(例如，释放速率与剂型中的疫苗、抗原和/或免疫原浓度无关，例如，释放速率在一段时间内大致恒定，例如，每单位时间消除恒定量的疫苗、抗原和/或免疫原)，一级释放(例如，释放速率是剂型中剩余的疫苗、抗原和/或免疫原的量的函数，例如，每单位时间消除疫苗、抗原和/或免疫原的恒定比例，例如百分比)，和二级释放(例如，其中将剂量中疫苗、抗原和/或免疫原的浓度加倍，释放速率为四倍)。在一些实施例中，微针的一部分配置成用于第一类型的释放，例如突发释放，而微针的另一部分配置成用于第二类型的释放，例如持续释放。此外，疫苗、抗原和/或免疫原剂(例如冠状病毒疫苗，流感疫苗或其组合)从本文所述的微针(例如基于丝素蛋白的微针)的释放(例如施用)可通过疫苗、抗原和/或免疫原从微针或其部分的扩散来促进；微针或其一部分的降解(例如，蛋白酶介导的降解)；和/或溶解所述微针或其一部分。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置表现出疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的控制释放或持续释放至少约1-3周(例如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天，例如约5至约25天，例如约10至约15天)，这导致免疫原性提高，免疫应答增强和/或广谱免疫中的一种或多种。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置证明冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的控制释放或持续释放约5至约25天。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置证明冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的控制释放或持续释放约10至约20天。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置证明冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的控制释放或持续释放约10至约15天。
本文所述的微针(例如，基于丝素蛋白的微针)被配置成具有足够的机械特性(例如，强度)和合适的几何形状(例如，尖端锐度、尖端夹角、长度、针间间距)以刺穿生物屏障(例如皮肤)，例如以实现疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗、流感疫苗或其组合)向受试者的局部和/或全身递送。
在一些实施方式中，微针和微针装置(例如包含本文所述的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以是自我施用的并且是耐储存的。在一些实施方式中，微针和微针装置可提供单剂量保护，例如，对抗冠状病毒和/或流感病毒，并且还可保护对抗菌株漂移(例如，通过感染模拟)。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可提供季节性保护，例如对抗冠状病毒和/或流感病毒。
在其他实施方式中，还公开了用于施用疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的方法、制剂、组合物、制品、装置和/或制剂，所述疫苗、抗原和/或免疫原向受试者提供改善的免疫原性，增强的免疫应答和/或广谱免疫。因此，本文公开了用于在受试者中控制和/或持续释放疫苗、抗原和/或免疫原的组合物，制剂，装置(例如微针和微针装置)，试剂盒，以及制备和使用它们的方法。
在一些实施方式中，控释或缓释制剂，组合物，制品，装置和制剂包含至少一种本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施方式中，本文所述的用于控释和/或缓释的制剂、组合物、制品、装置和制剂在足以提供对病毒例如冠状病毒和/或流感病毒的免疫力的足够长的时间段内释放疫苗、抗原和/或免疫原(例如，在至少约1天至约25天(例如，约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天或更多天，例如，约4天至约25天，约5天至约25天，约10天至约20天，约10天至约15天，例如，约1-2周，约1-3周或约1-4周，例如，约一周、约两周、约三周、约四周、约五周、或约六周或更多周的时间段内)。因此，公开了控释或缓释制剂、组合物、制品、装置和制剂、微针、微针装置、试剂盒及其制备和使用方法。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于指该冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。例如，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
术语“约”当指的是可测量的值例如量，持续时间等时，意指涵盖与指定值的±20％，或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，或在一些情况下±1％，或在一些情况下±0.1％的变化，因为此类变化是适当的，例如，以执行所公开的方法。
如本文在说明书和权利要求书中所用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“任一者或两者”，即在一些情况下结合地存在而在其他情况下分离地存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应当以相同的方式解释，即如此结合的要素中的“一个或多个”。除了由“和/或”条款具体指明的要素之外，可以任选地存在其他要素，无论与具体指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，当结合开放式语言如“包含”使用时，对“A和/或B”的引用在一个实施例中可以仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方式中，仅B(任选地包含A以外的元素)；在又一个实施方式中，对A和B两者(任选地包括其他元素)；等等。
如本文所用，“佐剂”是指能够促进或放大免疫事件的级联，最终导致增加的免疫应答，例如对抗原的整合的身体应答，包括细胞和/或体液免疫应答的物质。佐剂的非限制性实例包括：铝(例如铝凝胶和/或铝盐，如氢氧化铝，磷酸铝和硫酸铝钾)，脂质(例如角鲨烯，单磷酰脂质A(MPL))，ASO3(例如包含D,L-α-生育酚(维生素E)，角鲨烯和聚山梨醇酯80的佐剂)，基于角鲨烯的佐剂(例如MF59)，基于胞嘧啶磷酸鸟嘌呤的佐剂(例如CpG 1018)，衍生自δ菊粉的佐剂(例如Advax佐剂)和ASO4(例如包含氢氧化铝和MPL的组合的佐剂)。
术语“给药”或“施用”包括将治疗剂引入受试者以执行其预期功能的途径。在某些实施方式中，治疗剂的施用，例如通过如本文所述的微针或微针装置，可以重复并且施用可以间隔至少约1天，2天，3天，5天，10天，15天，30天，45天，3周，4周，5周，6周，12周，2个月，75天，3个月或至少6个月。在其他实施方式中，治疗剂的施用，例如通过本文所述的微针或微针装置，可以每年重复。在其他实施方式中，治疗剂的施用，例如通过如本文所述的微针或微针装置，可以按需要频繁地重复以实现治疗或预防效果。“与一种或多种其他治疗剂组合”施用包括以任何顺序同时(并发)和连续施用。
如本文所用，术语“抗原”是指能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，例如导致B和/或T淋巴细胞和/或先天免疫细胞和/或抗原呈递细胞活化的分子(例如基因产物(例如蛋白或肽)，病原体片段，完整病原体，病毒载体或病毒颗粒)。任何大分子，包括蛋白或肽，可以是抗原。抗原也可以来源于基因组和/或重组DNA。例如，包含编码能够引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA编码“抗原”。在一些实施方式中，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码，抗原也根本不需要由基因编码。在一些实施方式中，抗原可以是合成的或可以衍生自生物样品，例如组织样品，肿瘤样品，细胞或具有其他生物组分的流体。在一些实施方式中，抗原可衍生自病毒，例如灭活病毒，病毒样颗粒或病毒载体。本文所用的抗原也可以是几种单独抗原的混合物。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外源抗原的免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如B细胞、树突细胞等)。T细胞可利用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将其呈递给T细胞。
如本文所用，术语“抗原漂移”是指病毒(例如冠状病毒或流感病毒)的基因中的突变，其在病毒复制时随时间累积。这些突变通常产生彼此紧密相关(例如，在系统发生树上紧密定位在一起)的病毒，并且在本文中称为“漂移株”。在一些实施方式中，彼此紧密相关的病毒具有相似的抗原特性，并且免疫系统暴露于第一病毒，随后第一病毒的漂移病毒株通常将识别漂移病毒株并通过引发免疫应答(例如保护性免疫应答)对其作出应答，称为“交叉保护”。然而，在一些实施方式中，这些小的遗传改变可以随时间累积并且导致抗原性不同的病毒(例如，位于系统发生树上的更远处)，并且当这种情况发生时，身体的免疫系统可能不识别那些病毒(例如，那些漂移的病毒株)。
如本文所用，术语“背衬”是指适于粘结到和/或粘附到微针组件的材料。在一些实施方式中，背衬材料适于粘结和/或粘附到本文所述的微针的基质(例如可溶性基质)。
如本文所用，术语“基质”或“可溶性基质”是指形成微针基质的层(例如，用作装载有疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗，流感疫苗或其组合)的远端微针尖端(例如，丝素蛋白尖端)的支撑物)，和/或还可用作连接相邻微针以形成连续微针阵列或微针贴片的层。在一些实施方式中，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的基质在施用至生物屏障(例如皮肤，粘液表面或口腔)后溶解。
如本文所用，短语“广谱免疫”是指针对病毒(例如本文所述的病毒)的至少一种(例如针对至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，针对至少八种或至少针对多于八种)病毒株的免疫应答，例如体液和/或细胞应答(例如免疫或保护性免疫)，其中所述至少一种病毒株(或其抗原)不存在于例如根据本文所述的方法，微针和微针装置施用于受试者的疫苗中。在一些实施方式中，不存在于疫苗中和/或不被疫苗特异性靶向的至少一种病毒株(或其抗原)是病毒的漂移病毒株。在一些实施方式中，所述至少一种菌株属于与存在于疫苗中和/或由疫苗特异性靶向的菌株不同的类型。
如本文所用，术语“剂量”是指疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，抗原和/或免疫原被施用(例如在疫苗接种中)以在生物体中引发免疫应答(例如体液和/或细胞免疫应答)的量。
如本文所用，“标准剂量”意指疫苗的典型人类剂量中的抗原量，例如如由国家或国际监管机构(例如，美国FDA、EMEA)批准用于销售的疫苗。
在免疫应答的上下文中，术语“促进”或“增强”是指免疫应答的增加，例如免疫细胞靶向和/或杀死病原体和病原体感染的细胞的能力的增加，以及接种后的保护性免疫等。在一些实施方式中，保护性免疫是指存在足够的免疫应答(例如抗体滴度)以防止随后被包含相同抗原的病原体感染。在一些实施方式中，病原体是病毒，例如冠状病毒和/或流感病毒。
如本文所用，“部分剂量”是指包含疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，抗原和/或免疫原的总剂量(例如标准剂量)的部分量的剂量，所述疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，抗原和/或免疫原被施用(例如在疫苗接种中)以在生物体中引发免疫应答(例如体液和/或细胞免疫应答)。在一些实施方式中，部分剂量中的疫苗、抗原和/或免疫原的量不超过1/X，其中X是任何数字，例如其中X是疫苗总剂量，例如标准剂量，的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多。
如本文所用，术语“明胶”是指衍生自胶原的水溶性蛋白。在一些实施方式中，术语“明胶”是指通过动物胶原的部分酸水解(A型明胶)或部分碱水解(乙型明胶)产生的无菌无热原蛋白制剂(例如，级分)，所述动物胶原最通常衍生自牛，猪和鱼来源。可以获得不同分子量范围的明胶。也可以使用明胶的重组来源。
如本文所用，术语“免疫”或“保护性免疫”是指由疫苗或免疫方案(例如接种方案)引发的免疫应答，例如体液和/或细胞应答，当施用给有需要的受试者(例如本文所述的受试者)时，其预防，延缓由本文所述的病毒引起的病毒感染的发展和/或降低其严重性。在一些实施方式中，免疫或保护性免疫减轻或完全消除病毒感染的症状。在一些实施方式中，免疫性或保护性免疫性的特征在于存在以下一种或多种：循环抗体(例如体液免疫)，致敏T淋巴细胞的存在(例如细胞免疫)，粘膜表面上分泌性iga的存在(例如粘膜免疫)或其组合。
如本文所用，术语“免疫原”是指能够在生物体中引发免疫应答的任何物质(例如抗原，抗原组合，病原体片段，完整病原体)。“免疫原”在给予哺乳动物受试者后能够诱导针对自身的免疫应答。本文所用的关于免疫应答的术语“免疫的”是指在受体受试者中产生针对免疫原的体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答。这种应答可以是通过向受试者施用免疫原或免疫原性肽诱导的主动应答或通过施用针对免疫原的抗体或致敏T细胞诱导的被动应答。在一些实施方式中，免疫原是冠状病毒抗原。在一些实施方式中，免疫原是冠状病毒。在一些实施方式中，免疫原是流感病毒。在一些实施方式中，免疫原是病毒疫苗(例如一价(也称为单价)或多价(也称为多价)疫苗，例如针对冠状病毒和/或流感的疫苗)。在一些实施方式中，疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以是单价、二价、三价、四价(也称为四价)或五价的。在一些实施方式中，免疫原是复制型或非复制型疫苗载体(例如，包含腺病毒载体，腺伴随病毒载体，α病毒载体，疱疹病毒载体，麻疹病毒载体，痘病毒载体或水泡性口炎病毒载体)。
如本文所用，术语“免疫原性”是指诸如抗原或表位的物质在受试者中激发体液和/或细胞介导的免疫应答的能力。技术人员可以容易地测量物质的免疫原性。免疫组织化学介导的免疫应答的存在可通过任何本领域公认的方法测定，例如，增生测定(CD4+T细胞)，CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定，或在施用免疫原后与受试者的组织切片免疫组织化学以测定活化细胞如单核细胞和巨噬细胞的存在。本领域技术人员可以通过任何成熟的方法容易地确定受试者中体液介导的免疫应答的存在。例如，在生物样品如血液中产生的抗体水平可以通过蛋白印迹，ELISA或其他已知的用于抗体检测的方法来测量。
如本文可互换使用的，术语“持续释放尖端”，“可植入持续释放尖端”，“可植入微针尖端”或“可释放尖端”是指能够刺穿受试者的生物屏障(例如皮肤，粘液表面或口腔)并沉积在生物屏障，皮肤层(例如真皮)内的微针的远端，例如尖端。在实施方式中，所述尖端包含丝素蛋白，其量足以将疫苗例如冠状病毒疫苗(例如SARS-CoV-2疫苗)和/或流感疫苗的释放维持延长的时间段，例如至少约1天(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12，13或14天或更多天，例如约4天至约30天，约25天5天，约10天至约20天，约10天至约15天，约4天至约14天，约14天至约15天，例如约1-2周，约1-3周或约1-4周，例如约2-12个月)。在一些实施方式中，可植入的持续释放尖端包含冠状病毒疫苗、抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，可植入的持续释放尖端包含流感疫苗、抗原和/或免疫原。
如本文所用，术语“微针”是指具有至少两个，更典型地三个组分(例如层)的结构，用于穿过生物屏障(例如皮肤，组织或细胞膜)运输或递送疫苗、抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，微针包含基质(例如，如本文所述的可溶性基质)，尖端(例如，如本文所述的可植入尖端)和任选的背衬材料。在实施方式中，微针具有约350μm至约1500μm的高度尺寸(例如，约350μm至约1500μm，例如，约350μm，约400μm，约450μm，约500μm，约550μm，约600μm，约650μm，约700μm，约750μm，约800μm，约850μm，约900μm，约950μm，约1000μm，约1050μm，约1100μm，约1150μm，约1200μm，约1250μm，约1300μm，约1350μm，约1450μm，约1500μm))。在一些实施方式中，微针被制造成具有任何尺寸和/或几何形状，以使得微针尖端(例如丝素蛋白尖端)，例如可植入的持续释放尖端，能够在约100μm和约900μm之间的深度(例如在约800μm的深度)部署到皮肤的真皮层中，用于疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的释放，例如控制释放或持续释放。
如本文所用，术语“微针贴片”和“微针阵列”是指包含例如以随机或预定图案排列的多个微针(例如基于丝素蛋白的微针)(例如阵列)的装置。
如本文所用，术语“聚乙二醇(PEG)”是指环氧乙烷的低聚物或聚合物。PEG也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)。PEG的结构通常表示为H-(O-CH2-CH2)n-OH。
如本文所用，术语“丝素蛋白”包括蚕丝蛋白和昆虫或蜘蛛丝蛋白。根据本文所述的各个方面，可以使用任何类型的丝素蛋白。由家蚕如家蚕(Bombyx mori)生产的丝素蛋白是最常见的，并且代表地球友好的可再生资源。例如，微针中使用的丝素蛋白(例如丝素蛋白尖端，例如微针的可植入控释或缓释尖端)可通过从B的茧中除去丝胶蛋白而获得。莫里。在一些实施方式中，丝素蛋白是再生丝素蛋白，例如从B的茧中提取丝胶蛋白后获得的丝素蛋白。和附加的加工，例如通过蒸煮步骤。有机蚕茧也是可商购的。然而，存在许多不同的丝，包括蜘蛛丝(例如，从Nephila Clavipes获得)，转基因丝，重组和/或基因工程丝，如来自细菌，酵母，哺乳动物细胞，转基因动物或转基因植物的丝(参见例如WO97/08315；US5,245,012)及其变体。
如本文所用，术语“释放”和“受控释放或持续释放”是指疫苗、抗原和/或免疫原(例如，从本文所述的微针，微针装置，制剂，组合物，制品，装置和制剂，例如，从如本文所述的基于丝素蛋白的微针尖端)，诸如冠状病毒疫苗，流感疫苗或其组合，在一段时间内释放，例如，至少约1天至约28天(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或更多天，例如，约4天至约25天，约10天至约20天)。约10至约15天，约12至约16天，例如约1-2周，约1-3周或约1-4周，例如约1个月至约3个月)。在一些实施方式中，通过本文所述的微针，微针装置，制剂，组合物，制品，装置或制剂在约1至约14天，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天的时间段内控制或持续释放疫苗，例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗，可在受试者中产生例如广谱免疫。在一些实施方式中，包含丝素蛋白的疫苗制剂和制备物具有控释或缓释性质(例如，被配制和/或配置为在例如1、5、10、15、30、45分钟的时间段或至少1、5、10、15、30、45分钟内将疫苗释放到受试者的皮肤中；1、2、3、4、5、10、24小时的时间段或至少1、2、3、4、5、10、24小时的时间段；1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天的时段；1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周，或至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周的时段；一段时间或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月；1年或至少1年、2年、3年、4年、5年或更长时间。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常，动物是脊椎动物，例如灵长类动物，啮齿类动物，家畜或猎物动物。灵长类动物包括黑猩猩，食蟹猴，蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠，大鼠，旱獭，雪貂，兔和仓鼠。家畜和猎物动物包括牛，马，猪，鹿，野牛，水牛，猫科动物(例如家猫)，犬科动物(例如狗，狐狸，狼)，鸟类(例如鸡，鸸鹋，鸵鸟)和鱼(例如鳟鱼，鲶鱼和鲑鱼)。在本文所述方面的某些实施方式中，受试者是哺乳动物(例如灵长类动物，例如人)。受试者可以是男性或女性。在某些实施方式中，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人，非人灵长类动物，小鼠，大鼠，狗，猫，马或牛，但不限于这些实例。此外，本文所述的方法和制剂可用于治疗家养动物和/或宠物。在一些实施方式中，术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物，例如人)。
在特定的实施方式中，受试者是人。受试者可以是任何年龄。在一个实施方式中，受试者是老年人受试者，例如65岁或更大。在一个实施方式中，受试者是非老年人，例如小于65岁的人受试者。在一个实施方式中，受试者是人类儿童受试者，例如18岁或以下。在一个实施方式中，受试者是例如年龄大于18岁的成年受试者。
如本文所用，术语“治疗剂”和“活性剂”是本领域公认的术语，并且是指作为在受试者中局部或全身起作用的生物学，生理学或药理学活性物质的任何化学部分。可使用各种形式的治疗剂，其在施用给受试者后能够从本文所述的微针释放到邻近组织或流体中。治疗剂(也称为“药物”)的实例描述于熟知的参考文献中，例如默克索引(Merck Index)，医师案头参考和治疗学的药理学基础，且其包括(但不限于)药剂；维生素类；矿物质补充剂；用于治疗，预防，诊断，治愈或减轻疾病或病症如病毒感染的物质；影响机体结构或功能的物质；或前药，其在置于生理环境后变得具有生物活性或更具活性。
在某些实施方式中，治疗剂包括但不限于疫苗、抗原和/或免疫原。在某些实施方式中，治疗剂包含冠状病毒疫苗、抗原和/或免疫原。在某些实施方式中，治疗剂包含流感疫苗、抗原和/或免疫原。
在某些实施方式中，治疗剂包括但不限于氨基酸分子，例如肽和/或蛋白。在某些实施方式中，治疗剂包括重组蛋白疫苗。
在某些实施方式中，治疗剂包括但不限于核酸分子，例如脱氧核糖核酸(DNA)分子和/或核糖核酸(RNA)分子。在特定实施方式中，治疗剂包含mRNA。在一些实施方式中，治疗剂包含基于核酸的疫苗，例如基于DNA的疫苗和/或基于RNA的疫苗。在一些实施方式中，治疗剂包括基于mRNA的疫苗。
如本文所用，术语“疫苗”是指将在已暴露于组合物的受试者中引发保护性免疫应答的任何组合物。免疫应答可包括诱导抗体和/或诱导T细胞应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下效应中的一种或多种：抗体，B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生或活化，所述抗体，B细胞，辅助性T细胞，抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞特异性针对包含在感兴趣的组合物或疫苗中或来源于感兴趣的组合物或疫苗的一种或多种抗原。优选地，受试者将显示治疗性或保护性免疫(记忆)应答，使得对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重性降低。这种保护将通过与病原体感染相关的一种或多种临床症状的数量或严重程度的减少或缺乏，病毒血症发作的延迟，病毒持久性的减少，总病毒载量的减少和/或病毒排泄的减少来证明。在一些实施方式中，“疫苗”是指抗原或免疫原(包括亚基抗原，类毒素抗原，缀合物抗原或其他类型的抗原分子，或编码它们的核酸分子)或灭活或活的减毒微生物的任何制剂，当将其引入受试者体内时，其通过引起针对特定抗原或微生物的免疫系统的活化(例如，诱导抗体形成，T细胞应答和/或B细胞应答)来影响针对特定抗原或微生物的免疫应答。通常，针对微生物的疫苗针对病毒，细菌，寄生虫，支原体或其他感染物的至少一部分。
术语“治疗有效量”是指如本文所定义的组合物有效预防，改善和/或治疗由如本文所述的疾病(如病毒感染)引起的病况的量。
术语“治疗”是指治愈或停止或至少延缓疾病进展的治疗性治疗以及预防性或防止性措施。需要治疗的那些包括已经患有由本文所述病毒感染引起的病症的那些以及其中要预防病毒感染的那些。部分或完全由本文所述病毒感染恢复的受试者也可能需要治疗。预防包括抑制或减少病毒的传播或抑制或减少与本文所述病毒感染相关的一种或多种症状的发作，发展或进展。
术语“病毒滴度”或“病毒载量”可互换地指活性病毒感染的严重性的量度，并且可以通过本领域技术人员已知的方法测定。该测定可以基于病毒蛋白的检测，例如通过与病毒蛋白结合的抗体并进一步检测，或者通过扩增方法例如PCR和RT-PCR检测病毒DNA和/或病毒RNA。通过核酸扩增方法监测血浆中病毒体相关的病毒RNA是广泛使用的参数，用于评估病毒疾病的状态和进展，以及评价预防性和治疗性干预的有效性。在某些实施方式中，病毒载量或病毒滴度可以通过估计体液样品中病毒的活量来计算，如每毫升血液样品中RNA拷贝数。
本文所用的术语“病毒”是指由包裹在蛋白中的核酸组成的感染物。这些感染因子不能自主复制(即复制需要使用宿主细胞的机制)。病毒基因组可以是单链(ss)或双链(ds)，RNA或DNA，并且可以或不可以使用逆转录酶(RT)。另外，ssRNA病毒可以是有义(+)或反义(-)。示例性病毒包括但不限于dsDNA病毒(例如腺病毒，疱疹病毒，痘病毒)，ssDNA病毒(例如细小病毒)，dsRNA病毒(例如Reo病毒)，(+)ssRNA病毒(例如小RNA病毒，披膜病毒，冠状病毒)，(-)ssRNA病毒(例如正粘病毒，弹状病毒)，ssRNA-RT病毒，即(+)具有生命周期中DNA中间体的有义RNA(例如逆转录病毒)和dsDNA-RT病毒(例如嗜肝DNA病毒)。在一些实施方式中，病毒还可以包括野生型(天然)病毒，灭活病毒，减毒活病毒，修饰病毒，重组病毒或其任何组合。示例性逆转录病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)。病毒的其他实例包括但不限于有包膜病毒，呼吸道合胞病毒，无包膜病毒(例如人乳头瘤病毒(HPV))，噬菌体，重组病毒和病毒载体。本文所用的术语“噬菌体”是指感染细菌的病毒。
本文所用的术语“冠状病毒”是指冠状病毒科中的正义ssRNA病毒。冠状病毒可以是α冠状病毒，β冠状病毒，γ冠状病毒或δ冠状病毒。冠状病毒可以是活的野生型病毒，活的减毒病毒，灭活病毒(例如，UV灭活病毒)，嵌合病毒或重组病毒。已知冠状病毒感染人和其他动物(例如鸟和哺乳动物)。冠状病毒的实例包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)，严重急性呼吸综合征病毒2(SARS-CoV-2)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，人冠状病毒229E(HCoV-229E)，人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)和人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)。
如本文所用，术语“流感病毒”是指正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中的负义ssRNA病毒。流感病毒可以是活的野生型病毒，活的减毒病毒，灭活病毒，嵌合病毒或重组病毒。流感病毒的实例包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒。
范围：贯穿本公开，各种实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被认为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，诸如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的单个数值，例如1，2，2.7，3、4，5，5.3和6。作为另一个实例，诸如95-99％同一性的范围包括具有95％，96％，97％，98％或99％同一性的某物，并且包括诸如96-99％，96-98％，96-97％，97-99％，97-98％和98-99％同一性的子范围。这不管范围的宽度如何都适用。
下文进一步详细描述本文的组合物和方法的各种实施方式。在整个说明书中给出了附加的定义。
微针装置
本文提供了包含丝素蛋白的各种微针和微针装置，所述微针和微针装置被配置成包封有效量的治疗剂(诸如疫苗)并将其释放至受试者。在某些实施方式中，本文提供了微针，例如，基于丝素蛋白的微针，多个微针，和微针装置(例如，微针贴片)，例如，基于丝素蛋白的微针装置，其被配置为将有效量的疫苗，抗原，和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗(例如，SARS-CoV-2疫苗)，流感疫苗，或它们的组合)和随后释放(例如，施用)到受试者中(例如，进入和/或穿过受试者的生物屏障，例如皮肤)。微针，多个微针和微针装置的使用可导致对受试者中的病毒和/或病毒相关抗原(诸如冠状病毒或冠状病毒相关抗原和/或流感病毒或流感病毒相关抗原)的免疫力(例如，延长的广谱免疫力)。
本文所述的微针可以是适用于刺穿生物屏障(例如皮肤层)的任何形状和/或几何形状，例如本文所述的形状或几何形状。微针可包括两层或更多层，诸如背衬材料，基质层(例如可溶性基质层)和微针尖端(例如可植入的微针尖端)，它们在本文中更详细地描述。
本文所述的微针可包括任何合适量的丝素蛋白。例如，微针或其一部分如微针尖可包含约0.1％至约20％v/v的丝素蛋白，或约0.1％至约10％v/v的丝素蛋白，任选地，其中百分比(％)基于制造期间使用的丝素溶液(“印刷溶液”)。例如，微针或其一部分，例如微针尖端，可包含至少约0.1％，约0.25％，约0.5％，约0.75％，约1％，约1.25％，约1.5％，约1.75％，约2％，约2.25％，约2.5％，约2.75％，约3％，约3.25％，约3.5％，约3.75％，约4％，约4.25％，约4.5％，约5.75％，约6％，约6.25％，约6.5％，约5.75％，约7％，约7.25％，约7.5％，约7.75％，约8％，约8.25％，约8.5％，约8.75％，约9％，约9.25％，约9.5％，约9.75％，约11％，约11.5％，约12％，约12.5％，约13％，约13.5％，约14％，约14.5％，约15％，约15.5％，约16％，任选地，约18％，约18.5％，约19％，约19.5％或约20％v/v丝素蛋白，其中百分比(％)基于制造期间使用的丝素溶液(“印刷溶液”)。
在一些实施方式中，丝素蛋白来自蚕(家蚕)。在一些实施方式中，丝素蛋白包括蜘蛛丝。在一些实施方式中，丝素蛋白不包括蜘蛛丝。在一些实施方式中，丝素蛋白为纤维或颗粒的形式。在一些实施方式中，丝素蛋白不包含纤维或颗粒。
在一些实施方式中，多个微针可以以随机或预定图案排列以形成微针阵列和/或贴片，如本文所述(参见例如图3)。贴片可包括粘附到基质背面的载体，背衬或“手柄”层(参见例如图2)。该层可以提供结构支撑和区域，通过该区域可以在不干扰针阵列的情况下处理和操作贴片。
微针装置(例如微针贴片)可包括至少约100或更多个微针，例如约100至约500个微针，例如约100至约400个微针，约100至约300个微针，或约100至约200个微针，例如约121个微针。微针可以排列成网格，例如正方形网格。在一些实施方式中，微针装置包括约121个针，例如呈11×11正方形网格。在一些实施方式中，微针装置包括在11×11正方形网格中的约121个针，间距为约0.75mm。
在一些实施例中，单个微针是具有约0.35mm的基部直径和约30°的夹角的约0.65mm长的锥体。在一些实施例中，针的尖端足够尖锐以穿透生物屏障，例如皮肤。在一些实施例中，微针尖端的曲率半径不超过0.01mm。
在一个方面，本公开的特征在于用包封治疗剂(例如疫苗)的丝素蛋白尖端制造的固体锥形微针阵列，所述治疗剂负载在溶解的聚合物基质上。在短暂的皮肤施用后，可将装载疫苗的丝尖端植入受试者的表皮/上真皮中，其中它们在由丝基质的各种可调性质(包括例如丝基质的结晶度)确定的时间段内释放疫苗。
在另一个方面，本公开的特征在于用包封治疗剂(例如mRNA)的丝素蛋白尖端制造的固体锥形微针阵列，所述治疗剂负载在溶解的聚合物基质上。在短暂的皮肤施用后，可将负载mRNA的丝尖端植入受试者的表皮/上真皮中，其中它们在由丝基质的各种可调性质(包括例如丝基质的结晶度)确定的时间段内释放mRNA。
丝素蛋白基微颗粒
在一些实施方式中，本公开提供了用于向有需要的受试者施用有效量的治疗剂(诸如疫苗)的基于丝素蛋白的微针和微针装置(例如，微针贴片)。
在一些实施方式中，本公开提供基于丝素蛋白的微针和微针装置(例如，微针贴片)，其用于将有效量的疫苗、抗原和/或免疫原(诸如冠状病毒疫苗，流感疫苗或其组合)运输和释放到和/或穿过生物屏障(例如，皮肤，粘膜，组织(诸如器官组织和肌肉组织)，颊腔，口腔或细胞膜)。
因此，本文公开的基于丝素蛋白的微针和微针装置可被配置成具有各种机械特性(例如强度)，设计和几何形状(例如针形状和锐度)和释放动力学(例如持续释放)，以使得能够向受试者施用有效量的疫苗、抗原和/或免疫原，诸如冠状病毒疫苗，流感疫苗或其组合，例如以保护受试者免受感染(例如冠状病毒和/或流感病毒的感染)。
在另一方面，本公开的特征在于微针(例如，基于丝素蛋白的微针)，其可稳定置于微针中的疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，例如部分由于微针组合物的热稳定特性(例如，丝素蛋白组合物的热稳定特性)。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗(例如SARS-CoV-2疫苗、SARS-CoV疫苗和/或MERS-CoV疫苗)和/或流感疫苗通过本文所述的微针或微针装置稳定。
在另一方面，本公开的特征在于可稳定置于微针中的mRNA的微针。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在例如室温(例如约25℃)下储存2周或更多周后保留其原始生物活性(例如免疫原性)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在例如室温(例如约25℃)下储存8周或更多周后保留其原始生物活性(例如免疫原性)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在约25℃储存至少约2周(例如，约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周或约12周)后保留其原始生物活性(例如，免疫原性)的至少70％，80％或90％。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在约25℃储存至少约8周(例如，约8周、约9周、约10周、约11周或约12周)后保留其原始生物活性(例如，免疫原性)的至少70％、80％或90％。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在约37℃储存至少约2周(约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周或约12周)后保留其原始生物活性(例如免疫原性)的至少60％，70％或80％。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗在约45℃储存至少约2周(约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周或约12周)后保留其原始生物活性(例如免疫原性)的至少50％、60％或70％。
机械性能
微针，包括本文公开的基于丝素蛋白的微针，可被设计用于插入皮肤而不破裂。在一些实施例中，通过使用具有尖锐尖端和足够长度的针来实现微针插入，以克服在插入之前发生的生物屏障(例如，皮肤)表面的偏转。在一些实施例中，在插入过程中的微针完整性可以通过使所需的插入力最小化来实现，例如，通过使用尖锐尖端的针，通过使机械强度最大化，和/或通过优化针直径(参见，例如，Park等，J.Korean Phys.Soc.56(4):1223-1227,2010)。因此，在一些实施方式中，优化基于丝素蛋白的微针的机械特性(例如，通过调节各种制剂组分的浓度，包括本文所公开的丝素蛋白结晶度)以避免微针因弯曲而突然失效，并且使得微针能够成功地穿透和插入生物屏障(例如，皮肤)中。在一些实施例中，本文所公开的微针被配置成具有长度与等效直径的纵横比低于4：1的几何形状和/或具有以杨氏模量大于500MPa和破坏应力大于10MPa为特征的机械强度。在一些实施例中，微针具有15度的夹角和/或约4：1的纵横比。在一些实施方式中，基础配方具有约1000至约1500MPa的挠曲模量和约15至约30MPa的失效应力。
微针设计
在一些实施方式中，本公开提供具有各种设计构型的微针，诸如基于丝素蛋白的微针，以及包含所述微针的装置。本文所公开的微针(例如，基于丝素蛋白的微针)可呈适用于刺穿生物屏障(例如，皮肤)以使得疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)能够在受试者体内释放(例如，持续释放)的任何形状和/或几何形状。微针的形状和/或几何形状的非限制性实例包括：圆柱形，楔形，锥形，金字塔形，菱形和/或不规则形状，或其任何组合。在一些实施例中，微针的形状和/或几何形状不包括菱形。在一些实施例中，微针的形状和/或几何形状包括金字塔形。
本文公开的微针可以任何合适的形式制造。微针的形式的非限制性实例包括：实心微针，中空微针，涂覆微针，溶解微针，可植入微针，水凝胶微针或其任何组合。在一些实施例中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)包括实心支撑轴。在一些实施例中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)不包括实心支撑轴。
在一些实施方式中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)由溶解和/或可降解微针组成。在一些实施方式中，本公开的可溶解的和/或可降解的(例如，可再吸收的)微针将疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)包封在制剂中，例如基于丝素蛋白的制剂，其一旦在受试者(例如，皮肤)内部就溶解和/或降解。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从可降解微针的释放是通过蛋白酶介导的降解。在一些实施方式中，微针的仅一部分(例如尖端，例如丝素蛋白尖端)被配置为可溶解和/或可降解的。在一些实施例中，基本上所有的微针都是可溶解的和/或可降解的。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从可溶解的和/或可降解的(例如可再吸收的)微针的释放是通过微针的材料的扩散控制释放。
在一些实施方式中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)是实心微针。在一些实施例中，本发明的实心微针被设计成两部分系统。在一些实施方式中，首先将包含基于丝素蛋白的实心微针的微针装置施用于皮肤以产生刚好深到足以穿透生物屏障(例如皮肤)的最外层的显微孔，然后通过透皮贴片施用疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从固体微针的释放是通过扩散穿过微针的材料和/或微针的材料的降解，例如蛋白酶介导的降解。在其中实心微针降解的一些实施例中，实心微针通常称为溶解或可再吸收微针。
在一些实施方式中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)是中空微针。在一些实施方式中，本公开的中空微针包含将疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)直接递送到施用部位(例如生物屏障，例如皮肤)中的贮库。
在一些实施方式中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)是包被的微针，例如，用冠状病毒抗原和/或流感抗原或其疫苗制剂包被。在一些实施方式中，将疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)直接施用于微针的一部分(例如表面)。在一些实施方式中，涂覆的微针还涂覆有表面活性剂(例如辛基酚乙氧基化物(例如Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆(例如P188)和/或聚乙氧基化醇)和/或增稠剂，例如以确保疫苗、抗原和/或免疫原被适当地递送。
在一些实施方式中，本文所述的微针可包括一个孔或多个孔。在其他实施方式中，本文所述的微针不包括孔或多个孔。
在一些实施例中，在此描述的微针可以包括一个储器或多个储器。在其他实施例中，本文所述的微针不包括储存器或多个储存器。
在一些实施方式中，本公开的微针(例如，基于丝素蛋白的微针)可包含以下层：(1)背衬材料(任选的)；(2)基质(例如可溶性基质)；和(3)尖端(例如丝素蛋白尖端)。例如，微针可包括施用到可溶性基质层的背衬材料(任选的)，所述基质层支撑包含丝素蛋白和治疗剂的远侧丝素蛋白尖端，所述治疗剂诸如疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。
背衬
本文所述的微针和微针装置可具有背衬层。背衬可施加到基质(例如，可溶性基质)，并且可便于处理，脱模和/或施加微针或微针装置。
可用于制造本公开的微针的示例性背衬材料包括但不限于固体载体，例如纸基材料，塑料材料，聚合物材料或聚酯基材料(例如Whatman903纸，聚合物带，塑料带，粘合剂背衬的带(例如粘合剂背衬的聚酯带)或其他合适的带)。在一些实施方式中，背衬包括Whatman903纸。在一些实施方式中，背衬包括聚酯带。在一些实施方式中，聚酯带包括粘合剂背衬的聚酯带。在一些实施方式中，背衬材料可用适于粘结和/或粘附到本文所述微针的可溶性基质的粘合剂涂覆(例如，至少在一侧上)。在一些实施方式中，背衬可延伸超过微针阵列。在一些实施例中，涂覆在背衬上的粘合剂可适于粘附到受试者的皮肤以将阵列保持在适当位置。
本公开的微针中使用的背衬材料可具有各种特性，包括但不限于粘结和/或粘附到基质(例如可溶性基质)层以允许脱模的能力。在一些实施方式中，背衬材料保持贴片完整性，例如，如果溶解基层具有裂缝或不连续。该背衬材料可以是足够柔性的，以便符合例如非平坦表面，如皮肤表面。具体地讲，背衬在穿着期间可具有足够的柔性，诸如在将贴片施用(例如，压入)皮肤之后。背衬可包含非溶解材料和/或由非溶解材料组成，使得背衬在贴片施用到皮肤表面之后和在贴片从皮肤表面移除期间保持其完整性。
在一些实施方式中，背衬包含粘合剂。在一些实施方式中，背衬包含粘合剂，所述粘合剂包含固体载体。在一些实施例中，背衬包含粘合剂和多孔支撑基质。背衬可包含可在例如使背衬经受足以处理粘合剂的条件(例如通过温度，氧化和/或UV照射)之后进行处理的粘合剂。在一些实施方式中，背衬包含提供与固体载体(例如多孔载体基质)的连接的粘合剂。
背衬可具有适于施用到目标皮肤表面的任何尺寸。在一些实施方式中，背衬的尺寸可以是12mm直径的圆。在一些实施例中，背衬的尺寸可以是12mm宽的条带，其具有超出12mm×12mm贴片的边缘达12mm长度的“手柄”部分。在一些实施例中，可以使用具有大约12mm见方的延伸“手柄”的12mm见方的聚酯带。在一些实施方式中，背衬可以更大，例如约25mm2，任选地具有圆角。在一些实施方式中，背衬可以是约25mm直径的圆。在一些实施方式中，延伸超过阵列的背衬区域可用生物相容性皮肤粘合剂将贴片保持在皮肤上。
可溶性基质
本发明的微针和微针装置通常包括基层，例如溶解基层。基质层(例如，溶解基质层)形成针的基质(例如，用作装载有疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的远端微针尖端(例如，丝素蛋白尖端)的支撑物)。基质层(例如可溶性基质层)也可用作连接相邻针以形成微针阵列或贴片的层。
在一些实施方式中，基质层(例如，溶解基质层)包含可例如在预期的佩戴时间(例如，约5分钟)内溶解到受试者中的材料。在一些实施方式中，在施用至受试者的生物屏障(例如皮肤)后，可溶性基质层的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％在预期的佩戴时间内(例如在小于1小时，例如约1分钟至约45分钟，约2分钟至约30分钟，约5分钟至约15分钟，例如约1分钟，约2分钟，约3分钟，约4分钟，约5分钟，约6分钟，约7分钟，约8分钟，约9分钟，或约10分钟或更长的时间段内)溶解。在一些实施方式中，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的可溶性基质层在施用至受试者的生物屏障(例如皮肤)后在约5分钟内溶解。
在一些实施方式中，用于制造可溶性基质的材料足够坚固以使得微针能够穿透皮肤，并且足够坚韧(例如，不过度脆)以还使得微针在制造期间能够脱模。在一些实施例中，可溶性基质材料可经受常规处理而无灾难性失效，并且在脱模与施加之间保持其机械特性(例如，吸湿性不至于使其由于环境湿度而熔化)。在一些实施方式中，可溶性基质层材料在贴片中使用的剂量下是无毒且无反应原性的。在一些实施方式中，可溶性基质层包含水溶性组分。
可用于制造基质层(例如可溶性基质层)的材料的非限制性实例包括多糖，二糖，聚合物，蛋白，增塑剂和/或表面活性剂。在一些实施例中，基质层(例如，溶解基质层)包含一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，或全部)多糖(例如，右旋糖酐)；二糖(例如蔗糖、麦芽糖和海藻糖)；聚合物(例如，甲基纤维素、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、透明质酸)；蛋白(例如，明胶，丝心蛋白)；增塑剂(例如，甘油、丙二醇)；和表面活性剂(例如辛基酚乙氧基化物(例如Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)。
本文所公开的基质层可包含浓度介于约0.001％和约75％之间(例如介于约0.001％至约1％之间，例如约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％或约75％)的多糖、二糖、聚合物、蛋白、增塑剂和/或表面活性剂。在一些情况下，干燥固体基质可包含浓度至多约100％的多糖、二糖、聚合物、蛋白、增塑剂和/或表面活性剂。在一些情况下，干燥的固体基质可包含浓度为约0.001％的表面活性剂。
在一些情况下，如本文所述的可用于制造基质层(例如，可溶性基质层)的材料的量可指在制造期间使用的基质层溶液(“印刷溶液”)中存在的量。在某些实施方式中，该量可以表征为体积/体积(v/v)，重量/重量(w/w)或重量/体积(w/v)测量值。
在一些情况下，如本文所述的可用于制造基质层(例如，可溶性基质层)的材料的百分比(％)可指在制造期间使用的基质层溶液(“印刷溶液”)中存在的百分比(％)。在某些实施方式中，该百分比(％)可表征为体积/体积(v/v)，重量/重量(w/w)或重量/体积(w/v)测量值。
在一些实施方式中，基层(例如，溶解基层)被配置用于疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的持续释放。在一些实施方式中，基质层(例如，可溶化基质层)包含一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，或六种或更多种)明胶，葡聚糖，甘油，聚乙二醇(PEG)，蔗糖，海藻糖，麦芽糖，羧甲基纤维素(CMC)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，透明质酸，甲基纤维素，和/或表面活性剂(例如，辛基酚乙氧基化物(例如，Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆，和/或聚乙氧基化醇)，任选地其中所述微针被配置用于持续释放。
在一些实施方式中，基质层(例如，溶解基质层)包含一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种，或四种或更多种)右旋糖酐，蔗糖，甘油和表面活性剂(例如，辛基酚乙氧基化物(例如，曲通-x)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)，任选地被配置用于持续释放。
在一些实施方式中，基层(例如，溶解基层)被配置用于疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的爆发释放。在一些实施方式中，基质层(例如，溶解基质层)包含明胶，右旋糖酐，甘油，PEG，蔗糖，海藻糖，麦芽糖，CMC，PVP，PVA，透明质酸，甲基纤维素和/或表面活性剂(例如，辛基酚乙氧基化物(例如，Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)中的一种或多种(例如，两种或更多种，三种或更多种，四种或更多种，五种或更多种，或六种或更多种)，任选地其中所述微针被配置用于突释。在一些实施方式中，基质层(例如，溶解基质层)包含聚乙烯醇(PVA)和蔗糖，任选地被配置用于突释。
在一些实施方式中，基质层(例如，溶解基质层)包含葡聚糖。在一些实施例中，右旋糖酐可以具有在约30kDa至约600kDa之间的分子量。在一些实施方式中，葡聚糖为约40kDa，约50kDa，约60kDa，约70kDa，约80kDa，约90kDa，约100kDa，约200kDa，约300kDa，约400kDa，约500kDa或约600kDa。在一些实施方式中，可以使用不同葡聚糖的混合物，例如具有各种分子量的葡聚糖的混合物。在一些实施例中，该右旋糖酐可以获得自和/或衍生自多种细菌来源，包括但不限于肠膜明串珠菌。
在一些实施例中，基质层(例如，溶解基质层)不包含聚(丙烯酸)(PAA)。在一些实施例中，如本文所述的可溶性基质层具有改善的生物相容性，例如，与包含PAA的可溶性基质层相比。在一些实施方式中，可溶解的基层材料引起减少的炎症反应和/或减少的组织坏死。在一些实施方式中，可溶性基质层材料不是PAA，并且与PAA相比诱导减少的炎症应答和/或减少的组织坏死。在一些实施方式中，可溶性基质层材料具有与其将溶解于其中的生物屏障相似的pH，例如约4.0至约8.0的pH。
在其他实施方式中，基质层包含丝素蛋白和/或疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。基质层(例如可溶性基质层)可包含小于98％(例如小于约98％，小于约90％，小于约80％，小于约70％，小于约60％，小于约50％，小于约40％，小于约30％，小于约20％，小于约10％，小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，小于约4％，小于约2％，小于约1％)的加载到微针和/或微针装置中的疫苗、抗原和/或免疫原的总量(例如剂量)。
在一些实施方式中，基质层不包含例如可检测量的丝素蛋白和/或疫苗、抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，配制基质层以限制和/或减少疫苗、抗原和/或免疫原从微针尖端(例如丝素蛋白尖端)渗漏(例如扩散)到基质层中的量，例如与本领域已知的基质层制剂(例如包含PAA的基质层制剂)相比。在一些实施方式中，可以在约1天，约2天，约3天，约4天，约5天或约6天测定疫苗、抗原和/或免疫原从抗原和/或免疫原渗漏(例如扩散)的有限和/或减少的量；约1周，约2周，或约3周；约1个月，约2个月，约3个月，约4个月，约5个月，约6个月，约7个月，约8个月，约9个月，约10个月，或约11个月；或在制造和储存(例如，在约4℃下储存(例如，冷藏)，在约25℃下储存(例如，室温)，在约37℃下储存(例如，体温)，在约45℃下和/或在约50℃下储存)之后约1年或更久，例如，与包含PAA的基质层制剂相比。
在一些实施方式中，可溶性基质包含介于约10％和约70％之间的明胶(例如，水解明胶)(例如，约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％或约70％明胶)。
在一些实施方式中，可溶解的基质包含介于约10％和约70％之间的增塑剂，诸如甘油(例如，约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％或约70％甘油)。在一些实施方式中，加入增塑剂以降低脆性。
在一些实施方式中，可溶性基质包含约0.001％至约5％的本文所述的表面活性剂，诸如聚山梨醇酯(例如，约0.001％至约1％，或约1％至约5％的表面活性剂)。在一些实施方式中，加入表面活性剂以帮助加工。在一些实施方式中，表面活性剂作为增塑剂加入。
在一些实施方式中，可溶性基质包含介于约1％和约70％之间的聚乙二醇(PEG)(例如，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％ PEG)。
在一些实施方式中，可溶性基质包含约1％至约35％的蔗糖(例如，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％的蔗糖)。
在一些实施方式中，可溶性基质包含介于约1％和约35％之间的羧甲基纤维素(CMC)(例如，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％CMC)。
在一些实施方式中，微针装置(例如，微针尖端和/或基质，例如可溶性基质)不包含羧甲基纤维素，或如果存在CMC，其以35％w/w或更少的量存在。在一些实施方式中，微针(例如，微针尖端和/或基质)包含小于35％w/w的羧甲基纤维素(例如，小于30％w/w、29％w/w、28％w/w、27％w/w、25％w/w、24％w/w、23％w/w、22％w/w、21％w/w、18％w/w、17％w/w、16％w/w、15％w/w、13％w/w、11％w/w、10％w/w、9％w/w、8％w/w、7％w/w、6％w/w、5％w/w、2％w/w、1％w/w、0.5％w/w、0.3％w/w、0.2％w/w或0.1％w/w的羧甲基纤维素)。
在一些实施方式中，可溶性基质包含介于约10％和约70％w/v之间的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(例如，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％w/vPVP)。在一些实施方式中，PVP是10kDAPVP。
在一些实施例中，可溶性基质包含介于约0.01％与约5％v/v之间的Triton X-100(例如，约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％或约1％v/v Triton X-100)。
在一些实施方式中，可溶性基质包含介于约10％和约70％w/v之间的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(例如，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％w/v PVP)和约0.01％和约5％v/v之间的Triton X-100(例如约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.15％、约0.2％、约0.25％、约0.3％、约0.35％、约0.4％、约0.45％、约0.5％、约0.55％、约0.6％、约0.65％、约0.7％、约0.75％、约0.8％、约0.85％、约0.9％、约0.95％或约1％v/v Triton X-100)。
在一些实施方式中，可溶性基质包含介于约1％和约35％之间的聚乙烯醇(PVA)(例如，例如约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％或约35％ PVA)。
在一些实施方式中，可溶性基质包含约1％至约75％的透明质酸(例如，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、或约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、或约75％的透明质酸)。
在一些实施方式中，可溶性基质包含约1％至约75％的麦芽糖(例如，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、或约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、或约75％的麦芽糖)。
在一些实施方式中，可溶性基质包含约1％至约75％的甲基纤维素(例如，约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、或约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、或约75％的甲基纤维素)。
在一些实施方式中，可溶性基质层包含在去离子(DI)水中的40％水解明胶，10％w/v蔗糖。任选地，基质层可包含1％低粘度羧甲基纤维素(CMC)，其可降低脆性。在一些实施方式中，可溶性基质层可包含在DI水中至多50％w/v的10kDMW的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚乙烯醇(PVA)87％在13kDMW下水解，在DI水中高达20％；或在DI水中至多10％的CMC。以下组合也可适用于制造可溶性基质层：30％ PVP和10％ PVA；37％ PVP，5％ PVA和15％蔗糖；或各种其他比例的PVP，PVA和蔗糖。
在一些实施方式中，可溶性基质层为约12mm见方和0.75mm厚。在一些实施方式中，可溶性基质层可覆盖整个贴片。在一些实施例中，基层的尺寸可以是12mm直径的圆，或12×12mm的正方形。
微针尖端
本文所述的微针和微针装置包括微针尖端。在一些实施例中，微针尖端是可植入的微针尖端。在一些实施方式中，微针尖端是基于丝素蛋白的微针尖端(例如，可植入的微针尖端)。在一些实施方式中，微针尖端是可植入的持续释放尖端，例如包含丝素蛋白。微针尖端可进一步包含治疗剂，如本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，和任选的额外治疗剂和/或佐剂。
在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含如本文所述的治疗剂。本文提供的方法可用于制造包含任何合适量的治疗剂的微针尖端，例如丝素蛋白尖端，例如可植入持续释放尖端。例如，微针尖端可包含约0.1μg至约50μg的如本文所述的治疗剂。在一些实施方式中，微针尖端可包含至少约0.1μg、约0.5μg、约1μg、约1.5μg、约2μg、约2.5μg、约3μg、约3.5μg、约4μg、约4.5μg、约5μg、约5.5μg、约6μg、约6.5μg、约7μg、约7.5μg、约8μg、约9μg、约9.5μg、约10μg、约10.5μg、约11μg、约11.5μg、约12μg、约12.5μg、约13μg、约13.5μg、约14μg、约14.5μg、约15μg、约15.5μg、约17μg、约17.5μg、约18μg、约18.5μg、约19μ约19.5μg、约20μg、约20.5μg、约21μg、约21.5μg、约22μg、约22.5μg、约23μg、约23.5μg、约24μg、约24.5μg、约25μg、约25.5μg、约26μg、约26.5μg、约28μg、约28.5μg、约29μg、约29.5μg、约30μg、约30.5μg、约31μg、约31.5μg、约32μg、约32.5μg、约34μg、约34.5μg、约35μg、约35.5μg、约36μg、约36.5μg、约37μg、约38.5μg、约39μg、约39约40.5μg、约41μg、约41.5μg、约42μg、约42.5μg、约43μg、约43.5μg、约44μg、约44.5μg、约45μg、约45.5μg、约46μg、约46.5μg、约47μg、约47.5μg、约48μg、约48.5μg、约49μg、约49.5μg或约50μg如本文所述的治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂包含如本文所述的mRNA。在一些实施方式中，治疗剂包含如本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。
本文提供的方法可用于制造任何尺寸的微针尖端，例如丝素蛋白尖端，例如可植入的持续释放尖端。微针尖端(例如丝素蛋白尖端)可经配置以包含和释放有效量的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施例中，微针(例如，微针尖端)经配置以刺穿生物屏障(例如，皮肤)。
本文所述的微针尖端可包括任何合适量的丝素蛋白。在一些实施方式中，微针尖端可包含介于约0.1％和约20％之间的丝素蛋白，或介于约0.1％和约10％v/v之间的丝素蛋白，任选地，其中百分比(％)基于制造期间使用的丝素溶液(“印刷溶液”)。例如，微针尖端可包括至少约0.1％，约0.25％，约0.5％，约0.75％，约1％，约1.25％，约1.5％，约1.75％，约2％，约2.25％，约2.5％，约2.5％，约3.75％，约4％，约4.25％，约4.5％，约4.75％，约5％，约5.25％，约5.5％，约5.75％，约6％，约6.25％，约6.5％，约7.5％，约7.75％，约8％，约8.25％，约8.5％，约8.75％，约9％，约9.25％，约9.5％，约9.75％，约11％，约10.5％，约12％，约12.5％，约13％，约13.5％，约14％，约14.5％，约15％，约15.5％，约16％，约17％，约17.5％，约18％，约18.5％，任选地，约19.5％或约20％v/v丝素蛋白，其中百分比(％)基于制造期间使用的丝素溶液(“印刷溶液”)。在实施方式中，本文所述的微针可包含具有约82和约92kDa(例如，约82，约83，约84，约85，约86，约87，约88，约89，约90，约91或约92kDa)之间的平均重均分子量的丝素蛋白片段群体。
在某些实施方式中，微针尖端可包含任何合适量的表面活性剂。在某些实施方式中，微针尖端可包含约0.1％至约10％表面活性剂的量的表面活性剂。例如，微针尖端可包括至少约0.1％，约0.25％，约0.5％，约0.75％，约1％，约1.25％，约1.5％，约1.75％，约2％，约2.25％，约2.5％，约2.75％，约3％，约3.25％，约3.5％，约3.75％，约4％，约4.25％，约4.5％，约4.75％，约5％，约5.25％，约5.5％，约5.75％，约6％，约6.25％，约6.5％，约6.75％，约7％，约7.25％，约7.5％，约7.75％，约8％，约8.25％，约8.5％，约8.75％，约9％，约9.25％，约9.5％，约9.75％或约10％的表面活性剂，任选地，其中百分比(％)基于制造期间使用的溶液(“印刷溶液”)。在某些实施方式中，表面活性剂可以是Tween，例如Tween 20。
在一些情况下，可用于制造如本文所述的微针尖端的材料的量可指在制造期间使用的溶液(“印刷溶液”)中存在的量。在某些实施方式中，该量可以表征为体积/体积(v/v)，重量/重量(w/w)或重量/体积(w/v)测量值。
在一些情况下，可用于制造如本文所述的微针尖端的材料的百分比(％)可指在制造期间使用的溶液(“印刷溶液”)中存在的百分比(％)。在某些实施方式中，该百分比(％)可表征为体积/体积(v/v)，重量/重量(w/w)或重量/体积(w/v)测量值。
在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)的尺寸在高度/长度上为约75μm至约800μm(例如约75μm，约100μm，约125μm，约150μm，约250μm至约300μm，约300μm至约350μm，约350μm至约400μm，约400μm至约450μm，约450μm至约500μm，约500μm至约550μm，约550μm至约600μm，约600μm至约650μm，约650μm至约700μm，约700μm至约750μm，约750μm至约800μm)。在某些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)具有约200μm至约500μm的高度/长度尺寸。在某些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)具有约300μm至约400μm的高度/长度尺寸。
在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端，例如可植入尖端)可具有任何尺寸的直径，例如基于意欲被尖端刺穿的生物屏障(例如皮肤层)的类型。在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)具有约10μm或更小(例如在约1μm与约10μm之间，例如约1μm或更小，约2μm或更小，约3μm或更小，约4μm或更小，约5μm或更小，约6μm或更小，约7μm或更小，约8μm或更小，约9μm或更小，或约10μm或更小)的尖端半径。在实施方式中，尖端可具有范围为约50nm至约50μm(例如，约50nm至约250nm，约250nm至约500nm，约500至约750nm，约750nm至约1μm，约1μm至约5μm，约5μm至约10μm，约10μm至约15μm，约15μm至约20μm，约25μm至约30μm，约30μm至约35μm，约35μm至约40μm，约40μm至约45μm，或约45μm至约50μm)的尺寸(例如，直径)。可以理解，不存在防止尖端具有甚至更小直径的基本限制(例如，丝复制品铸造的限制已经用数十nm的分辨率证明，参见例如Perry等,Adv.Mat.(2008)20:3070)。
在一些实施方式中，本文根据尖端半径描述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)(例如可植入持续释放尖端)的锐度。用于制造本文所述的微针的模具设计成具有约0.5μm至约10μm(例如，约0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm)的尖端半径。在一些实施例中，尖端半径在约20μm至约25μm之间(例如，约20μm、21μm、22μm、23μm、24μm或25μm)。不受理论的约束，可以理解钝针可能需要更大的力来穿透表皮。在实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端，例如可植入的持续释放尖端)的其他尺寸可通过模具的形状和/或填充体积来控制。在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)，例如可植入持续释放尖端，可具有约5度与约45度之间的夹角(例如约5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或45度)。在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)(例如可植入的持续释放尖端)可具有介于约15度与45度之间的夹角(例如约15度、约16度、约17度、约18度、约19度、约20度、约21度、约22度、约23度、约24度、约25度、约26度、约27度、约28度、约29度、约30度、约31度、约32度、约33度、约34度、约35度、约36度、约37度、约38度、约39度、约41度、约42度、约43度、约44度或约45度)。
在实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)，例如可植入的持续释放尖端的高度可取决于制剂和填充体积(例如填充体积或液滴分配体积)，其可影响表面张力和干燥动力学。在一些实施例中，尖端的高度可以延伸到微针的整个高度的一半。在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)(例如可植入持续释放尖端)的高度介于约75μm至约475μm之间(例如约75μm、约100μm、约125μm、约150μm、约175μm、约200μm、约225μm、约250μm、约275μm、约300μm、约325μm、约375μm、约400μm、约425μm或约475μm)。在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)(例如可植入持续释放尖端)的高度在约300μm至约400μm之间。在一些实施例中，尖端的一部分包括大致在约5-10μm厚(例如，约5、6、7、8、9或10μm厚)之间的薄“壳”状层。在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)(例如可植入的持续释放尖端)可干燥成具有最小“壳”的更坚固的构造，其中高度可接近150μm(例如在约50μm与约200μm之间)且厚度>50μm(例如在约25μm与约75μm之间)。
此外，本公开的微针可利用所开发的本领域已知技术，例如使丝素蛋白(例如，活性剂，诸如染料和传感器)官能化。参见例如美国专利号6,287,340,Bioengineeredanterior cruciate ligament；WO 2004/000915,Silk Biomaterials&Methods of UseThereof；WO 2004/001103,Silk Biomaterials&Methods of Use Thereof；WO 2004/062697,Silk Fibroin Materials&Use Thereof；WO 2005/000483,Method for FormingInorganic Coatings；WO 2005/012606,Concentrated Aqueous Silk Fibroin Solution&Use Thereof；WO 20111005381,Vortex-Induced Silk fibroin Gelation forEncapsulation&Delivery；WO 20051123114,Silk-Based Drug Delivery System；WO2006/076711,Fibrous Protein Fusions&Uses Thereof in the Formation of AdvancedOrganic/Inorganic Composite Materials；美国申请公布号2007/0212730,CovalentlyImmobilized Protein Gradients in Three-Dimensional Porous Scaffolds；WO 2006/042287,Method for Producing Biomaterial Scaffolds；WO 2007/016524,Method forStepwise Deposition of Silk Fibroin Coatings；WO 2008/085904,BiodegradableElectronic Devices；WO 20081118133,Silk Microspheres for Encapsulation&Controlled Release；WO 2008/1108838,Microfluidic Devices&Methods forFabricating Same；WO 2008/1127404,Nanopatterned Biopolymer Device&Method ofManufacturing Same；WO 2008/1118211,Biopolymer Photonic Crystals&Method ofManufacturing Same；WO 2008/1127402,Biopolymer Sensor&Method of ManufacturingSame；WO 2008/1127403,Biopolymer Optofluidic Device&Method of Manufacturingthe Same；WO 2008/1127401,Biopolymer Optical Wave Guide&Method ofManufacturing Same；WO 2008/1140562,Biopolymer Sensor&Method of ManufacturingSame；WO 2008/1127405,Microfluidic Device with Cylindrical Microchannel&Methodfor Fabricating Same；WO 2008/1106485,Tissue-Engineered Silk Organs；WO 2008/1140562,Electroactive Biopolymer Optical&Electro-Optical Devices&Method ofManufacturing Same；WO 2008/1150861,Method for Silk Fibroin Gelation UsingSonication；WO 2007/1103442,Biocompatible Scaffolds&Adipose-Derived StemCells；WO 2009/1155397,Edible Holographic Silk Products；WO 2009/1100280,3-Dimensional Silk Hydroxyapatite Compositions；WO 2009/061823,Fabrication ofSilk Fibroin Photonic Structures by Nanocontact Imprinting；和WO 2009/1126689,System&Method for Making Biomaterial Structures。
在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施方式中，由于真皮中的抗原呈递细胞群体通常高于皮下空间中的抗原呈递细胞群体(例如，驻留于皮肤的树突细胞)，因此可以将尖端设计成展开到皮肤的真皮层中(例如，不展开到皮下空间中)。在人类中，基于位置和患者年龄和健康，真皮的厚度为约1000-2000μm(例如约1-2mm)。在啮齿动物中，真皮薄得多(例如，小鼠～100-300μm，和大鼠～800-1200μm)。不希望受理论束缚，使用650μm高的微针，尖端(例如，可植入的持续释放尖端)可以在约100μm与约600μm之间的深度部署以实现如本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的受控或持续释放。
在各种实施方式中，微针尖端(例如，基于丝素蛋白的微针尖端)还包含至少一种附加的治疗剂，其中所述附加的治疗剂可分散在整个微针中或形成微针尖端的至少一部分。在一些实施方式中，附加的治疗剂可用于治疗本文所述的病毒感染。任选地，基于丝素蛋白的微针尖端可进一步包含如本文所述的赋形剂和/或佐剂。
不受理论束缚，用于制造本文所述的微针的丝素蛋白溶液的分子量可用作调节疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从尖端释放的控制因子。在一些实施方式中，较高分子量丝素蛋白溶液可有利于较慢的控制释放或持续释放(例如，将初始爆发的量(例如，在第0天释放的量)减少至少约10％，然后在至少约接下来的4天内释放附加的疫苗、抗原和/或免疫原)。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原从尖端的控制释放或持续释放可超过至少约4天(例如，约4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天或更多天，例如，约5天与25天之间，约10天与约20天之间，约10天与约15天之间，约4天与约15天之间，或约14天与15天之间，例如，约1-2周，约1-3周或约1-4周之间)。在一些实施方式中，释放发生在约1周至约2周内。在一些实施方式中，释放发生超过约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约13天、约14天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天或约25天。在一些实施方式中，释放发生在约10天内。在一些实施方式中，释放发生在约11天内。在一些实施方式中，释放发生在约12天内。在一些实施方式中，释放发生在约13天内。在一些实施方式中，释放发生在约14天内。在一些实施方式中，释放发生在约15天内。在一些实施方式中，释放发生在约16天内。
或者，或除了包含丝素蛋白之外，在一些实施方式中，微针(例如，微针尖端)包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。在一些实施方式中，微针(例如，微针尖端)包含聚谷氨酸(PGA)。在一些实施方式中，微针(例如，微针尖端)包含聚己内酯(PCL)。在一些实施方式中，微针(例如，微针尖端)包含透明质酸(HA)(例如，交联的HA)。在一些实施方式中，微针(例如，微针尖端)包含明胶。在一些实施方式中，微针(例如，微针尖端)包含表面活性剂，诸如吐温，任选地，吐温20。在一些实施方式中，微针(例如，微针尖端)包含转基因和/或重组丝素蛋白。
在一些实施方式中，用于制造本文所述微针的丝素蛋白溶液可包含介于约0.1％和约20％v/v之间的丝素蛋白，或介于约0.1％和约10％v/v之间的丝素蛋白。例如，用于制造本文所述微针的丝素溶液可包含至少约0.1％、约0.25％、约0.5％、约0.75％、约1％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2％、约2.25％、约2.5％、约2.75％、约3％、约3.25％、约3.5％、约3.75％、约4％、约4.25％、约4.5％、约4.75％、约5％、约5.25％、约5.5％、约5.75％、约6％、约6.25％、约6.5％、约7.5％、约7.75％、约8％、约8.25％、约8.5％、约8.75％、约9％、约9.25％、约9.5％、约9.75％、约11％、约11.5％、约12％、约12.5％、约15％、约15.5％、约14％、约14.5％、约16％、约16.5％、约17％、约17.5％、约18％、约18.5％、约19％、约19.5％、或约20％的丝素蛋白。在实施方式中，用于制造本文所述的微针的丝素溶液可包含具有约82和约92kDa之间的平均重均分子量(例如，约82、约83、约84、约85、约86、约87、约88、约89、约90、约91或约92kDa)的丝素片段群体。
在一些实施方式中，用于制造本文所述微针的丝素蛋白溶液可包含表面活性剂。例如，用于制造本文所述微针的丝素溶液可包含至少约0.1％、约0.25％、约0.5％、约0.75％、约1％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2％、约2.25％、约2.5％、约2.75％、约3％、约3.25％、约3.5％、约3.75％、约4％、约4.25％、约4.5％、约4.75％、约5％、约5.25％、约5.5％、约5.75％、约6％、约6.25％、约6.5％、约6.75％、约7％、约7.25％、约7.5％、约7.75％、约8％、约8.25％、约8.5％、约8.75％、约9％、约9.25％、约9.5％、约9.75％或约10％的表面活性剂。在一些实施方式中，表面活性剂可以是Tween，例如Tween 20。在一些情况下，用于制造如本文所述的微针尖端的材料(例如表面活性剂)的百分比(％)可表征为体积/体积(v/v)，重量/重量(w/w)或重量/体积(w/v)测量值。
在实施方式中，用于制造本文所述的微针的丝素蛋白溶液可以是包含具有一定范围的分子量的丝素蛋白片段群体的低分子量丝素蛋白组合物，其特征在于：所述群体中丝素蛋白片段总数的不超过15％具有超过200kDa的分子量，并且所述群体中丝素蛋白片段总数的至少50％具有在指定范围内的分子量，其中所述指定范围在约3.5kDa与约120kDa之间，或在约5kDa与约125kDa之间。换言之，用于制造本文所述微针的丝素蛋白溶液可包含具有一定范围分子量的丝素蛋白片段群体，其特征在于：群体中丝素蛋白片段总摩尔数的不超过15％具有超过200kDa的分子量，并且群体中丝素蛋白片段总摩尔数的至少50％具有在指定范围内的分子量，其中所述指定范围介于约3.5kDa与约120kDa之间，或介于约5kDa与约125kDa之间(参见例如WO2014/145002，其以引用的方式并入本文中)。
示例性的丝素蛋白(例如，再生丝素蛋白)溶液可以具有不同的分子量分布，例如，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)方法测定的(参见，例如，图4)。在一些实施方式中，丝素蛋白溶液可以例如根据已建立的方法制备。在一些实施方式中，在通过SEC分析之前，首先将来自家蚕Bombyx mori的茧在0.02M Na2CO3中煮沸以除去存在于未加工的天然丝中的丝胶蛋白。在一些实施方式中，丝素蛋白组合物可以是通过在常压沸腾温度下将来自家蚕Bombyxmori的茧脱胶约480分钟或更少，例如小于480分钟，小于400分钟，小于300分钟，小于200分钟，小于180分钟，小于120分钟，小于100分钟，小于60分钟，小于50分钟，小于40分钟，小于30分钟，小于20分钟，小于10分钟或更短而产生的组合物或混合物。在一个实施方式中，丝素蛋白组合物可以是通过在碳酸钠水溶液中在常压沸腾温度下将丝茧脱胶约480分钟或更少，例如小于480分钟，小于400分钟，小于300分钟，小于200分钟，小于180分钟，小于120分钟，小于100分钟，小于60分钟，小于50分钟，小于40分钟，小于30分钟，小于20分钟，小于10分钟或更短而产生的组合物或混合物。
在一些实施方式中，丝素蛋白溶液可以是10分钟煮沸(10MB)，60分钟煮沸(60MB)，120分钟煮沸(120MB)，180分钟煮沸(180MB)或480分钟煮沸(480MB)的丝素蛋白溶液(参见例如图4)。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以配制在1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)10MB丝素蛋白溶液中。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以配制在1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)60MB丝素蛋白溶液中。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以配制在1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)120MB丝素蛋白溶液中。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以配制在1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)180MB丝素蛋白溶液中。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以配制在1％w/v至约10％w/v(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％w/v)480MB丝素蛋白溶液中。
不受理论的束缚，丝素蛋白尖端(例如可植入的持续释放尖端)的主要可调谐性是其结晶度，通过β-片层含量(分子间和分子内β-片层)测量。这影响丝尖基质的溶解性和疫苗、抗原和/或免疫原被保留的能力。随着β-片层含量的增加，尖端的机械强度也变得更大。特定疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)释放曲线可通过调节丝基质的结晶度和扩散性来实现。这通过丝输入材料和配方以及增加结晶度的后处理(例如，退火，如水退火或甲醇/溶剂退火)来实现。在一些实施方式中，例如基于“结晶度指数”(例如本领域已知的“结晶度指数”)，丝素蛋白尖端(例如可植入的控释或缓释微针尖端)包含约10％至约60％(例如约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％)的β-片层含量。在一些实施方式中，丝素蛋白尖端，例如可植入的控释或缓释微针尖端，可以配制为颗粒(例如微粒和/或纳米颗粒)。
微针尺寸
在一些实施方式中，本公开提供具有各种尺寸和几何形状的微针(例如，基于丝素蛋白的微针)和包含所述微针的装置。
在实施方式中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)的长度可被制造成足够长，以能够将包含疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)和任选的附加的治疗剂的微针尖端(例如，丝素蛋白尖端)递送(例如，植入)到生物屏障(例如，皮肤)内的期望深度，例如，以诱导免疫应答。
在一些实施方式中，所述微针(例如，基于丝素蛋白的微针)的长度在约350μm至约1500μm之间(例如，约350μm，约400μm，约450μm，约500μm，约550μm，约600μm，约650μm，约700μm，约750μm，约800μm，约850μm，约900μm，约950μm，约1000μm，约1050μm，约1100μm，约1150μm，约1200μm，约1250μm，约1300μm，约1350μm，约1450μm，约1500μm)。
在一些实施方式中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)长度足以使可植入尖端(例如，包含疫苗、抗原和/或免疫原)能够递送至表皮(例如，皮肤表面下约10μm至120μm)，例如，以引发免疫应答。在一些实施方式中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)长度足以使可植入尖端(例如，包含疫苗、抗原和/或免疫原)能够递送至真皮(例如，皮肤表面下约60μm至约2.1mm)，例如，以引发免疫应答。
在一些实施方式中，微针被配置为将微针尖端(例如，丝素蛋白尖端)以约100μm至约600μm之间的深度(例如，尖端的远侧部分的最大穿透深度)植入受试者的生物屏障中。在一些实施例中，所述微型针的长度在约350μm至约1500μm之间。在一些实施方式中，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)的高度可延伸至微针整个高度的约一半。
不希望受理论束缚，技术人员可针对多种因素调节微针长度(例如，基于丝素蛋白的微针长度)，所述因素包括但不限于组织厚度，例如皮肤厚度(例如，作为年龄，性别，身体上的位置，受试者物种(例如，人)，药物递送概况，疫苗、抗原和/或免疫原的扩散特性(例如，离子电荷和/或分子重量，和/或疫苗、抗原和/或免疫原的形状)或其任何组合的函数。
然而，不希望受理论束缚，对于约650μm高的微针，微针尖端(例如丝素蛋白尖端)可在皮肤的真皮层内约100μm与约600μm之间的深度部署(例如植入)到受试者以实现疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从微针尖端(例如丝素蛋白尖端)的释放(例如持续释放)。在一些实施例中，该微针可以是约800μm高(例如，在约500μm和1200μm高之间)。
本公开的示例性微针在图2和图3中示出。
微针贴片
在一些实施例中，本公开的微针装置(例如，微针贴片)包括本文公开的多个微针。微针装置(例如，微针贴片)可包括多个相同类型的微针。或者，微针装置可包括多个不同类型的微针。在本公开的另一方面，本文所述的微针和微针装置(例如，微针贴片)通过精确填充每个单个的微针尖端来制造，以实现本文所述的不同疫苗递送模式，给药方案和不同活性剂(例如，疫苗、抗原、免疫原、佐剂和/或附加的治疗剂)的组合施用。例如，可以将单独的抗原制剂分配到贴片的不同微针尖端中，用于通过同一贴片共同递送不同的抗原而不共同配制抗原。图5示出了本公开的示例性微针装置的一部分的放大视图，其被制造成在不同的微针中包括不同的制剂。
本文所述的免疫，疫苗递送和给药方法可包括疫苗、抗原和/或免疫原与附加的活性剂的组合施用。在一些实施方式中，附加的活性剂可以在与疫苗相同的顶端共同配制。不希望受理论束缚，这种组合可包括驱动更强的细胞免疫应答和/或粘膜应答的佐剂。此外，可以递送附加的抗原用于异源“初次免疫/加强免疫样”免疫，例如用来自第一病毒病毒株(例如冠状病毒和/或流感病毒)的抗原初次免疫，和用不同抗原(例如漂移病毒株的抗原)加强免疫(例如通过控制释放或持续释放或与“初次免疫”不同的动力学模式提供)。例如，初次免疫可包含来自各种流感病毒株的HA抗原，和用不同抗原(例如，漂移病毒株，血凝素茎干，m2e蛋白或NA)加强免疫(例如，通过控制释放或持续释放或与“初次免疫”不同的动力学模式提供)。
本公开的微针装置(例如，基于丝素蛋白的微针装置)例如微针贴片可包含单价或多价疫苗，例如二价、三价、四价(quadrivalent/tetravalent)或五价疫苗。在一些实施方式中，微针装置包含四价疫苗。在一些实施方式中，微针装置包含五价疫苗。如本文所述，五价疫苗可包含一种或多种冠状病毒抗原(例如SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原和/或MERS-CoV抗原中的一种或多种)和一种或多种流感抗原(例如甲型流感抗原、乙型流感抗原、丙型流感抗原和/或丁型流感抗原中的一种或多种)。
多价疫苗的各组分，例如包含两种、三种、四种、五种或更多种不同抗原的多价疫苗的各组分可在同一微针中共同配制。例如，装置的每个微针可包括含有四价或五价疫苗的所有抗原的共同制剂。或者，装置的不同微针可包含彼此不同的制剂，例如包含一种或多种不同的抗原。例如，多价疫苗的不同组分(例如，不同冠状病毒和/或流感抗原)可置于装置的不同微针中。多价疫苗(例如四价或五价疫苗)可包含冠状病毒抗原和/或流感抗原的组合。在一些实施方式中，微针装置或多个微针包含多价流感疫苗(例如，二价、三价、四价(quadrivalent/tetravalent)或五价流感疫苗)。在一些实施方式中，微针装置或多个微针包含四价流感疫苗。
例如，在包含多种不同抗原(例如一种或多种冠状病毒和一种或多种流感抗原的组合)的微针装置中，不同抗原中的每一种可单独配制到装置中的其自己的微针组中。在一些实施方式中，在包含多种不同抗原的微针装置中，不同抗原中的一种以上在同一组微针中共同配制，而一种或多种其他抗原在装置的不同组微针中配制。例如，在包含多种不同抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原和一种或多种流感抗原的微针装置中，一种或多种流感抗原可以共同配制到装置的同一组微针中，而一种或多种冠状病毒抗原配制到装置的其自己的不同组微针中。
在一些实施方式中，微针装置包括至少两根不包含彼此相同的疫苗、抗原和/或免疫原制剂的微针。在一些实施方式中，微针装置包括至少三个彼此不包含相同制剂的疫苗、抗原和/或免疫原的微针。在一些实施方式中，微针装置包括至少四根彼此不包含疫苗、抗原和/或免疫原的相同制剂的微针。在一些实施方式中，微针装置包括至少五根彼此不包含疫苗、抗原和/或免疫原的相同制剂的微针。
本文所述的微针装置(例如，微针贴片)可包含预选分布的一个或多个微针，其包含冠状病毒抗原和/或流感抗原。例如，多个微针的一部分(例如，20％的微针)可含有一种或多种冠状病毒抗原，而剩余部分(例如，80％的微针)可含有一种或多种流感抗原。在一些实施方式中，多个微针的一部分(例如，微针的20％)包含一种或多种冠状病毒抗原，并且不包含流感抗原；并且所述多个微针的剩余部分(例如，80％的微针)包含一种或多种流感抗原，并且不包含冠状病毒抗原。
在一些实施方式中，多个微针包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，至少20％)包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针。在一些实施例中，多个微针包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，至少80％)包含一种或多种流感抗原(例如，一种、两种、三种或四种流感抗原)的微针。
在一些实施方式中，多个微针包含至少10％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少90％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。在一些实施方式中，多个微针包含至少20％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少80％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。在一些实施方式中，多个微针包含至少30％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少70％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。在一些实施方式中，所述多个微针包含至少40％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少60％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。在一些实施方式中，所述多个微针包含至少50％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少50％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。在一些实施方式中，多个微针包含至少60％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少40％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。在一些实施方式中，多个微针包含至少70％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少30％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。在一些实施方式中，多个微针包含至少80％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少20％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。在一些实施方式中，所述多个微针包含至少90％包含一种或多种冠状病毒抗原，例如一种冠状病毒抗原的微针，和至少10％包含一种或多种流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原的微针。
在一些实施方式中，微针装置包括第一，第二，第三，第四和/或第五微针，其包括：(i)冠状病毒疫苗、抗原和/或免疫原(例如SARS-CoV-2疫苗、SARS-CoV疫苗和/或MERS-CoV疫苗)；和(ii)流感疫苗、抗原和/或免疫原(例如，甲型流感疫苗，乙型流感疫苗，丙型流感疫苗和/或丁型流感疫苗)。在一些实施例中，装置的微针仅包括(i)。在一些实施例中，装置的微针仅包括(ii)。在一些实施例中，装置的微针包含(i)和(ii)。在一些实施例中，第一，第二，第三，第四和/或第五微针中的每一个包括(i)和(ii)。
在一些实施例中，第一微针仅包括(i)，第二微针仅包括(ii)。在一些实施方式中，第三微针仅包含(ii)，其中流感疫苗、抗原和/或免疫原不同于第二微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，第三微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原与第二微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原相同。在一些实施方式中，第四微针仅包含(ii)，其中流感疫苗、抗原和/或免疫原不同于第二和/或第三微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，第四微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原与第二和/或第三微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原相同。在一些实施方式中，第五微针仅包含(ii)，其中流感疫苗、抗原和/或免疫原不同于第二，第三和/或第四微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，第五微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原与第二，第三和/或第四微针中存在的流感疫苗、抗原和/或免疫原相同。
在一些实施方式中，存在于第一，第二，第三，第四和/或第五微针中的疫苗、抗原和/或免疫原的组合包含二价疫苗。在一些实施方式中，存在于第一，第二，第三，第四和/或第五微针中的疫苗、抗原和/或免疫原的组合包含三价疫苗。在一些实施方式中，存在于第一，第二，第三，第四和/或第五微针中的疫苗、抗原和/或免疫原的组合包含四价疫苗(例如，四价流感疫苗)。在一些实施方式中，预置在第一，第二，第三，第四和/或第五微针中的疫苗、抗原和/或免疫原的组合包含五价疫苗。在一些实施方式中，第一微针包含单价疫苗(例如冠状病毒疫苗)。在一些实施方式中，存在于第二，第三，第四和第五微针中的疫苗组合包含四价疫苗(例如，四价流感疫苗)。在一些实施方式中，第二，第三，第四和第五微针各自独立地包含四价疫苗(例如，四价流感疫苗)。在一些实施方式中，存在于第一微针中的冠状病毒疫苗和存在于第二，第三，第四和第五微针中的流感疫苗的组合包含五价疫苗。
释放动力学
本文所述的微针和微针装置(例如，微针贴片)可被配置成根据各种释放动力学释放疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，以及任选的附加的治疗剂。在一些实施方式中，释放动力学模拟天然感染(例如病毒感染)的释放动力学，其可以驱动更有效的免疫应答(例如更有效的细胞和/或体液免疫应答)。
不希望受理论束缚，本文所述的微针和微针装置可通过使病毒衍生的抗原，免疫原和/或疫苗能够释放(例如控制释放或持续释放)到受试者中(例如到受试者的真皮皮肤层中)来模拟抗原呈递(例如病毒抗原呈递)的天然过程。本文所述的制剂，组合物，制品，装置和制剂，微针和微针装置所实现的控制释放或持续释放可在受试者中诱导更大的免疫原性，增强的免疫应答(例如，更有效的细胞和/或体液免疫应答)和/或广谱免疫，与施用例如疫苗(诸如流感疫苗)的单次剂量或推注施用相比。
微针(例如，微针尖端)可在足够长的时间段内缓慢释放疫苗、抗原和/或免疫原疫苗、抗原和/或免疫原(例如，在至少约4天(例如，约1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天或14天或更多天，例如，约5天，约25天，约10天和约20天，约10天和约15天，约4天和约14天，约12天和16天，约14天和15天，例如，约1-2周，约1-3周或约1-4周，例如，约一周，约两周，约三周)的时间段内)。约四周，约五周，或约六周或更多周)。在一些实施方式中，微针尖端在约5天至约25天的时间段内缓慢释放疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施方式中，微针尖端在约10天至约20天的时间段内缓慢释放疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施方式中，微针尖端在约10天至约15天的时间段内缓慢释放疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。
可调节可植入控释或缓释微针尖端(例如包含丝素蛋白的微针尖端)的各种性质以调节(例如改变和/或修饰)疫苗、抗原和/或免疫原从微针尖端的释放动力学(例如释放速率)。例如，可以调节丝素蛋白的结晶度，β-折叠含量和分子量。在一些实施方式中，可植入控释或缓释微针尖端包含例如基于“结晶度指数”(例如本领域已知的“结晶度指数”)介于约10％和约60％之间(例如约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％)的β-片层含量。
在一些实施方式中，微针(例如，基于丝素蛋白的微针)被配置成通过持续释放来释放疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。持续释放的实例包括但不限于零级释放，一级释放和二级释放。在一些实施方式中，零级释放是不依赖于剂型(例如，微针)中的疫苗、抗原和/或免疫原浓度的释放速率。在一些实施方式中，零级释放是在一段时间内大致恒定的疫苗、抗原和/或免疫原的释放(例如，每单位时间释放恒定量的疫苗、抗原和/或免疫原)。在一些实施方式中，一级释放是释放速率，其是剂型(例如，微针)中剩余的疫苗、抗原和/或免疫原的量的函数。在一些实施方式中，一级释放是每单位时间从剂型(例如，微针)释放恒定比例(例如百分比)的疫苗、抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，二级释放是其中剂型中疫苗、抗原和/或免疫原的浓度加倍使释放速率加倍。
在一些实施方式中，持续释放包括疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的基本上连续的低剂量施用。持续释放可包括连续施用微针尖端(例如丝素蛋白尖端)中存在的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)总量的约大于0％部分至约100％部分(例如约1至约25％，约25％至约50％，约50％至约75％，约75％至约100％)。在一些实施方式中，持续释放是在包括至少约4天(例如，约4至25天，约5至25天，约10至20天，约10至15天，约12至18天，约14至16天，或约14至15天，例如，约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，或25或更多天，例如，约1至约2周，约1至约3周，或约2至约4周，例如，约1至约3个月)的时间段内。约2至约4个月，例如约3至约6个月)。在某些实施方式中，持续释放是在约5天至约25天之间的时间段内。在某些实施方式中，持续释放是在约7天至约15天之间的时间段内。在某些实施方式中，持续释放是在约10天至约20天之间的时间段内。在某些实施方式中，持续释放是在约10天至约15天之间的时间段内。
在一些实施方式中，本文所述的微针(例如基于丝素蛋白的微针)被配置成通过爆发释放来释放疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施方式中，爆发释放包括向受试者快速施用疫苗、抗原和/或免疫原。突释可包括在微针尖端(例如丝素蛋白尖端)中快速施用疫苗、抗原和/或免疫原总量的大于0％部分至约100％部分(例如约1至约25％，约25％至约50％，约50％至约75％，约75％至约100％)。在一些实施方式中，突释经过包括至少约1小时(例如，约1至约30分钟，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9，10，15，20或24小时)的时间段。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从本文所述的微针(例如基于丝素蛋白的微针)的释放(例如施用)可通过疫苗、抗原和/或免疫原从微针或其部分的扩散来促进。
在一些实施方式中，本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从微针(例如基于丝素蛋白的微针)的释放(例如施用)可通过微针或其部分的降解(例如蛋白酶介导的降解)来促进。
在一些实施方式中，本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)从微针(例如基于丝素蛋白的微针)的释放(例如施用)可通过微针或其部分的溶解来促进。
不希望受理论束缚，在包含冠状病毒疫苗和流感疫苗的微针装置中，冠状病毒疫苗的释放可以与流感疫苗的释放以基本相同的速率(例如，同时)发生。在其他实施方式中，冠状病毒疫苗的释放可以以与流感疫苗的释放速率不同的速率发生，使得冠状病毒疫苗基本上在流感疫苗释放之前或基本上之后释放。
抗原和制剂
在一些实施方式中，本公开提供疫苗、抗原和/或免疫原以及任选的附加的治疗剂的递送，例如受控递送或持续递送，例如通过本文所述的制剂，组合物，制品，装置，制剂，微针和/或微针装置(例如微针贴片)和/或根据本文所述的方法。疫苗、抗原和/或免疫原可以衍生自和/或靶向特定病毒，例如作为冠状病毒科成员和/或正粘病毒科成员的病毒，例如本文所述的冠状病毒或流感病毒。
在一些实施方式中，本文所述的疫苗，微针和/或微针装置(例如微针贴片)可包含病毒，诸如灭活病毒或活减毒病毒。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原包含来源于病毒(例如冠状病毒和/或流感病毒)的核酸(例如DNA和/或RNA)。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原包含编码病毒蛋白或其部分(例如冠状病毒和/或流感病毒蛋白或其部分)的核酸(例如DNA和/或RNA)。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原包含编码病毒蛋白或其部分(例如冠状病毒和/或流感病毒蛋白或其部分)的mRNA。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原包含来源于病毒(例如冠状病毒和/或流感病毒)的氨基酸(例如肽和/或蛋白)。在一些实施方式中，流感疫苗、抗原和/或免疫原包含冠状病毒和/或流感病毒的灭活和/或活的减毒病毒体或裂解病毒体。在一些实施方式中，疫苗和/或微针包含非复制型病毒抗原。
冠状病毒疫苗
本公开的特征在于包含冠状病毒疫苗、抗原和/或免疫原的微针和/或微针装置(例如，微针贴片)。冠状病毒是冠状病毒科(Coronaviridae)中的有包膜RNA病毒，并且具有正义单链RNA基因组。冠状病毒的基因组通常编码四种主要的结构蛋白，刺突(S)，包膜(E)，膜(M)和核壳(N)。冠状病毒可以分类为α冠状病毒，β冠状病毒，γ冠状病毒或δ冠状病毒。例如，SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV是β冠状病毒的实例。冠状病毒可感染人以及其他动物，包括哺乳动物和鸟类，例如蝙蝠、牛、猪、鸡、火鸡、雪貂、猫、狗和兔以及牛。通过频繁的突变和重组事件，冠状病毒可以连续改变，并且可能经历抗原漂移和抗原转变。
已知感染人的冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2；也称为hCoV-19和2019-nCoV)，中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，人冠状病毒229E(HCoV-229E)，人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)和人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)。尽管这些冠状病毒中的每一种都可以感染人类并引起疾病，但是SARS-CoV-2，SARS-CoV和MERS-CoV已知对人类是高度致病的，并且通常在下呼吸道中复制，引起严重疾病，例如肺炎。SARS-CoV是急性呼吸综合征(SARS)的病原体，SARS-CoV-2是冠状病毒病2019(COVID-19)的病原体，MERS-CoV是中东呼吸综合征(MERS)的病原体。特别是SARS-CoV-2容易从人类传播到人类，并且在2019年初次爆发时，导致全球大流行病。
在一些实施方式中，冠状病毒是SARS-CoV-2。在一些实施方式中，冠状病毒是SARS-CoV。在一些实施方式中，所述冠状病毒是MERS-CoV。在一些实施方式中，所述冠状病毒是HCoV-229E。在一些实施方式中，冠状病毒是HCoV-NL63。在一些实施方式中，冠状病毒是HCoV-OC43。在一些实施方式中，所述冠状病毒是HCoV-HKU1。
在一些实施方式中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2变体(漂移病毒株)，例如选自B.1.525，B.1.526，B.1.526.1，B.1.617，B.1.617.1，B.1.617.2，B.1.617.3，P.2，B.1.1.7，B.1.351，B.1.427，B.1.429或P.1。
冠状病毒在外表面具有糖基化刺突(S)蛋白，其可被病毒用于进入宿主细胞。例如，SARS-CoV-2的刺突蛋白是三聚体I类融合蛋白，并且通常以亚稳态的融合前构象存在，其可以经历实质性的结构重排以使病毒膜与宿主细胞膜融合。SARS-CoV-2刺突蛋白包含N-末端结构域(NTD)和受体结合结构域(RBD)，所述受体结合结构域(RBD)是与宿主细胞受体接合以经历融合的组成部分。部分由于刺突蛋白的关键功能，它代表了抗体介导的中和的关键靶标，并且可以告知疫苗和/或抗原发展。SARS-CoV-2刺突蛋白的结构已经通过冷冻电子显微镜测定(Wrapp等,Science(2020)367:1260-1263)。
下面提供了(SARS-CoV-2的)刺突蛋白的示例性氨基酸序列：MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:1)
在一些实施方式中，SARS-CoV-2的刺突蛋白可以包含各种蛋白取代，如在SARS-CoV-2变体B.1.525中鉴定的那些(例如，A67V，69del，70del，144del，E484K，D614G，Q677H，F888L)；B.1.526(如，(L5F*)，T95I，D253G，(S477N*)，(E484K*)，D614G，(A701V*))；B.1.526.1(如，D80G，144del，F157S，L452R，D614G，(T791I*)，(T859N*)，D950H)；B.1.617(例如，L452R，E484Q，D614G)；B.1.617.1(如，(T95I)，G142D，E154K，L452R，E484Q，D614G，P681R，Q1071H)；B.1.617.2(例如，T19R，(G142D)，156del，157del，R158G，L452R，T478K，D614G，P681R，D950N)；B.1.617.3(如T19R，G142D，L452R，E484Q，D614G，P681R，D950N)；P.2(如E484K，(F565L*)，D614G，V1176F)；B.1.1.7(如，69del，70del，144del，(E484K*)，(S494P*)，N501Y，A570D，D614G，P681H，T716I，S982A，D1118H(K1191N*))；B.1.351(例如，D80A，D215G，241del，242del，243del，K417N，E484K，N501Y，D614G，A701V)；B.1.427(例如，L452R，D614G)；B.1.429(例如，S13I，W152C，L452R，D614G)；和P.1(例如，L18F，T20N，P26S，D138Y，R190S，K417T，E484K，N501Y，D614G，H655Y，T102)，其中(*)表示在变体的一些序列但不是全部中检测到取代。在一些实施方式中，SARS-CoV-2的刺突蛋白可以包含L452R和/或E484K蛋白取代。
本公开的特征在于包含冠状病毒疫苗的微针装置和/或微针。冠状病毒疫苗可包含SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原、MERS-CoV抗原或其组合。冠状病毒疫苗可以是几种疫苗类型之一或其组合。例如，冠状病毒疫苗可以是基于DNA的制剂，基于RNA的制剂，含有病毒表位的重组亚基，基于腺病毒的载体，纯化的灭活病毒或其组合。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2疫苗。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含SARS-CoV疫苗。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含MERS-CoV疫苗。在一些实施方式中，SARS-CoV-2疫苗包含SARS-CoV-2病毒(例如活的减毒SARS-CoV-2病毒，或灭活的SARS-CoV-2病毒)，或SARS-CoV-2抗原，例如SARS-CoV-2刺突蛋白(例如SARS-CoV-2-S1)或其亚基。在一些实施方式中，SARS-CoV疫苗包含SARS-CoV病毒(例如活的减毒SARS-CoV病毒，或灭活的SARS-CoV病毒)，或SARS-CoV抗原，例如SARS-CoV刺突蛋白(例如SARS-CoV-S1)或其亚基。在一些实施方式中，MERS-CoV疫苗包含MERS-CoV病毒(例如活的减毒MERS-CoV病毒或灭活的MERS-CoV病毒)或MERS-CoV抗原，例如MERS-CoV刺突蛋白(例如MERS-CoV-S1)或其亚基。
本文所述的冠状病毒疫苗可以包含蛋白，例如SARS-CoV-2蛋白、SARS-CoV蛋白和/或MERS-CoV蛋白。所述蛋白可以是重组蛋白，例如重组SARS-CoV-2蛋白、重组SARS-CoV蛋白和/或重组MERS-CoV蛋白。在一些实施方式中，重组蛋白是重组SARS-CoV-2刺突蛋白。在一些实施方式中，重组蛋白是重组SARS-CoV刺突蛋白。在一些实施方式中，重组蛋白是重组MERS-CoV刺突蛋白。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含三聚体结构。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含融合前SARS-CoV-2刺突蛋白，其包含三聚体结构。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含刺突蛋白或其亚基，例如SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基，SARS-CoV刺突蛋白或其亚基，或MERS-CoV刺突蛋白或其亚基。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含融合前刺突蛋白(例如，融合前SARS-CoV-2刺突蛋白，融合前SARS-CoV刺突蛋白或融合前MERS-CoV刺突蛋白)。冠状病毒疫苗可包含完整刺突蛋白，稳定刺突蛋白，锁定刺突蛋白，刺突蛋白亚基和/或来自刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2刺突蛋白(例如SARS-CoV-2-S1)或其亚基。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2-S1。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2-S1fRS09。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含MERS-S1。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含MERS-S1f。在一些实施方式中，所述冠状病毒疫苗包含MERS-S1fRS09。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含MERS-S1ffliC。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽或其功能片段。
冠状病毒疫苗还可以包含编码刺突蛋白或其亚基的基因产物，载体，RNA或DNA，和/或被构建成表达刺突蛋白或其亚基，例如完整刺突蛋白，稳定刺突蛋白，锁定刺突蛋白，刺突蛋白亚基或来自刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含核壳蛋白或其亚基，例如SARS-CoV-2核壳蛋白或其亚基，SARS-CoV核壳蛋白或其亚基，和/或MERS-CoV核壳蛋白或其亚基。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含灭活的冠状病毒，例如灭活的SARS-CoV-2，灭活的SARS-CoV和/或灭活的MERS-CoV。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含UV-灭活的冠状病毒，例如UV-灭活的SARS-CoV-2，UV-灭活的SARS-CoV和/或UV-灭活的MERS-CoV。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含灭活的SARS-CoV-2。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含UV-灭活的SARS-CoV-2。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含PiCoVacc。
冠状病毒疫苗可包含寡核苷酸如DNA或RNA。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含DNA(例如DNA质粒)。DNA(例如DNA质粒)可以编码冠状病毒抗原(例如本文所述的冠状病毒蛋白)，例如SARS-CoV-2蛋白，SARS-CoV蛋白和/或MERS-CoV蛋白。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含编码冠状病毒刺突蛋白或其亚基(例如SARS-CoV-S1，SARS-CoV-2-S2，MERS-CoV-S1或其亚基)的DNA。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含编码SARS-CoV-2刺突蛋白的DNA。在一些实施方式中，DNA(例如，DNA质粒)被配置为在受试者中表达冠状病毒抗原(例如，刺突蛋白)，例如，以诱导免疫应答。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含INO-4800。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含RNA。RNA可以是信使RNA(mRNA)，自扩增mRNA(saRNA)，核苷修饰的mRNA(modRNA)或含尿苷的mRNA(uRNA)。在一些实施方式中，所述RNA是mRNA。在一些实施方式中，所述mRNA是裸mRNA。RNA(例如mRNA)可以编码冠状病毒抗原(例如本文所述的冠状病毒蛋白)，例如SARS-CoV-2蛋白，SARS-CoV蛋白和/或MERS-CoV-2蛋白。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含编码冠状病毒刺突蛋白或其亚基(例如SARS-CoV-2-S1，SARS-CoV-S1，MERS-CoV-S1或其亚基)的RNA。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含编码SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的mRNA。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含编码SARS-CoV刺突蛋白或其亚基的mRNA。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含编码MERS-CoV刺突蛋白或其亚基的mRNA。RNA(例如，mRNA)可以被配置为在受试者中表达冠状病毒抗原(例如，刺突蛋白)，例如，以诱导免疫应答。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含例如mRNA-1273。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含mRNA疫苗，例如Pfizer-Biontech和/或Moderna疫苗。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含常规的灭活疫苗，例如BBIBP-CorV、Coronavac、Covaxin、WIBP-CorV、Covivac和/或Qazvac疫苗。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含病毒载体疫苗，例如Sputnik Light、Sputnik V、Oxford–AstraZeneca、Convidecia、和/或Johnson&Johnson疫苗。在一些实施方式中，所述冠状病毒疫苗包含蛋白亚基疫苗，例如EpiVacCorona和/或RBD-二聚体疫苗。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含病毒载体，例如SARS-CoV-2病毒载体、SARS-CoV病毒载体和/或MERS-CoV病毒载体。病毒载体可以是非复制型病毒载体或复制型病毒载体。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含腺病毒载体，例如复制缺陷型腺病毒载体。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含5型腺病毒载体。在一些实施方式中，腺病毒载体被构建成表达冠状病毒抗原(例如冠状病毒蛋白，例如冠状病毒刺突蛋白)。在一些实施方式中，腺病毒载体被构建成表达SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含Ad5-nCoV。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含Ad26-SARS-CoV-2。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含病毒样颗粒(VLP)，例如包含一种或多种冠状病毒蛋白的VLP。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2VLP。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含SARS-CoVVLP。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含MERS-CoVVLP。
冠状病毒疫苗还可以包含不是冠状病毒的病毒，例如可以作为冠状病毒抗原的载体的病毒。例如，冠状病毒疫苗可以包含含有冠状病毒抗原的活的经修饰的正痘病毒(例如，horpepox)。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含活病毒。在一些实施方式中，冠状病毒包括活的修饰病毒。在一些实施方式中，冠状病毒包含活的修饰的正痘病毒，例如马痘病毒，其包含冠状病毒抗原。在一些实施方式中，冠状病毒包含活的经修饰的马痘病毒，其包含SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原和/或MERS-CoV抗原。在一些实施方式中，冠状病毒包含TNX-1800。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗不包含活病毒。
在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含树突细胞。树突细胞可以例如用慢病毒载体修饰以表达冠状病毒基因产物。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含用合适的载体(例如慢病毒载体)修饰以表达冠状病毒基因产物的树突细胞，和/或被修饰以包含冠状病毒基因，例如SARS-CoV-2小基因、SARS-CoV小基因、和/或MERS-CoV小基因。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含LV-SMENP-DC。类似地，冠状病毒疫苗可以包含人工抗原呈递细胞(aAPC)。在一些实施方式中，例如用合适的载体(例如慢病毒载体)修饰aAPC以表达冠状病毒基因产物。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗包含用慢病毒载体修饰的aAPC以表达冠状病毒基因产物，例如SARS-CoV小基因、SARS-CoV-2小基因、和/或MERS-CoV小基因。
流感疫苗
在另一方面，本公开的特征在于包含流感疫苗、抗原和/或免疫原的疫苗，微针和/或微针装置(例如，微针贴片)。流感病毒是RNA病毒(例如，线性负义单链RNA病毒)。存在四种已知的流感病毒属，每种包含单一类型(例如，甲型、乙型、丙型和丁型流感)。流感病毒可以连续变化，并且受到抗原漂移和抗原转变的影响。示例性流感株进一步描述于WO2019/195350中，其全文以引用的方式并入本文中。
基于病毒表面的两种蛋白，甲型流感可分为亚型：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。甲型流感包括18种已知的HA亚型，在本文中称为H1-H18，和11种已知的NA亚型，在本文中称为N1-N11。HA和NA蛋白的许多不同组合可以在甲型流感病毒的表面发现。例如，“H1N1病毒”指包含H1蛋白和N1蛋白的甲型流感病毒亚型。确认感染人的示例性甲型流感病毒亚型包括但不限于H1N1、H3N2、H2N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7和H7N9。H1N1病毒和H3N2病毒目前在人类中普遍循环。
示例性的乙型流感病毒可属于例如B/Yamagata谱系(例如B/Phuket)和/或B/Victoria谱系(例如B/Brisbane)。在一些实施方式中，乙型流感病毒属于B/Yamagata谱系。在一些实施方式中，乙型流感病毒属于B/Phuket谱系。在一些实施方式中，乙型流感病毒属于B/Victoria谱系。在一些实施方式中，乙型流感病毒属于B/Brisbane谱系。
用于本文所述的微针和微针装置(例如，微针贴片)中的流感疫苗的非限制性实例可包括商业疫苗，诸如季节性疫苗，大流行疫苗和/或通用疫苗；基于蛋的疫苗，基于细胞培养的疫苗；重组疫苗；减毒活灭活全病毒，裂解病毒体和/或蛋白亚基疫苗；和含佐剂的疫苗。在一些实施例中，微针装置包括基于蛋的疫苗。下面列出了各种商业流感疫苗。另外，包含HA干抗原，RNA(例如mRNA)，DNA，病毒载体(例如腺病毒载体)和/或病毒样颗粒(VLP)的流感疫苗适用于本文所述的微针和微针装置(例如微针贴片)。在一些实施方式中，流感疫苗可靶向流感病毒的基质蛋白1，基质蛋白2(M2e)和/或核蛋白(NP)。在一些实施方式中，疫苗是基于卵的疫苗。在一些实施方式中，疫苗在卵中生长，随后纯化，灭活和/或裂解。
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疫苗制剂
本文所述的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原(例如，本文所述的来源于流感病毒的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原)可掺入多种制剂，组合物，制品，装置和/或制剂中用于施用，例如以实现受控释放和/或持续释放。更具体地，本文所述的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原(例如，本文所述的源自冠状病毒和/或流感病毒的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原)可以通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂组合而配制成制剂，组合物，制品，装置和/或制剂，并且可以配制成半固体，固体或液体形式的制剂。在一些实施方式中，本文所述的制剂，组合物，制品，装置和/或制剂包含丝素蛋白。
示例性制剂，组合物，制品，装置和/或制剂包含：微针(例如，微针装置，例如，微针贴片，例如，如本文所述)，可植入装置(例如，泵，例如，皮下泵)，可注射制剂，储库，凝胶(例如，水凝胶)，植入物和颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)。因此，组合物的施用可以以各种方式实现，包括皮内，肌内，透皮，皮下或静脉内施用。此外，可以配制和/或施用制剂，组合物，制品，装置和/或制剂以实现本文所述的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原(例如，本文所述的源自冠状病毒和/或流感病毒的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原)的受控释放和/或持续释放。
在一些实施方式中，施用疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)，例如基本上持续施用，持续一段时间或至少1、5、10、15、30或45分钟；1、2、3、4、5、10、24小时的时间段或至少1、2、3、4、5、10、24小时的时间段；1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天或至少1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天的时段；1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周的时段；一段时间或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月；1年或至少1年、2年、3年、4年、5年或更长时间。在一些实施方式中，在约4至30天，例如约5至25天，约10至20天，约10至15天，约12至18天，约14至16天，约14至15天，例如约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，25天的时期内施用疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)。
在一些实施方式中，疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)作为控释或缓释制剂，剂型或装置施用。在某些实施方式中，疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)被配制用于连续递送，例如皮内，肌内和/或静脉内连续递送。在一些实施方式中，用于控制或持续释放疫苗的组合物或装置选自：微针(例如，微针装置，例如，微针贴片)，可植入装置(例如，泵，例如，皮下泵)，可注射制剂，储库，凝胶(例如，水凝胶)，植入物或颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)。在一个实施方式中，疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)是基于丝的控释或延长释放剂型或制剂(例如本文所述的微针)。在一个实施方式中，疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)通过可植入装置，例如泵(例如皮下泵)，植入物，微针的可植入尖端或储库施用。可以优化递送方法，使得在受试者中施用和/或维持如本文所述的疫苗(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)剂量(例如，标准剂量)预定的时间段(例如，1，5，10、15、30、45分钟或至少1，5，10、15、30、45分钟的时间段；1、2、3、4、5、10、24小时；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12，13，14天；1、2、3、4、5，6，7，8周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月；1年、2年、3年、4年、5年或更长)。疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的基本持续或延长释放可用于预防或治疗病毒感染(例如冠状病毒感染和/或流感病毒感染)数小时，数天，数周，数月或数年。
在一些实施方式中，疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)作为单剂量施用。在一些实施方式中，疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)以预定间隔作为多剂量(例如至少2，3、4，5或更多剂量)施用。在一些实施方式中，第二或后续剂量的疫苗可施用至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12，13，14天；1、2、3、4、5，6，7，8周；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个月；1年、2年、3年、4年、5年或更长)后首次或之前给药。在一些实施方式中，疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)可以每年施用。在一些实施方式中，疫苗(例如冠状病毒和/或流感疫苗)可以根据需要经常施用以实现免疫。
在一些实施方式中，本公开提供了制剂，组合物，制品，装置和/或制剂，其可被配制和/或配置用于以足以在受试者中引起针对病毒(例如，冠状病毒和/或流感病毒)的免疫应答(例如，细胞免疫应答和/或体液免疫应答)的量(例如，剂量)和/或时间段来控制释放或持续释放至少一种疫苗、抗原和/或免疫原(例如，源自本文所述的冠状病毒和/或流感病毒的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原)。
在一些实施方式中，本公开的制剂，组合物，制品，装置和/或制剂可被配制和/或配置用于以足以在受试者中产生广谱免疫的量(例如剂量)和/或时间段控制释放或持续释放至少一种疫苗、抗原和/或免疫原(例如，至少一种源自本文所述的冠状病毒和/或流感病毒的疫苗、抗原和/或免疫原)。
疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的基本连续或延长释放递送或制剂可用于预防或治疗病毒感染(例如冠状病毒感染和/或流感病毒感染)数小时，数天，数周，数月或数年。
在一些实施方式中，例如在形成本文所述的丝素蛋白微针或微针装置之前，可将本文所述的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原加入到丝素蛋白溶液中。在实施方式中，丝素蛋白溶液可以与疫苗、抗原和/或免疫原混合，然后用于制造可植入的微针尖端，例如通过填充和/或浇铸，干燥和/或退火的方法，以产生具有任何所需材料性质的微针，如本文所述。
不受理论的束缚，微针的可植入尖端中丝素蛋白与疫苗、抗原和/或免疫原的比率影响它们的释放。在一些实施方式中，可植入尖端中增加的丝浓度有利于尖端内更慢的释放和/或更大的抗原保留。可以使用任何浓度的丝，只要该浓度允许印刷并且具有足以刺穿皮肤的机械强度。
在一些实施方式中，丝素蛋白可以以约1％w/v至约10％w/v(例如，约1％w/v、2％w/v、3％w/v、4％w/v、5％w/v、6％w/v、7％w/v、8％w/v、9％w/v或10％w/v)的浓度用于制造如本文所述的微针或其组件。
示例性赋形剂
本文所述的制剂，组合物，制品，装置(例如微针装置，例如微针贴片)和/或制剂(例如包含疫苗、抗原和/或免疫原)可与常用赋形剂，稀释剂或载体一起配制，用于通过皮内，肌内，经皮，皮下或静脉内途径施用。在一些实施方式中，制剂，组合物，制品，装置和/或制剂可以例如经皮施用，并且可以配制成控释或缓释剂型等。本文所述的制剂，组合物，制品，装置和/或制剂可单独施用，彼此组合施用，或它们可与其他已知治疗剂组合使用。
适用于本公开的制剂可见于Remington's Pharmaceutical Sciences(1985)。此外，关于药物递送方法的综述，参见Langer Science(1990)249:1527-1533。本文所述的制剂、组合物、制品、装置和/或制剂可以本领域技术人员已知的方式制造，例如通过混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨细、乳化、包封、包埋或冻干过程。以下方法和赋形剂仅是示例性的并且绝不是限制性的。
用于制造本文所述微针的丝素蛋白制剂可包括赋形剂。在实施方式中，包含赋形剂可用于改善掺入的疫苗、抗原和/或免疫原的稳定性；增加来自制剂，组合物，制品，装置，制剂和/或微针(例如，微针尖端)的疫苗、抗原和/或免疫原的丝基质孔隙率和扩散性；和/或增加丝基质的结晶度/β-片层含量以使丝材料较不可溶(例如不溶)。
示例性赋形剂包括但不限于糖或糖醇(例如蔗糖，海藻糖，山梨醇，甘露醇或其组合)，二价阳离子(例如Ca2+，Mg2+，Mn2+和Cu2+)，表面活性剂(例如辛基酚乙氧基化物(例如Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)，多元醇(例如甘油)，二醇(例如丙二醇，PEG)和/或缓冲剂。在一些实施方式中，赋形剂的浓度可用于改变基质的孔隙率，例如蔗糖用作用于此目的的最常见赋形剂。还可以加入赋形剂以有利于丝自组装成有序的β-折叠二级结构，并且这样的赋形剂通常可以参与与丝的氢键或电荷相互作用以实现该效果。可用于促进丝自组装成有序β-折叠二级结构的赋形剂的非限制性实例包括谷氨酸一钠(例如L-谷氨酸)，赖氨酸，糖醇(例如山梨醇和/或甘油)和溶剂(例如二甲亚砜，甲醇和/或乙醇)。
在一些实施方式中，糖或糖醇是以小于70％(w/v)，小于60％(w/v)，小于50％(w/v)，小于40％(w/v)，小于30％(w/v)，小于20％(w/v)，小于10％(w/v)，小于9％(w/v)，小于8％(w/v)，小于7％(w/v)，小于6％(w/v)，或5％(w/v)或更少的量存在的蔗糖，例如，在干燥之前。
在一些实施方式中，糖或糖醇是以约1％(w/v)至约10％(w/v)，约2％(w/v)至约8％(w/v)，约2.2％(w/v)至约6％(w/v)，约2.4％(w/v)至约5.5％(w/v)，约2.5％至约5％，或约2.4％(w/v)，约2.5％，或约5％(w/v)的量存在的蔗糖，例如，在干燥之前。
在一些实施方式中，糖或糖醇是海藻糖，其以约1％(w/v)至约10％(w/v)，约2％(w/v)至约8％(w/v)，约2.2％(w/v)至约6％(w/v)，约2.4％(w/v)至约5.5％(w/v)，约2.5％至约5％，或约2.4％(w/v)，约2.5％，或约5％(w/v)的量存在，例如在干燥前即刻。
在一些实施方式中，糖或糖醇是山梨糖醇，其以约1％(w/v)至约10％(w/v)，约2％(w/v)至约8％(w/v)，约2.2％(w/v)至约6％(w/v)，约2.4％(w/v)至约5.5％(w/v)，约2.5％至约5％，或约2.4％(w/v)，约2.5％，或约5％(w/v)的量存在，例如，在干燥之前。
在一些实施方式中，糖或糖醇是以约1％(w/v)至约10％(w/v)，约2％(w/v)至约8％(w/v)，约2.2％(w/v)至约6％(w/v)，约2.4％(w/v)至约5.5％(w/v)，约2.5％至约5％，或约2.4％(w/v)，约2.5％，或约5％(w/v)的量存在的甘油，例如，在干燥之前。
在一些实施方式中，表面活性剂(例如辛基酚乙氧基化物(例如Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)以约0.005％(w/v)至约1％(w/v)，约1％(w/v)至约10％(w/v)，约2％(w/v)至约8％(w/v)，约2.2％(w/v)至约6％(w/v)，约2.4％(w/v)至约5.5％(w/v)，约2.5至约5％，或约2.4％(w/v)，约2.5％，或约5％(w/v)的量存在，例如在即将干燥之前。
在一些实施方式中，多元醇(例如，甘油)以约1％(w/v)至约10％(w/v)，约2％(w/v)至约8％(w/v)，约2.2％(w/v)至约6％(w/v)，约2.4％(w/v)至约5.5％(w/v)，约2.5至约5％，或约2.4％(w/v)，约2.5％，或约5％(w/v)的量存在，例如，在即将干燥之前。
在一些实施方式中，二醇(例如丙二醇，例如PEG)以约1％(w/v)至约10％(w/v)，约2％(w/v)至约8％(w/v)，约2.2％(w/v)至约6％(w/v)，约2.4％(w/v)至约5.5％(w/v)，约2.5至约5％，或约2.4％(w/v)，约2.5％，或约5％(w/v)的量存在，例如在即将干燥之前。
在一些实施方式中，疫苗制剂还包含二价阳离子。在一些实施方式中，二价阳离子选自Ca2+，Mg2+，Mn2+和Cu2+。在一些实施方式中，二价阳离子例如在干燥之前立即以0.1mM至100mM的量存在于制剂中。在一些实施方式中，二价阳离子以每标准剂量的病毒免疫原10-7至10-4摩尔的量存在于制剂中，例如在干燥前即刻。在一些实施方式中，二价阳离子在干燥前即刻以10-10至2×10-3摩尔的量存在于制剂中。
在一些实施方式中，疫苗制剂还包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PGLA)。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原制剂还包含缓冲液，例如在干燥前即刻。在一些实施方式中，缓冲剂具有在pH3和pH8之间，在pH4和pH7.5之间，或在pH5和pH7之间的缓冲能力。在一些实施方式中，缓冲剂选自4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲剂和柠檬酸盐-磷酸盐(CP)缓冲剂。在一些实施方式中，缓冲剂例如在干燥前立即以0.1mM至100mM的量存在于制剂中。在一些实施方式中，缓冲液以每标准剂量的病毒免疫原10-7至10-4摩尔的量存在。在一些实施方式中，缓冲剂以10-10至2×10-3摩尔的量存在。
此外，疫苗、抗原和/或免疫原也可配制成储库，凝胶或水凝胶制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，例如，疫苗可以用合适的聚合物或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物，例如微溶盐。
在一个实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原通过可植入的输注装置，例如泵(例如皮下泵)，植入物或贮库施用。可植入的输注装置典型地包括容纳液体储器的壳体，该液体储器可以由穿透填充端口隔膜的皮下注射针经皮填充。药物储存器通常通过内部流动路径连接到装置出口，用于通过导管将液体输送到患者身体部位。典型的输注装置还包括控制器和流体传送机构，例如泵或阀，用于将液体从贮存器通过内部流动路径移动到装置的出口端口。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原可以包装和/或配制成颗粒，例如微粒和/或纳米颗粒。典型地，纳米颗粒的直径为10，15，20，25，30，35，45，50，75，100，150或200nm或200-1，000nm，例如直径为10，15，20，25，30，35，45，50，75，100，150或200，或20或30或50-400nm。较小的颗粒倾向于更快地从系统中清除。治疗剂(包括疫苗)可被包埋在纳米颗粒内或与纳米颗粒偶联，例如共价偶联或以其他方式粘附。
基于脂质或油的纳米颗粒，如脂质体和固体脂质纳米颗粒(LNP)可用于递送疫苗、抗原和/或免疫原，任选地与本文所述的附加的治疗剂一起递送。用于递送治疗剂的固体LNP描述于以下中：Serpe等，Eur.J.Pharm.Bioparm.(2004)58:673-680；和Lu等，Eur.J.Pharm.Sci.(2006)28:86-95。基于聚合物的纳米颗粒，例如基于PLGA的纳米颗粒可用于递送本文所述的药剂。这些倾向于依赖于生物可降解的主链，其中治疗剂插层(具有或不具有与聚合物的共价键)在聚合物基质中。PLGA广泛用于聚合物纳米颗粒，参见Hu等，J.Control.Release(2009)134:55-61；Cheng等，Biomaterials(2007)28:869-876；Chan等，Biomaterials(2009)30:1627-1634。PEG化的基于PLGA的纳米颗粒也可用于递送治疗剂，参见例如Danhhier等,J.Control.Release(2009)133:11-17,Gryparis等，Eur.J.Pharm.Biopharm.(2007)67:1-8。金属基，例如金基纳米颗粒也可用于递送治疗剂。基于蛋白的纳米颗粒(例如基于白蛋白的纳米颗粒)可用于递送本文所述的药剂。在一些实施方式中，治疗剂可以与人白蛋白的纳米颗粒结合。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原被LNP包封，和/或配制为脂质纳米颗粒(LNP)制剂。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含一种或多种脂质，诸如可电离脂质(例如SM-102)、胆固醇、磷脂(例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC))和/或含PEG的脂质(例如1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG 2000DMG)。
宽范围的纳米颗粒是本领域已知的。示例性途径包括WO2010/005726，WO2010/005723，WO2010/005721，WO2010/121949，WO2010/0075072，WO2010/068866，WO2010/005740，WO2006/014626中所述的那些；和美国专利号7,820,788和7,780,984，其内容通过引用整体并入本文。
给药量
例如当通过本公开的微针施用时，能够在受试者中引起免疫应答(例如免疫原性和/或广谱免疫)的疫苗、抗原和/或免疫原的任何剂量(例如标准剂量和/或分次剂量)可根据本文所述的方法使用。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的剂量，例如标准剂量(例如人剂量)为约0.1μg至约1000μg(例如约0.1μg至约750μg，约0.1μg至约500μg，约0.1μg至约250μg，约0.1μg至约200μg，约0.1μg至约150μg，约0.1μg至约125μg，约0.1μg至约100μg，约0.1μg至约75μg，约0.1μg至约50μg，约0.1μg至约40μg)。约0.1μg-约30μg，约0.1μg-约20μg，约0.1μg-约10μg，约0.1μg-约1μg，约0.5μg-约5μg，约5μg-约10μg，约10μg-约20μg，约20μg-约30μg，约30μg-约40μg，约40μg-约50μg，约50μg-约65μg，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000μg)。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗)的剂量，例如标准剂量(例如人剂量)为约0.1μg至约500μg，(例如约0.1μg至约500μg，约0.1μg至约400μg，约0.1μg至约300μg，约0.1μg至约200μg，约0.1μg至约100μg，约1μg至约500μg，约25μg至约500μg，约50μg至约500μg，或约100μg至约500μg，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275或300μg。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如流感疫苗)的剂量，例如标准剂量(例如人剂量)为约0.1μg至约65μg(例如约0.1μg至约10μg，约0.1μg至约1μg，约0.5μg至约5μg，约5μg至约10μg，约10μg至约20μg，约20μg至约30μg，约30μg至约40μg，约40μg至约50μg，约50μg至约65μg，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13。14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65μg)。在一些实施方式中，本文所述疫苗(例如流感疫苗)的剂量(例如标准人类剂量)为约1μg至约30μg/病毒株，例如约5μg至约30μg/病毒株的病毒(例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30μg/病毒株)。
在一些实施方式中，本文所述的疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的剂量，例如分次剂量，不超过1/X，其中X是数字，例如其中X是总剂量，例如标准剂量，的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多。部分由于皮肤中相对高的抗原呈递细胞群体，当将疫苗递送到真皮内空间时，例如，当将冠状病毒抗原和/或流感抗原递送到真皮内空间时，剂量节约是可能的。因此，在一些实施方式中，可以通过本公开的微针递送的疫苗例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的总剂量可以在约5μg和13μg之间(例如，约5μg，约6μg，约7μg，约8μg，约9μg，约10μg，约11μg，约12μg或约13μg)。
不希望受理论束缚，通过本文所述的微针施用的疫苗、抗原和/或免疫原的总剂量(例如标准剂量)可在多个微针之间(例如在贴片内)分开，使得微针尖端可构成总剂量的一部分。例如，在包含约121个微针的阵列中，一个或多个微针(例如，每个微针)可包含冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的总剂量的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％或更多。在一些实施方式中，如本文所述的可植入微针尖端可包含约0.1μg至约65μg(例如，约0.1μg，约0.2μg，约0.3μg，约0.4μg，约0.5μg，约0.6μg，约0.7μg，约0.8μg，约0.9μg，约1μg，约1μg至约10μg，约10μg至约20μg，约20μg至约30μg，约30μg至约40μg，约40μg至约50μg，约50μg至约65μg)如本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原。在一些实施方式中，本文所述的微针装置的一个或多个微针(例如每个微针)可包含约0.002μg至约5μg的疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，例如至少约0.003μg、0.004μg、0.005μg、0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.05μg、0.06μg、0.07μg、0.08μg、0.09μg、0.1μg、0.12μg、0.14μg、0.16μg、0.18μg、0.2μg、0.25μg、0.3μg、0.35μg、0.4μg、0.45μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1.0μg、1.2μg、1.8μg、2.0μg、3.0μg、3.5μg、4.0μg、4.5μg或5μg的疫苗。
在一些实施方式中，装载到微针贴片中的疫苗剂量可以通过形成针尖的配制溶液中的抗原浓度，分配到每个针尖中的溶液体积和针的总数(前两种通常是改变剂量的更方便的方式)来控制。释放到皮肤中的剂量与展开效率(在除去贴片后留在皮肤中的针尖部分)有关，还与随时间的释放曲线和针尖在皮肤中的停留时间有关。由于皮肤从表皮连续脱落，皮肤内更深的展开可能与更长的停留时间有关。因此，期望使针尖的穿透深度最大化(达到由皮肤内疼痛受体的深度限定的极限，例如在约100μm和约600μm之间的深度)，并且还期望使抗原在空间上朝向针尖集中。
本文所述的制剂，组合物，制品，装置和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)被设计成不仅在例如尖端保留在真皮中的持续时间内持续释放疫苗抗原，而且在这段时间(例如至少约1-2周)内维持抗原的稳定性。在一些实施方式中，可预期例如并入本文所述的制剂，组合物，制品，装置，制剂和/或微针中的总剂量的约95％-100％可用于递送至例如受试者中，例如递送至受试者的组织中，例如皮肤，粘膜，器官组织，口腔，组织或细胞膜中。在不受理论束缚的情况下，微针成功地部署到皮肤内是阵列的至少约50％并且可以高达100％(例如，在施用时，包含阵列的微针的总数的至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如，100％)成功地部署在例如皮肤内，用于疫苗抗原的控制释放或持续释放)。在一些实施方式中，在展开期间一部分抗原可能不从丝尖端释放。
示例性佐剂和治疗剂
本文所述的微针和微针装置(例如，微针贴片)可被配置成施用一种或多种疫苗与附加的治疗剂和/或佐剂。在一些实施方式中，附加的治疗剂和/或佐剂可以配制在与疫苗相同的顶端中。例如，疫苗、抗原和/或免疫原可以与一种或多种佐剂共同递送，例如通过微针装置。不希望受理论束缚，这种组合可以驱动更强的细胞免疫应答和/或粘膜应答。
佐剂可用于促进或放大免疫事件的级联，最终导致增加的免疫应答，例如对抗原的整合的身体应答，包括细胞和/或体液免疫应答。可以与本文所述的疫苗例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗组合的佐剂的非限制性实例包括：铝(例如铝凝胶和/或铝盐，如氢氧化铝，磷酸铝和硫酸铝钾)，脂质(例如角鲨烯，单磷酰脂质A(MPL))，AS03(例如包含D,L-α-生育酚
Figure SMS_3
角鲨烯和聚山梨醇酯80的辅料)，基于角鲨烯的辅料(例如/>
Figure SMS_4
)，基于胞嘧啶磷酸鸟嘌呤的辅料(例如CpG1018)，衍生自δ菊粉的辅料(例如Advax辅料)，AS04(例如包含氢氧化铝和MPL的组合的辅料)AS01(例如包含3-O-脱酰基-4'-单磷酰脂质A(MPL)和皂苷如QS-21的组合的基于脂质体的辅料)，免疫刺激复合物(ISCOM)(例如包含皂苷和磷脂的组合的辅料)和基于皂苷的辅料(例如QS21或M)。
在一些实施方式中，微针或微针装置(例如微针贴片)不含佐剂。例如，不希望受理论束缚，由本文所述的微针装置(例如，微针贴片)提供的持续抗原呈递可消除对佐剂的需要。因此，微针或微针装置(例如，微针贴片)可用于增强，加速和/或扩大免疫应答和/或减少所需的剂量数(“剂量节约”)，考虑到生产疫苗抗原的成本和当需要疫苗加强以实现保护性免疫应答时多次临床就诊的挑战，这可能是优于常规疫苗制剂的重要优点。
在一些实施方式中，本文所述的微针或微针装置(例如微针贴片)可被制造成施用至少一种附加的治疗剂。可使用各种形式的治疗剂，其在施用于受试者后能够从本文所述的微针释放到邻近组织或流体中。在一些实施方式中，附加的治疗剂可包含在基质层内和/或可植入尖端内。
可根据本公开的方法(例如在制造期间并入本文所述的微针中)使用的其他治疗剂的实例包括类固醇和类固醇酯(例如雌激素，孕酮，睾酮，雄酮，胆固醇，炔诺酮，洋地黄毒苷，胆酸，脱氧胆酸和鹅去氧胆酸)，含硼化合物(例如碳硼烷)，化疗核苷酸，药物(例如抗生素，抗病毒剂，抗真菌剂)，烯二炔(例如加利车霉素、埃斯培霉素、动力蛋白、新制癌菌素发色团和凯达西丁发色团)，重金属复合物(例如顺铂)，激素拮抗剂(例如他莫昔芬)，非特异性(非抗体)蛋白(例如糖寡聚物)，寡核苷酸(例如结合靶核酸序列的mRNA序列或反义寡核苷酸)，肽，蛋白，抗体，光动力剂(例如罗丹明123)，放射性核素(例如，I-131、Re-186、Re-188、Y-90、Bi-212、At-211、Sr-89、Ho-166、Sm-153、Cu-67和Cu-64)，毒素(例如,蓖麻毒素)和基于转录的药物。
在一些实施方式中，本文所述的微针或微针装置可包含和/或被配置成释放非疫苗分子，例如可用于确定剂量递送的分子。在微针或微针装置中包含非疫苗分子(例如，染料)可用于确认微针或微针装置内(例如，在微针尖端中)的定位，和/或用于确认受试者中的释放，例如，确认剂量递送。在一些实施方式中，本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)与非疫苗分子共同配制。例如用于确认剂量递送的非疫苗分子可以是任何合适的染料分子，例如生物相容性染料分子或报道分子。在一些实施方式中，非疫苗分子可以在施用给受试者后例如通过在UV照射下照射而可视化。在一些实施方式中，非疫苗分子是染料。在一些实施方式中，非疫苗分子是生物相容性染料。在一些实施方式中，可以在UV照射下照射非疫苗分子，例如以便于可视化，例如在微针中和/或在受试者中。
制造微针的方法和微针装置
本文描述了制造例如本文所述的微针或微针装置的方法。图1示出了描述本公开的微针的制造方法的示意图。将精确的nL体积的溶液(例如，包含疫苗、抗原和/或免疫原的丝素蛋白溶液)机器视觉引导地分配到单独的针腔中使得能够将不同的剂量和制剂掺入微针装置(例如，微针阵列或贴片)的可释放尖端内。
在一些实施例中，在制造本文所述的微针装置(例如，微针阵列或贴片)期间，可将一种或多种治疗剂(例如一种或多种疫苗、抗原和/或免疫原)印刷到相同微针中或印刷到不同微针中。
在一些实施方式中，一种或多种冠状病毒疫苗和/或一种或多种流感疫苗可以在制造本文所述的微针装置(例如，微针阵列或贴片)期间印刷到相同微针中或印刷到不同微针中。
在一些实施方式中，在制造本文所述的微针装置(例如，微针阵列或贴片)期间，可以将一种或多种冠状病毒疫苗印刷到相同的微针中或印刷到不同的微针中。
在一些实施方式中，在制造本文所述的微针装置(例如，微针阵列或贴片)期间，可将一种或多种流感疫苗印刷到相同微针中或印刷到不同微针中。
在某些实施方式中，冠状病毒疫苗和流感疫苗在同一微针中。在某些实施方式中，冠状病毒疫苗和流感疫苗在不同的(例如，分开的)微针中。
在一些实施方式中，在制造本文所述的微针装置(例如，微针阵列或贴片)期间，可将一种或多种mRNA分子(例如一种或多种mRNA疫苗)印刷到相同微针中或印刷到不同微针中。
示例性的微针装置(例如，微针阵列或贴片)包括11×11锥体阵列。应当理解，微针装置可包括以不同数量的腔和取向的阵列产生的针腔，以实现所需的结果。
模具生产
在一些实施例中，模具用于制造微针装置。如下面将更详细讨论的，消毒的模具可用于生产具有可释放尖端阵列的微针装置，所述可释放尖端阵列包含抗原制剂，例如抗原-丝制剂，如包含冠状病毒抗原，流感抗原或其组合或疫苗制剂的制剂。
例如，硅树脂(DOW Corning
Figure SMS_5
184)可浇铸在具有微型针阵列的预定几何形状的模上。一旦硅酮固化，就可以将其从母版上移除。然后，母模可以重新用于大量的硅树脂铸件。在整个制造过程中，可以检查有机硅模具的缺陷(例如，铸件之间的缺陷)。如果需要，有机硅模具可例如通过高压灭菌法灭菌。在一个实施例中，模具包括具有形成在模具主体内的针腔阵列的模具主体。
在一些实施例中，可使用其他类型的硅酮和/或其他材料和工艺来制造模具。例如，可以使用液体硅树脂注射成型和热塑性弹性体注射成型。不希望受理论束缚，可以理解的是，关键要求是模具材料是软的和柔性的(例如，包括约50A的肖氏硬度)并且具有与在贴片的构造中使用的丝和其他材料的低粘附性。
头端填充
本文所述的微针装置的制造可包括尖端填充步骤，例如用尖端制剂填充模具。例如，包含丝素蛋白的尖端制剂，和/或用于微针尖端的另一种合适的制剂(例如，本文所述的制剂)；疫苗、抗原和/或免疫原；和/或水溶液中的其他赋形剂，佐剂和/或非疫苗分子(例如染料)经由纳升印刷分配到模具中的每个针腔中。这可以在实验室规模使用机器视觉引导的自动分配系统来实现，例如由BioDot生产的Biojet EliteTMAD3400分配系统，但是也可以使用由其他供应商制造的具有类似能力的系统。可以将BioDotTM分配器的工作体积封闭并保持在约60％相对湿度(RH)，以减缓制剂的干燥并避免干燥固体在分配喷嘴上累积。
尖端制剂(例如丝素蛋白溶液，例如抗原-丝素蛋白溶液)的精确体积(例如纳升体积)的机器视觉引导印刷可提供在微针尖端内包含不同剂量和/或制剂的微针装置。在一些实施例中，每个单个微针尖端的精确填充可实现疫苗递送的不同模式，给药方案，抗原的不同组合和/或包含抗原，治疗剂和/或佐剂的不同组合的微针。在一些实施例中，在不能共同配制的情况下，可以修改制造过程，以便将第一尖端制剂分配到针阵列的一部分中，然后将第二制剂分配到针阵列的不同部分中。图5示出了本公开的微针装置的一部分的放大视图，其被制造成在不同的微针中包括不同的制剂。
使用这些方法，可以制备包含例如各自独立地配制到不同微针中的五种不同抗原的微针装置。在一些实施方式中，尖端填充包括用冠状病毒抗原或四种不同流感抗原中的一种独立地填充微针腔，使得装置包含单独配制到不同微针中的所有冠状病毒抗原和四种流感抗原。在一些实施方式中，尖端填充包括用冠状病毒抗原填充一个或多个微针腔，和用流感抗原的共同制剂填充剩余的微针腔。在一些实施方式中，尖端填充包括用冠状病毒抗原和一种或多种流感抗原(例如，四种流感抗原)的共同制剂填充每个微针腔。
模具可以放置在夹具中，该夹具将它们的位置限制在BioDotTM分配器的处理平台上。机器使用照相机对每个模具成像，并且机器视觉算法识别每个模具中的针腔阵列的精确位置和取向。该位置可用于引导随后的分配步骤。可以使用立体显微镜检查填充的模具以填充缺陷，例如液体中的未对准的分散物或大的气泡，然而可以使用任何其他合适的方法或仪器来检查填充的模具。
一次干燥
在用顶端配料填充模具之后，填充的模具可以经历一次干燥步骤。例如，可将填充的模具放在一边以在机器外壳内干燥约7分钟。在干燥之后，可以重复上述分配过程。在一些实施方式中，将模具移至具有大约饱和湿度的室中并温育过夜以缓慢干燥尖端。在这段时间内，丝结构转变为更多的β-折叠并且可以变得较不可溶或不可溶(退火)。如本文所述，并且不希望受理论束缚，例如改变β-折叠含量的退火过程可用于微调丝尖端基质的溶解度以改变疫苗、抗原和/或免疫原的保留能力(例如提供从微针尖端的受控或持续释放)，和/或增加微针尖端的机械强度。
二次干燥
在一些实施方式中，将模具移动至其中在室温(例如，约25℃)下将湿度控制至约10％至约25％相对湿度的室中，并保持过夜(约14小时)以完成干燥。这是“二次”干燥步骤。
水退火
制造微针或微针装置的方法可采用水退火步骤。在一些实施方式中，将模具转移到还含有约500mL去离子水的真空干燥器中。然后可将干燥器封闭并置于真空下约5分钟，例如在实验室中使用主真空管线。5分钟后，可关闭干燥器的出口阀并将干燥器置于保持在约37℃的培养箱中约4小时。4小时后，可将干燥器排气，并将模具转移回环境室温(例如，约25℃)下的25％相对湿度室。
退火后干燥
在一些实施例中，制造微针的方法包括退火后干燥的步骤。例如，在随后的步骤之前，可以将模具在约10％至约25％的相对湿度下保持至少4小时或至多过夜。
基层填充
基层(例如可溶解的基层)可通过用本文所述的基质溶液填充模具来形成。在一些实施方式中，基质溶液是在去离子水中的40％w/v水解明胶和10％w/v蔗糖。在一些实施方式中，基质溶液是30％葡聚糖70kDa，10％蔗糖，1％甘油和0.01％ Triton-X。在一些实施方式中，例如使用移液管将150μL基质溶液均匀地铺展在模具上。接着，模具可以3900rpm离心至多约2分钟。在一些实施例中，检查模具，并且如果任何针腔保持未填充，则可以重复填充和离心过程。然后可以用50μL的基质溶液将模具“顶出”。在一些实施方式中，可以使用离心机填充。在一些实施例中，通过使用视觉引导的液滴分配到模腔中以与尖端相同的方式填充基质。
基质干燥
在填充基层之后，然后可以干燥基层。例如，可以在约10％至约25％的相对湿度下将填充的模具转移回腔室，并干燥至少过夜和至多3天。
背衬应用
本文所述的例如用于疫苗、抗原和/或免疫原的释放(例如控制释放或持续释放)和提供改善的免疫原性(参见例如实施例)的微针装置(例如微针贴片)可背衬层。在一些实施方式中，微针装置(例如，微针贴片)包括粘合剂背衬，其可以或可以不进一步包括固体载体。在一些实施例中，微针装置(例如，微针贴片)包括粘性塑料带背衬层。在一些实施方式中，例如与纸背衬层相比，粘性塑料带作为背衬层具有优异的性能。
在一些实施方式中，纸背衬过程如下：用移液管在表面上铺展的10-30μL去离子水部分再润湿干燥的基层。将Whatman 903纸冲压成12mm直径圆。将纸圈轻轻压入基层的湿表面。湿基层部分地浸透纸。将具有背衬的模具转移回25％相对湿度的室中干燥至少4小时，或直到准备使用。
在一些实施方式中，胶带背衬过程如下：将粘合剂背衬的聚酯胶带(例如，
Figure SMS_6
魔术TM胶带)切割成约12mm宽和约25mm长的片。将胶带的一端与贴片对齐并轻轻地压在基层的表面上。胶带的自由端折叠在其自身上以形成非粘性“手柄”。
脱模
微针装置(例如微针贴片)在使用前从模具中移除。将柔性模具轻轻地弯曲离开较硬的补片，并将补片从模具中移除。可以检查补片的缺陷，例如缺失或断裂的针。
包装
微针装置(例如，微针贴片)可以在脱模后不久使用，例如在上述研究中，并且不需要包装。如果需要长期储存，则可将组装的贴片与干燥剂一起包装在具有低湿气透过率的容器(例如，由低湿气透过率(MVTR)材料制成的玻璃小瓶或热成型塑料盘和箔背衬的热密封盖)中以在包装内保持约0％至约50％(例如，约0％至10％，约10％至约20％，约20％至约30％，约30％至约40％，或约40％至50％，例如约25％)的相对湿度。
用于稳定，储存和递送信使RNA(mRNA)的方法和组合物
本文提供了用于稳定，储存和递送基于信使RNA(mRNA)的治疗剂的各种方法和组合物。不受理论束缚，信使RNA(mRNA)作为治疗方式的成功使用受到许多因素的阻碍，包括但不限于与mRNA分子的相对大的尺寸，内在不稳定性和降解倾向相关的挑战。当前稳定mRNA治疗剂的技术通常涉及极端寒冷条件，这通常是不切实际且昂贵的。因此，基于mRNA的治疗剂的储存和递送代表主要的障碍。需要用于储存和递送基于mRNA的治疗剂的改进的方法和组合物。
本公开至少部分基于以下令人惊讶的发现：本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)可在各种环境条件(包括但不限于温度，pH和湿度)下维持治疗剂(诸如mRNA)的稳定性。因此，在一些实施方式中，本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)可通过防止和/或减少mRNA在长期储存期间的降解来改善固有不稳定的mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性。
在某些实施方式中，本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)在各种环境条件(包括但不限于4℃或高于4℃的温度)下长期储存期间稳定治疗剂，诸如mRNA。
在一些实施方式中，mRNA在储存至少约1小时，至少约2小时，至少约3小时，至少约6小时，至少约12小时，至少约1天，至少约2天，至少约3天，至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约1周，至少约2周，至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月后保留其原始生物活性(例如表达编码的氨基酸序列的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。至少约6个月或更长，例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下。
在一些实施方式中，mRNA在例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下储存2周或更多周后保留其原始生物活性(例如表达所编码的氨基酸序列的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。
在一些实施方式中，mRNA在例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下储存4周或更多周后保留其原始生物活性(例如表达所编码的氨基酸序列的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。
在一些实施方式中，mRNA在例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下储存8周或更多周后保留其原始生物活性(例如表达所编码的氨基酸序列的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。
在一些实施方式中，mRNA在例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下储存16周或更多周后保留其原始生物活性(例如表达所编码的氨基酸序列的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。
在一些实施方式中，mRNA在例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下储存超过约1年或更长之后保留其原始生物活性(例如表达所编码的氨基酸序列的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。
另外，本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置，和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)被设计成不仅在例如尖端保留在真皮中的持续时间内持续释放治疗剂(例如mRNA)，而且还在真皮中的这段时间(例如至少约1-2周)内维持mRNA的稳定性。
因此，在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可通过防止和/或减少mRNA在长期储存期间的降解来改善mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性。在特定实施方式中，本文所述的微针和微针装置可通过防止和/或减少mRNA在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下长期储存期间的降解来改善mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性。在一些实施方式中，与在不存在本文所述的微针或微针装置的情况下储存的mRNA治疗剂相比，本文所述的微针和微针装置可通过在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下长期储存期间防止和/或减少mRNA降解至少约50％(例如，约50％，60％，70％，80％，90％，92％，94％，96％，98％，99％，99.5％或更多)来改善不稳定mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可改善不稳定mRNA治疗剂(包括mRNA疫苗)的储存稳定性，使得mRNA在例如约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下储存2周或更多周后保留其原始生物活性(例如表达编码氨基酸序列的能力)的至少约50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可改善mRNA冠状病毒疫苗的储存稳定性，例如通过防止和/或减少mRNA冠状病毒疫苗在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下长期储存期间的降解。在一些实施方式中，本文所述的微针和微针装置可改善mRNA流感疫苗的储存稳定性，例如通过防止和/或减少mRNA流感疫苗在约4℃、约25℃、约37℃和/或约45℃的温度下长期储存期间的降解。
因此，本文提供包含丝素蛋白的各种微针和微针装置，其被配置成在储存和/或持续释放至受试者期间稳定有效量的治疗剂，诸如mRNA(例如，mRNA疫苗)。在某些实施方式中，本文提供了包含多个微针的微针装置(例如，微针贴片)，其中所述多个微针包含：包含mRNA的微针，例如mRNA疫苗，其中所述微针装置被配置成向受试者递送足以诱导免疫应答(例如体液和/或细胞免疫应答)的量的mRNA，并且其中所述mRNA在储存至少约1小时，至少约2小时，至少约3小时，至少约6小时，至少约12小时，至少约1天，至少约2天，至少约3天的时间后保留其原始生物活性(例如表达编码的氨基酸序列，例如疫苗抗原的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约1周，至少约2周，至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约6个月或更长，例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下。
因此，本文提供了使用本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)在长期储存和/或持续释放至受试者期间稳定治疗剂如mRNA(例如mRNA疫苗)的各种方法。在某些实施方式中，本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置，和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)可用于稳定有效量的治疗剂，诸如mRNA(例如mRNA疫苗)mRNA，使得mRNA在储存至少约1小时，至少约2小时，至少约3小时，至少约6小时，至少约12小时，至少约1天，至少约2天的时间后保留其原始生物活性(例如表达编码的氨基酸序列，诸如疫苗抗原的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。至少约3天，至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约1周，至少约2周，至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约6个月或更长，例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下。
此外，本文提供使用本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)防止和/或减少治疗剂(例如mRNA(例如mRNA疫苗))在长期储存和/或持续释放到受试者期间的降解的各种方法。在某些实施方式中，本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置，和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)可用于预防和/或减少治疗剂(例如mRNA(例如mRNA疫苗)mRNA)降解至少约50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。不希望受理论束缚，使用本文所述的制剂，组合物，制品，微针和微针装置和/或制剂(包括可植入的持续释放尖端制剂)能够防止和/或减少mRNA的降解，导致mRNA在储存至少约1小时，至少约2小时，至少约3小时，至少约6小时，至少约12小时，至少约1天，至少约2天，至少约3天，至少约4天的时间后保留其原始生物活性(例如，表达编码的氨基酸序列，如疫苗抗原的能力)的至少50％(例如约50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、99.5％或更多)。至少约5天，至少约6天，至少约1周，至少约2周，至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约6个月或更长，例如在约4℃，约25℃，约37℃和/或约45℃的温度下。
在特定实施方式中，稳定化的mRNA编码本文所述的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。
应用
本文提供了治疗，预防或减轻病毒感染或由病毒感染引起的症状的方法，所述方法包括通过本文所述的微针或微针装置向有需要的受试者施用有效量的治疗剂。
本公开的特征在于用于递送疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)穿过生物屏障(例如皮肤)的方法。此类方法可包括提供本文所述的制剂，组合物，制品，装置，制剂和/或微针。
例如，此类方法可包括提供至少一种微针或至少一种本文所述的微针装置，其中所述微针或所述微针装置包含可植入尖端(例如，基于丝素蛋白的可植入尖端)，所述可植入尖端包含至少一种疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)；使所述微针或微针装置刺入所述生物屏障(例如皮肤)中；以及允许所述疫苗、抗原和/或免疫原在至少约4天(例如，约4至约25天，约5至约25天，约10至约20天，约12至约18天，约14至约16天，约14至约15天，例如，约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25天或更多天，例如，约1-2周，约1-3周，或约1-4周)的时间段内从所述可植入尖端释放。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原通过可植入微针尖端的降解和/或溶解释放到生物屏障中。在一些实施方式中，所述微针或微针装置被配置成施用一定量和/或持续时间的疫苗、抗原和/或免疫原，所述量和/或持续时间在受试者中产生广谱免疫，例如针对不存在于可植入持续释放尖端中的一种或多种病毒抗原的免疫，例如针对不存在于可植入持续释放尖端中的漂移菌株的免疫。
本公开还提供了用于在受试者中提供针对病毒例如冠状病毒和/或流感病毒的免疫力的方法，微针和/或微针装置，所述方法包括在受试者中以足以引起针对病毒的免疫力例如引起针对病毒的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)的量(例如剂量)和/或时间段施用疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施方式中，疫苗以用于疫苗的控制释放或持续释放的组合物(例如本文所述的微针或微针装置，例如用于本文所述的一种或多种病毒抗原的控制释放或持续释放)施用。在一些实施方式中，疫苗通过用于控制或持续释放疫苗(例如，用于控制或持续释放如本文所述的一种或多种病毒抗原)的装置(例如，微针装置)施用。可以将疫苗给予受试者，例如给予受试者的组织或腔，所述组织或腔选自皮肤，粘膜，器官组织，肌肉组织或口腔。
在另一方面，本公开提供了用于在受试者中提供针对病毒例如冠状病毒和/或流感病毒的广谱免疫的方法，微针和/或微针装置，所述方法包括以足以在受试者中引起针对病毒的广谱免疫，例如引起针对病毒的漂移病毒株的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)的量(例如剂量)和/或时间段施用疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)。在一些实施方式中，疫苗以用于控制或持续释放疫苗的组合物施用，例如本文所述的微针或微针装置，例如用于控制或持续释放本文所述的一种或多种病毒抗原。在一些实施方式中，通过用于控制或持续释放疫苗(例如，用于控制或持续释放如本文所述的一种或多种病毒抗原)的装置施用疫苗。可以将疫苗给予受试者，例如给予受试者的组织或腔，所述组织或腔选自皮肤，粘膜，器官组织，肌肉组织或口腔。
在一些实施方式中，本文所述的方法包括施用疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，施用的量(例如剂量)和/或施用的时间段足以产生以下中的一种或多种：(i)在受试者中暴露于疫苗中的一种或多种抗原，暴露的量和/或时间段在受试者中导致广谱免疫，例如导致对病毒漂移株的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)；或(ii)受试者中一种或多种抗原的水平基本上稳定，例如约20％，15％，10％，5％或1％至导致针对所述一种或多种抗原的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)所需的量，例如最小量。在一些实施方式中，用于控制或持续释放疫苗的组合物或装置选自：微针(例如，微针装置，例如，微针贴片，例如，如本文所述)，可植入装置(例如，泵，例如，皮下泵)，可注射制剂，储库，凝胶(例如，水凝胶)，植入物或颗粒(例如，微粒和/或纳米颗粒)。
在一些实施方式中，将疫苗、抗原和/或免疫原施用，例如通过用于疫苗的控制释放或持续释放的组合物或装置释放，例如施用到受试者中，以便将疫苗剂量(例如抗原浓度)维持足以在受试者中产生广谱免疫的时间段，例如产生针对病毒的漂移株的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)(例如其中时间段为约1至25天，例如约1至约21天，约5至约25天，约10至约20天，约12至约18天，约14至约16天，约14至约15天，约5至约10天，或约5至约7天，例如约1、2、3，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天)。
用于控制或持续释放疫苗、抗原和/或免疫原的组合物或装置，例如本文所述的微针或微针装置，可在持续的时间段内维持受试者中疫苗、抗原和/或免疫原的释放和/或水平。在一些实施方式中，用于控制或持续释放疫苗、抗原和/或免疫原的组合物或装置在持续的时间段内维持连续或非连续的疫苗、抗原和/或免疫原释放到受试者中。疫苗、抗原和/或免疫原可以在包括至少约一周，例如约1-2周，约1-3周或约1-4周的时间段内施用，例如通过用于控释或缓释的组合物或装置释放。在一些实施方式中，在包括至少约4天(例如，约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或更长，例如，约5天至约25天，约10天至约20天，约12天至约18天，约14天至约16天，约14天至约15天，约4天至约2周18天之间，约14天与约16天之间，约14天与约15天之间，约4天与约2周之间或约4天与约1周之间)的时间段内施用疫苗，例如通过组合物或装置释放以用于控制释放或持续释放。
疫苗、抗原和/或免疫原可以以约0.1μg至约1000μg，例如约0.2μg至约750μg，约0.2μg至约500μg，约1μg至约250μg，约1μg至约200μg，约1μg至约150μg，约1μg至约100μg(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、350、400、450、500、750或1000μg中的每一个)的剂量施用。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)以约0.1μg-约500μg，例如约0.2μg-约350μg，约0.2μg-约300μg，约1μg-约250μg，约1μg-约200μg，约1μg-约150μg，约1μg-约100μg(例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、300、400、450或500-1000μg中的每一个)的剂量施用。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)以包含约0.1μg至约65μg/病毒株，例如0.2μg至约50μg/病毒株(例如每株约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65μg)。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原的剂量的至少约1％(例如，剂量的至少约0.5％至约10％、至少约5％至约15％、至少约10％至约20％)，例如，由用于疫苗的控制释放或持续释放的组合物或装置释放，例如，进入受试者，维持包含至少约4天(例如，约4，5、6、7、8、9、10、11，12，13或14天，或更多，例如，在约5天和约25天之间，在约10天和约20天之间，在约12天和约16天之间，在约14天和约15天之间)的时间段。约4天和约2周之间，约4天和约1周之间)。
在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原以总剂量的多个分剂量(例如，标准剂量)施用，例如，通过用于控制释放或持续释放的组合物或装置在一段时间内释放，例如，使得实现免疫应答和/或广谱免疫，其中以每个分剂量施用的疫苗、抗原和/或免疫原的量不超过1/X，其中X是任何数字，例如，其中X是疫苗、抗原和/或免疫原的总剂量(例如，标准剂量)的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多。
在一些实施方式中，将疫苗、抗原和/或免疫原以相当于总剂量的百分比(例如，标准剂量的百分比)的多个剂量施用(例如，通过用于控制释放或持续释放的组合物或装置释放到例如受试者的皮肤中)一段时间，例如，使得实现广谱免疫，其中以多个剂量中的每一个施用的疫苗、抗原和/或免疫原的量为约X％，其中X为任何数，例如，其中X是疫苗、抗原和/或免疫原的总剂量(例如，标准剂量)的0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、300、400或500或更多。
疫苗、抗原和/或免疫原可以根据本文所述的任何方法施用，从而实现广谱免疫，例如，从而实现免疫应答，例如针对病毒漂移株的细胞免疫和/或体液免疫应答。
不希望受理论束缚，暴露于和/或感染第一病毒(例如冠状病毒和/或流感病毒)或暴露于对应于所述病毒的抗原(例如冠状病毒抗原和/或流感抗原)的受试者可产生免疫应答(例如细胞免疫和/或体液免疫应答)，导致产生针对所述第一病毒的抗体。例如，可以产生病毒特异性的中和抗体，免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白M(IgM)，免疫球蛋白A(IgA))，例如本文所述的抗体。
随着抗原变化(例如，突变)随时间在第一病毒中累积，针对第一病毒产生的受试者抗体可能不再识别漂移的病毒(例如，抗原性不同的病毒株)。使用本文所述的方法，给药方案，微针和微针装置，广谱免疫可赋予暴露于病毒(例如冠状病毒和/或流感病毒)，被病毒感染和/或处于感染风险中的受试者。此外，使用本文所述的方法，给药方案，微针和微针装置，可赋予受试者改善的免疫原性和/或广谱免疫，例如与疫苗的传统突释施用相比。例如，在受试者中可检测到的改善的免疫原性和/或广谱免疫性可大于(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍或更大)传统的疫苗突释施用，例如，疫苗的单次剂量施用或推注施用。
在一些实施方式中，所述微针(例如，可植入的持续释放尖端)或疫苗包含与第一冠状病毒株相关的冠状病毒抗原，并且向受试者施用一定剂量的冠状病毒疫苗导致对第二冠状病毒株(例如，漂移的SARS-CoV-2株)的广谱免疫的发展，所述第二冠状病毒株不存在于所述微针或疫苗中，与所述微针或疫苗相关，或由所述微针或疫苗直接靶向。在一些实施方式中，微针例如可植入的持续释放尖端或疫苗包含第一冠状病毒株，并且向受试者施用一定剂量的第一冠状病毒株(例如本文所述的第一SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS-CoV株)导致对微针或疫苗中不存在的第二冠状病毒株(例如漂移的SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS-CoV株)产生广谱免疫。
在一些实施方式中，可植入的持续释放尖端或疫苗包含第一流感病毒株，并且向受试者施用一定剂量的第一流感病毒株(例如，如本文所述的第一甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)导致对不存在于可植入的持续释放尖端或疫苗中的第二流感病毒株(例如，如本文所述的漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)产生广谱免疫。
在一些实施方式中，受试者(例如，人类受试者)是儿童受试者，成人受试者或老年受试者。受试者可能已经暴露于冠状病毒和/或流感病毒(例如，冠状病毒和/或流感病毒的特定病毒株)，被冠状病毒和/或流感病毒感染和/或处于感染风险中。这种风险可能是由于受试者的健康状况或年龄和/或旅行到病毒的特定病毒株流行的区域。
在一些实施方式中，本公开提供了在受试者中提供疫苗、抗原和/或免疫原的控制释放或持续释放的方法。与疫苗、抗原和/或免疫原的传统爆发释放给药相比，疫苗、抗原和/或免疫原的控释或缓释可实现改善的免疫原性和/或广谱免疫。不希望受理论束缚，与传统的单剂量疫苗施用模式(例如皮下或鼻内施用的推注剂量)相比，例如通过本文所述的组合物和/或微针施用本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原和/或控制释放或持续释放速率的方法(其模拟受试者(例如人类受试者)对病毒的天然暴露模式)可向受试者提供增强的免疫性和/或广谱免疫性。
在一些实施方式中，所需量的至少一种疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以在预定时间段内以持续的方式从本文所述的微针(例如可植入的微针尖端)释放。在一些实施方式中，至少约5％的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)，例如至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，或至少约97％，约98％，或约99％，或100％的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可在预定时间段内从微针(例如可植入的微针尖端)释放。在这样的实施方式中，所需量(例如，剂量，如标准剂量)的疫苗、抗原和/或免疫原(例如，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)可以在数秒，数分钟，数小时，数月和/或数年内从微针释放。在一些实施方式中，疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的期望量(例如剂量，诸如标准剂量)可以在插入生物屏障后从微针释放，例如在5秒内，10秒内，30秒内，1分钟内，2分钟内，3分钟内，4分钟内，5分钟内或更长。在一些实施方式中，可以在至少约1小时，至少约2小时，至少约3小时，至少约6小时，至少约12小时，至少约1天，至少约2天，至少约3天，至少约4天，至少约5天，至少约6天，至少约1周，至少约2周，至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约6个月或更长的约2周，至少约1个月，至少约2个月，至少约3个月，至少约6个月或更长的时间内从微针释放。在一些实施方式中，所需量(例如剂量，如标准剂量)的疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒和/或流感疫苗)可以在约1年或更长的时间内从微针释放。
在一些实施方式中，本公开提供了例如通过使受试者的皮肤与本文所述的微针或微针装置接触来增强受试者对病毒的免疫应答的方法。在一些实施方式中，细胞介导的免疫应答的存在可以通过任何本领域公认的方法来确定，例如，增生测定(CD4+T细胞)，CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定，或在施用免疫原后与受试者的组织切片免疫组织化学以确定活化细胞如单核细胞和巨噬细胞的存在。
本领域技术人员可以通过任何成熟的方法容易地确定受试者中体液介导的免疫应答的存在。例如，生物样品如血液中产生的抗体水平可以通过蛋白印迹，ELISA或其他已知的抗体检测方法来测量。在一些实施方式中，使用侧流测定测量生物样品例如血液(例如来自手指针刺)中产生的抗体。在一些实施方式中，本文所述的抗体(例如，在本文所述的方法中检测的抗体)是冠状病毒特异性抗体和/或流感特异性抗体。抗体可以是中和抗体。在一些实施方式中，抗体是抗冠状病毒中和抗体。在一些实施方式中，抗体是抗流感中和抗体。在一些实施方式中，抗体是免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G(IgG)，免疫球蛋白M(IgM)或免疫球蛋白A(IgA))。在一些实施方式中，抗体是广泛中和抗体(bnAb)。
冠状病毒特异性抗体可以是SARS-CoV-2特异性抗体，SARS-CoV特异性抗体或MERS-CoV特异性抗体。在一些实施方式中，抗体是SARS-CoV-2特异性抗体。在一些实施方式中，抗体是SARS-CoV特异性抗体。在一些实施方式中，抗体是MERS-CoV特异性抗体。在一些实施方式中，抗体是冠状病毒刺突蛋白(S)特异性抗体。在一些实施方式中，抗体是刺突受体结合结构域(RBD)特异性抗体。在一些实施方式中，抗体是核壳(N)-特异性抗体。在一些实施方式中，抗体是冠状病毒特异性IgG，例如抗冠状病毒IgG，如SARS-CoV-2S特异性IgG，例如SARS-CoV-2S特异性IgG或SARS-CoV-2RBD特异性IgG。在一些实施方式中，抗体是SARS-CoV-2S-特异性IgG。在一些实施方式中，抗体是SARS-CoV-2RBD特异性IgG。
在一些实施方式中，抗体是SARS-CoV-2S-特异性IgG抗体(本文中也称为“刺突-特异性IgG抗体”)。
在某些实施方式中，如本文所述的冠状病毒疫苗的微针递送可导致与传统疫苗施用途径(例如经由推注肌内注射(IM)或推注皮内注射(ID))相比更强健且变化较小的刺突特异性IgG抗体滴度。
在某些实施方式中，如本文所述的冠状病毒疫苗的单剂量微针递送可导致与较低剂量(例如，总剂量的一半)的IM初免/加强注射相当的刺突特异性IgG应答，从而证明剂量节约效应。
在某些实施方式中，如本文所述的无佐剂冠状病毒疫苗的微针递送与传统疫苗施用途径(例如经由推注肌内注射(IM)或推注皮内注射(ID))相比可改善刺突特异性IgG应答。
在某些实施方式中，在较低剂量(例如总剂量的一半)下，如本文所述的无佐剂冠状病毒疫苗的微针递送可导致比2-剂量推注IM方案更大的IgG滴度，从而证明剂量节约效应。
在某些实施方式中，与新制造的微针贴片相比，微针贴片的长期储存，例如在室温下储存至少约8周，可导致产生等同的刺突特异性IgG应答，从而证明有利的储存稳定性。
在一些实施方式中，抗体是血凝抑制(HAI)抗体。在一些实施方式中，抗体是抗流感IgG。
在一些实施方式中，在免疫后完整的冠状病毒季节期间，在受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒特异性抗体滴度。在一些实施方式中，在免疫后完整的冠状病毒季节期间，在受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒N-特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2-N特异性抗体)。在一些实施方式中，提高的冠状病毒S-特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2-S特异性抗体)在受试者的血液中在免疫后的完整冠状病毒季节期间是可检测的。
在一些实施方式中，在免疫后的完整流感季节期间，在受试者的血液中可检测到提高的流感特异性抗体滴度。在一些实施方式中，在免疫后的完整流感季节期间，在受试者的血液中可检测到提高的血凝抑制(HAI)抗体滴度。
在一些实施方式中，免疫应答和/或广谱免疫是细胞和/或体液免疫应答，其包括：(i)在受试者的血液中可检测到的提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基特异性抗体)，例如在免疫后至少3、4、5或6天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更多天可检测到的，(ii)在受试者的血液中可检测到的或免疫后至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个月或更多，和/或(iii)在受试者的骨髓中可检测到的针对冠状病毒例如SARS-CoV-2病毒的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更多天可检测到的。在一些实施方式中，提高的冠状病毒特异性抗体滴度是针对漂移的冠状病毒株(例如，漂移的SARS-CoV-2株)。在一些实施方式中，提高的抗冠状病毒IgG滴度是针对漂移的冠状病毒株(例如，漂移的SARS-CoV-2株)。
在一些实施方式中，免疫后至少3，4、5或6天或更长时间在受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒特异性抗体滴度。在一些实施方式中，免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、5145、46、47、48、49、51和/或52周或更长时间在受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒特异性抗体滴度。在一些实施方式中，在免疫后至少4、5或6天或更长时间内在受试者的血液中可检测到提高的抗冠状病毒IgG滴度。在一些实施方式中，在免疫后至少1、2、3或4周或更久，在受试者的血液中可检测到提高的抗冠状病毒IgG滴度。在一些实施方式中，在免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个月或更长时间内在受试者的血液中可检测到提高的抗冠状病毒IgG滴度。在一些实施方式中，针对冠状病毒例如SARS-CoV-2病毒的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平在免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更长时间在受试者的骨髓中是可检测的。
在一些实施方式中，免疫应答和/或广谱免疫是细胞免疫和/或体液免疫应答，其包括：(i)在受试者的血液中可检测到的提高的血细胞凝集抑制(HAI)抗体滴度，例如在免疫后至少3、4、5或6天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30周或更多可检测到的；(ii)在受试者的血液中可检测到的提高的抗-流感IgG滴度，例如在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个月或更长时间可检测到的；和/或(iii)在受试者的骨髓中可检测到的针对病毒例如流感病毒的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平，例如在免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33和/或34周或更多可检测到。在一些实施方式中，提高的HAI抗体滴度是针对漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株。在一些实施方式中，提高的抗-流感IgG滴度是针对漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株。
在一些实施方式中，在免疫后至少3、4、5或6天或更长时间，在受试者的血液中可检测到提高的血凝抑制(HAI)抗体滴度。在一些实施方式中，在免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更长时间内在受试者的血液中可检测到血凝抑制(HAI)抗体滴度。在一些实施方式中，在免疫后至少4、5或6天或更长时间内在受试者的血液中可检测到提高的抗-流感IgG滴度。在一些实施方式中，免疫后至少1周、2周、3周或4周或更久在受试者的血液中可检测到提高的抗-流感IgG滴度。在一些实施方式中，免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个月或更长时间在受试者的血液中可检测到提高的抗-流感IgG滴度。在一些实施方式中，针对流感病毒的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平在免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更长时间在受试者的骨髓中是可检测的。
在一些实施方式中，免疫应答是包括受试者血液中IFNγ分泌细胞水平增加的细胞免疫应答，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周或更多，例如通过本文所述的微针。在一些实施方式中，免疫应答是细胞免疫应答，其包括受试者血液中每预选数目的细胞IFNγ产生的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周，例如通过本文所述的微针。在一些实施方式中，可以使用ELISPOT测量(例如，检测)产生IFNγ的细胞，例如，以确定IFNγ斑点形成单位(SFU)的增加。
在一些实施方式中，受试者中可检测的提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如，SARS-CoV-2特异性抗体，例如，对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基特异性的抗体)，提高的抗冠状病毒IgG滴度，针对冠状病毒的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平，IFNγ分泌细胞的水平，和/或每预选数目的细胞的IFNγ的产生与疫苗的单次剂量施用或推注施用相比更大(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍，或15倍或更大)。
在一些实施方式中，与单剂量施用或推注施用疫苗相比，受试者中可检测的提高的HAI抗体滴度，提高的抗流感IgG滴度，针对病毒的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平，IFNγ分泌细胞的水平，和/或每预选数目的细胞的IFNγ产生量更大(例如，1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍，或15倍或更大)。
在一些实施方式中，广谱免疫可通过测量受试者的血清转化百分比来表征。在一些实施方式中，广谱免疫包括例如基于例如在免疫后6个月在受试者的血液中可检测到的提高的冠状病毒特异性抗体滴度的血清转化百分比大于约20％(例如20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多，例如100％)。在一些实施方式中，广谱免疫包括例如基于例如在免疫后6个月在受试者的血液中可检测到的提高的HAI抗体滴度的大于约20％(例如20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多，例如100％)的血清转化百分比。在一些实施方式中，血清转化比基线冠状病毒特异性抗体滴度和/或流感特异性抗体滴度(例如HAI抗体滴度)增加大于1倍，例如比基线冠状病毒特异性抗体滴度和/或流感特异性抗体滴度增加2倍，3倍，4倍，5倍或6倍或更多。在一些实施方式中，血清转化是基线冠状病毒特异性抗体滴度的四倍增加，例如增加10至40。在一些实施方式中，血清转化是基线HAI抗体滴度的四倍增加，例如增加10至40。
与通过使用本文所述的方法，给药方案，微针和微针装置赋予的广谱免疫相关的血清转化水平可大于(例如1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍或更大)通过疫苗(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的传统爆发释放给药，例如疫苗的单剂量给药或推注给药(例如皮下或鼻内给药)获得的血清转化水平。
本文所述的方法可以包括预防性地施用冠状病毒疫苗和/或流感疫苗，例如使用本文所述的微针或微针装置。在一些实施方式中，本文所述的微针或微针装置(例如微针贴片)在受试者中提供针对病毒(例如冠状病毒和/或流感病毒)感染的单剂量保护。例如，本文所述的冠状病毒疫苗和/或流感疫苗可以作为贴片(例如本文所述的微针贴片)，例如单一贴片施用。贴片可由健康护理专业人员如医生，护士或任何合适的健康护理专业人员施用。或者，贴片可以是自我给药的。例如，可以将贴片提供给对象，例如在适当的存储装置中，并且对象可以自行施用贴片，例如从家中或不需要就诊。受治疗者可以将贴片佩戴少于1小时的一段时间，例如约1分钟至约45分钟，约2分钟至约30分钟，约5分钟至约15分钟，例如约5分钟。在一些实施方式中，受试者佩戴贴片约5分钟。
在一些实施方式中，使用施用器施用贴片，例如适用于施用本文所述的微针装置(例如微针贴片)的施用器装置。
在一些实施方式中，微针装置(例如微针贴片)包含本文所述的非疫苗分子(例如染料分子)和/或被配置成释放本文所述的非疫苗分子，所述非疫苗分子允许确认受试者中的剂量递送。例如，在施用包含疫苗、抗原和/或免疫原(例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)以及非疫苗分子(例如染料)的微针装置(例如微针贴片)后，可通过检测例如受试者皮肤中的非疫苗分子来确认疫苗、抗原和/或免疫原的递送，例如通过在UV照射下照射非疫苗分子，或任何其他合适的检测手段。
在一些实施方式中，将包含疫苗抗原和/或免疫原的微针贴片季节性地施用于受试者(例如，由受试者佩戴)。例如，可以季节性地施用贴片，使得冠状病毒疫苗和/或流感疫苗每个冠状病毒季节和/或流感季节施用一次。在一些实施方式中，冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以常规加强方案施用，例如每年施用。
在另一方面，本公开的特征在于用于预防由冠状病毒和/或流感病毒引起的疾病的方法，微针和微针装置，例如在冠状病毒或流感季节期间。在一些实施方式中，微针或微针装置保护(例如，防止)受试者免于发展冠状病毒疾病2019(COVID-19)。在一些实施方式中，微针或微针装置保护(例如，防止)受试者免于发展严重急性呼吸综合征(SARS)。在一些实施方式中，微针或微针装置保护(例如防止)受试者免于发展中东呼吸综合征(MERS)。在一些实施方式中，微针或微针装置保护(例如，防止)受试者免于发生流感。在一些实施方式中，微针或微针装置保护(例如防止)受试者免于发展冠状病毒疾病2019(COVID-19)和流感。
示例性试剂盒
在某些实施方式中，本公开的特征在于包含如本文所述的微针或微针装置(例如，微针贴片)(例如，包含如本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原的微针，诸如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的包装或试剂盒。在一些实施方式中，本公开涉及包含本文所述的疫苗(例如，如本文所述的疫苗、抗原和/或免疫原，诸如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗)的包装或试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可以进一步包含用于与微针组合治疗的附加的治疗剂。在一些实施方式中，试剂盒可以进一步包含消毒剂(例如，酒精拭子)。在一些实施方式中，试剂盒可进一步包括说明书，例如可用于施用或施用本文所述的微针装置的说明书。在一些实施方式中，本文所述的此类包装和试剂盒可用于疫苗接种目的，例如在本文所述的受试者中实现广谱免疫。
实施例
为了更充分地理解本文所述的发明，阐述以下实施例。提供这些实施例仅用于说明的目的，并且除非另有说明，不旨在限制。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
用于以下实施例的冠状病毒抗原可包括但不限于SARS-CoV-2抗原，SARS-CoV抗原或MERS-CoV抗原。例如，冠状病毒刺突蛋白，灭活病毒；编码冠状病毒蛋白的mRNA，表达冠状病毒蛋白的腺病毒载体，编码冠状病毒蛋白的DNA质粒，经修饰以表达冠状病毒基因的树突细胞或经修饰以表达冠状病毒基因的人工抗原呈递细胞(aAPC)。待研究的冠状病毒抗原的示例性列表包括：融合前SARS-CoV-2刺突蛋白，UV灭活的SARS-CoV-2；mRNA-1273；Ad5-nCoV；Ad26SARS-CoV-2，INO-4800；和LV-SMENP-DC。
用于以下实施例的流感抗原可包括但不限于单价、二价、三价和四价流感疫苗，包括甲型流感、乙型流感、丙型流感和/或丁型流感抗原。这些实施例中使用的流感疫苗可以是灭活的流感疫苗。例如，可使用Fluzone高剂量，或本文所述的任何其他流感抗原。
实施例1.缓释微针制剂和制造
制备冠状病毒疫苗和流感疫苗用于微针装置制造。如果需要，首先加工流感疫苗和/或冠状病毒疫苗以除去过量的去污剂并浓缩抗原。为了这样做，多剂量(例如10剂量)的冠状病毒疫苗或流感疫苗将连续通过去污剂去除柱(例如PierceTM去污剂去除旋转柱)以去除去污剂(例如Triton X-100，其是用于灭活(例如裂解)病毒的制造的常见副产物)。为了确认不存在洗涤剂，将收集材料的等分试样并通过尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)进行分析。剩余材料将在10kDa旋转过滤器(例如，Amicon Ultra 0.5mL，Fischer Sci 501096)中通过在15000rpm下最多3次10分钟旋转浓缩。在HPLC-SEC上运行材料的等分试样以测定针对初始疫苗的抗原浓度。浓缩前和浓缩后材料的曲线下面积(AUC)的比较将用于确定处理的抗原储备液的浓度。
对于每种抗原，将约100uL的原液(或任何合适的体积)与丝素蛋白(例如，约85.6uL的丝素蛋白(60MB))和Milli-Q水(例如，64.4uL)混合以产生丝素蛋白抗原溶液(例如，约5％(w/v))，将其印刷到微针模具中。如果需要，疫苗将在针尖印刷之前共同配制，例如提供与一种或多种冠状病毒和/或流感疫苗共同配制的微针。另外，抗原溶液可以单独保存，并单独印刷到微针模具中，例如印刷到模具的单独孔中。尖端填充：使用视觉引导的分配(Biodot AD3420)将20nL制剂印刷到聚二甲基硅氧烷(PDMS)微针模具中。
头端填充检查：在立体显微镜下目视评估打印缺陷，包括未对齐的打印，未完全填充的针腔和异物碎片。
头端干燥：填充的微针模具将在受控条件下，例如在20％相对湿度下干燥过夜(约14-20小时)。
头端退火：通过将模具放置在充满Milli-Q水的真空干燥器中，施加真空5分钟，然后关闭真空阀并将干燥器移至37℃培养箱中，干燥的尖端可以在37℃下进行水退火4小时。
头端干燥：退火后，在受控条件下，例如在20％相对湿度下，将尖端再次干燥过夜(约14-20小时)。
基质填料：然后将所需的基质层溶液填充到微针模具中。例如，将40％(w/v)水解明胶(Gelita)和10％(w/v)蔗糖(Sigma-Aldrich)吸移到微针模具上并通过在3900rpm下离心2分钟填充。
底部填充检查：通过立体显微镜目视评估未完全填充的针腔的外观。如果观察到填充不足，将进行再填充和再离心。
基质干燥：将基质溶液在受控条件(例如20％相对湿度)下干燥过夜(14-20小时)。
背衬涂覆：然后将合适的背衬层施加到基质上(例如，使用纸或胶带)。例如，将Whatman903卡片冲压成12mm圆盘并施加到预润湿(10μL Milli-Q水)的干燥明胶基质上。
背衬干燥：然后在脱模之前，将器件在受控条件(例如20％相对湿度条件)下干燥2小时。
脱模：通过在保持装置静止的同时小心地将模具弯离装置，将装置从微型针模具中手动移除。
脱模检查：在立体显微镜下检查器械是否完全脱模；将丢弃未完全脱模的器械。
实施例2.用于施用冠状病毒抗原和一种或多种流感抗原的微针装置的体内评价。
体内模型，例如使用小鼠(例如BALB/c小鼠)，将用于评估冠状病毒抗原(例如冠状病毒疫苗)和一种或多种流感抗原的持续释放，它们引发免疫应答(例如细胞和/或体液免疫应答)和/或提供针对冠状病毒的免疫(例如广谱免疫)的能力。
冠状病毒抗原和流感抗原将如下皮内或皮下施用：
1.单次大剂量输注。
2.一系列分次注射，其中在时间范围内给予的总剂量等同于单次推注。这些注射剂可以每天或每隔一天给药。
3.用冠状病毒抗原和流感抗原配制的微针贴片(例如丝素蛋白微针贴片)。
将探索和优化持续释放的持续时间(每日注射或显微针)(约2-28天)。另外，持续释放的多个周期对于提供免疫性是最佳的。为了对此进行测试，将在约2-28天内通过单次推注或持续释放(每日注射或显微针)施用抗原。在一段时间内(约5-14天)，不给予动物治疗，然后在与第一轮相同的第二轮中给予抗原。
抗体滴度，例如抗-流感IgG和抗-冠状病毒IgG应答将通过ELISA或合适的替代方法测量。还将在免疫后数周，例如在免疫后第28天和第56天测量滴度。还将例如在第12周通过ELISPOT或任何合适的替代方法测量接种后的T细胞应答。将比较不同施用模式(即，上文列出的1-3中的任一种)之间的结果以确定免疫原性的程度，并确定针对冠状病毒和/或流感的疫苗的持续递送导致比通过常规肌内注射递送的等效剂量更强的体液和细胞应答。
实施例3.状病毒疫苗的丝基微针施用的功效的体内评估
体内模型(例如，使用小鼠，例如BALB/c小鼠)将用于评估冠状病毒抗原(例如，冠状病毒疫苗)从基于丝蛋白的微针贴片的持续释放的功效，以及引发免疫应答和/或提供对冠状病毒的免疫(例如，广谱免疫)的能力。
冠状病毒抗原将作为以下形式皮内或皮下施用：
1.单次大剂量输注，
2.一系列分次注射，其中在时间范围内给予的总剂量等同于单次推注。这些注射剂可以每天或每隔一天给药。
3.用冠状病毒抗原配制的丝微针贴片。
如实施例2，抗冠状病毒IgG应答将通过ELISA或合适的替代方法测量。还将在免疫后数周，例如在免疫后第28天和第56天测量滴度。接种后的T细胞应答将例如在第12周通过ELISPOT或任何合适的替代方法测量。将比较不同给药模式(上述1-3任一种)之间的结果以确定免疫原性程度，并确定从基于丝素蛋白的微针贴片持续递送冠状病毒抗原导致比通过常规肌内注射递送的等效剂量更强的体液和细胞应答。实例4.尖端分离和抗原动力学的体内评价
体内模型(例如使用小鼠，例如BALB/c小鼠)将用于评估微针贴片的尖端分离和抗原动力学，所述微针贴片例如负载有一种或多种冠状病毒抗原和/或一种或多种流感抗原的基于丝蛋白的微针贴片。将结果与施用推注剂量(例如皮内推注剂量)的荧光标记的抗原的受试者(例如BALB/c小鼠)形成对比。
冠状病毒抗原和/或流感抗原将用Alexafluor647(AF647，Invitrogen)或合适的替代物进行荧光标记。然后将标记的抗原装入微针贴片，例如按照实施例1中概述的方案。包含荧光标记抗原的微针贴片将在给药之前和之后通过荧光显微镜(EVOSFL，thermofisher)或合适的替代物成像。成像将允许检查抗原在微针尖端内的定位，并确认尖端在施用后从皮肤中的溶解聚合物适当释放。用IVIS(perkinelmer)或合适的替代物进行全动物荧光成像，以追踪冠状病毒抗原和/或流感抗原在皮肤中保留足够长的时间，使抗原从植入的尖端释放，如2周。
还将检查皮内微针尖端的持续释放对抗原运输到引流淋巴结的影响。在用含有荧光标记的抗原的微针贴片免疫后约3天，从受试者(例如小鼠)切除接种部位引流淋巴结，例如腹股沟淋巴结。使用iDISCO方案清除淋巴结组织(Renier等，Cell(2014)159:896–910)，或合适的替代方案，和体积成像，例如使用共聚焦显微镜。将检查引流淋巴结内的抗原定位，并与从接受荧光标记的冠状病毒抗原和/或流感抗原的快速浓注(例如，真皮内快速浓注)的受试者切除的引流淋巴结中的定位效应进行比较。
实施例5.SARS-CoV-2重组蛋白疫苗的持续皮内递送产生增强的体液抗体应答
Balb/c小鼠(n＝5/组)用1μg或5μg无佐剂的预融合稳定的SARS-CoV-2刺突蛋白抗原(也称为“SARS-CoV-2S-2P”或“S-2P”(Medigen Vaccine Biologics Corporation))免疫，以4周为间隔通过推注肌内注射(IM)，推注皮内注射(ID)或等效的10天内每日分剂量ID免疫两次以模拟持续释放动力学。5μg分次剂量组的队列仅在第0天免疫以评价单剂量与双剂量持续释放免疫。在每月的时间点收集血液，测量刺突特异性IgG滴度以评价体液免疫应答(图6)。这些结果证明，持续ID递送未佐剂化的预融合稳定的SARS-CoV-2刺突蛋白抗原导致与等量推注IM或推注ID注射相比显著更高的刺突特异性IgG滴度。此外，单一持续释放剂量优于未佐剂化预融合稳定的SARS-CoV-2刺突蛋白抗原的两次推注IM注射，证明了剂量节约效应。
实施例6.通过缓释丝微针免疫改善体液免疫应答
为了产生COVID疫苗微针贴片(MIMIX)，制备重组融合前稳定的SARS-CoV-2刺突蛋白(S-2P)用于微针装置制造，通过将材料在10kDa旋转过滤器中在14000xg下浓缩60分钟60分钟。在ELISA上运行材料的等分试样以确定针对初始疫苗的抗原的浓度。将含有浓缩的S-2P蛋白的液体制剂与丝和其他赋形剂混合，使用压电致动的喷射阀分配到针形腔模具中，并在受控的湿度和温度下干燥以调节丝结晶度和溶解度。一旦干燥，将可溶性基础制剂分配到模具中并干燥，然后将带背衬施加到装置以脱模。为了评价这些装置的免疫应答，将Balb/c小鼠(n＝5/组)用5μgSARS-CoV-2S-2P以4周间隔通过推注肌内注射(IM；或经由微针装置(MIMIX；浓缩疫苗)。通过拇指按压将MIMIX装置手动施加在小鼠胁腹上的无毛部分上，并在5分钟后移除。在每月的时间点收集血液，测量刺突特异性IgG滴度以评价体液免疫应答(图7)。这些结果表明，与IM注射相比，MIMIX递送未佐剂化的S-2P改善了刺突特异性IgG应答。此外，在总剂量的一半时，单次MIMIX给药导致比2-剂量推注IM方案更大的IgG滴度，证明了剂量节约效应。
实例7.通过丝微针递送的替代制剂和剂量的评价
Balb/c小鼠用5μg|、10μg或15μgSARS-CoV-2S-2P免疫两次，间隔4周，通过推注肌内注射(IM)或通过微针装置(MIMIX)免疫一次。此外，将一组贴片在室温和10％RH下储存8周以评价MIMIX贴片的体内稳定性。如前所述制造MIMIX装置并给予小鼠。在每月的时间点收集血液，测量刺突特异性IgG抗体滴度以评价体液免疫应答(图8-9)。这些结果表明，与IM注射相比，5μg S-2P的MIMIX递送导致提高的刺突特异性IgG滴度。当评价剂量时，与5μg，10μg和15μg剂量水平的IM注射相比，MIMIX递送导致更稳健和更少的可变IgG滴度(图8)。另外，单剂量MIMIX免疫对总剂量一半的IM初免/加强产生相等的尖峰特异性IgG应答(图8)。最后，以8周储存的MIMIXCOVID贴片产生与新鲜制备的贴片相当的尖峰特异性IgG应答，证明了贮存稳定性(图9)。
等同物和范围
本申请涉及各种公布的专利、公布的专利申请、期刊文章和其他出版物，所有这些都通过引用并入本文。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术内的本发明的任何特定实施方式可以从任何一个或多个权利要求中明确地排除。因为这样的实施方式被认为是本领域普通技术人员已知的，所以其可以被排除，即使该排除没有在本文中明确阐述。无论是否涉及现有技术的存在，出于任何原因，本发明的任何特定实施例可从任何权利要求中排除。
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述具体实施方式的许多等同物。本文描述的本发明实施方式的范围不旨在限于以上描述、附图或实施例，而是如所附权利要求中阐述的。本领域的普通技术人员将理解，在不脱离如以下权利要求所限定的本发明的精神或范围的情况下，可以对本说明书进行各种改变和修改。

Claims (93)

1.一种包含多个微针的微针装置(例如，微针贴片)，其中所述多个微针包含：
包含冠状病毒抗原(例如，一种或多种冠状病毒抗原，例如SARS-CoV-2抗原)或其疫苗制剂(“冠状病毒疫苗”)的第一微针；和
任选地，包含流感抗原(例如，一种或多种流感抗原，或其疫苗制剂(“流感疫苗”))的第二微针；
其中所述微针装置被配置为例如以足以诱导免疫应答(例如，体液和/或细胞免疫应答)的量向受试者递送所述冠状病毒抗原或所述冠状病毒疫苗，和任选地所述流感抗原或所述流感疫苗。
2.根据权利要求1所述的微针装置，其中所述多个微针中的所述第一微针和/或所述第二微针包含：
(i)基质(例如，可溶性基质)；
(ii)应用于所述基质的尖端(例如，可植入尖端)；和
(iii)任选地，应用于所述基质的背衬。
3.根据权利要求1或2所述的微针装置，其中所述第一微针和/或所述第二微针包含丝素蛋白，例如再生丝素蛋白和/或重组丝素蛋白。
4.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述微针尖端是丝素蛋白尖端(例如，可植入的丝素蛋白尖端)。
5.一种微针装置(例如，微针贴片)，其包含多个基于丝素蛋白的微针，其中：
所述多个微针(例如，多个第一微针)包含冠状病毒抗原，例如，一种或多种冠状病毒抗原(例如，以下中的一种或多种：SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原、或MERS-CoV抗原)，或其疫苗制剂(“冠状病毒疫苗”)；和
其中所述微针装置被配置成例如以足以诱导免疫应答(例如，体液和/或细胞免疫应答)的量向受试者递送所述冠状病毒抗原或所述冠状病毒疫苗。
6.根据权利要求5所述的微针装置，其中所述微针包含：
(i)基质(例如，可溶性基质)，
(ii)丝素蛋白尖端(例如，可植入丝素蛋白尖端)，其包含应用于所述基质的丝素蛋白；和
(iii)任选地应用于所述基质的背衬。
7.根据权利要求5或6所述的微针装置，其中所述微针装置进一步包含一个或多个第二微针，其包含流感抗原，例如流感疫苗。
8.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述微针尖端包含所述冠状病毒疫苗或所述流感疫苗。
9.根据权利要求1-4或7中任一项所述的微针装置，其中所述微针尖端包含所述冠状病毒疫苗和所述流感疫苗。
10.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述微针基质(例如可溶性基质)包含所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗。
11.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述第一微针和/或第二微针包含一种抗原/微针，例如一种疫苗/微针。
12.根据权利要求1-4或7-11中任一项所述的微针装置，其中所述第一微针包含来源于相同冠状病毒的抗原的组合(例如SARS-CoV-2抗原的组合)或来源于不同冠状病毒(例如不同β冠状病毒)的抗原的组合。
13.根据权利要求1-4或7-12中任一项所述的微针装置，其中所述第二微针包含来源于相同流感病毒或来源于不同流感病毒的抗原的组合。
14.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述装置或多个装置进一步包含多个附加的微针(“附加的多个”)，其中所述多个附加的微针中的一个或多个微针(例如每个微针)包含流感疫苗，例如一种、两种、三种、四种或更多种流感疫苗。
15.根据权利要求14所述的微针装置，其中所述附加的多个包含一个或多个微针，所述微针在同一微针中包含与所述冠状病毒疫苗组合，例如共同配制，的所述流感疫苗。
16.根据权利要求14或15所述的微针装置，其中所述附加的多个中的每个微针在同一微针中包含所述冠状病毒疫苗和所述流感疫苗，例如一种、两种、三种、四种或更多种流感疫苗。
17.根据权利要求14所述的微针装置，其中所述多个(例如，每一个)附加的微针包含两种、三种、四种或更多种附加流感疫苗，所述附加流感疫苗在同一微针中组合存在，例如共同配制，例如与所述冠状病毒疫苗分开存在。
18.根据权利要求14所述的微针装置，其中所述一种或多种流感疫苗和所述冠状病毒疫苗中的每一种独立配制到单个微针中。
19.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述多个微针包含至少两种、三种、四种、五种、六种或更多种抗原(例如，至少5种抗原)。
20.根据权利要求19所述的微针装置，其中所述多个中的部分或全部微针是相同的。
21.根据权利要求1-4或7-20中任一项所述的微针装置，其中所述多个微针包含所述冠状病毒抗原和所述流感抗原，例如至少一种、两种、三种、四种或五种或更多种流感抗原，例如至少4种流感抗原。
22.根据权利要求21所述的微针装置，其中所述多个中的部分或每个微针包含所述冠状病毒抗原和所述流感抗原，例如至少一种、两种、三种、四种或五种或更多种流感抗原，例如至少4种流感抗原，的组合。
23.根据权利要求22所述的微针装置，其中所述多个中的每个微针包含所述组合，例如所述冠状病毒和所述流感抗原是共同配制的，例如所有微针是相同的。
24.根据权利要求21所述的微针装置，其中至少两种、三种、四种或五种或更多种所述抗原，例如每种抗原，被单独配制，例如一种抗原/微针。
25.根据权利要求24所述的微针装置，其包含至少五种不同的微针，每种微针包含至少一种不同的抗原。
26.根据权利要求1-4或7-25中任一项所述的微针装置，其中所述多个包含至少一种冠状病毒抗原和至少两种、三种、四种或五种或更多种流感抗原，例如至少4种流感抗原。
27.根据权利要求26所述的微针装置，其中所述抗原中的每一种是单独配制的。
28.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述多个微针包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如至少20％)的包含所述冠状病毒抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原，的微针。
29.根据权利要求1-4或7-28中任一项所述的微针装置，其中所述多个微针包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多(例如至少80％)的包含所述流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原，的微针。
30.根据权利要求1-4或7-29中任一项所述的微针装置，其中所述多个微针包含：
(i)至少10％的各自包含所述冠状病毒抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原，的微针；和至少90％的包含所述流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原，的微针；
(ii)至少20％的各自包含所述冠状病毒抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原，的微针；和至少80％的包含所述流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原，的微针；或
(iii)至少30％的各自包含所述冠状病毒抗原，例如一种或多种冠状病毒抗原，的微针；和至少70％的包含所述流感抗原，例如一种、两种、三种或四种流感抗原，的微针。
31.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2抗原(例如SARS-CoV-2-S1或其亚基)、MERS-CoV抗原(例如MERS-CoV-S1或其亚基)、SARS-CoV抗原(例如SARS-CoV-S1或其亚基)或其组合。
32.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含SARS-CoV-2疫苗，例如SARS-CoV-2基因产物(例如SARS-CoV-2蛋白，或编码SARS-CoV-2蛋白的核酸(例如mRNA、DNA))，病毒或病毒颗粒(例如灭活或减毒的SARS-CoV-2病毒)或病毒载体，或其组合。
33.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述SARS-CoV-2疫苗选自SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基，SARS-CoV-2核壳蛋白，灭活病毒(例如灭活的SARS-CoV-2，例如UV灭活的SARS-CoV-2)，病毒载体(例如非复制型病毒载体或复制型病毒载体)，病毒样颗粒，DNA(例如DNA质粒)，RNA(例如信使RNA(mRNA))、自扩增mRNA(saRNA)、核苷修饰的mRNA(modRNA)或含尿苷的mRNA(uRNA))，腺病毒载体(例如5型腺病毒载体，例如Ad5-nCoV)，或其组合。
34.根据前述权利要求中任一项所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗选自冠状病毒刺突蛋白(例如融合前SARS-CoV-2刺突蛋白)，灭活的SARS-CoV-2(例如UV灭活的SARS-CoV-2或PiCoVacc)；mRNA(例如，编码冠状病毒蛋白的mRNA，例如，编码SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的mRNA，例如，mRNA-1273)；腺病毒载体(例如，表达冠状病毒蛋白(例如，SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基)的5型腺病毒载体，例如，Ad5-nCoV)；DNA质粒(例如，编码SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基的DNA质粒)，例如，INO-4800)；树突细胞(例如，用慢病毒载体修饰以表达SARS-CoV-2小基因的树突细胞)，例如，LV-SMENP-DC)；人工抗原呈递细胞(aAPC)，例如，用慢病毒载体修饰以表达SARS-CoV-2小基因的aAPC，或其组合。
35.根据前述权利要求中任一项所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含刺突蛋白，例如融合前SARS-CoV-2刺突蛋白；或其亚基。
36.根据前述权利要求中任一项所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含：
(i)完整刺突蛋白，稳定刺突蛋白，锁定刺突蛋白，刺突蛋白亚基或来自刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)；或
(ii)载体(例如5型腺病毒载体)，RNA(例如mRNA、saRNA、modRNA或uRNA)或DNA(例如DNA质粒)，其编码刺突蛋白或其亚基，例如完整刺突蛋白，稳定刺突蛋白，锁定刺突蛋白，刺突蛋白亚基或来自刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)。
37.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含灭活的SARS-CoV-2，例如UV灭活的SARS-CoV-2。
38.根据前述权利要求任一项所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含重组蛋白，例如重组SARS-CoV-2刺突蛋白，或其亚基。
39.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含冠状病毒衍生的蛋白，例如融合前SARS-CoV-2刺突蛋白，所述冠状病毒衍生的蛋白包含三聚体结构。
40.根据前述权利要求中任一项所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含脂质纳米颗粒(LNP)制剂，例如由LNP包封的冠状病毒疫苗，例如由LNP包封的mRNA疫苗。
41.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗包含mRNA-1273、BNT162、INO-4800、Ad26 SARS-CoV-2、TNX-1800或PiCoVacc，或其组合。
42.根据权利要求1-4或7-41中任一项所述的微针装置，其中所述流感疫苗包含一价(例如单价)或多价流感疫苗(例如二价、三价、四价或五价流感疫苗)。
43.根据权利要求1-4或7-42中任一项所述的微针装置，其被配置成递送(例如释放)两种或更多种流感抗原(例如三种或更多种，或四种或更多种抗原)，例如以针对两种或更多种不同的流感病毒提供保护。
44.根据权利要求1-4或7-43中任一项所述的微针装置，其中所述多个微针包含第三微针，所述第三微针包含不同于所述第二微针中的所述流感抗原的流感抗原。
45.根据权利要求44所述的微针装置，其中所述多个微针包含第四微针，所述第四微针包含不同于所述第二微针和所述第三微针中的所述流感抗原的流感抗原。
46.根据权利要求44或45中任意一项所述的微针装置，其中所述多个微针包含第五微针，所述第五微针包含与所述第二微针、所述第三和所述第四微针中存在的所述流感抗原不同的流感抗原。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的微针装置，其中：
(i)所述第二微针和所述第三微针中的流感抗原的组合包含二价流感疫苗；
(ii)所述第二微针、所述第三微针和所述第四微针中的流感抗原的组合包含三价流感疫苗；和/或
(iii)所述第二微针、所述第三微针、所述第四微针和所述第五微针中的流感抗原的组合包含四价流感疫苗。
48.根据权利要求1-4或7-47中任一项所述的微针装置，其中所述流感疫苗包含甲型流感疫苗、乙型流感疫苗、丙型流感疫苗和/或丁型流感疫苗。
49.根据权利要求1-4或7-48中任一项所述的微针装置，其中所述流感疫苗包含甲型流感疫苗(例如H1N1疫苗和/或H3N2疫苗)和乙型流感疫苗(例如B/Yamagata谱系和/或B/Victoria谱系疫苗)。
50.根据权利要求1-4或7-49中任一项所述的微针装置，其中所述多个微针包含4:1比率的流感疫苗与冠状病毒疫苗。
51.根据权利要求1-4或7-50中任一项所述的微针装置，其中所述冠状病毒疫苗和流感疫苗的组合包括五价疫苗。
52.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，所述微针装置被配置成产生对冠状病毒和/或流感病毒的单剂量保护，例如免疫。
53.根据权利要求1-4或7-52中任一项所述的微针装置，其中所述微针装置被配置成以足以诱导免疫应答，例如体液和/或细胞免疫应答，的量向所述受试者递送所述流感疫苗。
54.根据权利要求3-53中任一项所述的微针装置，其中所述丝素蛋白包括再生丝素蛋白和/或重组丝素蛋白。
55.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述装置被配置成用于持续释放所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗。
56.根据权利要求55所述的微针装置，其中所述持续释放包括所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗的基本上连续的低剂量施用，例如，在包括至少约4天(例如，约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天或更多天，例如，约5天和约25天之间、约10天和约20天之间、约10天和约15天之间、约12天和约16天之间、或约14天和约15天之间)的时间段内释放约1ug至约500ug的所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗。
57.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述微针被配置成在包括至少约4天(例如，约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天或更多天，例如，约5天和约25天之间、约10天和约20天之间、约10天和约15天之间、约12天和约16天之间、或约14天和约15天之间)的时间段内将所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗释放到受试者的皮肤中。
58.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述微针包含所述冠状病毒疫苗的剂量，例如标准剂量，的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％或更多。
59.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述微针尖端(例如，丝素蛋白尖端)包含浓度为约1％w/v至约10％w/v(例如，约1％w/v、2％w/v、3％w/v、4％w/v、5％w/v、6％w/v、7％w/v、8％w/v、9％w/v或10％w/v，或具有根据图4的分子量分布的丝素蛋白，或包含量为约20μg至约245μg的丝素蛋白，例如每121微针阵列)的丝素蛋白。
60.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述基质(例如可溶性基质)包含以下中的两种或更多种：
(i)多糖(例如，葡聚糖)；
(ii)二糖(例如蔗糖、麦芽糖和海藻糖)；
(iii)聚合物(例如，甲基纤维素、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)和透明质酸)；
(iv)蛋白质(例如明胶)；
(v)增塑剂(例如，甘油、丙二醇)；和
(vi)表面活性剂(例如辛基酚乙氧基化物(例如Triton-X)、聚山梨醇酯、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)。
61.根据前述任一项权利要求所述的微针装置，其中所述基质包括明胶，葡聚糖，甘油，聚乙二醇(PEG)(例如，包括低分子量PEG)，蔗糖，海藻糖，麦芽糖，羧甲基纤维素(CMC)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚乙烯醇(PVA)，透明质酸，甲基纤维素和/或表面活性剂(例如，辛基酚乙氧基化物(例如，Triton-X)，聚山梨醇酯，泊洛沙姆，例如P188，和/或聚乙氧基化醇)中的一种或多种，任选地其中所述微针被配置成用于持续释放。
62.根据前述权利要求中任一项所述的微针装置，其被配置成用于持续释放，所述微针装置包含：
(i)约20％至约40％之间，例如30％，的70kDa葡聚糖；
(ii)约5％至约15％之间，例如约10％，的蔗糖；
(iii)约0.5％至约2.5％之间，例如约1％，的甘油；和
(iv)约0.001％至约1％之间，例如约0.01％，的Triton-X；
(任选地，其中这是用于浇铸和/或用于干燥、固化的基质的组合物的溶液)。
63.根据前述权利要求中任一项所述的微针装置，其中所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)包含：
(i)二糖(例如蔗糖、麦芽糖和海藻糖)；
(ii)聚合物(例如，甲基纤维素、聚乙二醇(PEG)、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、透明质酸)；
(iii)氨基酸(例如苏氨酸)；
(iv)增塑剂(例如，甘油、丙二醇)；
(v)缓冲液(例如PBS)；
(vi)表面活性剂(例如辛基酚乙氧基化物(例如Triton-X)、聚山梨醇酯(例如Tween20)、泊洛沙姆和/或聚乙氧基化醇)；和/或
(vii)佐剂。
64.根据前述权利要求中任一项所述的微针装置，其中所述微针(例如，所述微针尖端)进一步包含以下和/或被配置成释放以下：非疫苗分子，例如，可用于确认剂量递送的分子，例如，染料分子(例如，生物相容性染料分子)，或报道分子，其可被可视化(例如，通过用UV辐射照射)。
65.一种在受试者中提供对病毒(例如SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV和/或流感病毒)的免疫(例如广谱免疫)的方法，其包括使所述受试者的皮肤与根据前述权利要求中任一项所述的微针装置接触。
66.一种在受试者中提供抗原例如冠状病毒疫苗和/或流感疫苗(例如SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原、MERS-CoV抗原和/或流感抗原、或其疫苗制剂)的控制释放或持续释放的方法，其包括使所述受试者的皮肤与根据权利要求1-64中任一项所述的微针装置接触。
67.一种增强受试者对病毒(例如冠状病毒(例如SARS-CoV-2、SARS-CoV和/或MERS-CoV)和/或流感病毒)的免疫应答的方法，其包括使所述受试者的皮肤与根据权利要求1-64中任一项所述的微针装置接触。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述免疫应答是包含以下的体液和/或细胞免疫应答：
(i)在所述受试者的血液中可检测到的提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如，对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基具有特异性的抗体)，例如在免疫后至少三、四、五、六天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和/或16周可检测到；
(ii)在所述受试者的血液中可检测到的提高的抗冠状病毒IgG(例如，抗SARS-CoV-2IgG)滴度，例如在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5和/或6个月可检测到；
(iii)在免疫后完整的冠状病毒季期间，在所述受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如，对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基具有特异性的抗体)；
(iv)所述受试者的血液中IFNγ分泌细胞水平的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周；和/或
(v)所述受试者的血液中每预选数目的细胞的IFNγ产生的增加，例如免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12周。
69.一种在受试者中提供对冠状病毒(例如SARS-CoV-2，SARS-CoV和/或MERS-CoV)和/或流感病毒的广谱免疫的方法，所述方法包括使所述受试者的皮肤与根据权利要求1-64中任一项所述的微针装置接触，例如在所述受试者中引起对所述冠状病毒和/或所述流感病毒的漂移株的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的方法，其中：
(i)所述冠状病毒疫苗包含与第一冠状病毒株相关的抗原，并且向所述受试者施用一定剂量的所述冠状病毒疫苗导致对不存在于所述组合物或所述疫苗中或与所述组合物或所述疫苗不相关的第二冠状病毒株(例如，漂移的SARS-CoV-2株)的广谱免疫；
(ii)所述流感疫苗包含第一流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一流感病毒株导致对所述组合物或所述疫苗中不存在的第二流感病毒株(例如漂移的流感病毒株)的广谱免疫；
(ii)所述流感疫苗包含第一甲型流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一甲型流感病毒株导致对所述组合物或所述疫苗中不存在的漂移的流感病毒株(例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的广谱免疫；
(iii)所述流感疫苗包含第一乙型流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一乙型流感病毒株导致对所述组合物或所述疫苗中不存在的漂移的流感病毒株(例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的广谱免疫；
(iv)所述流感疫苗包含第一丙型流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一丙型流感病毒株导致对所述组合物或所述疫苗中不存在的漂移的流感病毒株(例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的广谱免疫；和/或
(v)所述流感疫苗包含第一丁型流感病毒株，并且向所述受试者施用一定剂量的所述第一丁型流感病毒株导致对所述组合物或疫苗中不存在的漂移的流感病毒株(例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株)的广谱免疫。
71.根据权利要求65-70中任一项所述的方法，其中在免疫后完整的冠状病毒季期间，在所述受试者的血液中可检测到提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基具有特异性的抗体)，任选地其中所述提高的冠状病毒特异性抗体滴度是针对漂移的冠状病毒株(例如漂移的SARS-CoV-2株)。
72.根据权利要求65-71中任一项所述的方法，其中例如在免疫后6个月时，例如基于所述受试者的血液中可检测到的提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基具有特异性的抗体)的血清转化百分比大于约20％(例如20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多，例如100％)。
73.根据权利要求68、71或72中任一项所述的方法，其中与单剂量施用或快速浓注施用所述冠状病毒疫苗(例如SARS-CoV-2疫苗)相比，所述提高的冠状病毒特异性抗体滴度(例如SARS-CoV-2特异性抗体，例如对SARS-CoV-2刺突蛋白或其亚基具有特异性的抗体)、所述提高的抗冠状病毒IgG(例如抗SARS-CoV-2IgG)滴度和/或针对所述冠状病毒(例如SARS-CoV-2病毒)的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平更高(例如高1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍或15倍，或更多)。
74.根据权利要求65-73中任一项所述的方法，其中所述免疫应答和/或广谱免疫包括细胞和/或体液免疫应答，其包括：
(i)在所述受试者的血液中可检测到的提高的血细胞凝集抑制(HAI)抗体滴度，例如在免疫后至少3、4、5或6天，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更多时间可检测到，任选地其中所述提高的HAI抗体滴度是针对漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株；
(ii)在所述受试者的血液中可检测到的提高的抗流感病毒IgG滴度，例如在免疫后至少4、5或6天，或至少1、2、3或4周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和/或12个月或更多时间可检测到，任选地其中所述提高的抗流感病毒IgG滴度是针对漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株；和/或
(iii)在所述受试者的骨髓中可检测到的针对流感病毒，例如漂移的甲型、乙型、丙型和/或丁型流感病毒株，的抗体分泌浆细胞(ASC)的水平，例如在免疫后至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51和/或52周或更多时间可检测到。
75.一种用于在受试者中提供对冠状病毒(例如SARS-CoV-2、SARS-CoV和/或MERS-CoV)和/或流感病毒的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)和/或广谱免疫的方法，所述方法包括使所述受试者的皮肤与根据权利要求1-64中任一项所述的微针装置接触，
其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗以足以在所述受试者中引发针对所述冠状病毒和/或所述流感病毒的免疫应答(例如细胞免疫应答和/或体液免疫应答)的量(例如剂量)和/或包括约5-25天(例如约10-20天、约10-15天、约12-18天或约14-15天)，例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天的时间段施用。
76.根据权利要求65-75中任一项所述的方法，其中所述受试者(例如，所述人类受试者)是儿童受试者。
77.根据权利要求65-75中任一项所述的方法，其中所述受试者(例如，人类受试者)是成人受试者。
78.根据权利要求65-75中任一项所述的方法，其中所述受试者(例如，人类受试者)是老年受试者。
79.根据权利要求65-78中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或所述流感疫苗预防性施用。
80.根据权利要求65-79中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗的单剂量施用在所述受试者中提供针对例如冠状病毒和/或流感病毒感染的保护。
81.根据权利要求65-80中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗作为贴片，例如单一贴片施用。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述贴片由健康护理专业人员(例如医生或护士)施用给所述受试者。
83.根据权利要求81所述的方法，其中所述贴片是自身施用的。
84.根据权利要求81-83中任一项所述的方法，其中使用施用器施用所述贴片。
85.根据权利要求65-84中任一项所述的方法，其进一步包括在受试者中释放(例如，控制释放或持续释放)非疫苗分子，例如，可用于确认剂量递送的分子，例如，染料分子(例如，生物相容性染料分子)或报道分子，其可被可视化(例如，通过用UV辐射照射)。
86.一种生产微针装置的方法，所述方法包括：
提供包括模具本体的模具，所述模具本体具有形成在其中的具有预定形状的针腔的阵列，例如金字塔形和/或圆锥形针腔；
用组合物(例如，包含丝素蛋白的组合物)，冠状病毒抗原，例如，冠状病毒疫苗(例如，以下中的一种或多种：SARS-CoV-2抗原、SARS-CoV抗原、或MERS-CoV抗原、或其疫苗制剂)，和/或流感抗原，例如流感疫苗(例如一种或多种流感抗原，或其疫苗制剂)填充所述针腔的尖端；
干燥所述针腔的填充尖端以产生微针尖端(例如丝素蛋白尖端)，并任选地退火所述微针尖端；
用基质(例如可溶性基质)溶液填充所述模具的所述针腔；
干燥所述基质溶液以产生用于所述微针尖端(例如丝素蛋白尖端)的基层；和
任选地将背衬施加到所述基层上以产生微针装置。
87.根据权利要求86所述的方法，其进一步包括任选地在施加所述背衬之前从所述模具移除所述微针装置。
88.根据权利要求86或87所述的方法，其中通过将所述模具偏离所述微针装置弯曲来移除所述微针装置。
89.根据权利要求86-88中任一项所述的方法，其进一步包括用干燥剂将所述微针装置包装在具有低湿气渗透率的容器中，以保持所述包装内相对湿度在约0％和约50％之间(例如，约0％和10％之间、约10％和约20％之间、约20％和约30％之间、约30％和约40％之间、或约40％和50％之间，例如约25％)。
90.根据权利要求86-89中任一项所述的方法，其中所述组合物(例如包含丝素蛋白的组合物)、冠状病毒疫苗和/或流感疫苗溶液通过纳升印刷分配到所述模具中的每个针腔中。
91.根据权利要求86-90中任一项所述的方法，其中填充所述针腔的尖端包括将溶液例如丝素蛋白、冠状病毒疫苗和/或流感疫苗溶液分配到每个针腔中。
92.根据前述任一项权利要求所述的微针、微针装置或方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗是佐剂化的。
93.根据前述权利要求中任一项所述的微针、微针装置或方法，其中所述冠状病毒疫苗和/或流感疫苗是无佐剂的。
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