CN116390743A

CN116390743A - 免疫原性组合物

Info

Publication number: CN116390743A
Application number: CN202180067600.8A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·贝森; 冯高谦; 利里耶·库尔托维奇
Original assignee: Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Current assignee: Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health Ltd
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2023-07-04
Also published as: EP4192498A1; KR20230080396A; US20240181026A1; WO2022027107A1; AU2021322831A1

Abstract

用于预防疟疾的免疫原性或疫苗组合物以及施用其的方法，所述免疫原性或疫苗组合物包括或编码能够向受试者呈递N末端(NT)表位的CSP NT序列。

Description

免疫原性组合物

技术领域

本公开涉及疟疾疫苗的技术领域。

背景技术

本说明书中对任何先前公开物、或对任何已知材料的引用不是并且不应当认为是确认或承认暗示所述先前公开物或已知材料形成本说明书所涉及的研究领域中公共常识的一部分或其任何形式。

本说明书的结尾列出了所参考的文献的书目详细信息。

疟疾仍然是全球主要健康问题，其中恶性疟原虫疟疾(Plasmodium.falciparummalaria)每年引起大约2.19亿个临床病例和435,000人死亡。尽管国际监督做出了努力，但近年来疟疾负担仍然保持恒定。迫切需要一种用于控制和消除疟疾的高效疫苗，越来越多的抗疟药物耐药性和杀虫剂耐药性的报告进一步强调了这一点。世界卫生组织和资助伙伴设定了目标，即截至2030年开发具有超过75％疗效的疫苗，但已证明这很难实现。为了提高疫苗疗效，需要更好地了解介导免疫的机制，以开发产生更有效的保护性免疫应答的策略。

疟疾感染始于受感染的按蚊叮咬，在此期间子孢子被接种到真皮中。然后子孢子迁移通过血管，在血流中循环到肝脏，并在肝细胞中产生感染。子孢子代表疟疾疫苗的优先靶标，因为清除子孢子将在随后的血期感染期间发生的临床疟疾发作之前阻止感染。抗体被认为是对子孢子免疫的主要介体，如动物模型和疫苗试验所证实的(Beeson,J.G.等人开发有效且持久的疟疾疫苗的挑战和策略(Challenges and strategies for developingefficacious and long-lasting malaria vaccines),《科学转化医学(Sci Transl Med)》11(2019))。环子孢子蛋白(CSP)是在子孢子的表面上表达的最丰富的蛋白质，并且是人抗体的主要靶标。迄今为止，基于恶性疟原虫CSP的疫苗优于其它疫苗抗原，即使疗效仍然是次优的。最先进的疟疾疫苗，即RTS,S基于CSP的截短形式(仅包含中央重复区和C末端区)，并且在婴儿和幼儿的III期临床试验中实现了针对临床疟疾的适度疗效(26-36％)。CSP的中央重复区被认为是重要的抗体靶标，并且因此抗体对非重复区的重要性尚未明确。在儿童RTS,S疫苗试验中，针对C末端区的抗体与保护相关，并且一些C末端表位被RTS,S VLP中不存在的N末端结构域所遮蔽。就抗体活性的功能机制而言，重点一直在于抗体对CSP的中央重复区的直接抑制活性，这可能在体外抑制子孢子运动性和肝细胞侵袭。

需要更有效的疫苗来控制疟疾。

发明内容

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两种含义或任一含义提供明确的支持。

如本文所使用的，除非相反地说明，关于N末端片段或其表位区的术语“约”是指指定肽片段的+/-2个氨基酸或+/-3个氨基酸。

贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体将被理解为暗示包含所陈述的要素、整数或步骤、或要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤、或要素组、整数组或步骤组。当提及基因产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。

术语“受试者”、“哺乳动物”和“患者”可互换使用。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述哺乳动物受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是小鼠、大鼠、兔子、狗、驴、非人灵长类动物或实验室试验动物，如果蝇、斑马鱼等。

可设想到，所述方法和组合物可以包含排除本文所描述的任何实施例。

术语“基本上”被定义为如本领域普通技术人员理解的大部分但不一定完全的指定的内容(并且完全包含指定的内容)。在任何公开的实施例中，术语“基本上”可以用指定的内容的“[百分比]内”代替，其中百分比包含0.1％、1％、5％和10％。

除非本公开或实施例的性质明确禁止，否则尽管未描述或说明，但一个实施例的一个或多个特征可以应用于其它实施例。

如本文所使用的，除非上下文另外指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含单数和复数个指示物。

核苷酸和氨基酸序列由序列标识符编号(SEQ ID NO:)指示。SEQ ID NO:在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO:1)、<400>2(SEQ ID NO:2)等。表1中描述了序列标识符。权利要求之后提供了序列表。于2021年8月6日提交的命名为531124PCT的序列表也通过引用并入本文。

一方面，本公开提供了用于预防疟疾的免疫原性或疫苗组合物以及施用其的方法，所述免疫原性或疫苗组合物包括或编码能够向受试者呈递N末端(NT)表位的CSP NT序列。

因此，在一些实施例中，本发明提供并实现了一种在受试者体内诱导针对恶性疟原虫(P.falciparum，Pf)子孢子的抗体以对所述受试者进行疫苗接种的方法。在一个实施例中，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种表示选自NT和CT和/或NANP区的环子孢子多肽(CSP)的特异性亚区的肽抗原或其编码序列。在一个实施例中，所述方法包括：

(i)施用呈递PfCSP的N末端(NT)表位的肽或编码肽的序列；或

(ii)共同施用(i)的所述肽或所述序列以及呈递PfCSP的NANP和/或CT表位的肽或编码肽的序列；或

(iii)施用表示PfCSP的NT和CT和/或NANP亚区而不是全长PfCSP的肽或编码肽的序列。

如本文所示的NT CSP表位诱发功能性抗体应答以及具体地PCMS应答的发现提供了通过筛选疫苗候选物产生PCMS应答的能力来筛选疫苗候选物的方法。令人惊讶的是，已经鉴定了CSP的NT亚区中的本身诱发强PCMS应答的区。在一些实施例中，本发明提供并实现了一种在受试者体内诱导针对恶性疟原虫(Pf)子孢子的抗体以对所述受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种表示包含NT本身的环子孢子多肽(CSP)的特异性亚区的肽抗原或其编码序列，所述方法包括：

(i)施用呈递PfCSP的N末端(NT)表位的肽或编码肽的序列。

在一些实施例中，本发明提供并实现了一种在受试者体内诱导针对恶性疟原虫(Pf)子孢子的抗体以对所述受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种表示包含NT本身或NT和CT和/或NANP亚区的环子孢子多肽(CSP)的特异性亚区的肽抗原或其编码序列，所述方法包括：

(i)施用呈递PfCSP的N末端(NT)表位的肽或编码肽的序列；或

(ii)共同施用(i)的所述肽或所述序列以及呈递PfCSP的NANP和/或CT表位的肽或编码肽的序列。

在一个实施例中，本发明提供并且实现了一种在受试者体内诱导针对恶性疟原虫(Pf)子孢子的抗体以对所述受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种表示环子孢子多肽(CSP)的特异性亚区以及具体地NT和CT和/或NANP亚区的肽抗原或其编码序列，所述方法包括：(iii)施用表示PfCSP的NT和CT和/或NANP亚区而不是全长PfCSP的肽或编码肽的序列。

因此，在一些实施例中，本发明提供并实现了一种在受试者体内诱导针对恶性疟原虫(Pf)子孢子的抗体以对所述受试者进行疫苗接种的方法。在一个实施例中，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种表示选自NT和CT和/或NANP区的环子孢子多肽(CSP)的特异性亚区的肽抗原。

为了清楚起见，在一个实施例中，所述方法包括：

(i)施用呈递PfCSP的N末端(NT)表位并且不表示PfCSP的NANP或CT亚区的肽或编码肽的序列；或

(ii)共同施用(i)的所述肽或编码序列以及呈递PfCSP的NANP和/或CT表位的肽或编码肽的序列；或

(iii)施用呈递PfCSP的NT和CT和/或NANP亚区而不是全长PfCSP的肽或编码肽的序列。

在一个实施例中，全长CSP可能没有信号序列或其它末端区，以便在体外最大化表达。

在一个实施例中，CSP的所述NT亚区是全长NT区或缺乏信号序列或恶性疟原虫CSP的氨基酸58至104(SEQ ID NO:1)的全长NT亚区，并且呈递SEQ ID NO:1的NT表位的肽包括来自毒株3D7的CSP的N末端氨基酸58至104(SEQ ID NO:1)的3至48个连续氨基酸或来自不同恶性疟原虫毒株的对应肽。

在一个实施例中，CSP的所述NT亚区是恶性疟原虫CSP的氨基酸58至81(SEQ IDNO:2)，并且呈递SEQ ID NO:2的NT表位的肽包括毒株3D7的SEQ ID NO:2的3至24个连续氨基酸或来自不同恶性疟原虫毒株的对应肽。

在一个实施例中，所述NT亚区是所述PfCSP的氨基酸64至84(SEQ ID NO:3)，并且呈递SEQ ID NO:3的NT表位的肽包括SEQ ID NO:3的3至21个连续氨基酸或来自不同毒株的对应肽。

对3至48、3至24或3至21的引用包含例如6至48、6至24和6至21以及12至48、12至24、12至21和15至48、15至24和15至21。技术人员在本文中提供测定以确认肽的PCMS应答。

在一个实施例中，表示NT表位的肽包括来自CSP的N末端氨基酸58至81(SEQ IDNO:2)的3至24个连续氨基酸或来自不同毒株的对应序列，并且另外包括来自CSP的N末端氨基酸82至104(SEQ ID NO:4)的3至24个连续氨基酸或来自不同毒株的对应肽。

在一个实施例中，呈递CSP NT表位的肽包括来自CSP多肽的N末端氨基酸64至84的3至21个连续氨基酸，其中至少3个连续氨基酸包含DDG或GNN，并且其中所述肽另外包括来自CSP多肽的N末端氨基酸76至100(SEQ ID NO:5)的3至24个连续氨基酸，其中至少3个连续氨基酸包含KPK并且不包含GNP。

在一个实施例中，呈递CSP NT表位的肽包括选自以下中的一个或多个的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:57。

在一个实施例中，呈递CSP NT表位的肽包括T细胞辅助表位。

在一个实施例中，表示CSP NT表位的肽包括异源T细胞辅助表位。

在一个实施例中，呈递PfCSP的CSP NANP或CT表位的肽是RTS,S或R21疫苗肽。

在一个实施例中，表示PfCSP的NT、CT和NANP亚区的肽包括CSP的氨基酸59至327或60至327(SEQ ID NO:6)

QENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSGS，或来自不同Pf毒株的对应序列。

在一个实施例中，呈递NT表位的肽包括

ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADG(SEQ ID NO:57)或ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADSGSGQYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:60)。

在一个实施例中，所述抗原是以蛋白质和/或核酸形式作为病毒样颗粒与纳米载体/脂质体、病毒载体一起和/或以包括佐剂或免疫调节剂的药物组合物进行施用的。肽抗原可以以蛋白质形式(例如，表达或合成的抗原)和/或核酸形式(例如，mRNA和DNA)作为病毒样颗粒或其它纳米颗粒与纳米载体/脂质体、病毒载体一起和/或以包括佐剂或免疫调节剂的药物组合物进行施用。

另一方面，本发明提供并且实现了一种药物组合物，其包括表示CSP SEQ ID NO:1的NT亚区的肽抗原或抗原编码序列以及药学上可接受的赋形剂或稀释剂，其中所述抗原在施用于受试者时包括呈递SEQ ID NO:1的NT表位的肽并且包括SEQ ID NO:1的3至48个连续氨基酸或来自变体恶性疟原虫毒株的对应肽。

在所述组合物的一个实施例中，所述抗原包括异源间隔子或免疫调节元件，在一个实施例中包括辅助T细胞表位。

在所述组合物的一个实施例中，CSP NT肽包括SEQ ID包括

DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ(SEQ ID NO:25)或

ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADG(SEQ ID NO:57)或KQENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDP(SEQ ID NO:1)，或者其中所述肽包括SEQ IDNO:25以及来自CSP NT序列的N末端或C末端连续氨基酸，SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:1，或来自变体毒株的对应序列。

在一个实施例中，所述药物组合物进一步包括表示PfCSP的NANP和或CT亚区并且呈递PfCSP的NANP和/或CT表位的抗原肽或编码肽抗原的序列。

在另一个实施例中，实现了一种病毒样颗粒组合物，其中所述病毒样颗粒包括表示CSP SEQ ID NO:1的NT亚区的肽抗原以及药学上可接受的赋形剂或稀释剂，其中所述抗原在施用于受试者时包括呈递SEQ ID NO:1的NT表位的肽并且包括SEQ ID NO:1的3至48个连续氨基酸或来自变体恶性疟原虫毒株的对应肽。在一个实施例中，所述抗原包括异源间隔子或免疫调节元件，在一个实施例中包括辅助T细胞表位。

在VLP组合物的一个实施例中，CSP NT肽包括SEQ ID包括

DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ(SEQ ID NO:25)或

在另一个实施例中，本说明书使技术人员能够制备并且使用编码并且能够表达如本文所定义的抗原的载体或多核苷酸。在一个实施例中，所述肽抗原表示CSP SEQ ID NO:1的NT亚区，其中所述抗原在施用于受试者时包括呈递SEQ ID NO:1的NT表位的肽并且包括SEQ ID NO:1的3至48个连续氨基酸或来自变体恶性疟原虫毒株的对应肽。在一个实施例中，所述抗原包括异源间隔子或免疫调节元件，在一个实施例中包括辅助T细胞表位。

在一个实施例中，经编码的CSP NT肽包括SEQ ID包括

DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ(SEQ ID NO:25)或

ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADG(SEQ ID NO:57)或KQENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDP(SEQ ID NO:1)，或者其中所述经编码的肽包括SEQ ID NO:25以及来自CSP NT序列的N末端或C末端连续氨基酸，SEQ ID NO:57或SEQ IDNO:1，或编码来自变体毒株的对应序列。在另一个实施例中，本申请提供了一种病毒或非病毒载体，其包括编码肽抗原的核酸序列，所述肽抗原表示或包括PfCSP的NT表位并且任选地基本上不表示或包括CSP CT和/或NANP表位。

另一方面，本发明提供了一种治疗或预防疟疾的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如本文所定义的组合物、如本文所定义的VLP或如本文所定义的载体或多核苷酸。

一方面，提供了一种如本文所定义的PCMS抗原或NT CSP肽抗原或编码其的核酸分子在制备用于治疗或预防受试者的疟原虫感染或疟疾的药物中的用途。

在一个实施例中，本说明书提供了一种筛选疫苗候选物/表位的方法，所述方法包括测试其与中性粒细胞和单核细胞上的Fcγ受体结合并诱导子孢子的抗体依赖性调理素吞噬作用或通过自然杀伤细胞杀伤的能力。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，将由专利局提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

并入本说明书中且构成本说明书的一部分的附图示出了本发明的若干实施例，并且连同本说明书一起用于解释本发明的原理。

图1A-E展示了实例1中描述的结果，所述结果示出了中性粒细胞主要介导全血中的CSP涂覆的珠和子孢子的调理素吞噬作用。

(A)CSP涂覆的珠用不同浓度的兔抗CSP IgG进行调理。与单核细胞(右手侧)相比，中性粒细胞(左手侧)示出更大的吞噬活性(双向ANOVA，P<0.001)。条形图表示6个独立实验的平均值和标准误差。

(B)CSP涂覆的珠用以1/500稀释的兔抗CSP IgG进行调理，并且与全白细胞在不同的比率下共同温育。中性粒细胞(LHS)的吞噬活性显著高于单核细胞(RHS)的吞噬活性(双向ANOVA，P<0.001)。条形图表示3个独立实验的平均值和标准误差。

(C)使用表达恶性疟原虫(PfCSP-伯氏疟原虫(P.berghei))的CSP的转基因伯氏疟原虫子孢子系测试中性粒细胞对子孢子的吞噬作用，所述转基因伯氏疟原虫子孢子系用来自免疫成人的汇集的免疫血清进行调理。在存在免疫抗体的情况下，中性粒细胞(深蓝色条-LHS)比单核细胞(浅蓝色条-RHS-双向ANOVA，P＝0.005)吞噬更多的子孢子。误差条表示基于来自2个独立实验的数据的标准误差。

(D)将通过每个单核细胞子集吞噬的珠的数量定量并标准化为珠/100个单核细胞。经典单核细胞子集示出更大的吞噬活性(P<0.001)。条形图和误差条表示来自5个实验的平均值和标准误差。

(E)与未调理的对照相比，使用暴露于疟疾的免疫成人血清池调理嵌合PfCSP-伯氏疟原虫转基因子孢子通过中性粒细胞诱导更高水平的吞噬作用(P＝0.049)。调理素吞噬活性表示为溴化乙锭阳性细胞的百分比，并且示出了来自两个独立实验的结果(示出平均值和标准误差)。

图2A-H展示了特异性Fcγ受体在介导子孢子调理素吞噬作用中的作用，如实例2和图2的图例所述。

(A)阻断特异性FcγR对经调理的子孢子的中性粒细胞吞噬作用的影响；恶性疟原虫子孢子用暴露于疟疾的成人血清池进行调理。条形图表示基于一式两份进行的两个实验的结果的吞噬指数的平均值和标准误差。

(B)阻断特异性FcγR对通过中性粒细胞调理的CSP珠的吞噬作用的影响。CSP涂覆的珠用来自免疫成人的血清池进行调理。条形图表示来自一式两份进行的两个实验的平均值和标准偏差。

(C)阻断FcγR受体对通过THP-1细胞进行的CSP珠的吞噬作用的影响。条形图表示来自一式两份进行的两个实验的平均值和标准误差。

(D)与不存在(深蓝色条LHS)热灭活的人血清(双向ANOVA，P<0.001)的情况相比，通过THP-1细胞对CSP涂覆的珠的调理素吞噬作用在存在(浅蓝色条-RHS)热灭活的人血清的情况下要低得多。误差条表示来自两个独立实验的数据的标准误差。

(E)来自所选免疫血清样品的抗体使用CSP涂覆的珠和ADCC报告细胞系诱导ADCC活性。所选个体(AR1至AR13)示出为实例以证实观察到的活性的变化。来自未感染疟疾的墨尔本供体的血清被用作阴性对照(MC)。

(F)免疫成人血清样品(n＝31)中FcγRIII结合与ADCC测定(报告细胞系)中的抗体活性之间的相关性。

(G)使用CSP涂覆的珠和原代NK细胞测试来自相同免疫血清样品的抗体的ADCC活性。所选个体(S1至S13)示出为代表性实例。

(H)免疫成人血清样品(n＝31)中抗体介导的FcγRIII结合与ADCC活性(使用原代NK细胞)之间的相关性。

*表示显著性差异(p<0.05)；ns，不显著；RPI，相对吞噬指数。

图3A-B展示了FcγRIIa和FcγRIII结合活性的直接定量，如实例3所述。

(A)测试了免疫成人中针对CSP的抗体促进与FcγRIIa(LHS)和FcγRIII(RHS)结合的能力。条形图和误差条表示一式两份进行测试的每个样品的平均值和标准偏差。示出了代表性个体以反映所观察到的活性的范围。

(B)免疫成人队列中的FcγRIIa结合与FcγRIII结合之间的相关性。FcγRIIa结合与FcγRIII结合之间存在显著相关性(n＝104)。

图4A-E展示了CSP特异性抗体诱导的通过中性粒细胞的调理素吞噬作用，如实例4所述。

(A)与无抗体(无Ab)对照相比，由针对CSP的兔多克隆抗体介导的中性粒细胞对恶性疟原虫子孢子的调理素吞噬作用。数据示出了来自三个独立实验的平均值和标准误差。

(B)与作为对照的针对伯氏疟原虫CSP的小鼠单克隆抗体(3D11)相比，在不同浓度下由针对CSP的小鼠单克隆抗体(2H8)介导的中性粒细胞对恶性疟原虫子孢子的调理素吞噬作用。示出的数据是来自三个独立实验的平均值和标准误差。

(C)中性粒细胞对珠的调理素吞噬作用的水平在涂覆有CSP的不同区的珠之间发生变化(P＝0.022)。用来自一组免疫成人供体的抗体对涂覆有全长CSP(FL)、CT区、NT区和NANP重复区(重复序列)的珠进行调理。未调理的珠用作测定背景的阴性对照。数据示出了基于三个独立实验计算的平均值和标准误差。

(D)与针对CT区的兔IgG相比，针对NT区的兔IgG对于促进中性粒细胞对PfCSP-伯氏疟原虫子孢子的吞噬作用更有效(P＝0.0079)。示出的数据是基于两个独立实验的平均值和标准误差。吞噬活性相对于IgG对每种兔抗体的CSP的水平进行标准化。

(E)测试来自免疫成人组的抗体促进FcγRIIa与CSP的每个区的结合和FcγRIII结合活性的能力(与C的顺序相同)。FcγR结合水平根据与每种CSP构建体的总IgG结合水平(FcR结合效率)进行标准化。数据示出了基于两个独立实验的平均值和标准误差。区间的FcγR活性差异不显著(p>0.3)。

图5A-C展示了用诱导针对CSP的抗体的不同CSP区对兔的免疫。

(A)用CSP的N+C区免疫的兔仅产生针对CSP的CT区的抗体。图示出了通过ELISA确定的抗体对全长CSP(FL)、NT区(NT)、中央NANP重复区(NANP)和CT区(CT)的IgG反应性。(B)用NT区肽免疫的兔仅产生针对CSP的NT区的抗体。(C)通过ELISA确定的通过兔抗体对全长CSP(FL)的IgG反应水平针对NT区和CT区升高。误差条表示来自两个复制品的OD值的标准偏差。

图6展示了用于全白细胞测定以及定量中性粒细胞和单核细胞的吞噬水平的门控策略。吞噬珠的细胞基于荧光强度(FITC^高)和大小(FCS^高)进行门控。此群体进一步划分为中性粒细胞(CD66b^高)和单核细胞(CD66b^低和CD14⁺)。中性粒细胞或单核细胞吞噬的珠的数量基于珠荧光强度来确定。根据在每个样品中获取的吞噬细胞(包含中性粒细胞和单核细胞)的数量对这些数量进行进一步标准化，并将其表示为珠/100个吞噬细胞。

图7展示了使用原代NK细胞进行ADCC测定以及定量原代NK细胞中的ADCC的水平的门控策略。NK细胞被定义为CD3^-和CD56⁺淋巴细胞。ADCC的水平被确定为CD107a阳性NK细胞的百分比。

图8展示了使用THP-1细胞建立吞噬测定。

(A)冷冻保存的恶性疟原虫子孢子用溴化乙锭染色，用免疫成人血清池进行调理并被THP-1细胞吞噬。来自未感染疟疾的墨尔本供体的汇集的血清样品被用作阴性对照。当子孢子用免疫成人血清调理时，观察到更高水平的吞噬作用。吞噬作用水平表示为吞噬指数，所述吞噬指数反映了吸收荧光染色子孢子的THP-1细胞的百分比(数据示出了平均值和标准误差)。

(B)使用冷冻保存的子孢子和THP1细胞的调理素吞噬测定的重复性(斯皮尔曼rho(Spearman's rho)＝0.925，p<0.01)。冷冻保存的子孢子用选自暴露于疟疾的受试者的血清样品进行调理，以表示基于总IgG/CSP的高、中等以及低应答。吞噬测定独立地进行两次。吞噬指数标准化为阳性对照的百分比，所述阳性对照为免疫成人血清池。

(C)当使用CSP涂覆的珠或冷冻保存的恶性疟原虫子孢子时，THP-1细胞的调理素吞噬活性密切相关(斯皮尔曼rho＝0.831，p<0.01)。冷冻保存的子孢子或CSP涂覆的珠用选自免疫成人队列的血清样品进行调理，以表示基于总IgG/CSP的高、中等以及低应答。吞噬指数标准化为阳性对照的百分比，所述阳性对照为免疫成人血清池并且被定义为相对吞噬指数(RPI)。

图9展示了用于在单核细胞子集内进行分析的门控策略。

单核细胞群体被进一步划分为经典单核细胞(CD14^高CD16^-)、中等单核细胞(CD14^高CD16⁺)和非经典单核细胞(CD14^高CD16⁺)。

图10展示了FcγRIIa和FcγRIII阻断抗体的滴定。

中性粒细胞在与经调理的CSP涂覆的珠共同温育以进行吞噬之前通过FcγRIIa和FcγRIII阻断抗体以100ul/ml(深蓝色条)、25ug/ml(浅蓝色条)和6.25ug/ml(青蓝色条)的浓度进行阻断。当FcγR被阻断抗体以不同浓度进行阻断时，未观察到差异(P>0.1)。条形图和误差条表示一式两份进行测试的每个实验条件的平均值和标准偏差。

图11是示出针对CSP的NT提出的抗体的活性的结果的图形表示。使用固定化全长CSP(下)或N末端蛋白(上)测试针对CSP的NT区提出的兔抗体的IgG反应性(左图)和补体结合活性(C1q结合；右图)。结果示出了来自两个独立实验的平均值和范围。

图12是示出用全长CSP对兔进行疫苗接种不能有效地产生针对CSP的N末端区的抗体(底部粉红色线)的数据的图形表示。数据示出了抗体对CSP的不同区(NT、NANP和CT区；全长CSP用于比较)的IgG反应性(左图)和补体结合活性(C1q结合；右图)。两个独立实验的平均值和范围。

图13展示了针对CSP的N末端提出的多克隆兔IgG的表位定位的结果。针对源自CSP序列(3D7毒株)的重叠肽阵列测试抗体。下面列出了N末端肽序列。条形图和误差条表示来自两个独立实验的平均值和标准误差。

图14展示了在人抗体中耗竭针对CSP的N末端区的抗体如何降低抗体的FcγRIIa结合效率。

将血清抗体(来自不同的暴露于疟疾的成人)与重组NT蛋白一起温育，以从池中耗竭NT抗体。然后在耗竭/未耗竭NT抗体的情况下测试抗体促进FcγRIIa结合的能力，并且在耗竭/未耗竭的情况下根据总IgG滴度与全长CSP(FcγRIIa结合效率)进行进一步标准化。在NT特异性抗体耗竭后，FcγRIIa结合效率显著降低(P＝0.021)。

图15展示了使用RTS,S与CSP N末端PCMS抗原的组合进行疫苗接种的结果，A)如前所述，兔用全长CSP蛋白进行疫苗接种。疫苗接种后，测试血清对全长CSP(FL-CSP)以及CSP的不同区——N末端(NT)、C末端(CT)以及NANP重复区的IgG反应性。结果证实，用全长CSP进行疫苗接种不能有效地产生针对NT区的IgG。B)小鼠用对应于RTS,S疫苗构建体序列本身(单独的RTS,S)或与来自CSP的N末端区的合成肽序列混合(NT+RTS,S)的CSP混合物进行疫苗接种。疫苗接种后，测试小鼠血清中针对CSP的N末端(NT)、C末端(CT)和NANP重复区的IgG的存在。结果证实，RTS,S免疫原与NT肽免疫原的混合物有效产生针对CSP的所有3个区的IgG。组1：5ug RTS,S免疫原/剂量。组2：5ug RTS,S免疫原+10ug NT肽。用Quil-A佐剂调配疫苗，并且给予3个剂量。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

目前，最先进和最有效的疟疾疫苗是RTS,S，并且基于CSP抗原。然而，所述疫苗的疗效不大，并且需要诱导有效保护性免疫的新疫苗。虽然这一点在本领域是公认的，但尚不清楚如何实现更好的疗效并且诱导更有效的免疫应答。所述疫苗和其它基于CSP的疫苗的保护疗效由抗体介导。一种用于实现更高疗效的方法是设计产生更好且更有效的功能性抗体(促进而不是分散疫苗效率的抗体)的疫苗免疫原。根据本说明书，本发明的发明人已确定，针对CSP的抗体可以通过与血液中的补体蛋白以及与吞噬细胞(尤其是中性粒细胞)相互作用来起作用。RTS,S疫苗(以及被称为R21的相关疫苗)仅包含CSP的C末端区和中央重复区的一部分。根据本说明书，本发明的发明人已确定，如果抗体靶向CSP的N末端区，那么功能性抗体活性增强，所述N末端区为并非RTS,S疫苗的一部分的区。已经在N末端区中鉴定出诱发功能性抗体的表位，从而允许设计更好的疫苗构建体。已经产生了针对N末端区的抗体，并且这些抗体具有良好的功能活性。因此，在一个实施例中，建议制备和/或使用基于纳米载体的组合物，所述组合物包括CSP抗原，所述CSP抗原包含如本文所述的N末端肽或不具有表示CSP抗原的中央或CT亚区的肽的N末端肽。纳米载体包含VLP，所述VLP包含HBV载体(如源自人或嗜肝DNA病毒HBV载体的那些载体(参见Kurtovic等人,2021))或噬菌体载体。

“衍生物”或“修饰”意指通过改变(例如通过与其它化学部分缀合或复合)或通过如本领域将理解的翻译后修饰技术从碱性或亲本序列衍生而来的肽或多肽或核酸。所述术语还包含CSP的部分或片段，其中所述序列和其与部分或片段相关的亲本序列基本上相同。所述术语还包含在其范围内对母序列(包含其部分或片段)进行的更改，所述更改包含提供功能等效或功能改善的分子的取代、添加或缺失。CSP和其部分的改善形式是本领域已知的并在本文中进一步提出。衍生物还包含在最佳比对后在比较窗口内具有氨基酸或多核苷酸序列同一性百分比的分子。在一个实施例中，同一性百分比为至少80％-99％，包含80与99之间的任何数字。衍生物进一步包含类似物、包括异源元件(如间隔子、天然或非天然T细胞表位)的形式以及肽的前药和包括肽的纳米载体。

间隔子可以是连接抗原结构域的寡肽或多肽分子，并且足够灵活以允许抗原识别和结合。间隔子结构域可以包括或编码至多约300个氨基酸，但通常较短。

“分离”意指基本上或本质上不含通常以其天然状态伴随的组分的材料。

术语“受试者”包含“患者”，是指期望预防或疗法的任何受试者，具体地是人类受试者。受试者可能需要预防或治疗，但是应当理解的是，上述术语并不意味着存在疟疾或感染的症状。

术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“糖蛋白”等是可互换的并且不暗示任何特定的大小。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核酸”是指本领域已知的任何形式的核酸，如mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA或其混合物。所述术语通常指代长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。

如本文所使用的，术语序列“同一性”是指序列在比较窗口内在逐核苷酸的基础上或在逐氨基酸的基础上相同的程度。因此，“序列同一性百分比”通过以下来计算：在比较窗口内比较两个最佳比对的序列；确定相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、U)或相同的氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、lie、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、GIu、Asn、GIn、Cys和Met)出现在这两个序列中的位置的数量以产生匹配位置的数量；用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)；以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。出于本发明的目的，“序列同一性”可以理解为意指由DNASIS计算机程序(Windows2.5版；可从美国加利福尼亚州南旧金山的日立软体工程公司(Hitachi SoftwareEngineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA)获得)使用如软件随附的参考手册中使用的标准默认值计算的“匹配百分比”。氨基酸序列同一性也可以使用可从作为欧洲分子生物学实验室(the European Molecular Biology Laboratory)的一部分的欧洲生物信息学研究所(The European Bioinformatics Institute，EMBL-EBI)获得的EMBOSS成对比对算法工具来确定。此工具可在位于www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/的网站上获得。此工具利用尼德曼-翁施全局比对算法(Needleman-Wunsch globalalignment algorithm)(Needleman和Wunsch,1970)。使用默认设置，所述默认设置包含空位开放：10.0和空位延伸0.5。默认矩阵“Blosum62”用于氨基酸序列和默认矩阵。

术语序列“相似性”是指相同或构成如下表1所定义的保守氨基酸取代的氨基酸的数量百分比。相似性可以使用序列比较程序，如GAP(Deveraux等人,1984,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》12:387-395)来确定。以此方式，可能通过在比对中插入空位来比较与本文引用的序列长度类似或基本上不同的序列，此类空位例如通过由GAP使用的比较算法来确定。

APCMS肽可以是与本公开的肽具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中的任何可衍生范围)的肽。肽或多肽可以具有一种或多种保守或非保守的取代。取代变体通常含有蛋白质内的一个或多个位点处的一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以被设计成调节多肽的一个或多个特性，无论是否丧失其它功能或特性。取代可以是保守的，也就是说，一个氨基酸被具有类似形状和电荷的氨基酸替代。保守取代是本领域众所周知的并且包含例如以下改变：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。可替代地，取代可以是非保守的，使得影响多肽的功能或活性。非保守改变通常涉及用化学上不类似的残基取代残基，如极性或带电氨基酸取代非极性或不带电氨基酸，并且反之亦然。指示取代列于表2和3中。

本文中描述的PCMS抗原或肽可以包含在本公开的肽的至少或至多3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个或104个连续氨基酸或其中的任何可衍生范围内的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个(或其中的任何可衍生范围)变体氨基酸。

如本文所述的多肽区段可以包含本公开的肽的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个或更多个连续氨基酸或其中的任何可衍生范围。

本文所述的PCMS肽的固定长度可以为至少、至多或确切5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个或更多个氨基酸(或其中的任何可衍生范围)。

免疫细胞类型

针对子孢子抗原的抗体通常由IgG1和IgG3亚类主导(Irani,V.等人人IgG亚类的分子特性和其对设计针对感染性疾病的治疗性单克隆抗体的意义(Molecular propertiesof human IgG subclasses and their implications for designing therapeuticmonoclonal antibodies against infectious diseases)《分子免疫学(MolecularImmunology)》(2015)。这些亚类具有与FcγR相互作用的强大潜力，这表明FcγR介导的机制对子孢子也可能是重要的。IgG1和IgG3也具有很强的修复和激活补体的潜力。目前，对疟原虫子孢子的免疫的这些潜在机制知之甚少。

主要的吞噬细胞类型是单核细胞和中性粒细胞，所述单核细胞和所述中性粒细胞分别占外周白细胞的2-10％和45％-70％。单核细胞和中性粒细胞两者也都通过表达激活标志物、细胞因子和趋化因子而具有更广泛的免疫效应(综述于Gordon,S.吞噬作用：免疫生物学过程(Phagocytosis:An Immunobiologic Process)《免疫力(Immunity)》44,463-475(2016))。自然杀伤(NK)细胞也通过与在其表面上表达的FcγRIIIa相互作用而对经调理的病原体活跃。

除了吞噬作用外，中性粒细胞和自然杀伤(NK)细胞还可以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀死细胞(Kolaczkowska,E.和Kubes,P.健康与炎症中的中性粒细胞募集和功能(Neutrophil recruitment and function in health and inflammation)《自然免疫学评论(Nat Rev Immunol)》13,159-175(2013))。

FcγR表达模式在单核细胞与中性粒细胞之间不同，这会影响其免疫功能。

由于子孢子代表启动疟疾感染的第一步，因此子孢子通常将遇到处于静息或体内平衡状态而不是激活状态的潜在吞噬细胞。静息期单核细胞主要表达FcγRI和FcγRIIa，其中一小子集表达FcγRIIIa。相比之下，静息期中性粒细胞表达FcγRIIa和FcγRIIIb以及低水平的FcγRIIIa。

IgG亚类、糖基化和表位特异性可能各自影响与不同FcγR的相互作用以及固定和激活补体的能力。

了解由有效的功能性抗体靶向的CSP的特异性区和表位可以为开发更有效的疫苗开辟新的途径。

在本申请之前的工作中，研究了抗体与各种细胞类型上的Fcγ受体(FcγR)相互作用的能力以及其促进疟疾寄生虫的调理素吞噬作用或直接寄生虫细胞毒性的能力。

提出定义FcγR介导的靶向子孢子的机制以及主要的疫苗抗原CSP将揭示可以用于增强基于子孢子的疫苗的保护性疗效的新见解。本文描述和实现的结果揭示了特异性FcγR和中性粒细胞在通过特异性N末端表位介导子孢子的抗体依赖性调理素吞噬作用中的重要作用。针对N末端表位的抗体也可以促进补体结合，所述补体结合可以进一步有助于杀死子孢子。

本申请实现了疟疾疫苗或包括CSP N末端表位的免疫原性组合物、其抗体和筛选介导吞噬作用/子孢子细胞死亡的抗体的方法。

本申请还提供了包括本文所述的PCMS肽的试剂盒或表面。本申请考虑了呈冻干或干燥形式或呈溶液、凝胶或基质形式的PCMS肽。

本公开部分基于以下发现：相对于全长CSP、CT和NANP亚区，CSP的NT区内含有更高浓度的用于吞噬作用的抗体表位，并且针对这些表位的抗体在体内具有功能活性。这一发现允许采用不同的方法来筛选疫苗候选物，并且已鉴定到所关注的表位，所述表位提供一系列包括和/或编码这些表位的基于DNA、多肽、细胞或颗粒的疫苗。

因此，一方面，本公开提供了一种免疫原性组合物，其包括或编码经修饰的PfCSP或其片段，所述经修饰的PfCSP或其片段包括刺激抗体应答的N末端表位，所述抗体应答刺激受试者体内的子孢子调理和免疫细胞介导的清除。

基于在哺乳动物HEK293F细胞系中表达的3D7等位基因恶性疟原虫CSP(XP_001351122)产生重组CSP蛋白。CSP含有397个氨基酸并且可以被划分为若干个结构域：N末端信号肽(氨基酸1-18)、在位置25处含有游离半胱氨酸残基的N末端结构域(氨基酸19-104)、由4个NVDP和38个NANP重复序列组成的中央重复区(氨基酸105-272)以及在Cys-374处含有预测的GPI锚Ω位点的C末端结构域(氨基酸273-398)。

衍生物还包含在最佳比对后在比较窗口内具有氨基酸或多核苷酸序列同一性百分比的分子。在一个实施例中，同一性百分比为至少80％-99％，包含如本文进一步讨论的介于80与99之间的任何数字。

用于肽或表位或包括其的构建体或子孢子的生物活性的合适测定是熟练技术人员已知的，并且描述于实例和附图中。

VLP技术是本领域已知的向免疫系统呈递抗原的技术。抗原可以以包括呈递抗原的VLP的组合物的形式施用，所述抗原包含HBV载体，如人或鸭HBV载体。

在一些实施例中，具有肽或构建体活性或具有诱导有效吞噬/细胞毒性效应的能力的替代性或另外的标志物包含：寄生虫细胞死亡、中性粒细胞活性、抗体特异性测定等。

编码PCMS抗原或肽的全部或部分的核酸可以含有以下连续核酸序列：编码本文描述或引用的一个或多个氨基酸序列的多核苷酸中的10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、441个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、610个、620个、630个、640个、650个、660个、670个、680个、690个、700个、710个、720个、730个、740个、750个、760个、770个、780个、790个、800个、810个、820个、830个、840个、850个、860个、870个、880个、890个、900个、910个、920个、930个、940个、950个、960个、970个、980个、990个、1000个、1010个、1020个、1030个、1040个、1050个、1060个、1070个、1080个、1090个、1095个、1100个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、5500个、6000个、6500个、7000个、7500个、8000个、9000个、10000个或更多个核苷酸、核苷或碱基对，包含其间的所有值和范围。还考虑了特定多肽可以由含有具有略微不同核酸序列，但尽管如此编码相同或基本上类似的蛋白质的变体的核酸进行编码。密码子优化策略是本领域已知的。

在具体实施例中，本申请提供了并入编码本公开的肽的核酸序列的分离的核酸片段和载体。术语“重组”可以与多核苷酸或多肽结合使用，并且通常是指在体外产生和/或操纵或作为此类分子的复制产物的多肽或多核苷酸。

本公开中使用的核酸片段可以与其它核酸序列(如启动子、聚腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段等)组合，使得其总长度可以显著变化。因此，设想可以采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地受限于制备的容易性和在预期重组核酸方案中的使用。在一些情况下，核酸序列可以用另外的异源编码序列编码多肽序列，例如以允许多肽的纯化、运输、分泌、翻译后修饰，或用于治疗益处，如靶向或疗效。如上所讨论的，标签或其它异源多肽可以被添加到经修饰的多肽编码序列中，其中“异源”是指与经修饰的多肽不同的多肽。

在某些实施例中，本公开提供了与本文中公开的序列具有基本上同一性的多核苷酸变体；使用本文描述的方法(例如，使用标准参数的BLAST分析)，与本公开的多核苷酸序列相比，包括至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性(包含其间的所有值和范围)的多核苷酸变体。

本公开还考虑了与上述所有多核苷酸互补的多核苷酸的用途。多核苷酸可以被密码子优化以在宿主/受试者中表达。

用于在接受者细胞中表达如本文所述的PCM抗原的构建体或载体可以包括一个或多个DNA区，所述一个或多个DNA区包括与编码肽的核苷酸序列可操作地连接的启动子。启动子可以是诱导型或组成型的。合适的组成型启动子的实例包含例如即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸生长因子-1a(EF-1a)基因启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。诱导型启动子的实例包含但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

表达构建体可以通过任何合适的方法(包含重组或合成技术)利用本领域已知和可用的一系列载体(如质粒、噬菌体、杆状病毒、哺乳动物病毒、人工染色体等)产生。表达结构可以是环状的或线性的，并且应适于复制和整合到真核生物中。可用作载体的病毒包含但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。已经开发了多种基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可以使用本领域已知的技术将所选基因插入到载体中，并且包装到逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离并递送到受试者干细胞中。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。

在提供免疫原性组合物作为编码肽的核酸的特定实施例中，可以体内施用核酸以通过以下促进所述核酸的所编码蛋白质的表达：通过构建所述核酸作为适当核酸表达载体的一部分并且施用所述核酸使得其变为胞内(例如，通过使用逆转录病毒载体、通过直接注射、通过使用微粒轰击、通过涂覆脂质或细胞表面受体或转染剂或通过将所述核酸与同源盒样肽或其它胞内靶向部分连接施用)。

如本文所述的核酸分子可以呈任何形式，如DNA或RNA，包含体外转录的RNA或合成RNA。核酸包含基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子以及其修饰形式。核酸分子可以是单链或双链，并且线性或共价闭合以形成圆。RNA可以通过稳定序列、封端和聚腺苷酸化进行修饰。RNA或DNA可以作为质粒递送以表达肽。基于RNA的方法通常是可用的。

术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基并且优选地完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2'-位置具有羟基基团的核苷酸。术语包含双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及经修饰的RNA，所述RNA通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同。此类改变可以包含添加非核苷酸材料，如添加到RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可以包括非标准核苷酸，如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以被称作类似物或天然存在的RNA的类似物。

经优化的基于mRNA的组合物可以包括5'和3'非翻译区(5'-UTR，3'-UTR)，所述非翻译区优化如本领域已知的翻译效率和胞内稳定性。编码结构1的RHIM相互作用肽的开放式阅读框。在一个实施例中，可以通过用磷酸酶处理RNA来去除未封端的5'-三磷酸酯。RNA可以具有经修饰的核糖核苷酸以增加其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施例中，在RNA中，对于胞苷，5-甲基胞苷被部分或完全取代。在一个实施例中，术语“修饰”涉及提供具有5'-封端或5'-封端类似物的RNA。术语“5'-封端”是指在mRNA分子的5'-末端上发现的封端结构，并且通常由通过不寻常的5'到5'三磷酸酯连接与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施例中，此鸟苷在7-位置处被甲基化。术语“常规5'-封端”是指天然存在的RNA5'-封端，优选地7-甲基鸟苷封端。术语“5'-封端”包含类似于RNA封端结构的5'-封端类似物，并且被修饰成具有稳定RNA和/或增强RNA翻译的能力。提供具有5'-封端或5'-封端类似物的RNA可以通过在所述5'-封端或5'-封端类似物的存在下对DNA模板进行体外转录来实现，其中所述5'-封端共转录掺入产生的RNA链中，或者RNA可以例如通过体外转录产生，并且5'-封端可以使用封端酶，例如，牛痘病毒的封端酶，在转录后连接到RNA。

RNA的另外的修饰可以是天然存在的poly(A)尾部的延伸或截短或5'或3'非翻译区(UTR)的改变，如引入与所述RNA的编码区无关的UTR，例如，将现有的3'-UTR与源自珠蛋白基因(如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白)的3'-UTR的一个或多个，优选地两个拷贝进行交换或插入所述拷贝。具有未经掩蔽的poly-A序列的RNA比具有经掩蔽的poly-A序列的RNA更有效地进行翻译。为了增加RNA的稳定性和/或表达，其可以被修饰以与poly-A序列结合存在，所述序列的长度优选地为10个至500个，更优选地30个至300个，甚至更优选地65个至200个，并且尤其是100个至150个腺苷残基。为了增加RNA的表达，可以在编码区内对其进行修饰，以增加GC含量，以增加mRNA稳定性并进行密码子优化，并且因此增强细胞中的翻译。经修饰的mRNA可以酶促合成并包装到纳米颗粒，如脂质纳米颗粒中，并例如，肌肉内施用。

核酸分子可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中、胶体药物递送系统(例如脂质体、微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中。此类技术在本领域是已知的，并在《雷明顿：药学科学与实践(Remington,the Science and Practice ofPharmacy)》,第20版,Remington,J编辑(2000)以及其更新中广泛公开。

本申请扩展到含有主题肽或其编码核酸分子的宿主细胞。如本文所使用的，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换地使用。所有这些术语也包含其子代，即任何和所有的后代。应理解的是，由于有意或无意的突变，所有子代可能不相同。在表达异源核酸序列的上下文中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且所述宿主细胞包含任何能够复制载体或表达由载体编码的异源基因的可转化生物体。宿主细胞可以并且已经被用作载体或病毒的接受者。宿主细胞可以被“转染”或“转化”，这是指外源性核酸(如重组蛋白编码序列)被转移或引入到宿主细胞中的过程。经转化的细胞包含原代受试者细胞和其子代。

宿主细胞可以源自原核生物或真核生物，包含细菌、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，以复制载体或表达核酸序列的部分或全部。许多细胞系和培养物可用作宿主细胞，并且其可以通过美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC)获得，其是充当活培养物和遗传材料档案的组织(www.atcc.org)。

存在包括上文讨论的组合物的至少一部分或全部的许多表达系统。基于原核生物和/或真核生物的系统可以用于与本发明一起使用以产生核酸序列或其同源肽。许多此类系统是可在商业上和广泛获得的。

昆虫细胞/杆状病毒系统可以产生高水平的异源核酸片段的蛋白质表达，如美国专利5,871,986、4,879,236中所述，两者均通过引用并入本文，并且可以例如以来自赛默飞世尔公司(ThermoFisher)的名称

杆状病毒表达系统和来自

的BacPAK^TM杆状病毒表达系统购买。

此外，表达系统的其它实例包含

完全控制诱导型哺乳动物表达系统，所述表达系统涉及合成蜕皮激素诱导型受体或其pET表达系统，即大肠杆菌(E.coli)表达系统。诱导型表达系统的另一个实例可从

获得，其携带T-REx^TM(四环素调节表达)系统，即使用全长CMV启动子的诱导型哺乳动物表达系统。

还提供了酵母表达系统，所述酵母表达系统被设计用于高水平产生毕赤酵母属(yeast genusPichia)中的重组蛋白。本领域的技术人员将知道如何表达载体，如表达构建体，以产生核酸序列或其同源肽。

治疗和施用

根据本公开，主题组合物或药物组合物或其药学上可接受的盐、水合物、互变异构体、立体异构体、前药可以被施用。

对于组合疗法，组合疗法的每个组分可以同时、或按任何顺序依次或在不同的时间施用，以提供所期望的效果。可替代地，所述组分可以在单个剂量单位中共同作为组合产物。当单独施用时，可以优选的是通过相同或不同的施用途径施用的组分。施用可以通过施用抗原或表达抗原的多核苷酸进行，并且疫苗接种方案可以在蛋白质与核酸之间交替。

组合物可以通过注射、通过局部或粘膜应用、通过吸入或通过口服途径(包含改良的释放模式)在一定时间段内并且以有效影响或优化IgG亚类应答，优选地减少可能抑制FcγR相互作用的IgM应答的量递送。施用可以是全身性的(例如，肠胃外，通过例如静脉内、腹膜内、皮内、皮下或肌肉内途径)或靶向的。

要施用的肽、组合物、VLP或疫苗的量可以通过标准临床技术由本领域内的平均技术人员确定。另外，可以任选地采用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。所采用的精确剂量还将取决于药剂的性质和其它临床因素(如受试者的病状、其体重、施用途径和组合物类型)。要在治疗上或预防上有效且无害的精确剂量可以由本领域技术人员确定。药物组合物根据常规药物配制技术进行方便地制备。参见例如《雷明顿：药学科学与实践》,第20版,Remington,J.编辑(2000)以及较新的版本。

然而，用于静脉内施用本发明的肽的合适的剂量范围通常为约1.25-5微克活性化合物/千克(Kg)体重。用于鼻内施用的合适剂量范围通常为约0.01pg/kg体重到1mg/kg体重。可以根据源自体外或动物模型测试系统的剂量-应答曲线来外推有效剂量。栓剂通常含有范围为0.5重量％至10重量％的活性成分；口服组合物优选地含有10％至95％的活性成分。

在另一个实施例中，本发明提供了一种在受试者或患者体内诱发体液或细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包括本文公开的抗原的组合物。

术语“治疗”是指关于在至少一些受试者的疟疾的一种或多种症状或发生疟疾晚期症状的风险或传播疟原虫属(Plasmodium sp.)的风险中的任何可测量的或统计学上显著的改善。

术语“预防”和“预防”等可互换使用，并且包含将本发明的组合物施用于未知感染疟原虫属的受试者，以预防或减轻随后的感染或降低被感染的风险或减轻与疟原虫感染相关的病状的严重程度或发作或病状的标志。

疫苗组合物的施用通常用于预防目的。组合物的预防性施用用于预防或减轻任何随后的感染。“药理学上可接受的”组合物是接受者患者耐受的一种组合物。考虑了施用有效量的疫苗。“有效量”是足以实现所期望的生物效应，如诱导足够的体液免疫或细胞免疫的量。这可能取决于疫苗的类型、接受者的年龄、性别、健康状况和体重。期望的生物学效应的实例包含但不限于产生无症状、减轻症状、降低组织中寄生虫滴度完全防止感染和部分保护。在一些实施例中，如果本发明的疫苗或组合物的存在引起接受者患者的生理学发生可检测的变化，所述变化增强或表明至少一种针对疟原虫物种或毒株的原发性或继发性体液或细胞免疫应答增强，那么本发明的疫苗或组合物在生理学上是显著的。

“药学上可接受的载体和或稀释剂”是包含在其它方面并非不合需要，即其本身或与活性组合物不太可能引起实质性不良反应的材料的药物媒剂。载体可以包含所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌剂和抗真菌剂、用于调整张力、增加或降低吸收或清除率的试剂、用于维持pH的缓冲剂、螯合剂、膜或屏障穿越剂。药学上可接受的盐是在其它方面并非不合需要的盐。药剂或包括药剂的组合物可以以药学上可接受的无毒盐的形式，如酸加成盐或金属络合物进行施用。

对于口服施用，可以将组合物调配成固体或液体制剂，如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、粉末、混悬剂或乳剂。在制备口服剂型的组合物时，在口服液体制剂(例如混悬剂、酏剂和溶液)的情况下，可以使用例如水、乙二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂、助悬剂等；或在口服固体制剂(例如粉末、胶囊和片剂)的情况下，可以使用载体，如淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等任何常用的药物介质。片剂和胶囊由于其施用简易性而代表了最有利的经口单位剂型，在所述情况下显然使用固体药物载剂。片剂可能含有粘合剂，如黄芪胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂，如海藻酸；以及润滑剂，如硬脂酸镁。如果需要，片剂可以通过标准技术进行包糖衣或包肠衣。可以将活性组合物包囊以使其稳定地通过胃肠道。参见例如国际专利公开第WO 96/11698号。

对于肠胃外施用，组合物可以溶解在载体中并作为溶液或悬浮液进行施用。对于经粘膜或经皮(包含贴片)递送，本领域已知的适当的渗透剂用于递送组合物。对于吸入，递送使用任何方便的系统，如干粉气雾剂、液体递送系统、空气喷射雾化器、推进剂系统。例如，调配物可以以气溶胶或雾的形式施用。组合物也可以以持续递送或缓释形式进行递送。例如，可生物降解的微球或胶囊或其它能够持续递送的聚合物配置可以包含在调配物中。可以修改调配物以改变药代动力学和生物分布。对于药代动力学的一般讨论，参见例如《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,1990(同上)。在一些实施例中，调配物可以加入脂质单层或双层，如脂质体或胶团中。本领域已知的靶向疗法可以用于将药剂更特异性地递送至某些类型的细胞或组织。

也考虑了针对本文公开的PCMS NT CSP肽产生的抗体，如单克隆抗体或其衍生物或类似物，包含但不限于：Fv片段；单链Fv(scFv)片段；Fab'片段；F(ab')2片段；人源化抗体和抗体片段；骆驼化抗体和抗体片段；以及前述的多价版本。也可以酌情使用多价结合试剂，包含但不限于：单特异性或双特异性抗体；如二硫键稳定的Fv片段、scFv串联(scFv)片段、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体，其通常是共价连接的或以其它方式稳定的(即亮氨酸拉链或螺旋稳定的)scFv片段。

如本文所使用的，术语“抗体片段”包含保留与由全长抗体识别的表位结合的能力的抗体的任何部分。抗体片段的实例包含但不限于Fab、Fab'和F(ab')₂、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(dsFv)以及包括V_L或V_H区的片段。抗体的抗原结合片段可以仅包括可变区或与铰链区、CH1、CH2、CH3或其组合的一部分的组合。优选地，抗体片段含有整个抗体的所有六个CDR，即使含有少于所有六个CDR的片段也可能是功能性的。

“单链FV”(“scFv”)是抗原结合片段，所述抗原结合片段含有与单个多肽中的抗体的轻链可变区(V_L)连接的抗体的重链可变区(V_H)，但缺乏抗体的恒定结构域中的一些或全部。V_H与V_L之间的连接可以通过短而灵活的肽来实现，所述肽被选择以确保V_L与V_H区的适当三维折叠发生，以维持scFv所源自的整个抗体的靶分子结合特异性。scFv缺乏抗体的恒定结构域中的一些或全部。

制备抗原或表位特异性结合剂(包含抗体以及其衍生物和类似物和适配体)的方法是本领域众所周知的。多克隆抗体可以通过免疫动物来产生。单克隆抗体、衍生物和类似物可以根据标准方法进行制备。

本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。这些技术是本领域众所周知的，并详细描述于以下方法论述中，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第3版,第1-3卷,Sambrook等人编辑,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.),(2001)；以及《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,Ausubel等人编辑,纽约的格林出版社和威利国际科学出版社(Greene Publishing and Wiley-Interscience,NewYork),(1992)(定期更新)。免疫学技术是本领域众所周知的，并详细描述于以下方法论述中，如《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》,Coligan等人编辑,纽约的格林出版社和威利国际科学出版社,(1992)(定期更新)；《免疫学进展(Advances inImmunology),第93卷,Frederick W.Alt编辑,马萨诸塞州伯灵顿的学术出版社(AcademicPress,Burlington,Mass.),(2007)；《制备和使用抗体：实验手册(Making and UsingAntibodies:APractical Handbook)》,Gary C.Howard和Matthew R.Kaser编辑,佛罗里达州博卡拉顿的CRC出版社(CRC Press,Boca Raton,Fl)(2006)；《医学免疫学(MedicalImmunology)》,第6版,Gabriel Virella编辑,英国伦敦的英富曼医疗保健出版社(InformaHealthcare Press,London,England),(2007)；以及Harlow和Lane《抗体：实验室手册(ANTIBODIES:A Laboratory Manual)》,第二版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社,(2014)。基因转移和基因疗法的常规方法也可以适于用于本发明。参见例如《基因疗法：原理与应用(Gene Therapy:Principles and Applications)》,T.Blankenstein编辑,施普林格出版社(Springer Verlag),1999；《基因疗法方案(分子医学方法)(Gene TherapyProtocols(Methods in Molecular Medicine))》,P.D.Robbins编辑,胡马纳出版社(Humana Press),1997；《用于基因疗法的病毒载体：方法和方案(Viral Vectors for GeneTherapy:Methods and Protocols)》,Otto-Wilhelm Merten和Mohammed Al-Rubeai编辑,胡马纳出版社,2011；以及用于基因疗法的非病毒载体：方法和方案(Nonviral Vectorsfor Gene Therapy:Methods and Protocols),Mark A.Findeis编辑,胡马纳出版社,2010《氨基酸(Amino Acids)》2018年1月；50(1):39-68.doi:10.1007/s00726-017-2516-0.电子版2017年11月28日。可以通过本领域已知的任何方法产生肽。肽和其编码核酸可以通过本领域已知的许多不同的策略进行修饰，以改变其稳定性、结合、活性或可检测性、表达、穿透细胞的能力等。肽和其核酸可以合成产生并且可以通过应用众所周知的重组核酸技术获得。肽可以使用常规的液相或越来越多的固相合成技术合成。例如，可以初步参考溶液合成或固相合成，例如，Atherton和Sheppard,《固相肽合成：一种实用的方法(SOLID PHASEPEPTIDE SYNTHESIS:A PRACTICAL APPROACH)》(英国牛津的牛津大学IRL出版社(IRLPress at Oxford University,Oxford,England),1989)，具体参见第9章，或Roberge等人(1995《科学(Science)》269:202)中描述的。

本文已经鉴定到中性粒细胞在清除血液中的子孢子的关键作用，其通过FcγRIIa和FcγRIII与靶向IgG1和IgG3的主要子孢子抗原、CSP以及具体地本文定义的N末端区相互作用来介导。本申请描述了FcγRIIa和FcγRIII在这种免疫机制中的关键作用以及具体地FcγRIII的重要性。针对CSP的抗体以及具体地本文描述的N末端表位促进通过FcγRIIIa介导的NK细胞活性。

使用完整的子孢子和抗原涂覆的珠已确定，全血中的吞噬作用主要是由中性粒细胞以用单核细胞观察到的低水平活性介导的。

通过评估阻断FcγR对细胞表面的影响并且通过使用新型FcγR二聚体作为探针结合抗原-抗体复合物，已经鉴定到涉及吞噬作用的关键机制。

CSP是这些功能性抗体的主要靶标，并且示出CSP的所有三个区都可以被抗体靶向以接合FcγR并促进调理素吞噬作用。具体地，针对NT区的抗体在一系列不同的测定中具有最大的活性，从而提供如本文所述的新疫苗构建体。

此外，本文公开了来自居住在疟疾流行地区的个体的天然获得的抗体能够促进子孢子的调理素吞噬作用。功能性抗体的获得是年龄依赖性的，并且仅通过来自成人而非幼儿的样品观察到更高水平的调理素吞噬活性以及FcγRIIa和FcγRIII的结合。功能活性与IgG1和IgG3亚类相关。

在接种到皮肤中之后，子孢子行进穿过真皮，并且在血流中循环，之后到达肝窦并实现肝细胞侵袭。在这个可能需要若干个小时的过程期间，大量暴露于中性粒细胞，血液中最丰富的是吞噬细胞，随后是单核细胞和NK细胞。此处关于外周血中的中性粒细胞在体外有效吞噬抗体调理的子孢子的证实表明这是在体内发生的机制。子孢子也暴露于真皮巨噬细胞和肝库普弗细胞(Kupffer cell)，这涉及FcγR介导的清除的另外的机制。

中性粒细胞的较高的吞噬活性，而单核细胞的非常低水平的活性可能与不同FcγR的存在和使用有关；应注意的是，中性粒细胞具有更大的吞噬率，这不仅仅是通过与单核细胞相比中性粒细胞的更高丰度来解释的。调理素吞噬作用是通过交联吞噬细胞的表面上的FcγR引发的，并且中性粒细胞和单核细胞在其表面上表达不同的FcγR。在研究中，专注于静息期单核细胞和中性粒细胞，因为子孢子在感染过程期间触发的免疫激活最小。静息期单核细胞表达FcγRI和FcγRIIa，其中单核细胞的仅一小子集也表达FcγRIIIa。另一方面，静息中性粒细胞表达FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb(Golay等人2019)。有趣的是，阻断FcγRIIa或FcγRIIIa/b抑制了中性粒细胞的吞噬活性，这表明这两种受体都是吞噬作用所需的，这通过使用组合使用的针对FcγRIIa和FcγRIII的阻断抗体实现较大抑制来支持。阻断FcγRI对中性粒细胞的吞噬作用没有影响。若干个观察表明FcγRIII的重要性更高；在多因素分析中，与FcγRIIa相比，FcγRIII阻断对子孢子吞噬作用的抑制作用普遍更大，并且通过抗体的FcγRIII结合与吞噬作用更高度相关。

GPI锚定的FcγRIIIb是在中性粒细胞上表达的最丰富的FcγRIII类型，但中性粒细胞也表达FcγRIIIa，其具有用于胞内信号传导的跨膜和胞质结构域。对于吞噬作用，胞内信号传导可以通过FcγRIIIa或FcγRIIa进行，其中与FcγRIIIb的结合也很重要，如通过发现所表明的。在THP-1细胞的情况下，通过阻断FcγRI有效抑制吞噬作用，但在阻断FcγRIIa或FcγRIII的情况下观察到最小的抑制。这表明THP-1细胞的吞噬作用主要由FcγRI介导。如果FcγRIII和FcγRIIa在吞噬作用中协同作用，那么这可以解释为什么FcγRIIa在单核细胞吞噬作用中的活性有限。NK细胞表达FcγRIIIa，并且确定针对CSP的抗体可以通过与FcγRIIIa相互作用来促进NK激活。

在FCS(但不包含人血清)的情况下使用标准条件，关于疟疾中的抗体介导的调理素吞噬作用的现有研究主要使用THP-1细胞系作为模型。最近的研究报告，在未感染疟疾的成人的RTS,S I/IIa期试验中，THP-1细胞的调理素吞噬作用与保护无关。本申请示出，THP-1细胞的吞噬作用主要通过FcγRI介导，从而突出与中性粒细胞相比功能机制的差异。此外，人血清中的非特异性IgG也可以降低THP-1细胞吞噬活性，因为FcγRI相互作用被人血浆中呈递的单体IgG抑制。因此，使用THP-1细胞似乎不是研究针对子孢子的调理素吞噬作用的好方法。

CSP是子孢子中最丰富的抗原以及主要的疫苗抗原。本申请示出，CSP的所有三个区(NT、CT和中央重复区)都可以被抗体靶向，所述抗体接合FcγRIIa和FcγRIII，以促进中性粒细胞对子孢子的吞噬作用，从而为针对这些区的抗体赋予可能促进免疫的新功能。具体地，本文所述的针对NT区的抗体的FcγR介导的功能潜力高于其它区，如在将抗原涂覆到珠上的情况下使用人抗体的吞噬测定、针对不同区提出的兔抗体对子孢子的吞噬作用以及人抗体对不同CSP区的FcγR结合所观察到的。这些发现表明，在疫苗设计中更关注于NT区将是有价值的；基于CSP的RTS,S或R21疫苗均不包含NT区；两种疫苗都仅含有CSP的中央重复序列(NANP重复序列)和CT区。最近研究示出，在涉及婴儿和幼儿的RTS,S III期试验中，针对中央重复区和CT区的抗体都与疫苗疗效相关。

此处关于促进中性粒细胞的FcγR介导的吞噬作用的抗体是通过暴露于疟疾而自然获得的发现进一步示出这是在体内发生的机制。在疟疾传播率高的情况下，已示出在最有风险感染并且患上重度疟疾的幼儿中，这些功能性抗体非常低，但在一些终生暴露的成人中，这些功能性抗体以相对较高的水平存在。值得注意的是，与促进血期裂殖子的吞噬作用的抗体相比，针对CSP的功能性抗体获得要慢得多，并且需要更大的暴露才能发生。使用FcγR二聚体作为探针，本申请证实针对CSP获得的抗体可以促进与FcγRIIa和FcγRIII的相互作用。每个受体的相对活性水平在个体之间显著变化，这可能会影响吞噬活性。特异性FcγR结合的变化将受到IgG亚类谱、抗体所靶向的表位以及IgG糖基化的影响(Irani,V.等人人IgG亚类的分子特性和其对设计针对感染性疾病的治疗性单克隆抗体的意义(Molecular properties of human IgG subclasses and their implications fordesigning therapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases)《分子免疫学(Molecular Immunology)》(2015))。具有最高的FcγR结合活性的IgG1和IgG3在获得的IgG亚类中占主导地位，并与FcγR结合活性相关。

先前的研究还证实，针对子孢子的抗体可以作为介导免疫的潜在机制抑制子孢子运动性、细胞穿越和肝细胞侵袭。然而，目前没有一致的证据示出这些机制与预防疟原虫感染相关。在动物的被动免疫模型中，针对CSP的高水平的IgG可以预防实验性感染。然而，在临床试验中，疫苗诱导的抗体尚未实现类似的持续一定时间段的高水平保护。

RTS,S诱导非常高的CSP IgG水平，但仅提供适度的保护，从而表明需要新的策略来产生具有更高功能性保护活性的抗体。

本申请利用FcγR介导的机制，以通过疫苗产生更有效的免疫以进行更高水平的预防。

本申请描述了一种用于研究针对CSP(即恶性疟原虫子孢子的关键免疫靶标)的抗体的调理素吞噬活性的平台筛选。此平台使得能够筛选目前公开的功能性抗体应答。

研究这些功能性抗体的诱导以及其与预防的相关性的未来研究有必要在RTS,S和其它基于CSP的疫苗的II期和III期试验中进行。在RTS,S疫苗接种的I/IIa期试验中进行初步研究，随后在健康的未感染疟疾的成人中进行实验性感染挑战(Kester,K.E.等人在未感染疟疾的成人中的恶性疟疾疫苗RTS,S/AS01B和RTS,S/AS02A的随机、双盲、2a期试验：安全性、疗效和与预防相关的免疫学(Randomized,double-blind,phase 2a trial offalciparum malaria vaccines RTS,S/AS01B and RTS,S/AS02A in malaria-naiveadults:safety,efficacy,and immunologic associates of protection)《传染病杂志(JInfect Dis)》200,337-346(2009))。这项初步研究确定，RTS,S疫苗接种确实诱导针对CSP的抗体，所述抗体促进FcγRIIa和FcγRIII的结合以及中性粒细胞的吞噬作用，并且这些功能活性与预防感染相关，从而提供了有用的基线。

本说明书公开了FcγR介导的机制在清除血液中的子孢子方面的重要性。本公开示出了中性粒细胞在子孢子吞噬清除中的关键作用，定义了FcγRIIa和FcγRIII的重要作用，并将CSP确定为此功能活性的关键靶标。单核细胞也有助于吞噬作用，但活性较低，并且抗体也可以促进NK细胞ADCC活性。本说明书确定了针对CSP的NT区的抗体的更高的功能活性，所述抗体未包含在RTS,S疫苗中。此外，还描述了针对CT区的抗体的新功能活性，这些活性与RTS,S疫苗试验中的预防有关(Dobano,C等人针对不同环子孢子表位的抗体的浓度和亲合力与RTS,S/AS01E疟疾疫苗疗效相关(Concentration and avidity of antibodiesto different circumsporozoite epitopes correlate with RTS,S/AS01Emalariavaccine efficacy)《自然通讯(Nat Commun)》10,2174(2019))。了解和定义介导免疫的机制对于使得能够开发更有效的疫苗至关重要。在疫苗开发中利用这种免疫机制和新靶标提供了产生更有效免疫应答的策略，所述策略提供更高水平的子孢子破坏和随后对疟疾的预防。

涵盖了以下实施例：

在一个实施例中，CSP N末端(NT)肽是PCMS抗原或表位，所述PCMS抗原或表位促进受试者抗体依赖性吞噬作用或补体介导的子孢子杀伤(PCMS)。具体地，这些肽或表位定位于CSP的N末端部分内，与先前描述的肝细胞受体结合区(R1)相比，主要具有更多的N末端。因此，基于PCMS的N末端CSP抗原被描述并提议用于针对疟疾的疫苗接种或预防或治疗疟疾的方案。

在一个实施例中，基于PCMS的N末端CSP抗原被描述并提议用于诱导针对恶性疟原虫(Pf)子孢子的抗体的方案，所述方案有效降低子孢子的水平。本文中描述了针对NT CSP肽提出的抗体诱导或促进抗体依赖性吞噬作用或补体介导的子孢子杀伤。

此外，在一个实施例中，与用CT和/或NANP肽相比，用NT CSP肽诱导增强的PCMS应答。在一个实施例中，表示CSP的CSP NT亚区但不表示(或基本上不表示)CT或NANP中央重复区的CSP NT肽与表示CSP的C末端(CT)和/或中央重复肽(NANP)亚区的第二肽共同施用。

在一个实施例中，表示CSP的CSP NT亚区但不表示CT或NANP中央重复区的CSP NT肽与表示CSP的C末端(CT)和/或中央重复肽(NANP)亚区的第二或另外的肽共同施用，其中肽序列一起存在于同一抗原中。

在一个实施例中，肽的共同施用可以同时进行，如表示PfCSP的不同亚区的两种肽存在于相同的施用组合物中，或者肽在同一时间单独地施用或在一定时间段内顺序地施用以诱导最佳免疫应答。时间段可以是一天、一周、两周、一个月或若干个月。

在一个实施例中，表示CSP的CSP NT亚区的CSP NT肽包括氨基酸，所述氨基酸将IgG抗体或PCMS呈递给受试者的免疫系统，从而诱导如本文所述的NT亚区的一部分。在一个实施例中，并且为了避免疑问，CSP NT肽不包括CT和/或NANP CSP亚区。

在一个实施例中，N末端PCMS抗原或肽包括DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ(SEQ ID NO:25)、或ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADG(SEQ ID NO:57)、或

KQENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDP(SEQ ID NO:1)或包括SEQID NO:25以及来自CSP NT序列的N末端或C末端连续氨基酸，SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:1，或来自不同(非3D7)毒株或变体的对应序列的肽。

在一个实施例中，除了NT CSP抗原/免疫原外，还使用呈递CSP的CT或NANP亚区的抗原，如RTS,S或R21疫苗中使用的抗原。虽然本申请描述了源自恶性疟原虫的PCMS抗原，但包括相同区的抗原可以源自其它疟原虫物种，如间日疟原虫(P.Vivax)。还提出了用于筛选抗原刺激PCMS能力的方法。对于本领域技术人员来说，如何实施本发明的概念和发明是显而易见的。

在一个实施例中，PCMS抗原包括来自CSP多肽的N末端氨基酸58至104(SEQ ID NO:1)的PCMS肽。在一个实施例中，肽包括来自CSP多肽的N末端氨基酸58至104的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个或47个、48个(或其中的任何可衍生范围)连续氨基酸。在一个实施例中，肽示出于SEQ ID NO:25或57中。

在一个实施例中，PCMS抗原或NT CSP抗原进一步包括T细胞辅助表位。

在一个实施例中，PCMS肽包括来自CSP多肽的N末端氨基酸58至81(SEQ ID NO:2)的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个连续氨基酸(来自说明性恶性疟原虫毒株3D7的氨基酸编号)。

在一个实施例中，PCMS肽包括来自CSP多肽的N末端氨基酸64至84(SEQ ID NO:3)的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个连续氨基酸。

在一个实施例中，肽包括来自CSP多肽的N末端氨基酸58至81的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个连续氨基酸，并且另外包括来自CSP多肽的N末端氨基酸82至104(SEQ ID NO:4)的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个连续氨基酸。

在一个实施例中，肽包括来自CSP多肽的N末端氨基酸64至84的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个连续氨基酸，其中至少3个连续氨基酸包含DDG或GNN，并且其中所述肽另外包括来自CSP多肽的N末端氨基酸76至100(SEQ ID NO:5)的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个连续氨基酸，其中至少3个连续氨基酸包含KPK并且不包含GNP。在一个实施例中，PCMS肽包括5至50个氨基酸或5至100个氨基酸。

在一个实施例中，PCMS肽序列与SEQ ID NO:1至5中的任一个具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％同一性。在一个实施例中，肽序列与SEQ ID NO:1至5中的任一个具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％同一性，和/或包括57至104的以下连续氨基酸序列中的至少一个或多个：DDG(SEQ ID NO:6)、GNN(SEQ ID NO:7)、DDGN(SEQ ID NO:8)、DDGNN(SEQ ID NO:9)、DDGNNE(SEQ ID NO:10)、DDGNNED(SEQ ID NO:11)、DDGNNEDN(SEQ ID NO:12)、DDGNNEDNE(SEQ ID NO:13)、DDGNNEDNEK(SEQ ID NO:14)、DDGNNEDNEKL(SEQ ID NO:15)、DDGNNEDNEKLR(SEQ ID NO:16)、DDGNNEDNEKLRK(SEQ ID NO:17)、DDGNNEDNEKLRKP(SEQ ID NO:18)、DDGNNEDNEKLRKPK(SEQ ID NO:19)、DDGNNEDNEKLRRKPKH(SEQ ID NO:20)、DDGNNEDNEKLRKPKHK(SEQ ID NO:21)、DDGNNEDNEKLRKPKHKK(SEQ ID NO:22)、DDGNNEDNEKLRKPKHKKL(SEQ ID NO:23)、DDGNNEDNEKLRKPKHKKLK(SEQ ID NO:24)、DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ(SEQ ID NO:25)、DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQP(SEQ ID NO:26)、

DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPA(SEQ ID NO:27)和

DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPAD(SEQ ID NO:28)。

在一个实施例中，肽序列与SEQ ID NO:1至5中的任一个具有至少70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％同一性，和/或包括58至104的以下连续氨基酸序列中的至少一个或多个：

KQENWYSLKKNSRSLGENDDGNN(SEQ ID NO:29)、

QENWYSLKKNSRSLGENDDGNN(SEQ ID NO:30)、KNSRSLGENDDGNN(SEQ ID NO:31)、NSRSLGENDDGNN(SEQ ID NO:32)、RSLGENDDGNN(SEQ ID NO:33)、SLGENDDGNN(SEQ ID NO:34)、LGENDDGNN(SEQ ID NO:35)、GENDDGNN(SEQ ID NO:36)、ENDDGNN(SEQ ID NO:38)以及NDDGNN(SEQ ID NO:39)。

在一个实施例中，主题PCMS抗原/肽中不存在CSP的C末端(CT)区。

在另一个实施例中，主题PCMS抗原中存在CSP的C末端区。

一方面，本申请公开了与针对CT区中的表位的抗体相比，针对CSP的N末端区的抗体促进了显著更高的相对吞噬活性。在一个实施例中提出，基于CSP的疫苗(如RTS,S疫苗)可以通过包含来自N末端结构域的中央区的PCMS肽来改进。在另一个实施例中，表示CSP的N末端部分的全部或部分的PCMS抗原被呈递给免疫系统以刺激受试者体内的有效应答。

在一个实施例中，本申请提供了一种免疫原性组合物，其包括经修饰的PfCSP或其N末端肽片段，所述经修饰的PfCSP或其N末端肽片段包括一个或多个刺激受试者体内的抗体应答的N末端表位，所述抗体应答刺激受试者体内的子孢子调理和免疫细胞介导的清除。提及经修饰的PfCSP意指非全长CSP，并且包含与天然存在的多肽相比截短的多肽，如N末端和/或C末端截短的多肽。

在一个实施例中，本申请提供了一种免疫原性组合物，其包括经修饰的PfCSP或其N末端肽片段，所述经修饰的PfCSP或其N末端肽片段各自包括一个或多个刺激受试者体内的抗体应答的N末端表位，所述抗体应答刺激受试者体内的子孢子调理和免疫细胞介导的清除。在一个实施例中，本申请提供了一种多核苷酸构建体，其编码经修饰的PfCSP或其N末端肽片段，所述经修饰的PfCSP或其N末端肽片段各自包括一个或多个刺激受试者体内的抗体应答的N末端表位，所述抗体应答刺激受试者体内的子孢子调理和免疫细胞介导的清除。多核苷酸包含如本文所描述和本领域已知的质粒、载体、表达载体、RNA、DNA、杂交体和经修饰形式。如本领域所知，多核苷酸可以用于在体外或体内表达抗原。

在一个实施例中，本申请提供了一种免疫原性组合物，其包括或编码经修饰的PfCSP或其N末端肽片段，所述经修饰的PfCSP或其N末端肽片段包括一个或多个刺激受试者体内的抗体应答的N末端表位，所述抗体应答刺激受试者体内的子孢子调理和免疫细胞介导的清除，并且其中所述N末端片段诱导与中性粒细胞和单核细胞上的Fcγ受体结合的基本上N末端CSP特异性抗体，并且诱导子孢子的抗体依赖性调理素吞噬作用或自然杀伤细胞的杀伤。

在一个实施例中，经修饰的PfCSP或PCMS抗原包括CSP的氨基酸59至327(SEQ IDNO:41)

QENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSGS。

在一个实施例中，PCMS抗原包括图14中的肽11至23中的一种或多种(SEQ ID NO:9至21)。具体地，肽13至15中的一种或多种或共享肽13至15内的连续序列/表位的肽。具体地，肽17至20或肽13至15内共享的连续序列/表位。表位定位是本领域已知的。本说明书描述了用于确定抗原促进PCMS的能力的方法。在本申请的一个实施例中，此类N末端部分或PCMS表位出乎意料地被针对N末端氨基酸58至104的抗体识别，并且其中至少一部分通过吞噬作用或补体介导的机制刺激子孢子杀伤。

因此，本申请的一个实施例提供了如上所述的PCMS抗原，所述抗原在哺乳动物受试者体内诱发针对CSP的N末端部分的抗体(包括氨基酸19至104(3D7))。在一个实施例中，所产生的抗体包含通过吞噬作用或补体介导的机制刺激疟原虫子孢子杀伤的抗体。

在一个实施例中提供了包括如本文所述的编码PCMS抗原的核酸分子的组合物。恶性疟原虫CSP(3D7/NF54毒株)的基因ID为PF3D7_0304600。有关恶性疟原虫CSP的序列的详细信息可在PlasmoDB(疟原虫基因组学资源)(plasmodb.org/plasmo/app/record/gene/PF3D7_0304600)上获得。

在另一个实施例中，提供了一种病毒或非病毒载体或包括PCMS抗原编码序列的病毒样颗粒。

在一个实施例中，提供了一种组合物，其包括或编码如本文所述的PCMS抗原。

在一个实施例中，本申请实现了一种药物组合物，其包括或编码如本文所述的PCMS抗原。在一个实施例中，组合物包括药学上可接受的稀释剂和/或载体。在一个实施例中，载体是纳米载体。合适的纳米载体描述于Kurtovic等人《免疫学前沿(Frontiers inImmunology)》第12卷,文章641421 2021年3月，所述文献并入本文。在一个实施例中，组合物可以包括佐剂。

在一个实施例中，CSP疫苗抗原的组合可以组合、同时或顺序施用。例如，基于C末端CSP的抗原和本发明的基于N末端PCMS的抗原可以同时或间隔开在相同或不同的组合物或载体中一起施用。

在一个实施例中，表示CSP的CT和NANP亚区的基于CSP的抗原包含RTS,S和/或R21疫苗候选物。

另一方面，本申请提供了一种治疗或预防疟疾或诱导功能性(例如，PCMS)免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包括如本文所述的肽抗原或其编码序列的组合物。

在一个实施例中，包括或编码NT区的全部或部分(如仅基于PCMS的N末端抗原)的组合物还包括或编码来自CSP的中央或CT区的抗原。在一个实施例中，不同的抗原在相同或不同的组合物中同时或间隔开施用。如图15所示，疫苗接种研究证实，RTS,S免疫原(包括CT和NANP亚区)与NT CSP肽免疫原的混合物有效产生针对CSP的所有3个区的IgG。

在另一个实施例中，本申请提供了如本文所述的供使用或在治疗或预防疟原虫感染时使用的组合物。

在另一个实施例中，本发明提供了如本文所述的PCMS抗原或肽或组合物在制备用于治疗或预防受试者的疟原虫感染或疟疾的药物中的用途。

本公开的任何方法或组合物都可以由以下组成或基本上由以下组成，而不是包括/包含/含有/具有以下：所描述的元件和/或特征和/或步骤中的任一个。因此，在任何权利要求中，术语“由……组成”或“基本上由……组成”可以取代上面提到的任何开放式连接动词，以便改变在其它方面将使用开放式连接动词的给定权利要求的范围。“基本上由所提及要素组成”的组合物排除了任何另外的活性成分，但不排除药物赋形剂、缓冲液、结构组分等。

本申请要求于2020年8月6日提交的澳大利亚临时专利申请2020902779的优先权的权益，所述澳大利亚临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。

还涵盖了以下编号的条款。

1.一种免疫原性或疫苗组合物，其包括促进抗体依赖性吞噬作用或补体介导的子孢子杀伤(PCMS)的PCMS抗原，所述PCMS抗原包括包含恶性疟原虫CSP多肽的N末端氨基酸58至104(SEQ ID NO:1)的PCMS肽、或来自毒株3D7的恶性疟原虫环子孢子多肽(CSP)多肽的N末端氨基酸58至104(SEQ ID NO:1)的3至48个连续氨基酸的PCMS肽或来自不同恶性疟原虫毒株/分离株的对应肽。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PCMS肽包括所述CSP多肽的N末端氨基酸58至81(SEQ ID NO:2)或来自所述CSP多肽的N末端氨基酸58至81(SEQ IDNO:2)的3至24个连续氨基酸。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述PCMS肽包括所述CSP多肽的N末端氨基酸64至84(SEQ ID NO:3)或来自所述CSP多肽的N末端氨基酸64至84(SEQ ID NO:3)的3至21个连续氨基酸。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述PCMS肽包括来自所述CSP多肽的所述N末端氨基酸58至81的3至24个连续氨基酸，并且另外包括来自所述CSP多肽的N末端氨基酸82至104(SEQ ID NO:4)的3至24个连续氨基酸。

5.根据权利要求1或3所述的组合物，其中所述PCMS肽包括来自所述CSP多肽的N末端氨基酸64至84的3至21个连续氨基酸，其中至少3个连续氨基酸包含DDG或GNN，并且其中所述肽另外包括来自所述CSP多肽的N末端氨基酸76至100(SEQ ID NO:5)的3至24个连续氨基酸，其中至少3个连续氨基酸包含KPK并且不包含GNP。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述PCMS肽包括5至50个氨基酸、或10至50个、或20至50个或5至100个氨基酸。

7.一种免疫原性或疫苗组合物，其包括促进抗体依赖性吞噬作用或补体介导的子孢子杀伤(PCMS)的PCMS抗原，所述PCMS抗原包括与SEQ ID NO:1至5中的任一个具有至少70％至100％同一性的PCMS肽序列，和/或包括来自氨基酸57至104的以下连续氨基酸序列中的至少一个或多个(SEQ ID NO:1)：DDG、GNN、DDGN、DDGNN、DDGNNE、DDGNNED、DDGNNEDN、DDGNNEDNE、DDGNNEDNEK、DDGNNEDNEKL、DDGNNEDNEKLR、DDGNNEDNEKLRK、DDGNNEDNEKLRKP、DDGNNEDNEKLRKPK、DDGNNEDNEKLRRKPKH、DDGNNEDNEKLRKPKHK、DDGNNEDNEKLRKPKHKL、DDGNNEDNEKLRKPKHKLK、DDGNNEDNEKLRKPKHKLKQ、DDGNNEDNEKLRKPKHKLKQP、DDGNNEDNEKLRKPKHKLKQPA和DDGNNEDNEKLRKPKHKLKQPAD。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述PCMS肽序列与SEQ ID NO:1至5中的任一个至少70％至100％相同，和/或包括来自58至104的以下连续氨基酸序列中的至少一个或多个(SEQ ID NO:1)：KQENWYSLKKNSRSLGENDDGNN、QENWYSLKKNSRSLGENDDGNN、KNSRSLGENDDGNN、NSRSLGENDDGNN、RSLGENDDGNN、SLGENDDGNN、SLGENDDGNN、LGENDDGNN、GENDDGNN、ENDDGNN和NDDGNN。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中主题PCMS抗原中不存在CSP的C末端(CT)区。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述PCMS抗原或所述组合物进一步包括CSP的C末端(CT)区。

11.一种免疫原性组合物，其包括或编码经修饰的PfCSP或其N末端肽片段，所述经修饰的PfCSP或其N末端肽片段包括一个或多个刺激受试者体内的抗体应答的N末端表位，所述抗体应答刺激受试者体内的子孢子调理和免疫细胞介导的清除，其中所述N末端片段诱导与中性粒细胞和单核细胞上的Fcγ受体结合的基本上N末端CSP特异性抗体，并且诱导子孢子的抗体依赖性调理素吞噬作用或自然杀伤细胞的杀伤。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中经修饰的PfCSP或PCMS抗原包括CSP的氨基酸59至327(SEQ ID NO:6)

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述PCMS抗原包括图14中的肽11至23中的一种或多种(SEQ ID NO:7至19)。

本申请中使用的方法在下面不受限制地描述。

重组蛋白和合成肽抗原

序列选择和修饰：基于在哺乳动物HEK293F细胞系中表达的3D7等位基因恶性疟原虫CSP(XP_001351122)产生重组蛋白。CSP含有397个氨基酸并且可以被划分为若干个结构域：N末端信号肽(氨基酸1-18)、在位置25处含有游离半胱氨酸残基的N末端(NT)结构域(氨基酸19-104)、由4个NVDP和38个NANP重复序列组成的中央重复区(氨基酸105-272)以及在Cys-374处含有预测的GPI锚Ω位点的C末端结构域(氨基酸273-398)。

一方面，表示C末端区(CT)的CSP的不同亚基以及N末端区与C末端区之间的融合(N+C；NANP和NVNP重复序列不存在)。CT构建体含有氨基酸273-383，并且表示具有破坏的GPI锚基序的CT的略微截短形式。N+C构建体含有N末端的略微截短形式(氨基酸26-104；去除内源性信号序列)，所述略微截短形式通过短GGGS接头与C末端结构域(氨基酸273-383)融合。为了介导这些重组蛋白分泌到培养基中并通过镍树脂色谱法纯化，将用于组织纤溶酶原激活剂(TPA)的信号肽，随后是6-组氨酸标签与两种蛋白质的N末端融合。然后评估两种蛋白质序列的潜在糖基化位点，但没有鉴定出，并且因此没有对蛋白质序列进行另外的修饰。

产生合成肽以表示CSP(美国新泽西州的泽溪源公司(LifeTein,NJ,USA))的N末端区(氨基酸19-104，NT)和中央重复区(NANP×15，NANP)。

蛋白表达载体的产生：CT和N+C蛋白序列用于产生针对哺乳动物表达进行密码子优化并且然后合成的DNA序列(GeneArt，赛默飞世尔公司)。合成基因在Puc载体中供应，并且然后使用Xho1和BamH1限制性位点克隆到pcDNA 3.1+中。对最终质粒进行定量并用于转染HEK293F细胞。

HEK293F细胞培养和转染：将HEK293 Freestyle^TM细胞(赛默飞世尔科技公司)按照制造商的方案进行培养。简而言之，在37℃下在8％ CO₂下在鄂伦麦尔摇瓶(Erlenmeyershaker flask)(125ml，康宁公司(Corning))中用FreeStyle^TM 293表达培养基(赛默飞世尔科技公司)以135×rpm下在轨道振荡器上培养细胞。使用Countess^TM细胞计数室载玻片(赛默飞世尔科技公司)和Countess^TM自动化细胞计数器(赛默飞世尔科技公司)利用台盼蓝(0.4％；赛默飞世尔科技公司)细胞排除方法对细胞进行计数。按照制造商的方案(赛默飞世尔科技公司)在轻微改变的情况下转染HEK293F细胞以进行蛋白质表达。在转染当天，将细胞离心(在4℃下700g，10分钟)，并以1:100抗生素/抗霉菌溶液(赛默飞世尔科技公司)以1x 10⁶个细胞/ml的最终密度重新悬浮于HEK293F表达培养基中。对于30ml转染，将90μl的聚乙烯亚胺(PEI)转染试剂(25kDA线性；多学科；储备液1mg/ml)添加到0.6ml的OptiPro^TM无血清培养基(赛默飞世尔科技公司)中并温育5分钟。然后将此溶液添加到DNA溶液(30μg的经纯化的质粒和0.6ml的OptiPro^TM无血清培养基(赛默飞世尔科技公司))中。在室温下温育10分钟后，将此最终溶液添加到细胞中，并且然后返回到轨道振荡器中并温育。第二天，添加Lupin(1:40的20％w/v，素莱碧雅生物技术公司(Biotech Solabia))和普朗尼克酸F-68(1:100的10％w/v)(赛默飞世尔科技公司)。转染后6天通过离心细胞(700×g，10分钟)采集所表达的蛋白质以收集上清液，然后将所述上清液过滤(0.2μm膜)并储存在4℃下直到纯化为止。使用SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹测试蛋白质表达。

蛋白质纯化和透析：将含有所表达的蛋白质的所采集培养基通过镍树脂柱(生命技术公司(Life Technologies)，赛默飞世尔科技公司)，用20mM咪唑/PBS(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))洗涤，并将所结合的蛋白质在500mM咪唑/PBS中洗脱成若干个1ml级分。通过光谱法和SDS-PAGE测试所洗脱的级分中的蛋白质的存在。将含有蛋白质的级分汇集，过滤灭菌，透析到无菌PBS中，并使用10,000MW截止过滤器通过离心调整到1mg/ml的浓度。通过SDS-PAGE确认蛋白质大小和纯度。

产生针对不同CSP蛋白的抗体

简而言之，兔(家兔(Oryctolagus cuniculus)(n＝2)用以下抗原中的一种抗原进行免疫：全长CSP、N+C重组蛋白和NT肽。每只兔在第0天、第28天和第56天接受与弗洛伊德佐剂(Freud's adjuvant)共同施用的三个剂量的抗原(200μg/剂量)。在第68天第三次免疫后收集兔血清，并且通过蛋白A阳性选择纯化兔IgG。最初对兔抗N+CIgG进行测试，并且示出主要识别CSP的C末端区，而不是N末端区(图12)。兔抗NT IgG被证实识别CSP的N末端区(图11)。NT和CT抗体两者均与全长CSP反应。

从外周血中分离PBMC、中性粒细胞和全白细胞

使用先前确定的方法从外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)和中性粒细胞(Quinn等人,2007)。简而言之，使用Ficoll梯度离心从健康供体中分离外周血。分别收集含有PBMC的棕黄色层和含有中性粒细胞的RBC沉淀物。对于PBMC分离，在4℃下将从棕黄色层收集的细胞用PBS-1％NCS洗涤4次。随后将PBMC重新悬浮于RPMI1640-10％胎牛血清(FCS)中并保持在冰上。在Ficoll梯度离心后，通过葡聚糖分割从RBC沉淀物中富集中性粒细胞，随后进行低渗裂解。通过用葡聚糖分割进行初始富集，然后通过低渗裂解，从全血中分离出全白细胞。将所分离的中性粒细胞和全白细胞调整到5×10⁵个中性粒细胞/ml或5×10⁶个吞噬细胞(单核细胞和中性粒细胞)/ml，并且随后重新悬浮于补充有10％ FCS和2.5％热灭活人血清的RPMI1640中，并保持在冰上。使用针对FcγRI(克隆10.1，BD生物科学公司(BDBioscience))、FcγRIIa(克隆8.26，BD生物科学公司)和FcγRIII(克隆3G8，BD生物科学公司)的抗体对细胞进行表型分析以进行FcγR表达。针对CD14(克隆M5E2，BD生物科学公司)的抗体也用于确定单核细胞子集。

THP-1细胞的维持

将THP-1前单核细胞系的细胞维持在含有0.002mol/L L-谷氨酰胺、0.01mol/LHEPES和10％胎牛血清(FCS)的RPMI-1640中。密切监测细胞密度，并维持在1x 10⁵个与1x10⁶个细胞/ml之间。每6天或当细胞密度接近1x 10⁶个细胞/ml时对细胞进行传代。

伯氏疟原虫子孢子的培养和分离

向感染有表达伯氏疟原虫ANKA寄生虫系的嵌合CSP的瑞士韦伯斯特小鼠(SwissWebster mice)喂食斯氏按蚊(Anopheles stephensi mosquito)(Triller等人,2017)。在感染性血餐后18-22天解剖唾液腺，并在PBS中均质化。将子孢子通过70μm组织过滤器(福尔肯公司(Falcon))并使用血球计进行计数。

恶性疟原虫裂殖子的培养和分离

将恶性疟原虫的D10系维持在补充有0.5％ Albumax(生命技术公司)和0.18％NaHCO₃的RPMI-HEPES中。将培养物维持在10％以下寄生虫血症，并通过山梨糖醇处理同步。使用先前公布的方法分离裂殖子(Osier,2014)。简而言之，通过磁纯化富集所感染红细胞的裂殖体阶段，并在将成熟的裂殖体通过1.2um过滤器以释放裂殖子之前，在补充有反式环氧琥珀酰-L-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷(E64，西格玛奥德里奇公司)的培养基中继续培养8小时。将裂殖子调整到5×10⁷/ml以进行调理素吞噬测定，或调整到1×10⁷/ml以涂覆到ELISA板进行FcγR结合测定。

抗原与荧光乳胶珠的共价偶联

将2.0μm大小的胺改性的荧光乳胶珠(西格玛奥德里奇公司)用400μl的PBS洗涤两次，并以2000×g离心3分钟。将含8％戊二醛的PBS添加到珠中，并在4℃下在滚轮上温育过夜。在用PBS洗涤后，将1mg/ml的重组CSP添加到珠中并在涡旋下温育6小时。随后，将珠离心并重新悬浮于200μl的乙醇胺中，并在涡旋下温育30分钟以淬灭所有剩余的胺基团。随后将珠在PBS中洗涤，并在4℃下用1％ BSA封闭过夜。将抗原涂覆的珠在4℃下保持在超声水浴中持续20分钟以减少聚集，并且随后调整到5×10⁷个珠/ml。在存在0.1％ SDS和0.02％NaN3的情况下，将珠储存在4℃下。

调理素吞噬测定

出于不同目的以可变设置进行调理素吞噬测定，如以下和表1中所述。

使用分离的细胞的恶性疟原虫和伯氏疟原虫子孢子的调理素吞噬作用：冷冻保存的恶性疟原虫子孢子由PATH-MVI(美国罗克维尔的沙纳瑞亚公司(Sanaria,Rockville,USA))提供并储存在液氮中，并按照制造商的用户手册中的描述在37℃下解冻40秒。新鲜解剖的伯氏疟原虫子孢子是表达PfCSP的嵌合体(参见例如Triller,2017)将子孢子用10μg/ml溴化乙锭在冰上染色1小时，随后用RPMI-HEPES洗涤3次。对于调理，将50,000个子孢子与1ul的测试血清在冰上温育1小时，随后在补充有10％ FCS和来自未感染疟疾的墨尔本供体的2.5％热灭活人血清的RPMI-1640中以5x 10⁵个细胞/ml的浓度与5,000个中性粒细胞共同温育。还另外添加了1ul的测试血清，以考虑添加中性粒细胞引起的体积变化，并在吞噬期间保持相同的测试抗体浓度。在37℃下在5％ CO₂温育箱中允许共温育15分钟，以发生吞噬作用。将细胞在4℃下离心并用冷PBS-1％NCS-0.04％ NaN₃(FACS缓冲液)洗涤以阻止吞噬活性。通过流式细胞术(FACS CantoII，BD生物科学公司)定量吞噬水平，并使用FlowJo软件进行分析。将数据表示为吞噬指数(PI)，所述PI被定义为具有所吞噬的子孢子的中性粒细胞或THP-1细胞的比例。对于对Kanyawegi和Chulaimbo队列进行的实验，PI进一步标准化为相对吞噬指数(RPI)，所述RPI被定义为每个样品相对于阳性对照的PI百分比。未调理的子孢子作为阴性对照包含在所有测定中。标准的中性粒细胞吞噬测定包含来自未暴露于疟疾的供体的2.5％人血清。使用包含10％ FCS的确定方法进行标准THP-1吞噬测定。

使用分离的细胞吞噬抗原涂覆的珠或裂殖子：吞噬测定改编自有修改的先前发布的方法²⁸。简而言之，将1×10⁶个抗原涂覆的荧光乳胶珠或裂殖子用血清样品调理1小时。在与1×10⁵个中性粒细胞共同温育用于吞噬作用之前，用RPMI-1640洗涤珠或裂殖子三次。在37℃下，允许珠发生吞噬作用持续20分钟，或裂殖子发生吞噬作用持续10分钟，并且随后在300g和4℃下用FACS缓冲液洗涤细胞持续4分钟。通过流式细胞术(FACS CantoII，BD生物科学公司)评估含有荧光珠或裂殖子的中性粒细胞的比例，并使用FlowJo软件进行分析。在一些测定中，在包含10％ FCS的标准条件下使用THP-1细胞系；在其它测定中，使用来自未感染疟疾的墨尔本供体的另外的2.5％人血清进行比较。

使用全血白细胞制剂吞噬抗原涂覆的珠或伯氏疟原虫子孢子：用针对CSP提出的兔多克隆抗体调理CSP涂覆的珠。通过将经调理的珠与含有1x 10⁶个吞噬细胞(单核细胞和中性粒细胞)的全血中的总白细胞级分在37℃下在5％ CO₂温育箱中共同温育20分钟来进行吞噬作用。这些实验使用可变抗体浓度进行调理或可变珠与吞噬细胞的比率。为了测试全白细胞制剂对伯氏疟原虫子孢子的调理素吞噬作用，将5x 10⁵个子孢子用暴露于疟疾的免疫成人血清池以1:100的稀释度进行调理，随后与含有5x 10⁴个吞噬细胞的全白细胞共同温育。将细胞在4℃下离心4分钟以停止吞噬活性，并用荧光缀合的抗体标记不同的吞噬细胞(单核细胞和中性粒细胞)以进行进一步分析。将单核细胞用抗CD14-Alexa657(

BD生物科学公司)和抗CD16-BV421(3G8，BD生物科学公司)进行标记，并且将中性粒细胞用抗CD66b-APC-H7(G10F5，BD生物科学公司)进行标记。对于FACS分析，所吞噬的珠被选择作为PE^高和FSC^高群体。使用CD14和CD66b染色进一步区分被单核细胞和中性粒细胞吞噬的珠。基于荧光强度计算被单核细胞和中性粒细胞吞噬的珠的数量。使用吞噬细胞(单核细胞和中性粒细胞)的总数进一步标准化此数量，并将其表示为珠/100个吞噬细胞，表示不同细胞类型的吞噬速率。

通过阻断Fcγ受体抑制调理素吞噬作用：使用特异性阻断抗体阻断不同的FcγR。用50μg/ml阻断抗体(mAb 10.1，默克公司(Merck))阻断FcγRI，用50μg/ml阻断抗体(mAbIV.3)阻断FcγRIIa，用50μg/ml阻断抗体(mAb 3G8)阻断FcγRIII。在与CSP涂覆的乳胶珠共同温育之前，在4℃下分别用每种FcγR阻断剂处理THP-1细胞和中性粒细胞持续30分钟，所述乳胶珠已经用来自免疫成人的血清进行调理。如上所提及的进行吞噬作用测定。

通过ELISA测量总IgG和IgG亚类

如前所述，通过ELISA测量针对重组蛋白的总IgG和IgG亚类(Kurtovic,L.等人人抗体激活针对恶性疟原虫子孢子的补体，并且与预防儿童中的疟疾相关(Humanantibodies activate complement against Plasmodium falciparum sporozoites,andare associated with protection against malaria in children.)《BMC医学(BMCMed)》16,61(2018)。简而言之，将CSP在96孔Maxisorp微量滴定板(丹麦罗斯基勒的NUNC公司(NUNC,Roskilde,Denmark))上以1μg/ml进行涂覆，并在4℃下温育过夜。用含有0.05％Tween 20(PBS-Tween)的PBS洗涤板，并在37℃下用PBS-1％ BSA封闭2小时。将人血清或兔IgG稀释到所期望的浓度，并一式两份添加到板中。对于总IgG检测，使用以1:2500稀释的HRP缀合的山羊抗人IgG，随后使用ABTS底物进行显色。用1％ SDS停止反应，并在405nm处测量吸光度。对于IgG亚类检测，使用以1:1000稀释的针对人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的单克隆抗体，随后使用以1:2500稀释的HRP缀合的山羊抗小鼠IgG。最后，使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，生命技术公司)底物进行显色，并用1M H₂SO₄停止反应。在450nm处测量吸光度。对CSP具有高IgG反应性的免疫成人血清池用作阳性对照。

Fcγ受体结合测定

采用先前公布的方法在稍作修改的情况下进行Fcγ受体结合测定(Wines,B.D.等人二聚体FcγR胞外结构域作为抗流感病毒IgG的Fc受体功能的探针(Dimeric FcgammaREctodomains as Probes of the Fc Receptor Function of Anti-Influenza VirusIgG)《免疫学杂志(J Immunol)》197,1507-1516(2016))，参见Lichtfuss,G.F.等人HIV抑制由NK细胞上的CD16交联触发的早期信号转导事件，这对于抗体依赖性细胞毒性很重要(HIVinhibits early signal transduction events triggered by CD16 cross-linking onNK cells,which are important for antibody-dependent cellular cytotoxicity)《白细胞生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)》89,149–158(2011)。简而言之，将50ul的浓度为1μg/ml的重组CSP涂覆在Maxisorp^TM板上并在4℃下温育过夜，随后用PBS-Tween洗涤3次。然后在37℃下将板用200μl的1％ BSA-PBS封闭2小时，随后用PBS-Tween洗涤3次。将血清样品在PBS-BSA中以1:50稀释，并将50μl的每种样品一式两份添加到板中并在室温下温育2小时，随后在PBS-Tween中洗涤3次。向每个孔中添加五十微升的生物素缀合的重组可溶性FcγRIIaH131胞外结构域二聚体(0.2ug/ml)或FcγRIII V158胞外结构域二聚体(0.1ug/ml)，并在37℃下温育1小时，随后用PBS-Tween洗涤3次。随后是在37℃下在PBS-BSA中的次级HRP缀合的链霉亲和素(赛默飞世尔科技公司，1:10,000)持续1小时，然后用PBS-Tween洗涤3次。最后，添加50μl的TMB液体底物持续20分钟，以测量酶反应性。用50μl的1M H₂SO₄溶液停止反应。在450nm处测量结合水平作为光密度。将来自暴露于疟疾的免疫成人(1/100)与针对CSP的兔多克隆IgG(1:500)的汇集的人IgG用作阳性对照。将来自未经处理的墨尔本成人(1/50)的个体血清用作阴性对照。对于一些测定，在抗原涂覆的板中温育以耗竭NT区特异性抗体之前，将血清样品用浓度为20ug/ml的NT肽预处理2小时。

对于与裂殖子的FcγR结合，将50μl的浓度为1×10⁷/ml的裂殖子涂覆到Maxisorp^TM板。如上所述进行FcγR结合测定，除了使用不含0.05％ Tween的PBS进行洗涤，并且将浓度为1/250的来自暴露于疟疾的免疫成人²⁸的经纯化的人IgG用于阳性对照之外。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性测定

按照制造商的说明，在进行以下修改的情况下，使用ADCC报告生物测定试剂盒(普洛麦格公司(Promega)，目录号G7010)评估所选血清样品的ADCC诱导活性。用以1:50稀释的人血清调理CSP涂覆的珠。将报告细胞以每孔72,000个细胞与CSP涂覆的荧光珠一起以10:1的比率进行平板接种。在温育6小时后，添加化学发光底物，并且大约每5分钟检测发光并进行定量持续40分钟(CLARIOstar，BMG实验室科技公司(BMG LabTech))。在添加化学发光底物后约30分钟记录所呈现的数据。

ADCC的水平也使用先前公布的方法在原代NK细胞中得到证实(Lichtfuss,G.F.等人HIV抑制由NK细胞上的CD16交联触发的早期信号转导事件，这对于抗体依赖性细胞毒性很重要《白细胞生物学杂志》89,149-158(2011))。简而言之，将含有NK细胞的PBMC在补充有10％ FCS和100IU/ml白细胞介素-2(IL-2)的RPMI1640中培养过夜。将CSP涂覆的珠用以1:50稀释的人血清进行调理，然后在存在抗CD107a-AF647(H4A3，BD生物科学公司)的情况下与引发的PBMC共培养1小时。随后，将布雷菲德菌素A(西格玛奥德里奇公司)和蛋白质转运抑制剂(BD生物科学公司)分别以5ug/ml和1/1500的浓度添加到共培养物中，并继续温育3小时。温育后，将细胞在4℃下以300×g离心4分钟，并用抗CD3-APC-H7(SK7，BD生物科学公司)、抗CD56-PE-Cy7(B159，BD生物科学公司)和抗CD16-BV450(3G8，BD生物科学公司)染色。NK细胞被定义为CD3^-、CD56⁺淋巴细胞，并且ADCC水平通过流式细胞术定量为用CD107a染色的NK细胞的百分比(LSR Fortessa X-20，BD生物科学公司)。

数据分析

使用Prism版本7(GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc))和STATA版本13.1(STATACorp)进行统计学分析。在图解中指示了统计检验和p值。使用斯皮尔曼相关性系数(Spearman's correlation coefficient)和多元线性回归模型评估吞噬作用、FcγR结合与IgG水平之间的相关性。使用单向ANOVA与多重比较评估年龄组和不同调理条件之间的吞噬作用、FcγR结合和IgG水平的差异。为了评估抗体功能活性，而不考虑针对CSP的总IgG滴度，将FcγR结合效率和吞噬效率计算为FcγR结合水平或相对于针对CSP的总IgG滴度的调理素吞噬水平。使用斯皮尔曼相关性和曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)分析儿童和成人的抗体功能效率。使用双向ANOVA比较全白细胞测定中的中性粒细胞和单核细胞的调理素吞噬作用。对非正态分布的数据进行克鲁斯拉-沃利斯检验(Kruskal-Wallistest)和曼-惠特尼检验。如果反应性大于未暴露于疟疾的对照的值的平均值+3个标准偏差，那么样品被归类为对抗体呈阳性。

定位NT区的抗体表位

合成了表示CSP(3D7/NF54毒株)的线性序列的含有70个生物素化15聚体肽的阵列(澳大利亚的迈拓公司(Mimotopes,Australia))。每种肽在CSP肽序列与生物素标签(添加所述生物素标签以帮助固定)之间都有短SGSG间隔子，并且肽之间具有12aa重叠。使用先前确定的方法进行抗体测定(Feng等人2018；Boyle等人2015)；将每孔50ul肽添加到预涂覆有1ug/ml链霉亲和素(西格玛奥德里奇公司)的ELISA板中。通过使用生物素-HRP定量链霉亲和素上的残余生物素结合位点，随后用10％牛奶阻断并用具有0.05％ Tween的PBS洗涤实现并证实了肽结合的饱和。将针对CSP的NT区提出的兔多克隆IgG以1/500的浓度添加到每个孔中。通过HRP缀合的山羊抗兔IgG(密理博公司(Millipore))检测兔IgG结合水平，并使用TMB底物进行定量。

通过以下实例进一步展示本说明书，所述实例不应被解释为以任何方式进行限制。

实例

实例1-子孢子的调理素吞噬作用主要由外周血中的中性粒细胞介导

为了研究针对子孢子的FcγR介导的机制的相关性，在标准条件下使用未分化的THP-1细胞系(前单核细胞)建立了调理素吞噬测定(Osier,F.H.等人恶性疟原虫裂殖子的调理素吞噬作用：人免疫机制与预防疟疾的相关性(Opsonic phagocytosis ofPlasmodium falciparum merozoites:mechanism in human immunity and a correlateof protection against malaria)《BMC医学》12,108(2014)；Steel,R.W.等人恶性疟原虫子孢子的调理素吞噬测定(An Opsonic Phagocytosis Assay for Plasmodiumfalciparum Sporozoites)《临床与疫苗免疫学(Clin Vaccine Immunol)》24(2017)。使用来自居住在疟疾高流行的地区并且对疟疾具有显著的临床免疫力以及针对CSP的抗体的免疫成人的血清抗体(Kurtovic,L.等人人抗体激活针对恶性疟原虫子孢子的补体，并且与预防儿童中的疟疾相关《BMC医学》16,61(2018)。

用来自免疫成人的免疫抗体调理的冷冻保存的恶性疟原虫子孢子被THP-1细胞以浓度依赖性方式有效吞噬，并且使用来自未感染疟疾的供体(墨尔本居民)的抗体几乎没有观察到调理素吞噬作用(图1A和图解)。由单独血清介导的调理素吞噬作用的量级具有高度可重复性(r＝0.925，p<0.001；图1B和图解)。调理素吞噬测定需要大量活的恶性疟原虫子孢子，所述恶性疟原虫子孢子难以产生，并且限制了此测定在临床研究中的更广泛应用。因此，确定使用涂覆有全长CSP(即在子孢子上表达的主要抗原)的荧光珠作为子孢子的调理素吞噬作用的替代量度。用来自不同免疫成人的所选抗体样品调理的CSP涂覆的珠被THP-1细胞有效吞噬，并且CSP涂覆的珠的调理素吞噬作用与子孢子的调理素吞噬作用密切相关(r＝0.831，p<0.01，图1C和图解)。因此，CSP珠提供了用于研究抗体介导的子孢子的调理素吞噬作用的有效平台。

通过用针对CSP的多克隆兔抗体调理的CSP珠，在使用新鲜血液的全白细胞测定中研究介导调理素吞噬作用的细胞类型。有趣的是，中性粒细胞的吞噬速率(每个细胞吞噬的珠的数量)远高于单核细胞的吞噬速率(图1A和B)。由于吞噬速率是定量的，因此中性粒细胞的更高活性不能简单地通过其相较于单核细胞的更高的丰度解释。调理素吞噬作用随着抗体浓度的增加而增加，并且在高浓度和低浓度下观察到中性粒细胞相较于单核细胞的更高的相对活性(图1A)。此外，中性粒细胞在一系列珠:细胞比率下表现出更高的吞噬活性(图1B)。使用表达恶性疟原虫CSP(其替代内源性伯氏疟原虫CSP基因(Triller等人2017)；被称为PfCSP-伯氏疟原虫)的转基因伯氏疟原虫子孢子证实了中性粒细胞的更大的吞噬活性。与先前使用珠的观察一致，用来自暴露于疟疾的免疫供体的血清池调理的转基因PfCSP-伯氏疟原虫子孢子的吞噬作用主要由中性粒细胞介导，其中单核细胞仅具有低水平吞噬作用，并且中性粒细胞示出较高的吞噬率(图1C)。对单核细胞群体的另外的分析表明，大多数吞噬作用通过经典子集进行(图1D；图1和图解)。此外，从外周血中分离的中性粒细胞可以有效地吞噬用来自免疫成人的汇集的血清抗体调理的转基因PfCSP-伯氏疟原虫子孢子(图1E)。

实例2-定义参与子孢子的调理素吞噬作用的Fcγ受体

为了定义参与调理素吞噬作用的特异性FcγR，用来自免疫成人的汇集的血清抗体调理全恶性疟原虫子孢子和CSP珠，并在存在特异性FcγR阻断抗体的情况下测量中性粒细胞的调理素吞噬作用。在存在FcγRIIa或FcγRIII阻断剂的情况下，中性粒细胞对CSP珠和恶性疟原虫子孢子两者的调理素吞噬作用显著较低(图2A和B)，表明这两种受体都是重要的。值得注意的是，FcγRIII阻断对抑制恶性疟原虫子孢子或CSP珠的吞噬作用最有效，其中FcγRIIa阻断的作用较弱。中性粒细胞的调理素吞噬作用不受阻断FcγRI的影响。滴定阻断抗体的浓度表明，已经实现了阻断每个单独FcγR的最大效果(参见图2和图解)。因此，结合了FcγRIIa和FcγRIII阻断抗体，并且发现所述阻断抗体对吞噬作用的抑制作用比使用任一种阻断抗体本身都更大，从而进一步表明两种FcγR类型对于中性粒细胞的最佳吞噬作用的重要性(图2B)。这些结果与FcγR在静息中性粒细胞上的表达一致，所述静息中性粒细胞主要表达FcγRIIa和FcγRIIIa/b，但缺乏FcγRI。FcγRIII在介导CSP珠和子孢子的调理素吞噬作用中的重要性可以部分地解释单核细胞的相对较低的活性，因为主要单核细胞子集在未激活状态下在表面上表达很少的FcγRIIIa，并且不表达FcγRIIIb。THP-1细胞被广泛用作单核细胞吞噬模型并且高度表达FcγRI，所述FcγRI与单体IgG结合(而由中性粒细胞表达的FcγRIIa和FcγRIII仅与免疫复合物结合)。因此，发现THP-1细胞在标准条件(仅含有10％ FCS)下的调理素吞噬作用受到FcγRI阻断剂的强烈抑制，其中在FcγRIIa阻断剂的情况下观察到有限的抑制作用，而FcγRIII阻断没有抑制作用(图2C)。这表明IgG与FcγRI之间的相互作用对于THP-1细胞而言特别重要，与在中性粒细胞的情况下观察到的结果形成鲜明对比。因此，通过在测定培养基中包含人血清，对标准THP-1测定进行修改，以使其更具生理相关性。对于在存在另外的2.5％人血清(如用于全白细胞和中性粒细胞测定)的情况下THP-1细胞对CSP涂覆的珠的调理素吞噬作用，调理素吞噬作用要少得多(图2D)，可能是由于人血清中存在的非免疫单体人IgG与FcγRI的结合以及FcγRIIIa的有限表达。这些发现可以解释在存在人血清的情况下在全白细胞测定中观察到的单核细胞的低吞噬活性。

鉴于FcRγIII的明显重要性，在ADCC测定中测量了免疫成人中针对CSP的抗体的功能，因为FcRγIII相互作用在通过NK细胞介导ADCC中起关键作用。在使用仅表达FcγRIIIa的ADCC报告细胞系的测定中，选择来自免疫成人队列(Kanyawegi队列)的所选样品来代表高、中等和低应答(n＝31)。在此测定中，免疫成人中的自然获得的人抗体具有显著活性，而来自墨尔本未感染疟疾的供体的抗体没有诱导ADCC(图2E和F)。这些发现表明，针对CSP的抗体也可以通过接合FcγRIIIa来促进ADCC活性。随后，使用确定的测定测试了新鲜血液中原代NK细胞的活性(Lichtfuss等人,2011)。将NK细胞与通过选择免疫成人调理的CSP珠一起温育使原代NK细胞脱粒(图2G和H)。活性因被测样品而异。有趣的是，原代NK细胞脱粒活性与FcγRIII结合显著相关(r＝0.538，p＝0.002；图2H)，但与IgG与CSP的相关性较弱(r＝0.127，P＝0.489，n＝31)。

实例3-抗体-抗原复合物直接结合FcγRIII和FcγRIIa

为了进一步了解FcγR-抗体结合在对子孢子的免疫中的重要性，使用重组FcγRIIa和FcγRIII开发了FcγR结合测定，所述重组FcγRIIa和FcγRIII以二聚体的形式表达和纯化，以便可以与抗原-抗体复合物相互作用(参见Wines等人2016)。免疫成人具有高患病率以及可以与FcγRIIa和FcγRIII二聚体相互作用的针对CSP的抗体的量级(代表性实例示出于图3A)。总体而言，67.3％和61.5％的样品(n＝104)被认为对FcγRIIa和FcγRIII结合呈阳性。虽然两种FcγR的结合在样品之间具有强的正相关性(r＝0.71，p<0.0001，n＝104)(图3B)，但总体上与FcγRIII的结合大于与FcγRIIa的结合，这与早期的数据一致，从而表明FcγRIII可能在吞噬作用中发挥更突出的作用(图2A和B)。此外，一些单独样品表现出与一种FcγR的高结合和与另一种的低结合。此外，针对CSP的抗体促进FcγRIII直接结合的能力与通过ADCC报告细胞系(r＝0.405，P＝0.022，图2F)和原代NK细胞(r＝0.538，P＝0.002，图2H)两者测试的ADCC相关。

实例4-功能性抗体靶向的CSP的区

研究了功能性抗体靶向的CSP的区。兔抗CSP抗体先前已示出促进CSP珠的调理素吞噬作用，并且本文证实了其针对全子孢子的功能活性。与对照相比，用这些抗体调理的恶性疟原虫子孢子产生高吞噬指数(40.5％)(图4A)。此外，针对恶性疟原虫CSP的中央NANP重复区的小鼠单克隆抗体(mAb)2H8(IgG2a亚类)(Kurtovic等人,2018)促进了实质性吞噬作用(17.4％，图4B)，所述吞噬作用比用靶向不具有NANP重复表位的伯氏疟原虫的CSP的阴性对照mAb 3D11所观察到的吞噬作用更大(图4B)。

使用以下三种蛋白质构建体确定CSP的不同区是否是调理素吞噬作用的靶标：i)表示NT区的长合成肽(其预计是非结构化的并且不包含在RTS,S疫苗中)；ii)表示重复区(NANP重复序列)的合成肽；以及iii)表示CT区的重组蛋白。将每个构建体分别涂覆到荧光珠(在饱和浓度下)上，并用免疫血清池调理。抗体有效促进涂覆有所有三种构建体的珠的中性粒细胞吞噬作用，其中NT区示出最高水平的调理素吞噬作用(图4C)。为了进一步定义针对CT和NT区的抗体的作用，产生了针对每个区的兔多克隆抗体，并且这些抗体被用于调理转基因PfCSP-伯氏疟原虫子孢子，以通过分离的中性粒细胞进行吞噬。针对CT和NT区两者的兔多克隆抗体有效地促进了PfCSP-伯氏疟原虫子孢子的调理素吞噬作用(图4D)。由于IgG对来自接种疫苗的兔血清的CT和NT的浓度不同，因此评估了相对于IgG水平的吞噬作用(计算为吞噬活性除以通过ELISA确定的IgG反应性)。这示出与CT抗体相比，针对N末端区的抗体具有显著更高的相对吞噬活性。

CSP区(NT区、中央重复区和CT区)被评估为自然获得的抗体的靶标，因为这些区能够促进FcγRIIa和FcγRIII与来自免疫成人血清池的抗体的接合。结果确定获得的人抗体以足够的密度调理每个CSP区，以促进FcγRIIa和FcγRIII的结合(图4E)。由于不同CSP构建体之间的IgG结合总水平不同，因此FcγRIIa和FcγRIII结合相对于IgG反应性水平(被称为FcγR结合效率)标准化。这表明针对NT区的抗体比针对中央重复区和CT区的抗体具有更高的接合FcγR的潜力。

实例5–NT区能够诱发IgG抗体和补体结合活性

针对NT区提出的抗体能够促进补体结合。先前的研究证实，补体结合可能引起子孢子杀伤并且抑制子孢子运动性和侵袭。使用固定化全长CSP(下)或N末端蛋白(上)测试针对CSP的NT区提出的兔抗体的IgG反应性(左图)和补体结合活性(C1q结合；右图)。结果(参见图11)示出了来自两个独立实验的平均值和范围。

实例6-用全长CSP进行疫苗接种没有产生针对N末端区的抗体

用包含N末端区的全长CSP进行免疫没有产生针对N末端区的良好抗体。相反，如本文所确定的，需要特异性构建体来实现这一点。用全长CSP对兔进行疫苗接种没有有效地产生针对CSP的N末端区的抗体(图12-底部粉红色线)。数据示出了抗体对CSP的不同区(NT、NANP和CT区；全长CSP用于比较)的IgG反应性(左图)和补体结合活性(C1q结合；右图)。两个独立实验的平均值和范围。

实例7–源自N末端的特异性重叠肽与多克隆IgG

由于针对NT区的抗体在激活FcγR和促进调理素吞噬作用方面非常有效，并且在一些实施例中还促进补体结合，因此使用重叠肽阵列对针对NT区的兔多克隆抗体进行表位定位。抗体与覆盖靠近N末端区与NANP/NVPD重复区之间的接合点的区的肽发生反应，但不包含最近报道的接合表位(Tan等人2018于2018年3月19日在线发布的《自然医学(NatureMedicine)》；doi:10.1038/nm.4513)，所述接合表位位于N末端区与NANP重复区之间。

针对源自CSP序列(3D7毒株)的重叠肽阵列测试抗体。下面列出了N末端肽序列。条形图和误差条表示来自两个独立实验的平均值和标准误差。

肽13、14和15与肽17、18、19和20一起与针对CSP的N末端提出的IgG相互作用。图13展示了使用针对CSP的N末端提出的多克隆兔IgG的表位定位的结果。与C末端内的肽存在一些交叉反应性，但这处于非常低的水平，并且预计将不会促进抗体的功能活性。针对NT区的抗体示出对代表整个C末端区的重组蛋白的反应性很小(图5)。测试针对NT区产生的兔抗体对重叠肽阵列(15aa与12aa重叠)的反应性，包含NT区、NANP/NVDP重复序列和接合区。数据示出IgG对不同肽的反应性；反应性肽包含对应于CSP残基76-96的21-aa区(对于肽反应性差异，P＝0.036，

克鲁斯拉-沃利斯检验，两个实验)。误差条表示来自两个实验重复序列的范围。

实例8-针对N末端的IgG抗体促进FcγRIIa结合

将血清抗体(来自不同的暴露于疟疾的成人)与重组NT蛋白一起温育，以从池中耗竭NT抗体。然后在耗竭/未耗竭NT抗体的情况下测试抗体促进FcRIIa结合的能力，并且在耗竭/未耗竭的情况下根据总IgG滴度与全长CSP(FcγRIIa结合效率)进行进一步标准化。在NT特异性抗体耗竭后，FcγRIIa结合效率显著降低(P＝0.021)。图14展示了在人抗体中耗竭针对CSP的N末端区的抗体如何降低抗体的FcγRIIa结合效率。

进行另外的实验以确定一种或多种刺激促进子孢子吞噬作用或补体介导的功能的抗体的表位。

实例9-用RTS,S和CSP N末端肽的组合进行疫苗接种有效诱发针对CSP的所有三个区(NT、CT和NANP)的IgG

小鼠用对应于RTS,S疫苗构建体序列本身(单独的RTS,S)或与来自CSP的N末端区的合成肽序列混合(在图15B中表示为NT+RTS,S)的CSP抗原/肽的混合物进行疫苗接种。疫苗接种后，测试小鼠血清中针对CSP的N末端(NT)、C末端(CT)和NANP重复区的IgG的存在。结果(参见图15)证实，RTS,S免疫原与NT肽免疫原的混合物有效产生针对CSP的所有3个区的IgG。因此，通过产生针对CSP NT区的功能性抗体，增强了疟疾疫苗的保护性作用。

用Quil-A佐剂调配疫苗，并且给予3个剂量：

组1：5ug RTS,S免疫原/剂量

组2：5ug RTS,S免疫原+10ug NT肽。

RTS,S构建体包含CT和NANP区，但不包含NT区。所使用的NT肽基于以下序列：ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADG(SEQ ID NO:57)。所述肽与源自破伤风类毒素的通用T细胞辅助表位-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO:58)–位于NT序列与T细胞表位之间的间隔子(SGSG)(SEQ ID NO:59)融合。用于疫苗接种的完整NT肽序列为：

ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADSGSGQYIKANSKFI GITEL(SEQ IDNO:60)。

目前领先的疫苗RTS,S(GSK)和R21(牛津的詹纳研究所(Jenner Institute,Oxford))基于CSP序列，所述序列包含C末端区(CT)和中央重复序列(NANP)，但不包含CSP的N末端(NT)序列。用全长CSP进行疫苗接种在产生针对CSP的N末端区的抗体方面并不有效。用RTS,S免疫原与基于N末端区的序列的部分的免疫原的混合物对小鼠进行疫苗接种有效产生针对CSP的所有主要区(C末端区、中央重复区和N末端区)的IgG。所述肽与源自破伤风类毒素的通用T细胞辅助表位-QYIKANSKFIGITEL融合。这些发现表明，添加N末端肽免疫原作为与其它基于CSP的疫苗的混合物是产生针对CSP的N末端区以及CSP的其它区的抗体的有效策略。用全长CSP进行疫苗接种不是有效的策略。

表1：调理素吞噬测定的实验材料和设置

表2：氨基酸子分类

表3：示例性和优选氨基酸取代

序列表符号说明

本文引用或参考的所有文件，以及本文引用的文件连同本文提及的任何产品的任何制造商说明书、说明、产品规范和产品表或通过引用并入本文的任何文件中引用或参考的所有文件都特此通过全文引用的方式并入本文。

本领域技术人员将理解的是，鉴于本公开，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对例示的具体实施例进行多种修改和改变。所有这种修改和改变旨在包含在所附权利要求的范围内。

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序列表

<110> 麦克法兰布奈特医疗研究与公共健康研究所有限公司

（Macfarlane Burnet Institute for Medical Research

and Public Health Limited）

<120> 免疫原性化合物

<130> 531124PCT

<150> AU2020902779

<151> 2020-08-06

<160> 60

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 47

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Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

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<211> 397

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Met Met Arg Lys Leu Ala Ile Leu Ser Val Ser Ser Phe Leu Phe Val

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Glu Ala Leu Phe Gln Glu Tyr Gln Cys Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Thr

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Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

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Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

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Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro

260 265 270

Asn Lys Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro Asn Asp

275 280 285

Pro Asn Arg Asn Val Asp Glu Asn Ala Asn Ala Asn Ser Ala Val Lys

290 295 300

Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu

305 310 315 320

Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val

325 330 335

Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala Asn

340 345 350

Lys Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile

355 360 365

Cys Lys Met Glu Lys Cys Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser Ser

370 375 380

Ile Gly Leu Ile Met Val Leu Ser Phe Leu Phe Leu Asn

385 390 395

<210> 56

<211> 1195

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 疟疾

<400> 56

atgatgagaa aattagctat tttatctgtt tcttcctttt tatttgttga ggccttattc 60

caggaatacc agtgctatgg aagttcgtca aacacaaggg ttctaaatga attaaattat 120

gataatgcag gcactaattt atataatgaa ttagaaatga attattatgg gaaacaggaa 180

aattggtata gtcttaaaaa aaatagtaga tcacttggag aaaatgatga tggaaataac 240

gaagacaacg agaaattaag gaaaccaaaa cataaaaaat taaagcaacc agcggatggt 300

aatcctgatc caaatgcaaa cccaaatgta gatcccaatg ccaacccaaa tgtagatcca 360

aatgcaaacc caaatgtaga tccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca 420

aatgcaaacc caaatgcaaa cccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca 480

aatgcaaacc caaatgcaaa cccaaatgca aacccaaatg caaacccaaa tgcaaaccca 540

aatgcaaacc ccaatgcaaa tcctaatgca aacccaaatg caaacccaaa cgtagatcct 600

aatgcaaatc caaatgcaaa cccaaacgca aaccccaatg caaatcctaa tgcaaacccc 660

aatgcaaatc ctaatgcaaa tcctaatgcc aatccaaatg caaatccaaa tgcaaaccca 720

aacgcaaacc ccaatgcaaa tcctaatgcc aatccaaatg caaatccaaa tgcaaaccca 780

aatgcaaacc caaatgcaaa ccccaatgca aatcctaata aaaacaatca aggtaatgga 840

caaggtcaca atatgccaaa tgacccaaac cgaaatgtag atgaaaatgc taatgccaac 900

agtgctgtaa aaaataataa taacgaagaa ccaagtgata agcacataaa agaatattta 960

aacaaaatac aaaattctct ttcaactgaa tggtccccat gtagtgtaac ttgtggaaat 1020

ggtattcaag ttagaataaa gcctggctct gctaataaac ctaaagacga attagattat 1080

gcaaatgata ttgaaaaaaa aatttgtaaa atggaaaaat gttccagtgt gtttaatgtc 1140

gtaaatagtt caataggatt aataatggta ttatccttct tgttccttaa ttagg 1195

<210> 57

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> NT肽

<400> 57

Glu Asn Trp Tyr Ser Leu Lys Lys Asn Ser Arg Ser Leu Gly Glu Asn

1 5 10 15

Asp Asp Gly Asn Asn Glu Asp Asn Glu Lys Leu Arg Lys Pro Lys His

20 25 30

Lys Lys Leu Lys Gln Pro Ala Asp Gly

35 40

<210> 58

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> T细胞辅助表位

<400> 58

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

1 5 10 15

<210> 59

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 间隔子

<400> 59

Ser Gly Ser Gly

1

<210> 60

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> PCMS抗原

<400> 60

Glu Asn Trp Tyr Ser Leu Lys Lys Asn Ser Arg Ser Leu Gly Glu Asn

1 5 10 15

Asp Asp Gly Asn Asn Glu Asp Asn Glu Lys Leu Arg Lys Pro Lys His

20 25 30

Lys Lys Leu Lys Gln Pro Ala Asp Ser Gly Ser Gly Gln Tyr Ile Lys

35 40 45

Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

50 55

Claims

1.一种在受试者体内诱导针对恶性疟原虫(P.falciparum，Pf)寄生虫/子孢子的抗体以对所述受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种或多种表示选自NT和CT和/或NANP亚区的环子孢子多肽(CSP)的特异性亚区的肽抗原，其中所述方法包括：

(i)施用呈递PfCSP的N末端(NT)表位并且不表示PfCSP的NANP或CT亚区的肽抗原或编码肽抗原的序列；或

(ii)共同施用(i)的肽抗原或序列以及呈递PfCSP的NANP和/或CT表位的肽或编码肽的序列；或

(iii)施用表示PfCSP的NT和CT和/或NANP亚区而不是全长PfCSP的肽或编码肽的序列，

其中CSP的所述NT亚区是恶性疟原虫CSP的氨基酸58至104(SEQ ID NO:1)，并且呈递SEQ ID NO:1的NT表位的肽包括来自毒株3D7的CSP的N末端氨基酸58至104(SEQ ID NO:1)的3至48个连续氨基酸或来自不同恶性疟原虫毒株的对应肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中CSP的所述NT亚区是恶性疟原虫CSP的氨基酸58至81(SEQ ID NO:2)，并且呈递SEQ ID NO:2的NT表位的肽包括毒株3D7的SEQ ID NO:2的3至24个连续氨基酸或来自不同恶性疟原虫毒株的对应肽。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述NT亚区是所述PfCSP的氨基酸64至84(SEQ IDNO:3)，并且呈递SEQ ID NO:3的NT表位的肽包括SEQ ID NO:3的3至21个连续氨基酸或来自不同毒株的对应肽。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中表示NT表位的肽包括来自CSP的N末端氨基酸58至81(SEQ ID NO:2)的3至24个连续氨基酸或来自不同毒株的对应序列，并且另外包括来自CSP的N末端氨基酸82至104(SEQ ID NO:4)的3至24个连续氨基酸或来自不同毒株的对应肽。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其中呈递CSP NT表位的肽包括来自CSP多肽的N末端氨基酸64至84的3至21个连续氨基酸，其中至少3个连续氨基酸包含DDG或GNN，并且其中所述肽另外包括来自CSP多肽的N末端氨基酸76至100(SEQ ID NO:5)的3至24个连续氨基酸，其中至少3个连续氨基酸包含KPK并且不包含GNP。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中呈递CSP NT表位的肽包括选自以下中的一个或多个的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:57。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中呈递CSP NT表位的肽包括T细胞辅助表位。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中表示CSP NT表位的肽包括异源T细胞辅助表位。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中呈递PfCSP的CSP NANP或CT表位的肽是RTS,S或R21疫苗肽。

10.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中表示PfCSP的NT、CT和NANP亚区的肽包括CSP的氨基酸59至327或60至327(SEQ ID NO:6)QENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNVDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENANANSAVKNNNNEEPSDKHIKEYLNKIQNSLSTEWSPCSVTCGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYANDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSGS，或来自不同Pf毒株的对应序列。

11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中呈递NT表位的肽包括DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ(SEQ ID NO:)、

ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADG(SEQ ID NO:57)或ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADSGSGQYIKANSKFIGITE L(SEQ ID NO:60)。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述抗原是以蛋白质(例如，表达或合成的抗原)和/或核酸形式(例如，mRNA和DNA)作为病毒样颗粒或其它纳米颗粒与纳米载体/脂质体、病毒载体一起和/或以包括佐剂或免疫调节剂的药物组合物进行施用的。

13.一种药物组合物，其包括表示SEQ ID NO:1的CSP的NT亚区的肽抗原或抗原编码序列以及药学上可接受的赋形剂或稀释剂，其中所述抗原在施用于受试者时包括呈递SEQ IDNO:1的NT表位的肽并且包括SEQ ID NO:1的3至48个连续氨基酸或来自变体恶性疟原虫毒株的对应肽。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述抗原包括异源间隔子或免疫调节元件。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述免疫调节元件是辅助T细胞表位或TLR(Toll样受体)激动剂。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的组合物，其中CSP NT肽包括SEQ ID包括DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ(SEQ ID NO:25)或

ENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADG(SEQ ID NO:57)或KQENWYSLKKNSRSLGENDDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQPADGNPDP(SEQ ID NO:1)，或者其中所述肽包括SEQ ID NO:25以及来自CSP NT序列的N末端或C末端连续氨基酸，SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:1，或来自变体毒株的对应序列。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的药物组合物，其进一步包括表示PfCSP的NANP和或CT亚区并且呈递PfCSP的NANP和/或CT表位的抗原肽或编码肽抗原的序列。

18.一种病毒样颗粒，其包括如权利要求13至16中任一项所定义的抗原。

19.一种载体或多核苷酸，其编码并且能够表达如权利要求13至16中任一项所定义的抗原。

20.一种病毒或非病毒载体，其包括编码肽抗原的核酸序列，所述肽抗原表示或包括PfCSP的NT表位并且任选地基本上不表示或包括CSP CT和/或NANP表位。

21.一种治疗或预防疟疾的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求13至17中任一项所述的组合物、根据权利要求18所述的VLP或根据权利要求19或20所述的载体或多核苷酸。

22.一种如权利要求13至17中任一项所定义的PCMS抗原或NT CSP肽抗原或编码其的核酸分子在制备用于治疗或预防受试者的疟原虫感染或疟疾的药物中的用途。

23.一种筛选疫苗候选物/表位的方法，所述方法包括测试其与中性粒细胞和单核细胞上的Fcγ受体结合并诱导子孢子的抗体依赖性调理素吞噬作用或通过自然杀伤细胞杀伤寄生虫的能力。