CN116376948A - 一种质粒载体及展示外源蛋白的ms2噬菌体类似颗粒的制备方法 - Google Patents
一种质粒载体及展示外源蛋白的ms2噬菌体类似颗粒的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116376948A CN116376948A CN202210876094.3A CN202210876094A CN116376948A CN 116376948 A CN116376948 A CN 116376948A CN 202210876094 A CN202210876094 A CN 202210876094A CN 116376948 A CN116376948 A CN 116376948A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- plasmid vector
- phage
- protein
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 45
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 claims abstract description 11
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 8
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims abstract description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 40
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000114864 ssRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
- C12N2795/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
- C12N2795/18023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种质粒载体及展示外源蛋白的MS2噬菌体类似颗粒的制备方法。本发明提供的质粒载体的特征在于：该质粒载体依次含有阿拉伯糖启动子，MS2CP基因、琥珀密码子、Linker序列、外源蛋白基因插入部分、His标签编码序列、MS2噬菌体包装序列、锤头酶序列和编码MS2噬菌体成熟蛋白序列。通过该质粒载体可以制备表面展示外源蛋白的MS2噬菌体类似颗粒，可应用于MS2噬菌体亚单位疫苗的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及质粒载体及展示外源蛋白的噬菌体类似颗粒的制备方法。
背景技术
病毒样颗粒(Virus like particles，VLPs)是由多个病毒的一种或几种结构蛋白组装而成的大颗粒，不含病毒核酸，不能进行自主复制，具有与病毒颗粒类似的整体结构。VLPs由于具有安全性高，在结构上与病毒粒子相似，可通过与病毒粒子相同的途径激起免疫系统的有效应答等优点，近二十年来在人用、兽用疫苗及药物递送系统中的应用越来越受到关注。
病毒样颗粒(VLPs)具高安全性和有效性，代表了亚单位疫苗开发的重大进步。病毒样颗粒(VLPs)的颗粒性质和密集的重复亚基组织使它们成为展示疫苗抗原的理想支架，因可以呈现病原体关键抗原特征而具有很好的免疫原性常用作特定类型的亚单位疫苗。但VLP的抗原展示的往往需要精心设计并劳动密集型的试错优化。另外，纯化展示抗原的VLP步骤也比较繁琐沉淀，往往需要沉淀，过滤，或超高速离心。
大肠杆菌MS2噬菌体是二十面体的单链正义RNA病毒，可感染大肠杆菌和肠杆菌科的其他成员，其基因组含有3569个核苷酸，同时作为mRNA编码4中蛋白质，包括成熟酶蛋白(A蛋白)、衣壳蛋白(CP)、复制酶蛋白(Rep)和裂解蛋白(Lys)。成熟酶蛋白和衣壳蛋白能与外源ssRNA中特定茎环结构(称为pac位点)相互作用，自发包装形成不具有侵染活性的病毒颗粒，这里称之为MS2-VLPs。MS2-VLPs应用广泛，这些颗粒能够模拟ssRNA病毒，在疫苗、药物传递系统和免疫活性多肽显示系统或纳米机器等多个领域，可以作为分子检测、过程控制以及定量分析的参照物。
发明内容
本发明开发一种质粒载体，通过该质粒载体可以制备表面展示外源蛋白的MS2噬菌体类似颗粒，可应用于MS2噬菌体亚单位疫苗的制备。同时，在外源蛋白的羧基端引入His标签，便于快速简洁纯化表面展示蛋白的VLP。
本发明提供的质粒载体的特征在于：该质粒载体依次含有阿拉伯糖启动子，MS2CP基因、琥珀密码子、Linker序列、外源蛋白基因插入部分、His标签编码序列、MS2噬菌体包装序列、锤头酶序列和编码MS2噬菌体成熟蛋白序列。
具体的，所述MS2 CP基因，无终止密码子，编码的蛋白为GenBank:AZS06102.1，如SEQ ID NO.1所示。
具体的，所述琥珀密码子为TAG。
具体的，所述Linker序列，编码的蛋白序列以甘氨酸和丝氨酸为主，长度超过15个氨基酸。
具体的，外源蛋白基因插入部分有酶切位点，方便外源序列的克隆到载体上。
具体的，所述His标签编码序列，编码连续6个以上组氨酸。
优选的，上述His标签编码序列编码8-10个组氨酸。
具体的，所述MS2噬菌体包装序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
具体的，所述锤头酶序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
具体的，所述编码MS2噬菌体成熟蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。
具体的，所述MS2噬菌体包装序列和所述锤头酶序列之间加入10bp以上随机序列。
优选的，上述随机序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明还提供展示外源蛋白的MS2噬菌体类似颗粒的制备方法，具体步骤如下：
(1)采用本发明提供的质粒载体插入外源蛋白基因X后，转入琥珀密码子抑制宿主中表达；
(2)离心诱导表达后的菌液，得到菌体，破碎菌体，释放宿主内蛋白，离心取沉淀获得上清；
(3)上清经离子亲和层析纯化得到表面展示X蛋白的MS2噬菌体样颗粒。
有益效果：
通过本发明提供的质粒载体可以成功制备表面展示外源蛋白的MS2噬菌体类似颗粒，并可利用HIS标签快速纯化出来，可应用于MS2噬菌体亚单位疫苗的制备。
附图说明
图1为本发明一具体实施例中质粒载体的示意图；
图2为MS2PLP--EGFP-His透射电镜图；
图3为MS-VLP表面表达标记的鉴定结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述具体细节以便于充分理解本发明，本领域技术人员可以在不违背本发明构思的情况下做类似改进，因此本发明的保护范围不受下面公开的具体实施例的限制。
具体实施例中采用的材料来源：pBAD-HisA质粒(购自优宝生物公司。基因序列合成由发明人自行设计并委托上海生物生工有限公司合成。所有的试剂如IPTG和Bl21(DE3)，LB培养基、感受态细胞购自Takara大连生物有限公司。
质粒载体的构建
在本实施例中质粒载体的图谱如图1所示，含有阿拉伯糖启动子(图中所示，AraBAD promoter)，MS2 CP基因(图1中所示，A)，琥珀密码子(图1中所示，B),Linker序列(图1中所示，C)，外源蛋白基因插入部分(图1中所示，D)，His标签编码序列(图1中所示，E),MS2噬菌体包装序列(图1中所示，F)和MS2 A蛋白基因(图1中所示，H)，图1中G部分为锤头酶序列。包含上述序列特征的载体命名为pMS2-P-His。在D部分插入外源蛋白基因X后获得载体pMS2-XP-His。
设计序列如SEQ ID NO.9所示(1-6位为NcoI酶切位点；3-392位为编码MS2 CP蛋白的序列；393-395位为琥珀密码子TAG；396-452位为Linker序列；453-503位为外源基因插入部分，有酶切位点，453-458位为pstI酶切位点，462-467位为SpeI酶切位点，534-565位为编码10个组氨酸序列与MS2噬菌体包装序列之间的随机序列；504-533编码10个组氨酸；566-584位为MS2噬菌体包装序列；585-626位为随机序列，627-676位为锤头酶序列；677-745位为随机序列，746-1927位为编码MS2噬菌体成熟蛋白的序列)，满足图1中A,B,C,D,E,G,H的顺序要求，上海生物生工有限公司合成并委托其通过NcoI和HindIII克隆到pBAD-HisA质粒质粒上，得到的质粒名pMS2-P-His。其中MS2 CP基因，无终止密码子，编码的蛋白为GenBank:AZS06102.1，如SEQ ID NO.1所示；琥珀密码子为TAG；Linker序列，编码的蛋白序列以甘氨酸和丝氨酸为主，长度超过15个氨基酸；His标签编码序列编码10个组氨酸；MS2噬菌体包装序列SEQ ID NO.3所示；锤头酶序列如SEQ ID NO.4所示；编码MS2噬菌体成熟蛋白序列如SEQ ID NO.6所示；MS2噬菌体包装序列和所述锤头酶序列之间加入10bp以上随机序列，随机序列如SEQ ID NO.7所示。
展示外源蛋白的MS2噬菌体类似颗粒的制备
序列如SEQ ID NO.8所示，是编码绿色荧光蛋白(EGFP)的序列，由上海生物生工有限公司合成并委托其通过pstI位点克隆到pMS2-P-His上，得到载体pMS2-EGFPP-His。
载体转入宿主表达,宿主为琥珀密码子抑制宿主XL1blue。取40ng pMS2-EGFPP-His质粒转入XL1blue感受态细胞。在氨苄抗生素的LB平板上挑取单个阳性克隆，接种至液体5mL LB培养基中37℃、180r/min恒温摇床培养过夜。
取1mL过夜培养基加入100mL新鲜液体LB培养基中(含氨苄抗生素50ng/mL),37℃、180r/min恒温摇床培养至OD600为0.4-0.6之间，加入1mM的IPTG诱导后继续培养6-16h。
表面展示EGFP的MS2噬菌体颗粒的纯化采用常规实验方法:
1.5000g离心10min，回收菌体，用5mL无菌PBS重悬上一步骤离心得到的菌体。用超声破碎仪在冰上进行破碎。超声功率设置为30％，每次破碎8s，暂停12s，共破碎10min。超声结束后，向破碎后的菌液中加DNaseⅠ(终浓度1μg/mL)和RNase A(终浓度10μg/mL)于37℃水浴1-2h，以消化掉一部分大肠杆菌破碎后释放的核酸。将上述消化好的破碎菌液于4℃，4000rpm离心15min，取上清并用0.22μM一次性针头式过滤器过滤。
2.使用AKTA avant蛋白纯化，所用亲和层析柱为HisTrap HP 5ml。
(1)试剂：Binding buffer:25mM Tris-HCl(pH7.5)；0.5M NaCl；10mM咪唑,10％glycerol；Elution buffer:25mM Tris-HCl(pH7.5)；0.5M NaCl；0.5M咪唑,10％glycerol；20％乙醇；去离子水。上述试剂需超声10-15min以除气泡。
(2)纯化：
用Binding buffer以5ml/min的流速，平衡柱子至紫外峰值(UV-280)不再变化(约5-10个柱体积)；
柱子平衡好后，用一次性注射器吸取步骤1过滤样品，手动上样；
待UV-280重新回到基线，采用50nm，150nm，250nm和500nm咪唑梯度洗脱蛋白；
纯化结果显示在150nm咪唑洗脱时，出现洗脱峰；
收集洗脱液，设置为每孔收集0.5mL；
根据洗脱峰对应的收集孔，留取纯化后的洗脱样品。
MS-VLP的鉴定
1)电镜观察。取上述收集的洗脱液适当体积送广东省微生物所电镜(TEM)观察，结果如图2所示(比例尺100nm)。结果显示咪唑洗脱成分的结构为噬菌体样颗粒。
2)MS-VLP表面表达标记的鉴定
取适当体积的上述洗脱成分进行SDS-PAGE电泳分离和蛋白质杂交鉴定。SDS-PAGE电泳的分离胶浓度为12％，一抗为Anti-eGFP mouse monoclonal antibody(购自上海生物工程有限公司)，实验过程和操作参照分子克隆实验指南(J.萨姆布鲁克等，2017年科学出版社出版的图书)进行。SDS-PAGE电泳和蛋白质杂交样品，包括质粒转入宿主后诱导前样品，诱导后样品，超声破碎后上清、沉淀以及纯化后的样品，结果如下图3所示，图3中A为SDS-PAGE检测MS-VLP蛋白，其中M：蛋白标准分子量；1：诱导前总蛋白；2：诱导后总蛋白；3：破碎上清；4：破碎沉淀；5：洗脱液。图3中B为WB检测pMS2-EGFPP-His蛋白表达，其中M：蛋白标准分子量；1：洗脱液样品；2：破碎上清；3：诱导后总蛋白；4：诱导后总蛋白；5：诱导前总蛋白。(上方箭头所指处为衣壳蛋白与EGFP融合的蛋白；下方箭头所指处为衣壳蛋白)。结果显示MS-VLP成分中有CP与EGFP蛋白融合蛋白。
Claims (10)
1.一种质粒载体，其特征在于：该质粒载体依次含有阿拉伯糖启动子，MS2 CP基因、琥珀密码子、Linker序列、外源蛋白基因插入部分、His标签编码序列、MS2噬菌体包装序列、锤头酶序列和编码MS2噬菌体成熟蛋白序列。
2.如权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述MS2 CP基因，无终止密码子，编码的蛋白为GenBank:AZS06102.1，如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述Linker序列，编码的蛋白序列以甘氨酸和丝氨酸为主，长度超过15个氨基酸。
4.如权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：外源蛋白基因插入部分有酶切位点。
5.如权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述His标签编码序列，编码连续6个以上组氨酸。
6.如权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述MS2噬菌体包装序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
7.如权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述锤头酶序列如SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示；所述编码MS2噬菌体成熟蛋白序列如SEQ ID NO.6所示。
8.如权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述MS2噬菌体包装序列和所述锤头酶序列之间加入10bp以上随机序列。
9.如权利要求8所述的质粒载体，其特征在于：所述随机序列如SEQ ID NO.7所示。
10.展示外源蛋白的MS2噬菌体类似颗粒的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)采用权利要求1-9提供的任一质粒载体插入外源蛋白基因X后，转入琥珀密码子抑制宿主中表达；
(2)离心诱导表达后的菌液，得到菌体，破碎菌体，释放宿主内蛋白，离心取沉淀获得上清；
(3)上清经离子亲和层析纯化得到表面展示X蛋白的MS2噬菌体样颗粒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210876094.3A CN116376948B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种质粒载体及展示外源蛋白的ms2噬菌体类似颗粒的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210876094.3A CN116376948B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种质粒载体及展示外源蛋白的ms2噬菌体类似颗粒的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116376948A true CN116376948A (zh) | 2023-07-04 |
| CN116376948B CN116376948B (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=86962002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210876094.3A Active CN116376948B (zh) | 2022-07-25 | 2022-07-25 | 一种质粒载体及展示外源蛋白的ms2噬菌体类似颗粒的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116376948B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105969786A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-09-28 | 博奥生物集团有限公司 | 一种表达ms2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶的质粒 |
| WO2017107060A1 (zh) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种新型病毒样颗粒表达载体、其构建方法及应用 |
| CN109957569A (zh) * | 2017-12-22 | 2019-07-02 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 基于cpf1蛋白的碱基编辑系统和方法 |
| CN113265489A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-08-17 | 广州医科大学 | 一种基于ms2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法 |
-
2022
- 2022-07-25 CN CN202210876094.3A patent/CN116376948B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017107060A1 (zh) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种新型病毒样颗粒表达载体、其构建方法及应用 |
| CN105969786A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-09-28 | 博奥生物集团有限公司 | 一种表达ms2噬菌体衣壳蛋白和成熟酶的质粒 |
| CN109957569A (zh) * | 2017-12-22 | 2019-07-02 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 基于cpf1蛋白的碱基编辑系统和方法 |
| CN113265489A (zh) * | 2021-06-01 | 2021-08-17 | 广州医科大学 | 一种基于ms2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116376948B (zh) | 2023-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3782104B2 (ja) | 医薬品等級プラスミドｄｎａの製造方法 | |
| GB2604692A (en) | Method for preparing recombinant subunit vaccine against novel coronavirus | |
| CN114480441B (zh) | 一段核苷酸序列及其表达重组蛋白纳米颗粒在犬瘟热病毒疫苗的应用 | |
| CN114703204B (zh) | 猫细小病毒vp2蛋白及所得自主组装病毒样颗粒 | |
| CN106636016B (zh) | 一种通过正负电荷引入辅助病毒样颗粒自组装的方法和应用 | |
| CN111303251B (zh) | 一种口蹄疫病毒样颗粒体外组装的方法及其应用 | |
| WO2024146613A1 (zh) | 一种人乳头瘤病毒56型l1蛋白突变体及减少重组蛋白降解的方法及应用 | |
| CN113462699A (zh) | 一种利用大肠杆菌表达猫细小vp2蛋白自主组装病毒样颗粒的制备 | |
| WO2017113050A1 (zh) | 猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物 | |
| CN116376948B (zh) | 一种质粒载体及展示外源蛋白的ms2噬菌体类似颗粒的制备方法 | |
| CN116514999B (zh) | 一种嵌合表达口蹄疫病毒抗原表位融合蛋白、自组装纳米颗粒制备及其应用 | |
| CN113144187A (zh) | 一种含EB病毒gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用 | |
| CN111378017B (zh) | 小反刍兽疫病毒的亚单位f蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN110846326A (zh) | 一种貉细小病毒vp2基因、表达载体、重组菌、制备vp2蛋白的方法和组装方法 | |
| CN114369610B (zh) | 一种基于单质粒的t7噬菌体病毒样颗粒自组装方法 | |
| CN112724204B (zh) | 一种用于生产vlp重组疫苗的cmv病毒样颗粒及其制备方法 | |
| CN108715607B (zh) | 重组霍乱毒素b亚基蛋白、pedv灭活疫苗及制备与应用 | |
| CN117126870A (zh) | 一种质粒载体体系及ms2噬菌体类似颗粒的制备方法 | |
| CN117883561B (zh) | 一种禽腺病毒血清4型MSN-CC-Fiber2纳米颗粒疫苗的制备与应用 | |
| CN113388585B (zh) | 一种噬菌体高滴度培养方法与应用 | |
| US20220184205A1 (en) | Universal bacteriophage t4 nanoparticle platform to design multiplex sars-cov-2 vaccine candidates by crispr engineering | |
| CN115960265B (zh) | 一种长效多价猪口蹄疫和猪瘟疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN116870145B (zh) | 九组分抗原非洲猪瘟纳米颗粒疫苗 | |
| US20240050559A1 (en) | Method of making virus-like particle | |
| CN115850403A (zh) | 细菌外膜蛋白、表达盒、病毒样颗粒及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |