CN116369905A - 一种用于检测心机细胞收缩功能的柔性生物电子器件及其制备方法 - Google Patents

一种用于检测心机细胞收缩功能的柔性生物电子器件及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测心机细胞收缩功能的柔性生物电子器件及其制备方法，所述生物电子器件从下至上依次包括基板、第一膜层、第二膜层、应变传感系统、绝缘膜层、电极以及细胞培养装置，成功将细胞培养室、生物传感器以及生物反应器的集成到一个系统中。在上述生物电子器件中，所述应变传感系统可原位测量心肌细胞收缩力的动态变化；所述基板与第一膜层之间存在空气通道和中空室，用于第二膜层的气动驱动，从而对细胞提供机械刺激；成对设置并与细胞培养装置相接触的电极，用于对细胞提供电刺激。上述柔性生物电子器件可在规定的微环境条件下对心肌细胞进行高通量收缩性测量，在高通量心脏药物筛选和体外细胞培养方面具有良好的应用前景。

Description

一种用于检测心机细胞收缩功能的柔性生物电子器件及其制 备方法
技术领域
本发明涉及心肌细胞传感器技术领域，具体涉及一种用于检测心机细胞收缩功能的柔性生物电子器件及其制备方法。
背景技术
心脏病和心力衰竭是全球死亡的主要原因，医疗保健支出也在大幅增加。随着人口持续老龄化，发病率将急剧上升，开发体外心脏模型、芯片上心脏平台和生物传感技术对于加速心脏药物的发现以治疗心脏病至关重要。传统的体外药物筛选试验通常依赖于新生儿动物心脏细胞或标准细胞系，如HL-1和H9c2细胞系。然而，与人类心肌细胞相比，这些细胞源在搏动生理学、蛋白质组学和基因表达方面表现出差异，导致反应人类心脏生理学的可靠性不佳、药物评估准确性低、脱靶心脏毒性和后期临床测试失败。体细胞重编程诱导干细胞技术的最新突破已被应用于生产可靠的具有人类蛋白质组、离子通道、代谢和收缩表型的诱导干细胞源性心肌细胞(iPSC-CMs)，以准确建立基于人源心肌细胞的体外心脏模型。人们对使用iPSC-CMs作为更准确的模型来理解心脏生理学、研究潜在的疾病机制和测试潜在药物的人体反应越来越感兴趣。尽管iPSC分化为心肌细胞已经实现并标准化，但iPSC来源的心肌细胞存在一个主要缺点，即表型不成熟，类似于胎儿或新生儿发育阶段的人体心肌细胞。iPSC-CM的成熟缺陷阻碍了准确测试成人心脏对候选药物反应，也导致了再生细胞治疗过程中的致心律失常风险。因此，亟需开发一种平台技术来实现体外微环境诱导iPSC-CM成熟，使其成熟度接近原生成年心肌细胞。
先天性或后天性心脏病患者均有收缩异常症状，表现为收缩力弱、心颤、搏动节奏紊乱等。为此，开发生物传感技术来量化体外心脏模型的收缩力变化对于分析心肌细胞的收缩功能和测试候选药物的治疗效果或潜在的心脏毒性是至关重要的。迄今为止，已经开发了几种生物传感技术/平台，用于测量单个心肌细胞，2D单细胞层和3D体外心脏组织的收缩力。例如，基于显微图像的心肌细胞动态机械运动分析、原子力显微镜(AFM)、心肌细胞搏动诱导的交叉指型电极阻抗变化、牵引力显微镜、柔性薄膜，柔性悬臂梁或光学测量组织丝(Biowire)的偏转。压阻应变传感器也集成到柔性结构中，以实现心肌细胞收缩的连续电读数。尽管已经取得了重大进展，但如何提高设备灵敏度以准确捕获体外心脏模型产生的弱收缩性信号，如何提高高通量药物测试平台的容量，以及如何同时整合刺激功能以研究心肌细胞发育/成熟与微环境因素的因果关系等方面仍存在挑战。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测心机细胞收缩功能的柔性生物电子器件及其制备方法，本发明将细胞培养室、生物传感器以及生物反应器的集成到一个电子器件中，该电子器件可在细胞培养过程中提供可控的机械/电气微环境因素，同时实现体外单层心肌细胞收缩功能的连续高通量测量，可用于体外心肌细胞培养和高通量心脏药物筛选。
为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种用于检测心机细胞收缩功能的柔性生物电子器件，所述柔性生物电子器件包含：
基板；
第一膜层，设置于所述基板上方并与所述基板相贴合，所述第一膜层贴合基板的一面上设置有一条或多条凹槽，每条凹槽上开设有一个或多个贯通第一膜层的通孔，所述凹槽及通孔与所述基板之间形成空气通道，所述通孔与所述基板之间形成中空室；
第二膜层，设置于第一膜层上方并与所述第一膜层相贴合；
应变传感系统，包含一个或多个应变传感器，固定设置于所述第二膜层远离第一膜层的一面上，所述应变传感器与所述通孔一一对应并位于相应通孔的正上方；
绝缘膜层，设置于所述应变传感器上方并与所述第二膜层相贴合；
电极，包含一对或多对成对电极，间隔固定设置于所述绝缘膜层远离第二膜层的一面上，所述成对电极与所述凹槽一一对应并位于相应凹槽正上方的两侧；
细胞培养装置，包含一个或多个细胞培养容器，设置于所述成对电极上方并与所述成对电极相接触，所述细胞培养容器与所述通孔一一对应并位于相应通孔的正上方。
进一步地，所述基材可与第一膜层通过等离子体处理后键合。
进一步地，所述基材的材料优选为玻璃。
进一步地，所述第一膜层的材料优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
进一步地，所述第一膜层的厚度优选为1～2mm。
进一步地，所述凹槽的深度等于或小于第一膜层的厚度，所述凹槽的宽度优选为200μm～800μm，例如500μm。
进一步地，所述通孔的直径优选为4mm～12mm。
进一步地，所述第二膜层的材料优选为PDMS或硅橡胶。
进一步地，所述第二膜层的厚度优选为5μm～20μm。
进一步地，所述应变传感器包含具有蛇形结构的柔性电极，所述柔性电极由导电纳米颗粒与弹性聚合物材料复合得到。以导电纳米颗粒作为导电填料制备的柔性电极，在受力状态下导电通路更容易断开连接，产生更灵敏的阻值变化。
进一步地，所述导电纳米颗粒选自银纳米颗粒、金纳米颗粒、炭黑中的一种或多种。
进一步地，所述柔性电极中导电纳米颗粒更优选为炭黑，弹性基底更优选为固化比为1:20的PDMS，所述固化比为固化剂与PDMS预聚体的质量比；所述柔性电极中炭黑的质量占比为15wt％～30wt％。
进一步地，所述绝缘膜层的材料优选为聚二甲基硅氧烷或硅橡胶，例如Sylgard527硅橡胶，以提供与体内心肌组织相似的硬度环境。
进一步地，所述第二膜层与绝缘膜层的材料更优选为固化比为1:20的PDMS，得到的PDMS膜的弹性模量为～624kPa。
进一步地，所述绝缘膜层在与细胞培养容器相接触的位置处设置有一条或多条沟槽，所述沟槽为环形或直线型沟槽，用于引导细胞周向排列或单方向排列。
进一步地，所述沟槽优选为环形沟槽，以模拟心肌的周向排列，有助于心肌周向收缩力的积累。
进一步地，所述沟槽的宽度优选为5μm～25μm，深度优选为2μm～10μm。
进一步地，当所述绝缘膜层在与细胞培养容器相接触的位置处设置有多条沟槽，相邻沟槽的间距为10μm～50μm。
进一步地，所述电极优选为碳纳米纤维束或金属薄膜，更优选为碳纳米纤维束，碳纤维具有成本低、电位窗口宽且电化学惰性，作为电极具有更好的稳定性。
进一步地，所述细胞培养容器的内径大于所述成对电极中两电极的间距。
进一步地，所述柔性生物电子器件具有多单元阵列结构，例如24孔(4×6)格式的生物阵列电子器件。
进一步地，所述柔性生物电子器件可用于心脏药物的筛选。
进一步地，将心脏药物与心肌细胞共培养，通过记录应变传感器的电阻信号变化来原位测量心肌细胞收缩力的动态变化，评估心脏药物疗效。
心肌细胞的同步收缩会引起悬浮膜(由第二膜层、应变传感器、绝缘膜层组成)的偏转，嵌入悬浮膜中的应变传感器会发生形变，从而产生阻值变化，通过记录阻值的动态变化，以评估心肌细胞的收缩功能，包括收缩率、搏动率和节律。
进一地，所述柔性生物电子器件可用于高通量细胞培养。
进一步地，所述柔性生物电子器件通过可控的机械刺激和电刺激可促进iPSC-CMs成熟；使用压力控制系统向空气通道提供气动压力，使中空室上方的悬浮膜膨胀，向细胞培养容器中中的细胞提供机械刺激；将电极连接到多通道电刺激器上，对细胞进行电起搏或长期电刺激。
本发明第二方面提供了一种第一方面所述的柔性生物电子器件的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第一膜层的成膜液置于模具中，固化后剥离得到第一薄膜，将第一薄膜转移至基板上表面，经等离子体处理后形成与基板相键合的第一膜层；
(2)将第二膜层的成膜液通过在模板上旋涂、固化得到第二薄膜，将第二薄膜转移至第一膜层上表面，经等离子体处理后形成与第一膜层相键合的第二膜层；
(3)将导电油墨通过喷涂或印刷的方式，在所述第二膜层的上表面制备具有预设图案的导电薄膜；
(4)将绝缘膜层的成膜液通过在相应模具上旋涂、固化得到绝缘膜，将绝缘膜转移至第二膜层上表面并覆盖导电薄膜，经等离子体处理后形成与第二膜层相键合的绝缘膜层；
(5)在绝缘膜层上表面根据预设图案制备电极；
(6)将定制细胞培养容器根据预设位置置于绝缘膜层上。
进一步地，所述成膜液由预聚体和固化剂以一定比例混合制成。
在一些优选的实施例中，所述第一膜层的成膜液由PDMS预聚体和固化剂以质量比为10:1的比例混合得到；所述第二膜层以及绝缘膜层的成膜液由PDMS预聚体和固化剂以质量比为20:1的比例混合得到。
在一些优选的实施例中，所述导电油墨由炭黑与PDMS预聚体按质量比1:3混合，并分散于异丙醇中得到。
在一些优选的实施例中，在细胞培养前，先用氧等离子体激活绝缘膜层表面，使细胞培养容器与绝缘膜层紧密贴合。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明提供了一种柔性生物电子器件，成功将细胞培养室、生物传感器以及生物反应器集成于一体，通过嵌入超薄膜中的柔性应变传感器的阻值变化，实现对心肌细胞收缩功能的原位连续高灵敏度测量，可用于心脏药物测试；同时本发明制备的柔性生物电子器件包含气动空气通道以及分布于细胞培养容器两端的电极，可通过气动刺激以及电刺激来实现可控的机械和电气微环境，以促进iPSC-CM成熟。
2.本发明通过喷雾沉积油墨的方法制备具有多孔微结构的薄膜传感层，具有高灵敏度和良好的稳定性，在长期传感方面表现出高重复性，可实时、长期且连续地记录心肌细胞的收缩能力变化。另外，本发明利用柔性生物电子器件的高通量对不同心脏药物进行测试，测试结果显示，该柔性生物电子器件能够测量药物种类以及剂量对心肌细胞收缩性能的影响，从而可实现药物种类、剂量的优化。此外，本发明通过可控的机械刺激或电刺激可促进iPSC-CM成熟，并发现在机械刺激和电刺激的联合作用下更为有效。
3.上述柔性电子器件易于制造，可实现高通量、多参数筛选和优化，在体外心肌细胞培养和高通量心脏药物筛选方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为柔性生物电子器件的制备过程示意图(1a-1h)，结构示意图(1i)以及局部结构的工作原理示意图(1j)，其中①为玻璃基底、②为第一膜层、③为悬浮膜、④为碳纤维束电极、⑤为电场、⑥为气动压力；
图2为绝缘膜层表面微槽的扫描电镜图；
图3为PDMS预聚体与固化剂以不同质量比混合制备的PDMS的刚度；
图4为喷雾沉积法制备的CB-PDMS复合材料的扫描电镜图(4a)，丝网印刷法制备的CB-PDMS复合材料的扫描电镜图(4b)以及不同方法制备的CB-PDMS复合材料的单轴拉伸实验曲线(4c)，图中ΔL/L0，L0为样品的初始长度，ΔL为样品在拉伸时长度与初始长度的差值；
图5为悬浮膜在启动压力驱动下变形的FEA模拟结构(5a)以及有限元分析计算的施加压力大小与膜面积变化的关系(5b)；
图6为柔性生物电子器件细胞培养器中培养的单层iPSC-CM在培养第1天～第7天内，应变传感器记录的电阻信号(ΔR/R0)变化曲线(6a)，ΔR/R0振幅(6b)、搏动时间间隔(6c)以及搏动频率(6d)随培养时间的变化值；
图7为在碳纤维电极旁培养的单层iPSC-CM活细胞(绿色)/死细胞(红色)染色图像(7a)，绿色：AM钙黄蛋白，红色：BOBO-3碘化物，比例尺200μm；在细胞培养第7天，单层iPSC-CM自发搏动或在1Hz和2Hz电起搏下产生的电阻信号(7b)；
图8为圆形微槽膜表面培养单层iPSC-CM的亮场光学图像以及共聚焦免疫荧光图像，蓝色：DAPI，绿色：α-辅肌动蛋白，红色：connexin-43，比例尺：100μm；
图9为单层iPSC-CM对心脏候选药物的剂量依赖性反应：(9a)异丙肾上腺素，(9b)omecamtiv mecarbil，(9c)blebbistatin和(9d)flecainide的药物检测结果，其中(i)为细胞收缩力随药物剂量的变化曲线，(ii)为细胞波动率随药物剂量的变化曲线，(iii)为细胞在不同浓度药物下的收缩曲线；
图10为对照组、机械刺激、电刺激以及机电联合刺激条件下单层iPSC-CM的免疫染色图像(10a)，细胞用两种抗体组合染色:α-肌动蛋白(绿色)与connexin-43(红色)或心肌肌钙蛋白-t(ctnt，青色)与肌球蛋白轻链-2(mlc2v，品红色)；收缩力(10b)、肌节长度(10c)、connexin-43表达(10d)以及mlc2v表达(10e)在不同条件下的量化值，其中将荧光强度相对细胞核荧光强度归一化，计算connexin-43和mlc2v的表达水平；测量的收缩力峰值：每个条件下n＝8，测量肌节：每种情况n＝30，测定connexin-43和mlc2v表达强度：每种条件n＝6张，组间横柱表示有统计学意义(p<0.05)。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例涉及一种柔性生物电子器件的制备，制备过程如图1所示，具体如下：
(1)将PDMS预聚体与固化剂按照质量比10:1配制得到第一PDMS成膜液，将第一PDMS成膜液置于铝模具中(图1a)，固化后剥离得到PDMS基底膜，将PDMS基底膜转移至玻璃基板上，用等离子体(PDC-001，Harrick等离子体)处理1分钟，将PDMS基底膜粘结到玻璃基板上，得到1mm厚的第一膜层(图1b)；所述第一膜层贴合基板的一面上设置有6条凹槽，每条凹槽上等间距的开设有4个贯通第一膜层的通孔，凹槽及通孔与所述基板之间形成空气通道，通孔与所述基板之间形成中空室，凹槽的宽度为500μm，深度为500μm；通孔的直径为6.35mm。
(2)将PDMS预聚体与固化剂按照质量比20:1配制得到第二PDMS成膜液，将第一PDMS成膜液以5000rpm的转速在硅烷化PDMS板上旋涂1min，然后置于80℃下固化过夜，形成底膜，将底膜转移至第一膜层上，经等离子体处理1min后与第一膜层键合，得到10μm厚的第二膜层(图1c)；
(3)将炭黑(CB)与PDMS预聚体按质量比1:3的比例混合，加入异丙醇，在超声浴中分散5分钟得到CB-PDMS油墨，将其通过喷雾沉积法在覆盖已有刚性阴影掩模的第二膜层上制备CB-PDMS膜，干燥后得到5μm厚的具有蛇形结构的导电薄膜(图1d)；
(4)将第二PDMS成膜液以5000rpm的转速在具有微槽印章结构的硅烷化PDMS板上旋涂1min(图1e)，并在80℃下固化过夜形成顶膜，将顶膜转移至第二膜层上表面并覆盖导电薄膜，表层经等离子体处理1min后与第二膜层粘结，得到10μm厚的绝缘膜层(图1f)，在每个通孔正上方的绝缘膜层上均存在圆形微槽(如图2所示)，圆形微槽的深度为5μm，宽度为10μm，间距为20μm；
(5)如图1g所示，将碳纤维束(每束1000根导线，每根导线直径7μm)平行间隔设置于每条凹槽正上方的两侧，并在两端滴加PDMS第一成膜液加热固化，固定在绝缘膜层上，每对电极的间隔为7mm；
(6)将24个定制的玻璃圆筒(内径8mm，外径10mm，高度10mm)连接到相应通孔正上方的绝缘膜层上，与碳纤维电极相接触(图1h)。
如图1i、1j所示，在柔性生物电子器件中，第二膜层、导电薄膜与绝缘膜层组成悬浮膜，悬浮膜内嵌入式的CB-PDMS柔性应变传感器用于测量细胞的收缩力；第一膜层的凹槽及通孔与基板形成的空气通道，用于气动驱动悬浮膜；碳纤维束电极用于电起搏；玻璃圆筒用于培养细胞。
1.本发明通过增大PDMS预聚体与固化剂的质量比来降低悬浮膜的刚性，从而提高柔性生物电子器件对心肌细胞收缩力测试的灵敏度。
图3为采用不同固化比制备得到的总厚度均为25μm的悬浮膜，由图可知，当PDMS预聚体与固化剂的质量比由10:1增加至20:1时，悬浮膜的杨氏模量由1.27MPa降低至624kPa(n＝6个压痕点)。
2.在上述导电薄膜制备过程中，本发明对不同方式制备导电薄膜对应变性能的影响进行了探索，具体操作如下：
将上述CB-PDMS油墨分别通过喷雾沉积、丝网印刷的方式在10mm×5mm×50μm的PDMS衬底上制备相同形状的导电薄膜，得到CB-PDMS复合材料，对不同方式制备的样品进行单轴拉伸测试(使用微拉伸测试平台进行循环加载0.3％应变，以模拟单层心肌细胞收缩产生的低应变量)，将导电薄膜与精密万用表相连接，记录循环拉伸下的相对阻力变化(ΔR/R0，R0为样品的初始阻值，ΔR为样品在拉伸时阻值与初始阻值的差值)，以评估压阻应变传感性能。
采用不同方式制备的导电薄膜的扫描电镜图分别如图4a(喷雾沉积)、4b(丝网印刷)所示，由图可知，采用喷雾沉积制备的导电薄膜表面形貌更粗糙，且具有多孔的微观结构；而丝网印刷制备的导电薄膜结构更为平滑、紧密。如图4c所示，由上述两种不同方式制备的样品的ΔR/R0值均与拉伸应变大小显示出高度线性关系，并且滞后小，其中喷雾沉积法制备样品的斜率明显大于丝网印刷制备的样品，这也说明喷雾沉积法制备的样品具有更高的灵敏度。
3.本发明进一步研究了气压大小与悬浮膜面积变化的关系，具体操作如下：
使用压力控制系统向微通道内提供气动压力，使悬浮膜膨胀。通过有限元分析(COMSOL Multiphysics)计算不同气压下膜面积的变化，每个悬浮膜单元被模拟为一个二维轴对称结构(图5a)。
结果如图5b所示，在1.7kPa气压作用下，悬浮膜的膜面积增加了15％，可对悬浮膜顶部附着的单层心肌细胞产生机械刺激。
4.本发明进一步探索电刺激对细胞的影响，具体操作如下：
对柔性生物电子器件进行γ射线消毒，细胞培养前，用氧等离子体激活PDMS膜表面1分钟。然后，每个培养室加入细胞培养基，37℃培养箱中放置过夜。将细胞解冻并分散在细胞培养基中，以1.5×105个细胞/cm2的密度播种，形成二维单层。单层细胞在37℃、5％CO2下培养，培养基每两天更换一次。
随着培养天数的增加，iPSC-CM逐渐建立细胞内连接，产生自发的细胞搏动，并施加压应力使悬浮膜偏转。图6a为柔性生物电子器件的电阻信号随培养天数增加的动态变化，由图可知，iPSC-CM在第2天开始自发搏动。从第2天到第7天，细胞收缩力随着培养天数的增加逐渐增加，如图6b所示。统计分析显示，相邻两个信号峰之间的搏动时间间隔由第2天的分散模式变为均匀值(图6c)，说明细胞搏动节律由不规则状态逐步走向稳定状态。此外，心肌细胞搏动率从第2天到第4天趋于下降，然后在第5天和第7天保持稳定(图6d)。
将柔性生物电子器件中的碳纤维电极连接到多通道电刺激器上，对细胞单层进行电起搏。第7天后，使用试剂盒(R37601，赛默飞世尔)测量碳纤维电极周围的iPSC-CMs活性。活细胞用Calcein-AM染色(绿色)，死细胞用BOBO-3碘化物染色(红色)。结果如图7a所示，细胞的存活率大于90％。
单层iPSC-CM自发搏动以及在不同频率(1Hz、2Hz)电起搏下产生的电阻信号如图7b所示，单层iPSC-CM在不同的电刺激下成功调整到不同的搏动频率。
5.本发明进一步观察细胞在柔性生物电子器件中的分布情况，具体操作如下：
对上述培养7天的单层iPSC-CM进行免疫染色，通过细胞核(蓝色)、α-肌动蛋白(绿色)和间隙连接蛋白(connexin-43，红色)的免疫染色分析细胞分布、肌节结构和相邻iPSC-CMs之间的细胞内连接。
成像结果如图8所示，由图可知，心肌细胞均匀分布于微槽膜表面，并沿圆形微槽排列。心肌细胞周期性收缩是由肌动蛋白和肌球蛋白丝在每个肌节单位之间的动态滑动产生的。细肌动蛋白丝被α-肌动蛋白固定在z线上。α-肌动蛋白免疫染色结果显示，肌节呈条纹状，沿圆形微槽排列，有效模拟了心肌周向排列，有助于心肌周向收缩力的积累。此外，清晰的connexin-43蛋白表达表明iPSC-CMs建立了用于通信和同步细胞跳动的有效细胞间连接。
实施例2
心肌细胞的收缩涉及一系列过程，包括膜电位变化、离子通道活动、钙动力学、肌丝滑动以及通过间隙连接或膜电流传导的细胞间通信。治疗性心脏药物或心脏毒性分子都可以通过调节上述过程来调节心肌细胞的收缩功能。本实施例通过评估四种代表性的抗心脏化合物(异丙肾上腺素、omecamtiv mecarbil、blebbistatin和flecainide)的效果，来验证上述柔性生物电子器件在高通量药物测试中的有效性。具体操作如下：
在iPSC-CM培养的第5-7天进行药物实验，在药物实验前，将培养基更换为250μL新鲜维持培养基，孵育2小时，以避免营养物质和温度对搏动行为的影响。然后每10分钟加入2.5μL的药物原液，在培养箱环境中，连续记录电阻信号，从阻值信号中提取收缩力和搏动率的剂量依赖响应，并拟合为s型曲线，以获取药物剂量对细胞收缩力、搏动频率和节律的影响，测试结果如图9a-9d所示。
异丙肾上腺素是一种激动剂，可用于治疗心动过缓。本实施例测试了异丙肾上腺素在以下剂量下的药物反应：1nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1μM、2μM和5μM。如图9a所示，收缩力和搏动率均呈剂量依赖性增加，收缩力EC50值为348nM，搏动频率EC50值为225nM。在异丙肾上腺素的有效剂量为250nM时，单层心肌细胞收缩力提高15％，搏动率由0.7Hz提高至1.12Hz。
omecamtiv mecarbil(OM)是一种心脏特异性肌凝蛋白激活剂，可以有效增强肌纤维丝之间连接的形成和持续时间。如图9b所示，不同药物浓度(1nM、10nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1μM、2μM和5μM)测试结果表明，细胞的收缩性随OM剂量增大而逐渐增加，并在1μM左右趋于稳定。收缩力EC50值为973nM。由于潜在的副作用，当OM的剂量达到5μM时，其改善收缩性的作用反而减弱。与收缩性变化相反，OM给药对细胞搏动率的影响很小。
此外，对肌丝抑制剂和离子通道阻滞剂也进行了测试，以验证本发明柔性生物电子器件在测量抑制心肌细胞药理效应和潜在心脏毒性方面的有效性。与OM相比，blebbistatin是一种肌凝蛋白丝抑制剂，可以通过影响肌凝蛋白重链的ATP酶活性来阻断肌凝蛋白和肌动蛋白丝之间的桥联。如图9c所示，Blebbistatin检测结果(10nM、100nM、250nM、500nM、1μM、2μM、5μM和10μM)显示细胞收缩能力随药物浓度的增加而下降，IC50＝584nM。同时，当药物剂量增加到1μM时，搏动突然停止。这一现象是由于blebbistatin的机电解耦机制仅抑制了可收缩细丝的滑动，而对膜电位的规律性没有影响。
Flecainide是一种多通道阻滞剂，主要作用于钠通道和hERG钾通道。本实施例测试了不同剂量的Flecainide(1nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1μM、2μM、5μM、10μM)对细胞收缩性以及搏动率的影响。如图9d所示，收缩性和搏动率均随Flecainide浓度的增加而逐渐降低。收缩性的IC50测试为2.48μM，搏动率IC50值为1.09μM。当Flecainide的浓度大于10μM时，细胞停止跳动。这些结果表明，本发明所述的柔性生物电子阵列能够测量药物种类以及剂量对心肌细胞收缩性能的影响。
实施例3
本实施例通过对单层iPSC-CM施加机械刺激和/或电刺激，观察细胞变化。
具体操作如下：
在iPSC-CMs细胞播种后静置培养48小时，形成局部粘连、细胞间连接和同步搏动。从第2天开始，通过膜膨胀变形施加15％静态应变进行机械刺激，同时通过平行碳纤维电极对施加周期性矩形脉冲(持续时间2ms,，1Hz，振幅2.5V，3.57V/cm)进行电刺激。在每个培养日结束时，机械/电刺激暂停1小时，以更换培养基。第7天结束时进行单层iPSC-CM收缩性测定和免疫染色。
如图10a所示，在四种培养条件下，悬浮膜顶表面均形成了良好的单层iPSC-CM。肌钙蛋白-t(ctnt)和α-肌动蛋白都是心肌细胞早期分化阶段表达的生物标志物。免疫荧光分析显示单层iPSC-CM中ctnt和α-肌动蛋白丝呈明显的条纹状。此外，在机械、电和联合刺激条件下，连接蛋白-43和肌球蛋白轻链-2(mlc2v)的荧光强度增强。四种不同培养条件下心肌细胞的收缩能力变化如图10b～10e所示，与对照组相比，机械刺激组收缩幅度增加35.1％，电刺激组增加30％，机电联合刺激组增加62.3％，这也说明通过电刺激或机械刺激可促进iPSC-CM成熟。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种用于检测心机细胞收缩功能的柔性生物电子器件，其特征在于，所述柔性生物电子器件包含：
基板；
第一膜层，设置于所述基板上方并与所述基板相贴合，所述第一膜层贴合基板的一面上设置有一条或多条凹槽，每条凹槽上开设有一个或多个贯通第一膜层的通孔，所述凹槽及通孔与所述基板之间形成空气通道，所述通孔与所述基板之间形成中空室；
第二膜层，设置于第一膜层上方并与所述第一膜层相贴合；
应变传感系统，包含一个或多个应变传感器，固定设置于所述第二膜层远离第一膜层的一面上，所述应变传感器与所述通孔一一对应并位于相应通孔的正上方；
绝缘膜层，设置于所述应变传感器上方并与所述第二膜层相贴合；
电极，包含一对或多对成对电极，间隔固定设置于所述绝缘膜层远离第二膜层的一面上，所述成对电极与所述凹槽一一对应并位于相应凹槽正上方的两侧；
细胞培养装置，包含一个或多个细胞培养容器，设置于所述成对电极上方并与所述成对电极相接触，所述细胞培养容器与所述通孔一一对应并位于相应通孔的正上方。
2.根据权利要求1所述的柔性生物电子器件，其特征在于，所述第一膜层的厚度为1mm～2mm，所述第一膜层的材料为聚二甲基硅氧烷。
3.根据权利要求1所述的柔性生物电子器件，其特征在于，所述凹槽的宽度为200μm～800μm；所述通孔的直径为4mm～12mm。
4.根据权利要求1所述的柔性生物电子器件，其特征在于，所述第二膜层的厚度为5μm～20μm，所述第二膜层的材料为聚二甲基硅氧烷或硅橡胶。
5.根据权利要求1所述的柔性生物电子器件，其特征在于，所述应变传感器包含具有蛇形结构的柔性电极，所述柔性电极由导电纳米颗粒与弹性聚合物材料复合得到；所述导电纳米颗粒选自银纳米颗粒、金纳米颗粒、炭黑中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的柔性生物电子器件，其特征在于，所述绝缘膜层的厚度为5μm～20μm，所述绝缘膜层的材料为聚二甲基硅氧烷或硅橡胶。
7.根据权利要求1所述的柔性生物电子器件，其特征在于，所述绝缘膜层在与细胞培养容器相接触的位置处设置有一条或多条沟槽，所述沟槽为环形或直线型沟槽。
8.根据权利要求7所述的柔性生物电子器件，其特征在于，所述沟槽的宽度为5μm～25μm，深度为2μm～10μm；当所述绝缘膜层在与细胞培养容器相接触的位置处设置有多条沟槽时，相邻沟槽的间距为10μm～50μm。
9.根据权利要求1所述的柔性生物电子器件，其特征在于，所述细胞培养容器的内径大于所述成对电极中两电极的间距；所述电极为碳纳米纤维束或金属薄膜。
10.一种权利要求1～9任一项所述的柔性生物电子器件的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将第一膜层的成膜液置于模具中，固化后剥离得到第一薄膜，将第一薄膜转移至基板上表面，经等离子体处理后形成与基板相键合的第一膜层；
(2)将第二膜层的成膜液通过在模板上旋涂、固化得到第二薄膜，将第二薄膜转移至第一膜层上表面，经等离子体处理后形成与第一膜层相键合的第二膜层；
(3)将导电油墨通过喷涂或印刷的方式，在所述第二膜层的上表面制备具有预设图案的导电薄膜；
(4)将绝缘膜层的成膜液通过在相应模具上旋涂、固化得到绝缘膜，将绝缘膜转移至第二膜层上表面并覆盖导电薄膜，经等离子体处理后形成与第二膜层相键合的绝缘膜层；
(5)在绝缘膜层上表面根据预设图案制备电极；
(6)将定制的细胞培养容器根据预设位置置于绝缘膜层上。
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