CN116369499A - 一种低油相Pickering乳液凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，属于食品加工技术领域。低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)将乳清分离蛋白加入缓冲溶液中，搅拌溶解、冷藏后加入γ‑谷维素的乙醇溶液，混合均匀后去除乙醇溶液，得到复合颗粒溶液；(2)调节复合颗粒溶液的pH至6.5～8.5，加热反应，得到聚集颗粒，然后在聚集颗粒中加入不饱和油脂，分散均匀，得到所述低油相Pickering乳液凝胶。本发明制备的低油相Pickering乳液凝胶具有良好的乳化性，实现了降低乳液凝胶含油量的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，特别是涉及一种低油相Pickering乳液凝胶的制备方法。
背景技术
许多食品都呈现出以乳液为基础的软固体结构，例如奶酪、固体酸奶等，以乳液为基础的软固体结构(乳液凝胶)由于其具有独特的三维网络结构，从而广泛应用于食品领域，包括减少反式脂肪或饱和脂肪、改善食物结构和提高营养的生物利用度。PEs(Pickering乳液)被认为是比传统乳液更好的输送系统，由于其具有更强的抗氧化性、储存稳定性和较低的脂解敏感性，同时在适当的条件下(如适当的颗粒类型、颗粒浓度、油相浓度、pH值和离子强度)可以转变为凝胶状PEs，因此，油相和乳化剂含量足够高时才能确保在邻近油滴表面吸收的固体颗粒能够连接和/或相互反应，从而形成凝胶状PEs。根据油相和乳化剂含量的高低可以将凝胶状PEs主要分为两类，分别是高内相Pickering乳液凝胶(HIPPEGs)和低油相Pickering乳液凝胶(LOPPEGs)。
高内相Pickering乳液凝胶(HIPPEGs)是指分散相的体积分数超过74％的高浓度乳液体系。普通的PEs由于重力分离、液滴聚集和奥斯特瓦尔德成熟的影响，从而造成其随着时间的推移而分解，然而HIPPEGs具有高含油量，从而有助于分散的液滴紧密填充，并获得良好的抗外力性能，因此HIPPEGs对物理(部分聚结和相分离)、化学(氧化和水解)微生物变化、温度、pH值和离子强度等表现出优异的稳定性。传统的HIPPEGs通常是由无机颗粒(如二氧化硅和二氧化钛)与合成表面活性剂(如Tweens和Span)结合来稳定的，然而有报道发现使用上述稳定剂会对人体健康产生不良的影响，如干扰正常胃肠道，肠道菌群和细胞毒性，因此，近年来采用蛋白质颗粒被用于替代上述稳定剂从而用于制备的HIPPEGs，同时满足了消费者对“纯天然”产品的需求，并在“清洁标签”食品的工业驱动方面显示出巨大的潜力。
尽管HIPPEGs具有高稳定性和高营养承载能力，但是由于其中含有较高的油含量(75％)，会造成人体摄入高脂肪含量的食品，进而引起各种健康问题，比如心脑血管疾病、肥胖和糖尿病等，这不符合现代饮食对于低脂食品的倡导，因此为了适应现代饮食的需要，减少过多的脂肪摄入，低脂乳液产品引发了学者的广泛研究，其中低油相Pickering乳液凝胶(LOPPEGs)在减少反式脂肪消耗和发展食品结构方面引起了食品行业的关注。
发明内容
本发明的目的是提供一种低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明的技术方案之一：一种低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将乳清分离蛋白加入缓冲溶液中，搅拌溶解、冷藏过夜后加入γ-谷维素的乙醇溶液，混合均匀后去除乙醇溶液，得到复合颗粒溶液；
乳清蛋白是食品工业中常见的营养强化剂之一，其具有优异的递送小分子生物活性物质的能力。乳清蛋白具有良好的乳化性，与非乳清蛋白作为乳化剂相比，乳清蛋白作为乳化剂可以延长乳液的保期、提高热稳定性、改善临界应力、屈服应力、黏弹性模量等。
γ-谷维素是一类含有甾醇的物质，甾醇具有丰富的生理功能并且结构类似于胆固醇的小分子生物活性物质，同时它是一种绿色、安全的稳定剂。乳清蛋白的加入可以改善甾醇在油-水界面的吸附行为，例如降低界面张力，提高油-水界面层厚度等。
(2)调节复合颗粒溶液的pH至6.5～8.5，加热反应，得到聚集颗粒，然后在聚集颗粒中加入不饱和油脂，分散均匀，得到所述低油相Pickering乳液凝胶。
进一步地，所述低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，在去除乙醇溶液后还包括：补充等体积的缓冲溶液的步骤。
进一步地，所述复合颗粒溶液中乳清分离蛋的浓度为10wt.％，γ-谷维素的浓度为1wt.％。
进一步地，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液；所述PBS缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH为7.0。
进一步地，所述搅拌的时间为2h；所述冷藏的温度为4℃，时间为12h。
进一步地，所述加热反应的温度为85℃，时间为1h。
进一步地，所述不饱和油脂为葵花籽油；所述不饱和油脂的添加量为聚集颗粒和不饱和油脂总质量的15％；所述分散具体包括：采用10000r/min的转速均质1.5min。
进一步地，所述复合颗粒溶液的pH为7.5。
本发明的技术方案之二：一种上述制备方法制备的低油相Pickering乳液凝胶。
本发明的技术方案之三：一种上述低油相Pickering乳液凝胶作为蛋白基低脂食品在食品工业中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明制备的低油相Pickering乳液凝胶具有良好的乳化性，实现了降低乳液凝胶含油量的技术效果，使其含油量降低到15％(通常情况下，在油含量超过74％的条件下才会形成乳液凝胶结构，即为高内相Pickering乳液凝胶)。
(2)本发明通过pH和加热结合诱导的方法制备得到了具有刚性结构的聚集颗粒，增强了聚集颗粒的凝胶强度，当油滴与此聚集颗粒进行高速分散的过程中，油滴会吸附在此刚性凝胶表面，从而形成网络状结构，进而形成更加致密的孔径，因此，即使是较低含量的油脂，也同样可以形成乳液凝胶状结构。
(3)本发明制备低油相Pickering乳液凝胶采用的WPI具有来源广泛、价格低廉和良好的乳化性等特点，采用的γ-谷维素含有的甾醇是一种具有降胆固醇、抗氧化等生理功能的天然甾族化合物，同时甾醇具有较强的疏水性和一定的乳化性，甾醇的加入不仅提高了两者聚集颗粒的凝胶强度，同时会使食品体系呈现出低降胆固醇的状态。
(4)本发明中，相比于pH6.5、7、8、8.5和85℃加热1h结合诱导的WPI-γS聚集颗粒所稳定的低油相Pickering乳液凝胶，pH7.5和85℃加热1h结合诱导的WPI-γS聚集颗粒所稳定的低油相Pickering乳液凝胶呈现出最强的物理稳定性、表观粘度和粘弹性模量。
(5)本发明所制备的低油相Pickering乳液凝胶兼具刚性凝胶结构和低油含量，因此将本发明的低油相Pickering乳液凝胶与市售的三种品牌的蛋黄酱之间进行比较，市售的三种品牌的蛋黄酱分别是好樂门、乐禧瑞和妙多，从颜色来看，市售的蛋黄酱均呈现淡黄色，而本发明所制备的低油相Pickering乳液凝胶呈现乳白色，并且从外观状态来看，本发明所制备的低油相Pickering乳液凝胶同样呈现出半固态结构，从而具有替代蛋黄酱的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1和实施例2制备的聚集颗粒的宏观照片，其中(A)～(E)是实施例2中不同pH下制备的聚集颗粒，(F)～(J)是实施例1中不同pH下制备的聚集颗粒；
图2为本发明实施例1和实施例2制备的聚集颗粒的质构分析结果图，其中，(A)为硬度、(B)为弹性、(C)为黏性、(D)为咀嚼性；
图3为本发明实施例1～2制备的聚集颗粒以及对比例1～2制备的颗粒的表面疏水性测试结果图；
图4为本发明实施例1～2以及对比例1～2制备的乳液凝胶的平均粒径和电位，其中，(A)为平均粒径，(B)为电位；
图5为本发明实施例1～2以及对比例1～2制备的乳液凝胶的界面形态结构图，其中，(A1)～(A5)为分别采用对比例2的WPI/pH6.5/0h、WPI/pH7/0h、WPI/pH7.5/0h、WPI/pH8/0h、WPI/pH8.5/0h制备的乳液凝胶的界面形态结构；(B1)～(B5)为分别采用对比例1的WPI-γS/pH6.5/0h、WPI-γS/pH7/0h、WPI-γS/pH7.5/0h、WPI-γS/pH8/0h、WPI-γS/pH8.5/0h制备的乳液凝胶的界面形态结构；(C1)～(C5)为分别采用实施例2的WPI/pH6.5/1h、WPI/pH7/1h、WPI/pH7.5/1h、WPI/pH8/1h、WPI/pH8.5/1h制备的乳液凝胶的界面形态结构；(D1)～(D5)为分别采用实施例1的WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h制备的乳液凝胶的界面形态结构；
图6为本发明实施例1和实施例2制备的乳液凝胶的表观粘度变化图；
图7为本发明实施例1和实施例2制备的乳液凝胶的流变学行为测定结果图，其中，(A)为实施例2制备的乳液凝胶储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)的频率依赖性曲线；(B)为实施例1制备的乳液凝胶储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)的频率依赖性曲线；(C)为实施例2制备的乳液凝胶储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)的应力依赖性曲线；(D)为实施例1制备的乳液凝胶储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)的应力依赖性曲线；
图8为本发明实施例1和实施例2制备的乳液凝胶的横向弛豫谱图；
图9为本发明制备的WPI、WPI-γS聚集颗粒和WPI-ES聚集颗粒的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力，其中，(A)为DPPH自由基，(B)为ABTS自由基；
图10为本发明制备的WPI、WPI-γS聚集颗粒和WPI-ES聚集颗粒的胆固醇抑制活性；
图11为本发明实施例3和实施例4制备的乳液凝胶的相图，其中，(A)为油含量5％，(B)为油含量10％，(C)为油含量15％，(D)为油含量20％；
图12为本发明实施例3和实施例4制备的乳液凝胶的相图，其中，(A)为加热0h，(B)为加热0.5h，(C)为加热1h，(D)为加热2h，(E)为加热3h；
图13为本发明实施例1～2以及对比例1～2制备的乳液凝胶的储存稳定性结果，其中，(A)为对比例2制备的乳液凝胶储存0天，(B)为对比例2制备的乳液凝胶储存0天，(C)为实施例2制备的乳液凝胶储存0天，(D)为实施例1制备的乳液凝胶储存0天，(E)为对比例2制备的乳液凝胶储存60天，(F)为对比例2制备的乳液凝胶储存60天，(G)为实施例2制备的乳液凝胶储存60天，(H)为实施例1制备的乳液凝胶储存60天；
图14为本发明实施例1在pH7.5时制备的乳液凝胶和市售的好樂门、乐禧瑞和妙多蛋黄酱的状态对比图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
一种低油相Pickering乳液凝胶的制备方法：
(1)将乳清分离蛋白(WPI)加入PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)中，在室温下匀速搅拌2h使WPI充分溶解，然后放置于4℃条件下过夜使WPI充分水合，得到浓度为12wt.％的WPI溶液。
(2)将γ-谷维素(γS)溶解于无水乙醇中配制成浓度为10wt.％的γS无水乙醇溶液。
(3)将120mL WPI溶液和13.8mLγS无水乙醇溶液混合均匀，并向其中加入9.65mL的PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)，然后用旋转蒸发仪除去乙醇，并补充等体积的PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)，使WPI的最终浓度为10wt.％，γS的最终浓度为1wt.％，然后分别调节pH至6.5、7、7.5、8、8.5，最后在85℃下加热1h，得到5种不同的WPI-γS聚集颗粒，记为WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h。
(4)将5种不同的聚集颗粒分别加入离心管中，并向聚集颗粒中加入葵花籽油(葵花籽油的添加量为聚集颗粒和葵花籽油总质量的15％)，并在室温下采用高速分散机(IKA，T18digital Ultra-turrax,Germany)以10000r/min的转速均质1.5min，得到5种低油相Pickering乳液凝胶(LOPPEGs)，储存在4℃条件下。
对比例1
同实施例1，区别仅在于，不进行步骤(3)中的加热处理。
具体如下：
(1)将乳清分离蛋白(WPI)加入PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)中，在室温下匀速搅拌2h使WPI充分溶解，然后放置于4℃条件下过夜使WPI充分水合，得到浓度为12wt.％的WPI溶液。
(2)将γ-谷维素(γS)溶解于无水乙醇中配制成浓度为10wt.％的γS无水乙醇溶液。
(3)将120mL WPI溶液和13.8mLγS无水乙醇溶液混合均匀，并向其中加入9.65mL的PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)，然后用旋转蒸发仪除去乙醇，并补充等体积的PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)，使WPI的最终浓度为10wt.％，γS的最终浓度为1wt.％，然后分别调节pH至6.5、7、7.5、8、8.5，得到5种不同的WPI-γS复合颗粒，记为WPI-γS/pH6.5/0h、WPI-γS/pH7/0h、WPI-γS/pH7.5/0h、WPI-γS/pH8/0h、WPI-γS/pH8.5/0h。
(4)将5种不同的WPI-γS复合颗粒加入离心管中，并向WPI-γS复合颗粒中加入葵花籽油(葵花籽油的添加量为WPI-γS复合颗粒和葵花籽油总质量的15％)，并在室温下采用高速分散机(IKA，T18 digital Ultra-turrax,Germany)以10000r/min的转速均质1.5min，得到乳液凝胶，储存在4℃条件下。
实施例2
(1)将乳清分离蛋白(WPI)加入PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)中，在室温下匀速搅拌2h使WPI充分溶解，然后放置于4℃条件下过夜使WPI充分水合，得到浓度为10wt.％的WPI溶液。
(2)将WPI溶液的pH分别调节至6.5、7、7.5、8、8.5，然后在85℃下加热1h，得到5种不同的WPI聚集颗粒，记为WPI/pH6.5/1h、WPI/pH7/1h、WPI/pH7.5/1h、WPI/pH8/1h、WPI/pH8.5/1h。
(3)将5种不同的聚集颗粒分别加入离心管中，并向聚集颗粒中加入葵花籽油(葵花籽油添加量为聚集颗粒和葵花籽油总质量的15％)，并在室温下采用高速分散机(IKA，T18 digital Ultra-turrax,Germany)以10000r/min的转速均质1.5min，得到低油相乳液凝胶，储存在4℃条件下。
对比例2
同实施例2，区别仅在于，不进行步骤(2)中的加热处理。
具体如下：
(1)将乳清分离蛋白(WPI)加入PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)中，在室温下匀速搅拌2h使WPI充分溶解，然后放置于4℃条件下过夜使WPI充分水合，得到浓度为10wt.％的WPI溶液。
(2)将WPI溶液的pH分别调节至6.5、7、7.5、8、8.5，得到5种不同的WPI颗粒，记为WPI/pH6.5/0h、WPI/pH7/0h、WPI/pH7.5/0h、WPI/pH8/0h、WPI/pH8.5/0h。
(3)将WPI颗粒加入离心管中，并向WPI颗粒中加入葵花籽油(葵花籽油的添加量为WPI颗粒和葵花籽油总质量的15％)，并在室温下采用高速分散机(IKA，T18 digitalUltra-turrax,Germany)以10000r/min的转速均质1.5min，得到低油相乳液凝胶，储存在4℃条件下。
效果例1(聚集颗粒的性质)
一、聚集颗粒的宏观表征
对实施例1和实施例2中经过加热处理获得的聚集颗粒(WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h；WPI/pH6.5/1h、WPI/pH7/1h、WPI/pH7.5/1h、WPI/pH8/1h、WPI/pH8.5/1h)进行宏观表征，结果见图1。
从图1((A)-(E))中可以看出，只有在pH7.5和加热结合诱导的条件下WPI会形成具有刚性凝胶结构的聚集颗粒。在pH7、8和加热结合诱导的条件下会形成具有较弱的WPI凝胶结构的聚集颗粒。然而在pH6.5、8.5和加热结合诱导的条件下WPI的聚集颗粒无法保持凝胶形状。
从图1((F)-(J))中可以看出，WPI-γS聚集颗粒在不同pH值下均呈现刚性凝胶结构，说明甾醇的加入会进一步增强WPI的凝胶性，并保持其结构在一段时间内不发生变化，这是因为γ-谷维素中的甾醇的存在，会降低静电排斥并暴露疏水基团，从而导致聚集颗粒和凝胶的形成。
综上可知，在pH7.5的条件下，pH和加热结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒具有最强的凝胶结构，这是因为WPI-γS在pH7.5时很容易发生热变性，这促进了蛋白质的疏水作用和二硫键交联。随着pH的不断增加，带负电荷的蛋白质之间的静电排斥作用会降低WPI和WPI-γS形成凝胶的倾向。
对比例1和对比例2由于未进行加热处理，因此，均无法形成凝胶结构。因为经过加热处理才能使蛋白质变性，从而肽链结构展开，疏水基团暴露，从而形成聚集颗粒，不进行加热处理就无法使蛋白质变性，肽链结构展开，疏水基团暴露，就无法成聚集颗粒。
二、聚集颗粒的质构的测定
采用质构分析仪测定实施例1和实施例2制备的聚集颗粒(WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h；WPI/pH6.5/1h、WPI/pH7/1h、WPI/pH7.5/1h、WPI/pH8/1h、WPI/pH8.5/1h)的硬度和粘附性，实验采用A/BE-d35探头进行测试，结果见图2(图2中(A)为硬度、(B)为弹性、(C)为黏性、(D)为咀嚼性)。
实验参数设置如下：测前、测试、测后速度分别为2mm/s、1mm/s、2mm/s，测试距离10mm，触发力5g，两次压缩间隔时间5s。
质构特性可以直观的反映凝胶强度，包括硬度、弹性、黏性和咀嚼性。其中硬度是指第一次压缩的最大力，弹性是指压缩的上冲程能量与下冲程能量之比，粘性是指测量分解半固态食物所需的能量，而咀嚼性测量咀嚼固体食物所需的能量。由于仅pH处理，未加热的WPI(对比例2)和WPI-γS(对比例1)无法形成凝胶状态，从而无法测定其质构特性。因此，仅展示出pH和加热结合诱导的聚集颗粒(实施例1和实施例2)的质构特性。
图2中pH为6.5的WPI/1h为WPI/pH6.5/1h；pH为6.5的WPI-γS/1h为WPI-γS/pH6.5/1h，其余pH代表的物质以此类推。
从图2中可以看出，在pH为7.5时，WPI/1h(WPI/pH7.5/1h)和WPI-γS/1h(WPI-γS/pH7.5/1h)的聚集颗粒均具有最高的硬度、弹性、黏性和咀嚼性。因此，pH7.5会使WPI和WPI-γS聚集颗粒具有最强的凝胶结构，这是因为此条件促进了蛋白质的疏水相互作用和二硫键的形成。然而pH为6.5时，WPI/1h(WPI/pH6.5/1h)和WPI-γS/1h(WPI-γS/pH6.5/1h)的聚集颗粒均具有最低的质构特性，这是因为蛋白质之间的静电排斥降低了聚集颗粒形成的凝胶的倾向。此外，当在相同pH的条件下，相比于WPI/1h聚集颗粒，WPI-γS/1h聚集颗粒的质构特性显著增强(P<0.05)，这是因为甾醇的存在会降低静电排斥作用，并暴露疏水基团，从而使聚集颗粒呈现更强的凝胶状态。
三、聚集颗粒的表面疏水性测定
测定本发明实施例1～2制备的聚集颗粒(WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h；WPI/pH6.5/1h、WPI/pH7/1h、WPI/pH7.5/1h、WPI/pH8/1h、WPI/pH8.5/1h)以及对比例1～2制备的颗粒(WPI-γS/pH6.5/0h、WPI-γS/pH7/0h、WPI-γS/pH7.5/0h、WPI-γS/pH8/0h、WPI-γS/pH8.5/0h；WPI/pH6.5/0h、WPI/pH7/0h、WPI/pH7.5/0h、WPI/pH8/0h、WPI/pH8.5/0h)的表面疏水性，结果见图3。
表面疏水性采用溴酚蓝(BPB)测定的。将1mL样品(实施例1、实施例2、对比例1或对比例2制备的)、1mL的0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.0)和200μL的BPB(1mg/mL)置于离心管中并漩涡10min。随后在4℃时以4000×g条件下离心15min。然后将上清液用PBS稀释10倍。采用型号UV-6100的紫外分光光度计测定稀释液在595nm处的吸光度。实验以PBS作为空白对照。BPB的结合量可用于分析复合物的表面疏水性，其计算公式如下：
bound BPB(μg)＝200μg×(Acontrol-Asample)/Acontrol
式中，bound BPB表示BPB的结合量，Acontrol表示空白组的吸光度，Asample表示样品的吸光度。
图2中pH为6.5的WPI/0h为WPI/pH6.5/0h；pH为6.5的WPI-γS/0h为WPI-γS/pH6.5/0h；pH为6.5的WPI/1h为WPI/pH6.5/1h；pH为6.5的WPI-γS/1h为WPI-γS/pH6.5/1h；其余pH代表的物质以此类推。
从图3中可以看出，在pH7和7.5时，相比于未加热处理的WPI-γS(WPI-γS/pH7/0h、WPI-γS/pH7.5/0h)，热诱导(加热处理)的WPI-γS(WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h)聚集颗粒的表面疏水性显著增强(P<0.05)，这是因为加热会导致蛋白质变性，从而蛋白质结构展开，其内部疏水基团暴露，进而表面疏水性显著提高；然而在pH6.5、8和8.5时，相比于未加热处理的WPI-γS，热诱导WPI-γS聚集颗粒的表面疏水性显著降低(P<0.05)。在不同pH处理的条件下，热诱导WPI聚集颗粒与未加热处理的WPI的表面疏水性没有显著差异。随着pH(6.5～8.5)的增加，pH和加热结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒的表面疏水性均呈现先升高后降低的趋势，并且在pH7.5时，WPI和WPI-γS聚集颗粒的表面疏水性相比于其它pH均达到最高，这可能是因为pH7.5条件下会使蛋白质的结构更加展开，从而暴露更多的疏水基团，提高了聚集颗粒的表面疏水性。此外，在相同的pH条件下，相比于WPI/0h与WPI/1h，WPI-γS/0h和WPI-γS/1h的表面疏水性显著提高，说明γS的加入使WPI分子中更多的疏水残基从疏水区转移到蛋白质分子表面。
四、测定本发明实施例1～2制备的聚集颗粒(WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h；WPI/pH6.5/1h、WPI/pH7/1h、WPI/pH7.5/1h、WPI/pH8/1h、WPI/pH8.5/1h)的化学相互作用力，结果见表1。
通过测定蛋白质在五种溶液中的溶解度从而分析其化学相互作用力。五种溶液的制备方法如下：S1(配置0.05mol/L的NaCl)，S2(配置0.6mol/L的NaCl)，S3(配置0.6mol/L的NaCl，1.5mol/L的尿素)，S4(配置0.6mol/L的NaCl，8mol/L的尿素)，S5(配置0.6mol/L的NaCl，8mol/L的尿素，0.6mol/L的β-巯基乙醇)。在3g聚集颗粒中分别加入30mL的五种不同的溶液，随后每15min进行漩涡2h，并在室温下过夜。采用双缩脲法测定蛋白质含量。通过蛋白质的浓度差来计算化学相互作用力，其中离子键为S2与S1中溶解蛋白质浓度的差值，氢键为S3与S2中溶解蛋白质浓度的差值，疏水相互作用力为S4与S3中溶解蛋白质浓度的差值，二硫键为S5与S4中溶解蛋白质浓度的差值。
热诱导的蛋白质凝胶(聚集颗粒)主要是通过疏水相互作用和共价键来稳定的，同时也会涉及氢键和静电相互作用。为了确定在甾醇存在的条件下WPI-γS的凝胶机制，通过测定聚集颗粒在不同溶液中溶解的蛋白质浓度，从而分析其相互作用力的类型。
表1化学相互作用力
从表1中可以看出，所有样品的S4、S3的差值(疏水相互作用力)和S5、S4的差值(二硫键)显著高于S2、S1的差值(离子键)和S3、S2的差值(氢键)，这说明维持聚集颗粒凝胶结构主要为疏水相互作用，其次为二硫键，很少涉及离子键和氢键。此外，不同pH下WPI和WPI-γS聚集颗粒的离子键和氢键变化不显著(P>0.05)。然而pH7.5下会显著降低WPI和WPI-γS聚集颗粒的疏水相互作用力(P<0.05)，增强了二硫键，从而形成了以二硫键为主更加稳定的蛋白质凝胶结构。在pH6.5和8.5时，WPI-γS聚集颗粒的疏水相互作用和二硫键会降低，这是因为此条件下蛋白质(乳清分离蛋白)和γS之间的相互作用使蛋白质结构不稳定。此外，在相同pH条件下，相比于WPI聚集颗粒，WPI-γS聚集颗粒的化学相互作用力显著增强，这是因为γS的存在减少了蛋白质之间的静电排斥，促进了二硫键交联。
效果例2(低油相Pickering乳液凝胶产品分析)
一、乳液凝胶平均粒径和电位的测定
测定采用本发明实施例1～2制备的聚集颗粒(WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h；WPI/pH6.5/1h、WPI/pH7/1h、WPI/pH7.5/1h、WPI/pH8/1h、WPI/pH8.5/1h)以及对比例1～2制备的颗粒(WPI-γS/pH6.5/0h、WPI-γS/pH7/0h、WPI-γS/pH7.5/0h、WPI-γS/pH8/0h、WPI-γS/pH8.5/0h；WPI/pH6.5/0h、WPI/pH7/0h、WPI/pH7.5/0h、WPI/pH8/0h、WPI/pH8.5/0h)制备(稳定)的乳液凝胶的平均粒径和电位，结果见图4。
采用激光粒度分析仪(Zetasizer Nano-ZS90，Malvern Ltd.，UK)在室温下测定样品的粒径和电位。对于蛋白质样品直接配置成不同浓度后测定。然而对于乳液样品，将乳液(实施例1～2以及对比例1～2制备的乳液凝胶)用0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)稀释50倍后再测定其粒径和电位。
图4中(A)为平均粒径，(B)为电位；图中，pH为6.5的WPI/0h为采用WPI/pH6.5/0h制备的乳液凝胶；pH为6.5的WPI-γS/0h为采用WPI-γS/pH6.5/0h制备的乳液凝胶；pH为6.5的WPI/1h为采用WPI/pH6.5/1h制备的乳液凝胶；pH为6.5的WPI-γS/1h为采用WPI-γS/pH6.5/1h制备的乳液凝胶；其余pH代表的物质以此类推。
从图4中可以看出，与未加热的WPI和WPI-γS稳定的LOPPEGs相比，pH和加热结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs的平均粒径显著降低(P<0.05)，电位的绝对值显著提高(P<0.05)，说明热诱导(加热处理)聚集颗粒可以提高其稳定的LOPPEGs的物理稳定性，这是因为热诱导使蛋白质分子展开，从而暴露疏水基团，使聚集颗粒更易于吸附在油-水界面上。相比于其它pH处理条件，在pH7.5条件下，对于0h和1h的WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs呈现出显著降低的平均粒径和显著提高的电位平均值(P<0.05)，然而pH6.5条件下的聚集颗粒具有最差的稳定性，产生这种现象的原因可能是pH7.5条件下的聚集颗粒具有最强的刚性结构，从而其稳定的LOPPEGs呈现致密的3D网络结构。此外，pH和加热结合诱导WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs比WPI聚集颗粒稳定的LOPPEGs展示出更强的稳定性，这是因为甾醇能够与WPI相互作用能够促进3D网络结构的形成，从而提高了乳液凝胶的稳定性。
二、乳液凝胶界面形态结构的测定
对实施例1～2及对比例1～2制备的乳液凝胶的界面形态结构进行测定，结果见图5。
在加速电压为3kV的条件下，采用冷冻电子显微镜观察Pickering乳液凝胶的表面形貌。根据Li等人的研究方法，取一小块Pickering乳液凝胶样品置于铝铆钉上，随后，将样品在熔化的乙烷(-182℃)中冷冻，并转移到低温制备室(Oxford CT 1500HF)，使用氮浆和真空防止水蒸气凝结。在低温制备室中，用冷却刀切割样品，并在-90℃使用升华蚀刻新创建的样品表面，从而将水去除到几微米的深度，并显示表面以下的结构。升华后的样品溅射镀上一层薄薄的金/钯，转入扫描电镜，样品在-125℃下分析。
图5中(A1)～(A5)为分别采用对比例2的WPI/pH6.5/0h、WPI/pH7/0h、WPI/pH7.5/0h、WPI/pH8/0h、WPI/pH8.5/0h制备的乳液凝胶的界面形态结构；
(B1)～(B5)为分别采用对比例1的WPI-γS/pH6.5/0h、WPI-γS/pH7/0h、WPI-γS/pH7.5/0h、WPI-γS/pH8/0h、WPI-γS/pH8.5/0h制备的乳液凝胶的界面形态结构；
(C1)～(C5)为分别采用实施例2的WPI/pH6.5/1h、WPI/pH7/1h、WPI/pH7.5/1h、WPI/pH8/1h、WPI/pH8.5/1h制备的乳液凝胶的界面形态结构；
(D1)～(D5)为分别采用实施例1的WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH7.5/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h制备的乳液凝胶的界面形态结构。
从图5的(A1)～(A5)和(B1)～(B5)中可以看出，WPI和WPI-γS稳定的LOPPEGs(乳液凝胶)展示出光滑的界面形态结构，然而相比于未加热的WPI和WPI-γS稳定的LOPPEGs的微观结构，pH和加热结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs的界面结构形态由光滑不断呈现出显著的网络状结构，这是因为热聚集颗粒会吸附在油-水界面上，从而形成致密的蛋白质颗粒。
从图5的(C1)～(C5)和(D1)～(D5)中可以看出，WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs的界面形态结构相比于WPI聚集颗粒稳定的LOPPEGs更加紧密，并且其网络状结构中存在大量的聚集颗粒，这是因为γS的加入促进了WPI发生有序聚集，同时使蛋白质肽链展开。此外，相比于其它pH处理条件，pH7.5和加热结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs均具有更加致密的孔径和更加致密的颗粒层，而其它pH处理条件下并没有显著的差异。
三、乳液凝胶表观粘度的测定
测定本发明实施例1和实施例2制备的聚集颗粒制备乳液凝胶的表观粘度，结果见图6。
采用旋转流变仪(NDJ-B5)研究HIPPEGs的表观粘度。在剪切速率为0.1～100s-1范围内记录其表观粘度的变化。
从图6中可以看出，所有LOPPEGs(乳液凝胶)的表观粘度与剪切速率均呈现负相关的关系，具体而言，在剪切速率为0～20s-1范围内，表观粘度随剪切速率的增加而急速下降，在剪切速率为20～100s-1范围内，表观粘度随剪切速率的增加而缓慢下降。上述现象说明所有LOPPEGs均为假塑性流体，并具有剪切稀化流变学效应。在剪切速率范围内(0～100s-1)，在相同pH处理条件下，WPI-γS/1h聚集颗粒比WPI/1h聚集颗粒具有更高的表观粘度，说明相比于WPI稳定的LOPPEGs，WPI-γS稳定的LOPPEGs的剪切稀化程度更加剧烈，这是因为γS的加入使乳液体系需要更大的剪切作用力进而抵抗布朗运动。对于不同pH处理的WPI/1h和WPI-γS/1h聚集颗粒，pH7.5结合加热诱导的聚集颗粒所稳定的LOPPEGs具有最高的表观粘度。有研究发现连续相被压缩的越紧密，从而乳液的粘度越大，本发明的连续相为pH和加热结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒，并且由图1可知，WPI/pH7.5/1h和WPI-γS/pH7.5/1聚集颗粒呈现出最强的刚性凝胶结构，从而聚集颗粒之间交联而形成的网络结构与葵花籽油在形成乳液的过程中通过进一步挤压，进而乳液液滴之间相连而使乳液的表观粘度显著提高。
四、乳液凝胶流变学行为的测定
采用直径为40nm平行板几何形状的旋转流变仪(HR-1，USA)测定乳液凝胶(实施例1和实施例2制备的聚集颗粒制备乳液凝胶)的流变学行为。其中测量间隙为500μm。在0.1～100s-1的范围内分析储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)随频率扫描和振幅扫描的变化，结果见图7。
图7中，(A)为实施例2制备的乳液凝胶储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)的频率依赖性曲线；(B)为实施例1制备的乳液凝胶储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)的频率依赖性曲线；(C)为实施例2制备的乳液凝胶储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)的应力依赖性曲线；(D)为实施例1制备的乳液凝胶储存模量(G'，实心)和损失模量(G”，空心)的应力依赖性曲线。
通过究乳液凝胶的储存模量(G′)和损失模量(G″)分别与频率和应力之间的关系，可以进一步分析pH和加热结合诱导聚集颗粒对于其稳定的乳液凝胶的影响。
从图7的(A)和(B)中可以看出，随着频率(0.1～100Hz)的不断变化，所有乳液凝胶的G′均高于G″，这是因为所有乳液凝胶均形成了致密的三维网状结构。同样地，从图7的(C)和(D)中可以看出，随着应力(0.1～100％)的不断变化，所有乳液的G′均高于G″，并且两者呈现几乎平行的状态，说明乳液凝胶均呈现出主要以弹性为主的质地。
WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs的G'和G”的值均比WPI聚集颗粒稳定的LOPPEGs高，说明乳液凝胶的固体行为显著增强。此外，对于频率扫描和应力扫描，相比于其它pH处理，WPI/pH7.5/1h和WPI-γS/pH7.5/1h聚集颗粒稳定的LOPPEGs均呈现出最大的G'和G”，说明pH7.5和加热结合诱导聚集颗粒稳定的LOPPEGs具有最紧密的网络结构和更高的弹性。
五、乳液凝胶低场核磁共振的测定
将本发明实施例1和实施例2制备的乳液凝胶(实施例1和实施例2制备的聚集颗粒制备乳液凝胶)置于10mL烧杯中用于后续实验。采用低场核磁共振(LF-NMR)分析仪(MesoMR 23-060H-I)测定乳液凝胶样品的低场核磁共振弛豫时间和成像。采用CPMG序列(脉冲间隔为1ms，扫描重复时间为2s)进行测定，每个样品重复扫描16次。随后，利用MultiExp InvAnalisis软件对数据进行反演，从而进行测定低场核磁共振弛豫时间，结果见图8和表2。
食品在化学和结构上具有显著不同的差异，使其组分的分子迁移率的不同而表现出不同的核磁共振弛豫，因此核磁共振弛豫能表征和定量的分析食品体系。本发明采用低场核磁共振分析仪测定pH和加热结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs的横向弛豫谱图(见图8)。为了进一步分析乳液中水分分布情况，对WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的LOPPEGs的横向弛豫时间(T2)和峰面积(P2)进行了测定(见表2)。
表2
从图8中可以看出，所有LOPPEGs均展示出两个松弛峰，其中具有弛豫时间较短的峰记为T21，表示乳液中的结合水，其峰面积记为P21，弛豫时间较长大的峰记为T22，表示乳液中的自由水，其峰面积记为P22。所有LOPPEGs的P21均显著高于P22(P<0.05)，说明所有乳液凝胶的水相主要以结合水的形式存在。由表2可知，相比于WPI/1h聚集颗粒稳定的LOPPEGs，WPI-γS/1h聚集颗粒稳定的LOPPEGs的两个峰的弛豫时间均显著降低(P<0.05)，说明γS的加入限制了复合物所稳定的LOPPEGs中水分的流动，进而提高了乳液凝胶的稳定性。此外，当调节pH分别为7.5和8.5时，WPI-γS/1h聚集颗粒稳定的LOPPEGs比WPI/1h聚集颗粒稳定的LOPPEGs的P21分别提高了0.9580％和26.53％，说明WPI-γS/1h聚集颗粒稳定的LOPPEGs比WPI/1h聚集颗粒稳定的LOPPEGs存在更多的结合水。此外，与WPI-γS/pH6.5/1h、WPI-γS/pH7/1h、WPI-γS/pH8/1h、WPI-γS/pH8.5/1h聚集颗粒稳定的LOPPEGs相比，WPI-γS/pH7.5/1h聚集颗粒所稳定的LOPPEGs的P21分别提高了33.11％、14.94％、10.12％、5.68％，说明WPI-γS/pH7.5/1h聚集颗粒所稳定的LOPPEGs具有更多的结合水和更少的自由水，从而其乳液凝胶具有最致密的结构。
实施例3
(1)将乳清分离蛋白(WPI)加入PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)中，在室温下匀速搅拌2h使WPI充分溶解，然后放置于4℃条件下过夜使WPI充分水合，得到浓度为12wt.％的WPI溶液。
(2)将γ-谷维素(γS)溶解于无水乙醇中配制成浓度为10wt.％的γS无水乙醇溶液。
(3)将WPI溶液和不同量的γS无水乙醇溶液混合均匀，并向其中加入PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)，然后用旋转蒸发仪除去乙醇，并补充等体积的PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)，使WPI的最终浓度为1wt.％，γS的最终浓度(甾醇浓度)分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1wt.％，然后分别调节pH至7.5，最后在85℃下加热1h，得到6种不同γS含量的WPI-γS聚集颗粒。
实施例4
(1)将乳清分离蛋白(WPI)加入PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)中，在室温下匀速搅拌2h使WPI充分溶解，然后放置于4℃条件下过夜使WPI充分水合，得到浓度为12wt.％的WPI溶液。
(2)将麦角甾醇(ES)溶解于无水乙醇中配制成浓度为10wt.％的ES无水乙醇溶液。
(3)将WPI溶液和不同量的ES无水乙醇溶液混合均匀，并向其中加入PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)，然后用旋转蒸发仪除去乙醇，并补充等体积的PBS缓冲溶液(浓度为0.01mol/L，pH为7.0)，使WPI的最终浓度为1wt.％，ES的最终浓度(甾醇浓度)分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1wt.％，然后分别调节pH至7.5，最后在85℃下加热1h，得到6种不同ES含量的WPI-ES聚集颗粒。
效果例3(一)抗氧化活性
测定WPI以及实施例3～4制备的WPI-γS聚集颗粒和WPI-ES聚集颗粒(样品)的DPPH自由基和ABTS自由基清除能力，结果见图9。
DPPH自由基清除能力测定方法：将40μL的样品(其中，WPI样品的终浓度为1wt.％)和160μL的DPPH乙醇溶液混合(0.1mmol/L)，随后在室温下避光反应30min，在517nm处测定混合物的吸光度。其计算公式如下：
其中，A表示样品与DPPH乙醇溶液混合的吸光度，Ai表示样品与乙醇混合的吸光度，Aj表示DPPH乙醇溶液的吸光度。
ABTS自由基清除能力测定方法：首先将150mL的ABTS储备液(7mmol/L)与1.32mL过硫酸钾储备液(2.45mmol/L)混合，然后避光静置12～16h得到ABTS阳离子自由基储备溶液，随后用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0)将ABTS阳离子自由基储备溶液稀释至一定倍数，直到其储备溶液在734nm处的吸光度为0.7±0.02，得到最终的ABTS阳离子自由基储备溶液。将20μL样品溶液和2mL的ABTS阳离子自由基储备溶液混匀，随后在反应6min后测定混合物在734nm处的吸光度以PBS为空白对照代替样品测定吸光度。其计算公式如下：
其中，A表示样品与ABTS阳离子自由基储备溶液混合的吸光度，A0表示PBS与ABTS阳离子自由基储备溶液混合的吸光度。
从图9中可以看出，WPI的DPPH和ABTS自由基清除能力分别为21.31％和29.45％，这是因为WPI是一种含有氨基酸(如半胱氨酸)的天然抗氧化生物聚合物，其具有清除自由基和螯合金属离子的能力。此外，与WPI相比，WPI-ES和WPI-γS聚集颗粒的抗氧化活性显著提高(P<0.05)，并且随着甾醇浓度的增加，两种聚集颗粒的抗氧化活性随之显著增强(P<0.05)，这可能是因为甾醇的加入会暴露WPI内部的疏水性氨基酸，从而提高了两种聚集颗粒的自由基清除能力。此外，WPI-γS聚集颗粒的自由基清除能力显著高于WPI-ES(P<0.05)，这是因为γS上的酚羟基上的氢容易断裂，从而易于捕捉自由基，同时ES上的醇羟基没有γS活跃，从而WPI-ES表现出较差的抗氧化活性。
(二)胆固醇抑制活性
测定WPI以及实施例3～4制备的WPI-γS聚集颗粒和WPI-ES聚集颗粒的胆固醇抑制活性，结果见图10。
胆固醇抑制活性的测定方法：将0.5377g牛黄胆酸钠、0.0316mL油酸、0.7714gNaCl、0.0155g胆固醇混合并置于100mL磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.0，0.1mol/L)中制备模拟胆汁胶束溶液。将胆汁胶束溶液在37℃条件下放置24h。随后测定100μL样品(其中，WPI样品的终浓度为1wt.％)与1μL胆汁胶束溶液混合后的胆固醇含量。胆固醇含量采用胆固醇试剂盒进行测定。胆固醇抑制率的计算公式如下：
其中，S0表示未加入样品的胆固醇含量，S1表示样品的胆固醇含量。
从图10中可以看出，WPI基本不具备体外降胆固醇活性，然而添加甾醇后，两种聚集颗粒的胆固醇抑制率显著提高(P<0.05)，并且随着甾醇浓度的增加，WPI-γS聚集颗粒的胆固醇抑制率略有增强(P<0.05)，这可能是因为甾醇能够进入胆汁胶束中从而与胆固醇竞争，进而干扰胆固醇在肠道中的吸收，从而起到降低胆固醇活性的作用。有报告指出在食品中加入甾醇后，其中的低密度脂蛋白胆固醇降低了10％。当甾醇的添加浓度相同时，WPI-γS聚集颗粒的胆固醇抑制率显著高于WPI-ES(P<0.05)，这可能是因为γ-谷维素属于一种甾醇酯，其所具有的芳香基团能够增强分子的刚性，从而相比于麦角甾醇，γS在胆汁胶束中具有更强的聚集能力，从而其胆固醇抑制率更强。
实施例5
制备不同葵花籽油含量的低油相Pickering乳液凝胶：
制备方法同实施例1，区别仅在在于，步骤(4)中葵花籽油的添加量为聚集颗粒和葵花籽油总质量的5％、10％、15％和20％。
实施例6
制备不同葵花籽油含量的低油相Pickering乳液凝胶：制备方法同实施例2，区别仅在在于，步骤(3)中葵花籽油的添加量为聚集颗粒和葵花籽油总质量的5％、10％、15％和20％。
效果例4
低油相Pickering乳液凝胶相行为分析
pH和加热结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的低油相Pickering乳液凝胶(实施例4～5制备的)的相图的构建见图11和图12。其中，蓝色的圆形表示不具有稳定性的油水分层的乳液，绿色的正方形表示具有流动性的未分层的乳液，橙色的三角形表示具有黏弹性的乳液凝胶。
图11(A-D)分别展示出在油含量为5、10、15、20条件下，不同pH和不同加热时间结合诱导WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的低油相Pickering乳液凝胶的相图，图12(A-E)分别展示出在加热时间分别为0、0.5、1、2、3h条件下，不同油含量和不同pH结合制备的WPI和WPI-γS聚集颗粒稳定的低油相Pickering乳液凝胶的相图。
从图11(A-D)中可以看出，当油含量分别为5％和10％时，改变pH和加热时间诱导聚集颗粒均无法形成具有黏弹性的乳液凝胶，然而随着油含量的增加能够不断促进具有黏弹性乳液凝胶的形成，在油含量为15％时，热诱导时间为1h和2h条件下，WPI-γS聚集颗粒稳定的低油相Pickering乳液凝胶同样会形成凝胶。从图12(A-E)中可以看出，当热诱导时间为3h时，改变油含量和pH所有到聚集颗粒均无法形成具有黏弹性的乳液凝胶。根据上述乳液相图的研究结果，在85℃加热1h条件下与pH结合形成的聚集颗粒为最佳条件，从而可用于稳定最低油含量为15％的低油相Pickering乳液凝胶。
效果例5
低油相Pickering乳液凝胶的宏观表征
测定方法：将制备好的所有低油相Pickering乳液凝胶样品分别装入3mL的样品瓶中，在室温下保存60天，随后观察低油相Pickering乳液凝胶在0和60天的宏观状态分析其储存稳定性，结果见图13。
图13中，(A)为对比例2制备的乳液凝胶储存0天，(B)为对比例2制备的乳液凝胶储存0天，(C)为实施例2制备的乳液凝胶储存0天，(D)为实施例1制备的乳液凝胶储存0天，(E)为对比例2制备的乳液凝胶储存60天，(F)为对比例2制备的乳液凝胶储存60天，(G)为实施例2制备的乳液凝胶储存60天，(H)为实施例1制备的乳液凝胶储存60天。
从图13中可以看出，所有乳液在储存0天(A-D)时均呈现均一的乳白色状态，其中WPI/0h和WPI-γS/0h稳定的LOPPEGs呈现溶液状态，WPI/1h稳定的低油相Pickering乳液凝胶呈现出比较粘稠的溶液，然而无法保持长时间不流动的状态，WPI-γS/1h稳定的低油相Pickering乳液凝胶呈现出乳液凝胶状态，并能够保持倒置后长时间不流动的状态。
由图13(E-H)可知，当乳液在储存60天后，WPI/0h和WPI-γS/0h稳定的低油相Pickering乳液凝胶呈现不稳定的分层状态，WPI/1h稳定的低油相Pickering乳液凝胶未出现明显的分层情况，但是乳液中会析出油脂，WPI-γS/1h稳定的低油相Pickering乳液凝胶依然呈现乳液凝胶状态，并且能够保持倒置后长时间不流动，而且没有油脂析出。
由以上结果可知，热诱导可以显著提高聚集颗粒稳定的低油相Pickering乳液凝胶的凝胶强度，这是因为热诱导聚集颗粒具有更高的表面疏水性，从而降低了其吸附在油-水界面上所需的能量，进而热诱导聚集颗粒能够更快的吸附在油-水界面上，从而提高其稳定的低油相Pickering乳液凝胶的稳定性和凝胶强度。
效果例6
对本发明实施例1在pH7.5时制备的乳液凝胶(本研究LOPPEGs)和市售的好樂门、乐禧瑞和妙多蛋黄酱进行状态对比，结果见图14。
从图14中可以看出，市售的三种品牌的蛋黄酱分别是好樂门、乐禧瑞和妙多，从颜色来看，市售的蛋黄酱均呈现淡黄色，而本发明所制备的低油相Pickering乳液凝胶呈现乳白色，并且从外观状态来看，本发明所制备的低油相Pickering乳液凝胶同样呈现出半固态结构，从而具有替代蛋黄酱的潜力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将乳清分离蛋白加入缓冲溶液中，搅拌溶解、冷藏后加入γ-谷维素的乙醇溶液，混合均匀后去除乙醇溶液，得到复合颗粒溶液；
(2)调节复合颗粒溶液的pH至6.5～8.5，加热反应，得到聚集颗粒，然后在聚集颗粒中加入不饱和油脂，分散均匀，得到所述低油相Pickering乳液凝胶。
2.根据权利要求1所述的低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，其特征在于，在去除乙醇溶液后还包括：补充等体积的缓冲溶液的步骤。
3.根据权利要求1所述的低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，其特征在于，所述复合颗粒溶液中乳清分离蛋的浓度为10wt.％，γ-谷维素的浓度为1wt.％。
4.根据权利要求1所述的低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液；所述PBS缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH为7.0。
5.根据权利要求1所述的低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，其特征在于，所述搅拌的时间为2h；所述冷藏的温度为4℃。
6.根据权利要求1所述的低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，其特征在于，所述加热反应的温度为85℃，时间为1h。
7.根据权利要求1所述的低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，其特征在于，所述不饱和油脂为葵花籽油；所述不饱和油脂的添加量为聚集颗粒和不饱和油脂总质量的15％；所述分散具体包括：采用10000r/min的转速均质1.5min。
8.根据权利要求1所述的低油相Pickering乳液凝胶的制备方法，其特征在于，所述复合颗粒溶液的pH为7.5。
9.一种权利要求1～8任一项所述的制备方法制备的低油相Pickering乳液凝胶。
10.一种权利要求9所述的低油相Pickering乳液凝胶作为蛋白基低脂食品在食品工业中的应用。
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