CN116371308A - 一种螺旋藻低聚叶绿素微胶囊及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新材料技术领域，公开了一种螺旋藻低聚叶绿素微胶囊，包括壳层和芯材，所述核层内包裹有低聚叶绿素，所述低聚叶绿素为由2～4个叶绿素分子组成。微胶囊直接采用低聚叶绿素作为微胶囊的芯材，其包埋效率高；同时本发明还公开了该微胶囊的制备方法和用途。
Description
技术领域
本发明属于新材料领域，具体涉及一种螺旋藻低聚叶绿素微胶囊及其制备方法和应用。
背景技术
螺旋藻因其含多种营养成分和有多种健康益处而可被用作食品和膳食补充剂，这些营养成分中就包含叶绿素。螺旋藻在自然界中存量巨大且尚未被充分利用，是一类丰富的资源储备，具有良好的潜在应用前景。然而，螺旋藻自身独有的不良气味、口感味道以及含有可能会引起部分人群发生过敏反应的物质却限制了其进一步的发展利用，因此提取螺旋藻中含有的有益天然物质是扩大螺旋藻利用的直接有效方法。
叶绿素广泛存在于高等植物的叶片和果实中，呈现明亮的绿色，是植物进行光合作用的主要色素，它对于植物的生长具有不可忽视的作用。近年来有关叶绿素对人体健康有益的研究趋势逐渐火热，叶绿素的功效值得去关注。目前已知叶绿素对人体有降低胆固醇、排毒、改善便秘、抗衰老、抗炎症、抗菌以及抗癌防突变的功能。叶绿素作为一种常见的天然色素，储存量巨大且随处可见，而随着人们经济水平的提高以及对健康的追求使得叶绿素具有十分广阔的市场前景。然而，叶绿素并不是一个稳定的结构，在光照条件下叶绿素会变成激发态。此时叶绿素会失去电子导致其氧化性大大提高，去争夺其他物质的电子，例如水，而这会让其本身变得极不稳定，该过程被称为叶绿素的光解。正是因为叶绿素的稳定性差、水溶性极差的性质限制了它们的实际应用，如何更高效的利用叶绿素使其对人体健康有益成为一道难题。
微胶囊技术是将稳定性和水溶性的化合物做为壁材单独或结合使用，以达到封装敏感化合物或化学物质等核心基质的一种技术手段。蛋白质(乳清蛋白、大豆蛋白、明胶等)、多糖(阿拉伯胶、麦芽糊精、改性淀粉和壳聚糖等)和脂质(磷脂等)通常被选为封装活性化合物的常见壁材料。而根据不同的芯材，选择适当的壁材对其进行封装以达到最好的封装效果成为该项技术的关键。
叶绿素在被壁材于水溶剂中封装时，往往会发生自聚集的现象。这种现象的产生一般与壁材的性质无关，而与叶绿素本身的结构属性有着直接的关联。在极性溶剂(如含水溶剂)中，受到极性溶剂包含的极性基团(OH、COOH等基团)的影响，导致与叶绿素结构组成中的中心镁原子相互作用，再与吡咯环氮同时形成氢键以及金属配位键。该种分子间的相互作用力会使叶绿素单体之间相互聚集形成高聚叶绿素，但这种高聚叶绿素对于微胶囊封装而言是不利的。高聚叶绿素的粒径较大，这会导致制备的叶绿素微胶囊体粒径变大，表面出现较大的孔洞，此类缺陷会显著降低微胶囊体的稳定性和生物利用率。
现有技术中，关于叶绿素的胶囊化的相关文献参考如下：
D1：CN115381094A公开了一种低臭味水溶性叶绿素铜及其制备方法与应用。通过采用糊膏状的叶绿素铜为原料，分别进行“脱臭”处理、胶体溶液乳化处理以及二次微胶囊包埋干燥处理，不采用强碱皂化或钠化操作，工艺路线更为安全、简洁，得到的低臭味水溶性叶绿素铜具有良好的水溶性，在pH值2～4.0溶液中不易沉淀、稳定性好、低臭味，在果冻、果酱类产品应用时不易“渗色”。
D2：CN106377539A公开了一种叶绿素亚铁微胶囊及其制备方法，其制备工艺具体包括如下步骤：
1)制备芯材溶液：准确称取20-30重量份叶绿素亚铁、10-20重量份大黄酸和10-20重量份淫羊藿苷，将其依次加入到200份赤藓醇中，搅拌均匀，得到芯材溶液；
2)制备壁材溶液：称取50-150重量份的瓜尔豆胶和200-500重量份变性淀粉，加550-1350重量份赤藓醇溶解，得到壁材溶液；
3)微胶囊制备：控制芯材干物质为壁材溶液干物质重量的15～28％，将芯材溶液与壁材溶液混合得到分散液；向分散液中加入其重量的0.5～1.5％的二聚甘油二油酸酯和1～1.4％蔗糖脂肪酸酯的混合乳化剂，搅拌均匀后在65～83℃、18～32MPa条件下乳化，喷雾干燥，即得叶绿素亚铁微胶囊。
D3：CN103157415A公开了一种彩色微胶囊，其包括囊壁及非水溶性囊芯，该囊壁是以天然色素、明胶以及具有与明胶相反电荷的水溶性聚合物做为壁材采用复合凝聚法所形成。本发明还涉及该彩色微胶囊的制备方法；该天然色素选自胡萝卜素类、蒽醌类、萘醌类、类黄酮类、姜黄素类、靛蓝类、叶绿素类中的至少一种。
D4：CN101322568A公开了一种螺旋藻微胶囊及其制备方法，以新鲜海洋生物螺旋藻为囊芯物，以海藻酸钠、CaCl2、附加剂和水为壁材。
通过以上专利分析可见，现有技术关于叶绿素的微胶囊处理大概分为两个方向：
1.普通胶囊化包裹水溶性叶绿素，即叶绿素衍生物，不是天然叶绿素分子；
2.将叶绿素作为壁材使用。
在研究过程中我们发现如下问题：
1.叶绿素单体、壳材在水溶液中构建微胶囊时，叶绿素单体容易自聚形成较大粒径的聚合物，包埋存在问题；
如果将大粒径的高聚叶绿素解聚成低聚叶绿素，这条路经比较困难，现阶段还没看到解决的可行方案。
2.叶绿素和壳材组成的微胶囊的稳定性值得关注；微胶囊最后需要经过喷雾成为粉末，并在使用过程中需要再分散，因此微胶囊的稳定性是较为重要的，这是保证叶绿素能够作为营养元素传递给作用对象的可靠保证；
所以，本项目的首要核心问题是上述(1)所记载的现实情况，即如何形成高效包埋的微胶囊。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种螺旋藻低聚叶绿素微胶囊，该微胶囊直接采用低聚叶绿素作为微胶囊的芯材，其包埋效率高；
同时本发明还公开了该微胶囊的制备方法，其除了采用低聚叶绿素之外，还附加了第一双极高压脉冲电场，通过第一双极高压脉冲电场促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用，提高微胶囊的稳定性。
在本发明中，低聚叶绿素采用第二双极高压脉冲电场来制作；需要说明的是，本发明所涉及的第一双极高压脉冲电场、第二双极高压脉冲电场其作用机理完全不同；在低聚叶绿素制备过程中，第二双极高压脉冲电场用于和非极性有机溶剂协同，避免叶绿素高度自聚形成高聚叶绿素，在作用于水时可保持稳定性；在制备微胶囊时，第一双极高压脉冲电场用于促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用，提高微胶囊的稳定性。
同时，本发明还提供了该螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：一种螺旋藻低聚叶绿素微胶囊，包括壳层和芯材，所述核层内包裹有低聚叶绿素，所述低聚叶绿素为由2～4个叶绿素分子组成。
经过实验证实，单个叶绿素的粒径为9～10nm；本发明包裹的低聚叶绿素的粒径为15～34nm左右，因此可以得知，本发明包裹的低聚叶绿素是由2，3或4个叶绿素分子组成；
在上述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊中，所述壳层由蛋白质、多糖、脂质中的一种或多种组成。
更为具体来说，所述蛋白质为乳清分离蛋白、大豆蛋白或明胶；所述多糖为阿拉伯胶、麦芽糊精、改性淀粉或壳聚糖；所述脂质为天然磷脂、改性磷脂或胆固醇。
在上述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊中，所述壳层由乳清分离蛋白和阿拉伯胶按照1:0.1～1的重量比组成。
乳清分离蛋白和阿拉伯胶的重量比可为：1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9或1:1；
同时，本发明还公开了上述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法，将用于构成壳层的壳材、含低聚叶绿素的溶液分散到水溶液中，在第一双极高压脉冲电场的作用下构建螺旋藻低聚叶绿素微胶囊；所述第一双极高压脉冲电场的电场强度为10～50kV/cm，脉宽为50～150μs，频率为10～100Hz；
所述壳材中至少部分原料为乳清分离蛋白。
在上述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法中，所述第一双极高压脉冲电场的脉冲个数为10～300个。
在一些实施案例汇总，所述脉冲个数为10、20、30、40、50、100、150、200、250或300个；
在上述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法中，所述低聚叶绿素的溶液的制备方法为：
步骤11：采用醇类溶剂从植物的细胞中提取叶绿素得到浆液，将浆液加入到非极性有机溶剂中，得到含叶绿素的有机溶液；
本发明所述的醇类溶剂可选为甲醇或乙醇，从安全性角度来说，首推乙醇。
所述步骤11中，辅以超声波震荡提取和破碎均质搅拌提取结合的方法利用无水乙醇从植物中提取叶绿素；
超声声能密度为1.0～1.6W/g，超声作用的时间为0.5～2.5h，料液重量比1:10～20；提取后通过离心操作获得叶绿素粗提取液；
步骤12：使用第二双极高压脉冲电场对有机溶液进行处理，形成聚合度小于或等于4的低聚叶绿素，得到含低聚叶绿素的溶液；
所述第二双极高压脉冲电场的电场强度为1～10kV/cm，脉宽为20～40μs，频率为10～100Hz；所述第二双极高压脉冲电场的脉冲个数为10～300个；
所述步骤12具体为：向叶绿素粗提取液中加入正己烷进行提纯，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
在上述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法中，所述第一双极高压脉冲电场处理时间为10～60min；所述第二双极高压脉冲电场处理时间为10～60min；
在一些实施案例中，所述第一双极高压脉冲电场处理时间为10min、20min、30min、40min、50min或60min；
在一些实施案例中，所述第二双极高压脉冲电场处理时间为10min、20min、30min、40min、50min或60min；
所述第一双极高压脉冲电场的处理温度、所述第二双极高压脉冲电场的处理温度均为20～40℃；
一般来说，在室温下处理即可。
所述非极性有机溶液为正己烷或苯；
所述有机溶液中叶绿素的浓度为100μg/mL～300μg/mL，叶绿素纯度可达70～90％；
需要说明的是，在有机溶剂中除了叶绿素之外，还有一些从细胞中提取的油溶性的物质，因此70～90％的叶绿素纯度是指：有机溶剂中的固相中叶绿素的含量为70～90wt％。
所述植物为藻类植物或种子植物。
在上述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法中，所述壳材在与含低聚叶绿素的溶液混合之前，先将壳材加入水中与水进行水合反应，得到壳材溶液，所述壳材溶液中壳材浓度为1～5wt％；所述壳材溶液、含低聚叶绿素的溶液的体积比为1～10:1；
在一些实施案例中，所述壳材溶液中壳材浓度为1wt％、2wt％、3wt％、4wt％或5wt％；
在一些实施案例中，所述壳材溶液、含低聚叶绿素的溶液的体积比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1；
所述螺旋藻低聚叶绿素微胶囊经过干燥处理得到粉末状的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
最后，本发明还公开了如上任一所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊作为食品添加剂、饲料添加剂的用途。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明采用低聚叶绿素制备微胶囊，微胶囊的叶绿素封装率高，可以有效防止螺旋藻叶绿素的分解，使产品货架期由不足1周提高到1个月，产品货架期更长。
在封装效率和稳定性良好的前提下，淡化了螺旋藻叶绿素天然的不良气味，使其更易于被大众人群接受，同时水溶性也得到提高。
本发明的微胶囊的制备方法，其除了采用低聚叶绿素之外，还附加了第一双极高压脉冲电场，通过第一双极高压脉冲电场促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用，提高微胶囊的稳定性和封装效率；
本发明的低聚叶绿素通过第二高压脉冲电场的处理含叶绿素的有机溶剂，降低了叶绿素在含有醇类溶剂和非极性有机溶剂的混合溶剂中发生自聚集的程度。同时，我们还发现高压脉冲电场的处理后的叶绿素促进了叶绿素低聚体结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用，使得制备而成的叶绿素微胶囊的粒径更小，封装效果更好，稳定性更佳。
就其原理来说，我们认为，通过第一双极高压脉冲电场促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用，提高微胶囊的稳定性和封装效率。
低聚叶绿素采用第二双极高压脉冲电场来制作；第二高压脉冲电场的高静电场、磁场效应可引起溶液中化合物极性基团电离程度和电荷数的变化，从而改变化合物分子中弱的非极性共价键和分子间作用力，进而阻止混合溶剂中的极性溶剂包含的OH基团与叶绿素结构组成中的中心镁原子相互作用、与吡咯环氮同时形成氢键以及金属配位键，实现低聚合度的叶绿素的合成；在本发明中，采用乙醇提取叶绿素是一方面提取成本低、操作方便，另外一方面，通过加入到非极性有机溶剂中，控制乙醇含量，可制造一种可自聚的环境，在高压脉冲电场的加持下，又保持较为克制的自聚；因此从必要性的角度来说，提取采用乙醇、后处理采用乙醇正己烷混合溶剂是实现低聚的有效保证。
需要说明的是，本发明所涉及的第一双极高压脉冲电场、第二双极高压脉冲电场其作用机理完全不同；在低聚叶绿素制备过程中，第二双极高压脉冲电场用于和非极性有机溶剂协同，避免叶绿素高度自聚形成高聚叶绿素，在作用于水时可保持稳定性；在制备微胶囊时，第一双极高压脉冲电场用于促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用，提高微胶囊的稳定性。
附图说明
图1为叶绿素的红外光谱图；
图2为阿拉伯胶的红外光谱图；
图3为乳清分离蛋白的红外光谱图；
图4为实施例5-7的红外光谱图；
图5为不同实施例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊紫外线处理后叶绿素保留率；
图6为阿拉伯胶粉的电镜图；
图7为乳清分离蛋白的电镜图；
图8为对比例4的电镜图；
图9为实施例5的电镜图；
图10为实施例6的电镜图；
图11为实施例7的电镜图；
图12为实施例8的电镜图；
图13为实施例9的电镜图；
图14为对比例5的电镜图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
第一部分低聚叶绿素的制备和性能验证
实施例1
步骤1：制备螺旋藻叶绿素提取液：采用超声波震荡提取和破碎均质搅拌提取结合的方法利用无水乙醇10mL从螺旋藻粉末1g中提取叶绿素，设置超声声能密度为1.0W/g，超声作用的时间为0.5h，料液比1:10(w/w)。
提取后通过离心操作13000g，4℃获得叶绿素粗提取液约10mL，之后加入正己烷50mL进行提纯，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
步骤2：利用PEF技术阻止叶绿素发生自聚集而形成聚合度小于4的低聚叶绿素：将螺旋藻叶绿素提取液在20℃温度下置于脉宽为40μs的双极高压脉冲电场进行电离10min，其中电场强度为1kV/cm，频率为10Hz，脉冲个数为10个，以此来阻止叶绿素发生自聚集，而形成聚合度小于4的低聚叶绿素，最终获得螺旋藻低聚叶绿素提取液。
实施例2
步骤1：制备螺旋藻叶绿素提取液：采用超声波震荡提取和破碎均质搅拌提取结合的方法利用无水乙醇30mL从螺旋藻粉末2g中提取叶绿素，设置超声声能密度为1.3W/g，超声作用的时间为1.5h，料液比1:15(w/w)。
提取后通过离心操作13000g，4℃获得叶绿素粗提取液约30mL，之后加入正己烷150mL进行提纯，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
步骤2：利用PEF技术阻止叶绿素发生自聚集而形成聚合度小于4的低聚叶绿素：将螺旋藻叶绿素提取液在30℃温度下置于脉冲宽度为30μs的双极高压脉冲电场脉冲进行电离30min，其中电场强度为5kV/cm，频率为50Hz，脉冲个数为150个，以此来阻止叶绿素发生自聚集，而形成聚合度小于4的低聚叶绿素，最终获得螺旋藻低聚叶绿素提取液。
实施例3
步骤1：制备螺旋藻叶绿素提取液：采用超声波震荡提取和破碎均质搅拌提取结合的方法利用无水乙醇100mL从螺旋藻粉末5g中提取叶绿素，设置超声声能密度为1.6W/g，超声作用的时间为2.5h，料液比1:20(w/w)。
提取后通过离心操作13000g，4℃获得叶绿素粗提取液约100mL，之后加入正己烷500mL进行提纯，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
步骤2：利用PEF技术阻止叶绿素发生自聚集而形成聚合度小于4的低聚叶绿素：将螺旋藻叶绿素提取液在40℃温度下置于脉冲宽度为20μs的双极高压脉冲电场脉冲进行电离60min，其中电场强度为10kV/cm，频率为80Hz，脉冲个数为300个；以此来阻止叶绿素发生自聚集，而形成聚合度小于4的低聚叶绿素，最终获得螺旋藻低聚叶绿素提取液。
实施例4
步骤1：制备螺旋藻叶绿素提取液：采用超声波震荡提取和破碎均质搅拌提取结合的方法利用无水乙醇10mL从螺旋藻粉末1g中提取叶绿素，设置超声声能密度为1.0W/g，超声作用的时间为0.5h，料液比1:10(w/w)。
提取后通过离心操作13000g，4℃获得叶绿素粗提取液约10mL，之后加入正己烷50mL进行提纯，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
步骤2：利用PEF技术阻止叶绿素发生自聚集而形成聚合度小于4的低聚叶绿素：将螺旋藻叶绿素提取液在20℃温度下置于脉宽为40μs的双极高压脉冲电场脉冲进行电离10min，其中电场强度为10kV/cm，频率为100Hz，脉冲个数为10个，以此来阻止叶绿素发生自聚集，而形成聚合度小于4的低聚叶绿素，最终获得螺旋藻低聚叶绿素提取液。
对比例1
步骤1：制备螺旋藻叶绿素提取液：采用超声波震荡提取和破碎均质搅拌提取结合的方法利用无水乙醇10mL从螺旋藻粉末1g中提取叶绿素，设置超声声能密度为1.0W/g，超声作用的时间为0.5h，料液比1:10(w/w)。
提取后通过离心操作13000g，4℃获得叶绿素粗提取液10mL，之后加入正己烷50mL进行提纯，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
对比例2
步骤1：制备螺旋藻叶绿素提取液：采用超声波震荡提取和破碎均质搅拌提取结合的方法利用无水乙醇10mL从螺旋藻粉末1g中提取叶绿素，设置超声声能密度为1.0W/g，超声作用的时间为0.5h，料液比1:10(w/w)。
提取后通过离心操作13000g，4℃获得叶绿素粗提取液约10mL，之后加入正己烷50mL进行提纯，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
步骤2：将螺旋藻叶绿素提取液在20℃温度下置于脉宽为10μs的双极高压脉冲电场中脉冲进行电离10min，其中电场强度为0.5kV/cm，频率为200Hz，脉冲个数为10个，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
对比例3
步骤1：制备螺旋藻叶绿素提取液：采用超声波震荡提取和破碎均质搅拌提取结合的方法利用无水乙醇10mL从螺旋藻粉末1g中提取叶绿素，设置超声声能密度为1.0W/g，超声作用的时间为0.5h，料液比1:10(w/w)。
提取后通过离心操作13000g，4℃获得叶绿素粗提取液约10mL，之后加入极性溶剂—乙醇水溶液(无水乙醇：水＝1:2，v/v)50mL进行提纯，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
步骤2：将螺旋藻叶绿素提取液在20℃温度下置于脉宽为40μs的双极高压脉冲电场脉冲进行电离10min，其中电场强度为1kV/cm，频率为10Hz，脉冲个数为10个，收集上清液即为螺旋藻叶绿素提取液。
性能测试1
粒径测定：采用Malvern Nanosizer ZS(Malvern,Worcestershire,UK)设备的动态光散射(DLS)测试实施例1-5以及对比例1-3的叶绿素溶液中叶绿素聚合体粒径。每个样品重复三次在室温下进行测试。对照组采用正己烷溶解叶绿素(色谱纯，sigma公司)。
结果可参考表1：
表1粒径测试结果
a-h同一列中的不同字母表示彼此之间的显著差异(p<0.05)
从表1结果可以看出来，相比于溶解于非极性溶剂的叶绿素对照组而言，实施例1、2、3、4的粒径大小均比较小，粒径比值在3.62～1.67之间，而对比例1、2、3的粒径接近于微米级，粒径比值超过了92，其中，对比例1中混合溶剂中存在乙醇，在静置过程中，会发生自聚；对比例2中由于电场强度较低，其不足以抑制OH基团与叶绿素结构组成中的中心镁原子相互作用、与吡咯环氮同时形成氢键以及金属配位键的作用，导致粒径较大；对比例3中，采用的是纯乙醇相并且还含有水，即使在电场作用下，也会发生剧烈的自聚反应。
上述实施例和对比例的结果说明通过本专利的方法可以有效的降低叶绿素自聚集现象的发生。
性能测试2
微胶囊制备性能测试
微胶囊制备方法如下：将乳清分离蛋白粉和阿拉伯胶粉按照1:0.1的质量比溶解在去离子水中得到浓度为1％的复合壁材溶液，将其冷却至室温并在温度为0℃下保藏过夜，以确保完全水合。再将螺旋藻低聚叶绿素提取液与复合壁材溶液按照1:1的体积比混合，在室温下置于双极性高压脉冲电场中使用10个100μs的脉冲进行电离10min，其中脉冲电场强度为10kV/cm，频率为10Hz，以促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用。最后，冷冻干燥得到螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
上述方法中，所使用的螺旋藻低聚叶绿素提取液采用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的最终产物制备得到。实施例1、对比例1、对比例2、对比例3中叶绿素的浓度近似。
测试项目1：螺旋藻低聚叶绿素微胶囊视觉色彩的测定
在室温下通过色度计测量每个微胶囊的视觉颜色。测量数据以Hunter颜色值表示，即L*、a*和b*值，分别代表亮度(0至100)、绿度(-)至红度(+)和蓝度(-)至黄度(+)。此外，色差(ΔE*)计算方程(1)如下，这表明的是样品颜色强度。
式中ΔL*、Δa*和Δb*分别是实施列1、2、3与对照组之间的差值。
表2不同实施例和对比例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊视觉颜色
a-d同一列中的不同字母表示彼此之间的显著差异(p<0.05)
从表2结果可以看出来，实施例1的L*显著低于对照组，可能是形成了均匀的叶绿素微胶囊导致亮度有所下降。a*值均为负值，因为叶绿素自身带有绿色从而导致微胶囊整体呈现出绿色，而实施例1的a*值最小，说明形成的微胶囊较为均匀。与实施例1相比，ΔE*＞4，说明对比例与实施例之间存在肉眼可见的差异，而这个差异与微胶囊的均匀度相关。
测试项目2
对螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的封装率(EE)进行检测
将50mg微胶囊加入到5mL的乙醇中，同时搅拌10min，然后将混合物以9000×g离心10min以获得上清液A。另一个样品(50mg)加入到5mL乙醇中，使用超声波细胞破碎仪以350W处理10min。然后，以9000×g离心10min获得上清液B。分别用紫外-可见光光谱仪测定上清液A和B的叶绿素含量，其分别代表微胶囊样本的表面叶绿素(SCHs)和总叶绿素(TCHs)含量，并用方程(2)和(3)计算叶绿素的封装率。
CChlorophyll＝6.10×A665+20.04×A649 (2)
其中叶绿素代表CH的浓度(μg/mL)，A665和A649分别代表665和649nm处的吸光度，6.10和20.04是转移系数。
表3不同实施例和对比例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的总叶绿素(TCHs)、表面叶绿素(SCHs)以及封装率(EE)
a-c同一列中的不同字母表示彼此之间的显著差异(p<0.05)
从表3可以看出来，较对照组1、2、3，实施例1所制备的微胶囊的表面叶绿素含量最低，并且表现出显著性差异性(p<0.05)。实施例1包埋率超过了92％以上，高于对照2组9.16％，说明通过本专利方法制备的叶绿素微胶囊具有更好的包埋率，这可能与叶绿素以低聚形式存在具有直接关系。
测试项目3：对螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的DPPH自由基清除活性进行检测
取在室温下贮藏1个月的微胶囊，用超声波将100mg微胶囊与10mL去离子水混合1min，然后以9000×g离心10min。随后，将3mL上清液与2mL的DPPH溶液(0.1mmol/L，溶于无水乙醇)混合，然后在室温下避光反应30min。最后，用紫外可见分光光度计在517nm处测量样品的DPPH混合溶液的吸光度。DPPH自由基清除活性通过公式(5)计算。
这里Asample表示样品溶液的吸光值，Ablank表示蒸馏水替代样品溶液的吸光值，Acontrol表示乙醇替代DPPH溶液的吸光值。
表4不同实施例和对比例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的DPPH自由基清除率测试结果
a-c同一列中的不同字母表示彼此之间的显著差异(p<0.05)
从表4可以看出，实施例1DPPH自由基清除率显著高于对比例1、2、3，且表现出显著性差异(p<0.05)，说明本发明制备的叶绿素微胶囊所具有的抗氧化性能较强，这与叶绿素的存在形式和微胶囊中叶绿素的包埋率具有显著的关系。
第二部分微胶囊的制备和性能验证
实施例5
将乳清分离蛋白粉和阿拉伯胶粉按照1:0.1的质量比溶解在去离子水中得到浓度为1％的复合壁材溶液，将其冷却至室温并在温度为0℃下保藏过夜，以确保完全水合。再将实施例1获得的螺旋藻低聚叶绿素提取液与复合壁材溶液按照1:1的体积比混合，在室温下置于双极性高压脉冲电场中使用脉宽为100μs的脉冲进行电离10min，其中脉冲电场强度为10kV/cm，频率为10Hz，脉冲个数为10个，以促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用。最后，冷冻干燥得到螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
实施例6
制备螺旋藻低聚叶绿素微胶囊：将乳清分离蛋白粉和阿拉伯胶粉按照1:0.5的质量比溶解在去离子水中得到浓度为2.5％的复合壁材溶液，将其冷却至室温并在温度为2℃下保藏过夜，以确保完全水合。再将实施例2获得的螺旋藻低聚叶绿素提取液与复合壁材溶液按照1:5的体积比混合，在室温下置于双极性高压脉冲电场中使用脉宽为100μs的脉冲进行电离30min，其中脉冲电场强度为25kV/cm，频率为50Hz，脉冲个数为150个，以促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用。最后，冷冻干燥得到螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
实施例7
制备螺旋藻低聚叶绿素微胶囊：将乳清分离蛋白粉和阿拉伯胶粉按照1:1的质量比溶解在去离子水中得到浓度为5％的复合壁材溶液，将其冷却至室温并在温度为4℃下保藏过夜，以确保完全水合。再将实施例3获得的螺旋藻低聚叶绿素提取液与复合壁材溶液按照1:10的体积比混合，在室温下置于双极性高压脉冲电场中使用脉宽为100μs的脉冲进行电离60min，其中脉冲电场强度为50kV/cm，频率为100Hz，脉冲个数为300个，以促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用。最后，冷冻干燥得到螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
实施例8
将乳清分离蛋白和麦芽糊精按照1:0.2的质量比溶解在去离子水中得到浓度为1％的复合壁材溶液，将其冷却至室温并在温度为0℃下保藏过夜，以确保完全水合。再将实施例1获得的螺旋藻低聚叶绿素提取液与复合壁材溶液按照1:1的体积比混合，在室温下置于双极性高压脉冲电场中使用脉宽为100μs进行电离10min，其中脉冲电场强度为10kV/cm，频率为10Hz，脉冲个数为10个，以促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用。最后，冷冻干燥得到螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
实施例9
将乳清分离蛋白和壳聚糖按照1:0.2的质量比溶解在去离子水中得到浓度为1％的复合壁材溶液，将其冷却至室温并在温度为0℃下保藏过夜，以确保完全水合。再将实施例1获得的螺旋藻低聚叶绿素提取液与复合壁材溶液按照1:1的体积比混合，在室温下置于双极性高压脉冲电场中使用脉宽为100μs进行电离10min，其中脉冲电场强度为10kV/cm，频率为10Hz，脉冲个数为10个，以促进低聚叶绿素结构中植醇和酯键与乳清分离蛋白结构中酪氨酸、色氨酸疏水残基之间的相互作用。最后，冷冻干燥得到螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
对比例4
将乳清分离蛋白粉和阿拉伯胶粉按照1:0.1的质量比溶解在去离子水中得到浓度为1％的复合壁材溶液，将其冷却至室温并在温度为0℃下保藏过夜，以确保完全水合。再将实施例1获得的螺旋藻低聚叶绿素提取液与复合壁材溶液按照1:1的体积比混合，在室温下机械搅拌(1000rpm)处理10min，促进微胶囊的形成。最后，冷冻干燥得到螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
对比例5
将乳清分离蛋白粉和阿拉伯胶粉按照1:0.1的质量比溶解在去离子水中得到浓度为1％的复合壁材溶液，将其冷却至室温并在温度为0℃下保藏过夜，以确保完全水合。再将实施例1获得的螺旋藻低聚叶绿素提取液与复合壁材溶液按照1:1的体积比混合，在室温下置于双极性高压脉冲电场中使用脉宽为100μs进行电离10min，其中脉冲电场强度为5kV/cm，频率为10Hz，脉冲个数为10个，促进微胶囊形成。最后，冷冻干燥得到螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
性能测试
实施例5～9以及对比例4和5的性能测试主要包括：1.螺旋藻低聚叶绿素微胶囊视觉色彩的测定(参考测试项目1)；测试结果可参考表5；
表5不同实施例和对比例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊视觉颜色
a-c同一列中的不同字母表示彼此之间的显著差异(p<0.05)
通过表5的结果看出，相比于对照组4、5，本专利实施例的L*较低，可能是形成了均匀的叶绿素微胶囊导致亮度有所下降。a*值均为负值，因为叶绿素自身带有绿色从而导致微胶囊整体呈现出绿色，而本发明实施例所有的a*值均小于对照组1、2、3，说明本发明制备的低聚叶绿素均匀的分布于微胶囊中。与实施例5相比，实施例6、7、8、9的ΔE*＜4，说明本发明实施例之间不存在肉眼可见的差异而对比例4、5与实施例5之间的ΔE*＞4，说明存在肉眼可见的差异，而这个差异与低聚叶绿素在微胶囊的分布均匀情况相关。
2.对螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的封装率(EE)进行检测(参考测试项目2)；
表6不同实施例和对比例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的总叶绿素(TCHs)、表面叶绿素(SCHs)以及封装率(EE)
a-e同一列中的不同字母表示彼此之间的显著差异(p<0.05)
通过表6的结果看出，相比于对照组4、5，本发明所有的实施例表面叶绿素含量较低，包埋率均高于92％以上，且表现出显著性差异，说明通过本发明的方法制备的低聚叶绿素微胶囊包埋效果好，这与本发明方法导致叶绿素以低聚态形式存在明显有关，而未经过本发明处理的叶绿素在极性溶液作用下自发形成高聚叶绿素，粒径较大。此外，由于高聚叶绿素的形成导致叶绿素分子中活性官与壳材官能团之间发生相互作用减弱，从而导致包埋效果欠佳，包埋率低。
3.对螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的结构特性进行检测；
CH，GA，WPI和微胶囊的功能基团是通过使用NicoletiS50 FT-IR傅里叶变换光谱学从相应的光谱(FT-IR)中鉴定出来的。将样品与溴化钾按1:50(w/w)的质量比混合并压制成薄片。在400～4000cm-1的光谱范围内扫描小球，在室温下光谱分辨率为4cm-1。在相同的操作条件下，通过自动去除背景光谱得到样品的光谱。
结果参考图1-4；图1为叶绿素的红外光谱图；图2为阿拉伯胶的红外光谱图；图3为乳清分离蛋白的红外光谱图；图4为实施例5-7的红外光谱图；
从图中可知，叶绿素(图1)在3439，2927，2855，1736，1626，1385和1068cm-1处的吸收峰分别代表功能基团O-H拉伸，C-H拉伸(植物醇)，C-H弯曲(甲基和亚甲基)，C-N拉伸，C-O拉伸(C-173和C-133)，C-N拉伸(芳香系统)/N-H弯曲和C-O拉伸。阿拉伯胶的特征吸收峰(图2)在3410，2931，1615，1417和1041cm-1的吸收峰分别代表功能基团O-H拉伸，CH-拉伸，C＝O拉伸/N-H弯曲，C-N拉伸和C-O拉伸。乳清分离蛋白特征吸收峰(图3)主要显示在3290，2960，1652，1537，1396，1240和1078cm-1处的吸收带，分别表示O-H拉伸，C-H拉伸，C＝O拉伸(酰胺II)，N-H弯曲(酰胺II)，C-N拉伸(酰胺I)，C-O拉伸和N-H弯曲。
从图4中，与叶绿素特征吸收峰相比，2927和1626cm-1的吸收峰出现红移，表明叶绿素分子的植物醇残基和芳香体系的振动受到抑制。此外，叶绿素分子的羟基(3439cm-1)的吸收峰形状变宽，这意味着叶绿素分子与复合壁材之间可以形成分子内氢键，特别是在实施例6中。因此，本发明提高了低聚叶绿素分子与复合壁材之间的分子间作用，从而从微观角度证明了螺旋藻低聚微胶囊的包埋效果和稳定性高的原因。
4.对螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的紫外光稳定性进行检测；
微胶囊的紫外光稳定性用312nm波长的紫外光交联剂进行测量。将50mg的微胶囊与5mL无水乙醇搅拌混合。然后，将混合溶液放置在UV交联剂中处理不同的时间(0～60min)，每隔10min测定溶液中的叶绿素含量，最后用公式(4)计算叶绿素的保留率(RT)。对照组即对比例4。
式中Ct为紫外线照射t时间后叶绿素的含量(mg/mL)，C0为微胶囊初始时叶绿素的含量(mg/mL)。
结果参考图5；叶绿素是一种重要的光合色素，它能够通过其分子结构的变化将光能转移到化学受体中，因此，叶绿素的结构稳定性可以通过紫外光照射后叶绿素的保留率来评估。图5为不同实施例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊紫外线处理后叶绿素保留率。如图5所示，随着紫外线处理时间的增加，实施例5、6、7制备的叶绿素的保留率显著高于未处理的叶绿素和对照组样品(p<0.05)，说明本发明的方法获得的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的光稳定性得到了明显提高。
5.对螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的热稳定性进行检测；
将2.0mg实施例5、6、7、8、9以及对比例4和5制备的微胶囊样品、阿拉伯胶和乳清分离蛋白分别密封在标准铝(Al2O3)盘中，并在氮气气氛保护下以10℃/min的加热速率从25℃加热到400℃，流速为20mL/min。用空的密封铝盘作为参考进行调零。
表7、不同实施例和对比例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊热解温度(Tm)和质量损失率(Mass loss)
a-h同一列中的不同字母表示彼此之间的显著差异(p<0.05)
表7为不同实施例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊热解温度(Tm)和质量损失率(Mass loss)。从表7可以看出来，微胶囊表现出了两个热解峰，分别是79.34～88.05℃之间第一个热解峰和262.70～341.36℃之间的第二个热解峰，其中第一个热解峰是水的损失导致的，而第二个与微胶囊热分解有关。
相比于壁材(阿拉伯胶和乳清分离蛋白)，所有微胶囊的分解温度均有所升高，而实施例5-9的温度均高于对比例4、5(p<0.05)，说明本发明的方法增加了低聚叶绿素分子的含量并且增加了其与壁材之间的相互作用，降低了微胶囊的水分含量，从而增加了叶绿素的稳定性和封装效果。
6.对螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的DPPH自由基清除活性进行检测(参考测试项目3)；测试结果参考表8；
表8不同实施例和对比例制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的DPPH自由基清除率测试结果
a-d同一列中的不同字母表示彼此之间的显著差异(p<0.05)
通过表8可见，本发明的微胶囊较叶绿素表现出更好的抗氧化性，说明微胶囊能够提高叶绿素的稳定性。相比于未经过对比例4和5，实施例5-9表现出的DPPH自由基清除率更高(p<0.05)，说明本发明的方法能够提高叶绿素单体以及低聚体的含量，促进其与壁材发生相互作用，形成更为稳定的微胶囊。
7.对螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的微观形貌进行检测；
采用扫描电镜(SEM)观察阿拉伯胶、乳清分离蛋白以及实施例5-9以及对比例4和5获得的微胶囊的微观形貌。采用溅射镀膜机为螺旋藻低聚叶绿素微胶囊表面涂上一层薄薄的金导电层，喷射时间为15s，然后在10kV的加速电压下观察，并且拍摄5000倍下的照片。
相关结果参考图6-图16；图6为阿拉伯胶粉的电镜图；图7为乳清分离蛋白的电镜图；图8为对比例4的电镜图；图9为实施例5的电镜图；图10为实施例6的电镜图；图11为实施例7的电镜图；图12为实施例8的电镜图；图13为实施例9的电镜图；图14为对比例5的电镜图；
从图6-14可以看出，相比于壁材和对比例4和5，本发明制备的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊形貌为近球型的微球，而对照组则呈现出无规则的片状。证明本发明公开的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊制备方法能够破坏叶绿素聚合体，形成低聚叶绿素，从而形成的微胶囊粒径更小，具有更好的形貌，有效的保护了叶绿素的稳定性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种螺旋藻低聚叶绿素微胶囊，其特征在于，包括壳层和芯材，所述核层内包裹有低聚叶绿素，所述低聚叶绿素为由2～4个叶绿素分子组成。
2.根据权利要求1所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊，其特征在于，所述壳层由蛋白质、多糖、脂质中的一种或多种组成。
3.根据权利要求2所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊，其特征在于，所述蛋白质为乳清分离蛋白、大豆蛋白或明胶；所述多糖为阿拉伯胶、麦芽糊精、改性淀粉或壳聚糖；所述脂质为天然磷脂、改性磷脂或胆固醇。
4.根据权利要求1所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊，其特征在于，所述壳层由乳清分离蛋白和阿拉伯胶按照1:0.1～1的重量比组成。
5.一种如权利要求1-4任一所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法，其特征在于，将用于构成壳层的壳材、含低聚叶绿素的溶液分散到水溶液中，在第一双极高压脉冲电场的作用下构建螺旋藻低聚叶绿素微胶囊；所述第一双极高压脉冲电场的电场强度为10～50kV/cm，脉宽为50～150μs，频率为10～100Hz；
所述壳材中至少部分原料为乳清分离蛋白。
6.根据权利要求5所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法，其特征在于，所述第一双极高压脉冲电场的脉冲个数为10～300个。
7.根据权利要求5所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法，其特征在于，所述低聚叶绿素的溶液的制备方法为：
步骤11：采用醇类溶剂从植物的细胞中提取叶绿素得到浆液，将浆液加入到非极性有机溶剂中，得到含叶绿素的有机溶液；
步骤12：使用第二双极高压脉冲电场对有机溶液进行处理，形成聚合度小于或等于4的低聚叶绿素，得到含低聚叶绿素的溶液；
所述第二双极高压脉冲电场的电场强度为1～10kV/cm，脉宽为20～40μs，频率为10～100Hz，脉冲个数为10～300个。
8.根据权利要求7所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法，其特征在于，所述第一双极高压脉冲电场处理时间为10～60min；所述第二双极高压脉冲电场处理时间为10～60min；
所述第一双极高压脉冲电场的处理温度、所述第二双极高压脉冲电场的处理温度均为20～40℃；
所述非极性有机溶液为正己烷或苯；
所述有机溶液中叶绿素的浓度为100μg/mL～300μg/mL，叶绿素纯度为70～90％；
所述植物为藻类植物或种子植物。
9.根据权利要求8所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊的制备方法，其特征在于，所述壳材在与含低聚叶绿素的溶液混合之前，先将壳材加入水中与水进行水合反应，得到壳材溶液，所述壳材溶液中壳材浓度为1～5wt％；所述壳材溶液、含低聚叶绿素的溶液的体积比为1～10:1；
所述螺旋藻低聚叶绿素微胶囊经过干燥处理得到粉末状的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊。
10.如权利要求1～4任一所述的螺旋藻低聚叶绿素微胶囊作为食品添加剂、饲料添加剂的用途。
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| JP2002035571A (ja) * | 2000-07-26 | 2002-02-05 | Dai Ichi Kogyo Seiyaku Co Ltd | 会合性クロロフィル系色素内包マイクロカプセル及びその製造方法 |
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| US20170226282A1 (en) * | 2016-02-04 | 2017-08-10 | University Of Calcutta | Chlorophyll polymers and uses thereof |
| KR20180053048A (ko) * | 2016-11-11 | 2018-05-21 | 경희대학교 산학협력단 | 엽록소 미세캡슐 및 이의 제조방법 |
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2023
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