CN116368234A - 用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的方法、用于生产全培养液酶组合物的基因修饰的丝状真菌、此类基因修饰的丝状真菌在生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物中的用途以及通过此类方法生产的丝状真菌全培养液酶组合物。
Description
发明领域
本发明涉及一种用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的方法，一种用于生产全培养液酶组合物的基因修饰的丝状真菌细胞，此类基因修饰的丝状真菌细胞用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的用途，以及通过此类方法生产的丝状真菌全培养液酶组合物。
背景技术
来自含木素纤维素(lignocellulose-containing)(或木质纤维素(lignocellulosic))生物质水解产物作为用于生产各种物质(例如，酶、乳酸、脂肪酸、异丁醇、丁二醇、琥珀酸、衣康酸以及乙醇)的有价值的底物越来越受到关注。源自这种方法的乙醇通常被称为“生物乙醇”或“生物燃料”。所需物质的生产通常通过涉及能够产生所需终产物的酵母、细菌或真菌的发酵方法进行。
此类方法的一个主要缺点是木质纤维素生物质底物本身。通常被称为“木质纤维素底物”的所有生物质含有相当大量的木质素(lignin)(至多40wt％)、纤维素(至多55wt％)和半纤维素(至多55wt％)。由于其来源(木材或杂草植物衍生的生物质)，细胞壁的结构也显著不同于将影响底物水解的大多数其它的那些植物物种。水解可以通过施用化学品(例如酸)来实现，但通常通过酶的消化来进行，其没有例如由化学处理产生的盐来污染水解产物。
这些聚合物的必要水解分解涉及使用几种纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和氧化还原酶。为了避免昂贵地补充单一特定的酶，此类水解分解通常通过施用所谓的“全培养液酶组合物”来进行，其由能够产生用于底物水解所必需的所有酶的微生物(例如丝状真菌)产生。然后，当使用普通的面包酵母时，所得的葡萄糖和纤维寡糖可以容易地发酵为所需的终产物，例如乙醇。
为了获得经济可行性，所需终产物的高产率以及所产生的全培养液酶组合物的高产率是必要的。这尤其适用于当最终产物是生物乙醇时，其必须与市场上的普通且廉价的矿物油衍生的燃料产物竞争。由纤维素和半纤维素以高产率生产单糖远比由含糖或含淀粉作物(例如甘蔗或玉米)衍生糖困难得多(Van Dyck and Pletschke,2012)。因此，尽管木质纤维素生物质的成本远低于糖和淀粉作物的成本，但从此类材料获得糖用于发酵成例如生物乙醇的成本通常被认为太高而不能在工业上可行。为此，关键是解决木质纤维素生物质转化为水解产物中涉及的问题。
一个问题是用于生产全培养液酶组合物所需要的真菌，尤其是丝状真菌的发酵培养液的高粘度。为了获得高产率的酶，期望真菌的旺盛生长，然而，旺盛生长伴随发酵培养液中真菌生物质的高含量。已知由i.a.菌丝组成的真菌在本领域中已知能使任何发酵底物成为高粘度组合物。当使用呈现海绵状、粘滑外观的丝状真菌时，这种效果显著更明显。
高粘度引起许多问题，因为真菌在生长期间需要通过通气持续供氧。此外，需要冷却发酵罐，尤其是在工业规模生产中。两者仅可以通过持续搅拌来保证-一方面将空气气泡均匀地分布在培养液内，并且另一方面便于与冷却装置进行持续的热交换。培养液的粘度越高，在反应器内实现有效搅拌需要消耗的能量越多。此外，被压入到反应器的空气越多，压缩机和无菌过滤器单元内的能量消耗也越高。因此，CAPEX和OPEX都随着发酵培养液粘度的增加而增加。替代措施-减少细胞产量-对于商业生产也不具有吸引力，因为这总是伴随着较低的全培养液酶产量。
由于木质纤维素生物质是已经提供了若干挑战的底物，当将此类方法应用于商业规模生产时，必须避免任何进一步的成本增加。
因此，本发明的发明人自己设定了开发用于生产具有低粘度的丝状真菌全培养液酶组合物的方法的任务，同时维持培养液内酶的高产率。
发明内容
该任务已经通过用于生产全培养液酶组合物的方法解决，其包含以下步骤：
(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，其葡萄糖含量为5至450g/L、木糖含量为2至300g/L、密度为1至2kg/L和干物质含量为10至75wt％；
(b)加入至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将所述发酵培养基和所述至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间；
(d)获得全培养液酶组合物。
具体实施方案
在本发明中，术语“全培养液”应理解为由部分或完全发酵的培养基组成或含有部分或完全发酵的培养基，甚至可以含有原始培养基的组分，但也可以含有发酵期间产生的任何化合物。“全培养液”还可以含有发酵微生物的部分或全部微生物生物质。
在本发明中，术语“全培养液酶组合物”应理解为本文所定义的含有至少一种酶的任何全培养液。至少一种酶可以已经被加入到全发酵培养液中，可以是原始发酵培养基的一部分，但是也可以在根据本发明的生产期间产生。“全培养液酶组合物”还可以包含两种或较多种此类酶的混合物。
在本发明中，全培养液酶组合物优选含有至少一种属于水解酶类的酶。在本发明的特别优选的实施方案中，全培养液酶组合物含有至少一种由至少一种丝状真菌细胞产生的属于水解酶类的酶。在另一个还特别优选的实施方案中，全培养液酶组合物含有通过至少一种丝状真菌细胞产生的至少一种属于纤维素酶类的酶和至少一种属于半纤维素酶类的酶。
在本发明中，术语“属于水解酶类的酶”应理解为包含能够水解化学键的任何酶。属于水解酶类的酶在酶的EC编号分类中被分类为EC 3。根据本发明，术语“水解酶”包括纤维素酶、半纤维素酶、也可以包括果胶酶、氧化酶和辅助蛋白。
本发明中使用的术语“纤维素酶”是指能够将纤维素聚合物水解成更短的低聚物和/或葡萄糖的任何酶。在全培养液酶组合物中优选的纤维素酶包括纤维二糖水解酶(CBH)(EC 3.2.1.-)、内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)(EC 3.2.1.4).)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.21)、糖苷水解酶61(GH61和CBM33)。
本发明中使用的术语“半纤维素酶”是指能够降解或支持半纤维素降解的任何酶。全培养液酶组合物中优选的半纤维素酶包括β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.-)、内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)、乙酰半乳聚糖酯酶(3.1.1.6)、乙酰甘露聚糖酯酶、阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)、葡萄糖醛酸酯酶(EC3.1.1.-)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(3.2.1.-)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)、β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、甘露聚糖1,4-甘露二糖苷酶(EC3.2.1.100)、阿拉伯半乳聚糖内切-β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、半乳聚糖内切-β-1,3-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.181、葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.136)、α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、松柏苷β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.126)、木葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.150,151,155)、木聚糖α-1,2-葡萄糖醛酸糖苷酶(EC 3.2.1.131)、内切木糖半乳糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-；GH28)、α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)、半乳聚糖1,3-半乳糖苷酶(GH43)、-1,4,-内切半乳聚糖酶(EC 3.5.1.89；GH53)、α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)。
本发明中使用的术语“果胶酶”是指能够降解或支持果胶降解的任何酶。全培养液酶组合物中优选的果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15,67,82；GH28果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)、果胶乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.-；GH28)、鼠李半乳糖醛酸乙酰酯酶(EC 3.1.1.86)、鼠李糖聚半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶(EC3.2.1.-)、木半乳糖醛酸水解酶(EC 3.2.1.-)、果胶甲基酯酶(EC 3.1.1.11)、β-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、β-1,4-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)、β-1,3-半乳聚糖酶(EC3.2.1.90)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、阿魏酰乙酰酯酶(EC 3.1.1.-)、α-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、(β-岩藻糖苷酶)(EC 3.2.1.38)、β-芹菜糖苷酶(EC 3.2.1.-)、α-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、β-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.43)、α-阿拉伯吡喃糖苷酶(EC 3.2.1.-)、β-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、α-葡萄糖醛酸酶(EC3.2.1.139)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和α-木糖苷酶(EC 3.2.1.x)。
本发明中使用的术语“辅助蛋白”是指能够支持纤维素分解酶活性的任何酶。术语是本领域技术人员众所周知的。全培养液酶组合物内的优选的辅助蛋白包括扩张蛋白、膨胀素、芦荟素和CIP蛋白(EC 3.1.1.-；CE15)。
本发明中使用的术语“氧化酶”是指能够催化氧化反应的任何酶。全培养液酶组合物中优选的氧化酶包括裂解多糖单加氧酶(LPMO)(AA9-11；先前分别为GH61和CBM33)(EC1.14.99.53-56,1.14.99.B10)、木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC1.11.1.13)、芳基醇氧化酶(EC 1.1.3.7)、乙二醛氧化酶(EC 1.1.3.)、碳水化合物氧化酶(EC 1.1.3.4,9,10)、纤维二糖脱氢酶(EC 1.1.99.18)、过氧化氢酶(过氧化氢氧化还原酶)(EC 1.11.1.6or EC 1.11.1.21)、染料脱色过氧化物酶(EC 1.11.1.19)、漆酶(EC1.10.3.2)、过氧化物酶(EC 1.11.1.x)和多功能过氧化物酶(EC 1.11.1.16)。
本发明中引用的酶根据基于国际生物化学和分子生物学联合会的酶命名法和分类法(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)或基于碳水化合物-活性酶(http://www.cazy.org/)数据库的命名法分类。
在本发明中，属于水解酶类的至少一种酶的量优选为1至45wt％(相对于全培养液酶组合物的重量)，进一步优选为1至25wt％，特别优选为1至20wt％，还优选为2至15wt％、2至14wt％、3至12wt％，并且最优选为5至11wt％。
在本发明中，术语“源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基”可以是通过木质纤维素生物质材料的化学、机械和/或酶水解制备的任何培养基，并且优选包含有木质纤维素生物质的预先机械和/或酸性预处理。在本发明方法的优选实施方案中，水解通过机械和酶水解或通过单独的酶水解进行，而不加入任何有机酸和/或无机酸。水解木质纤维素生物质是本领域技术人员已知的，示例性方法例如描述于Vishnu et等人2012(Trends inbioconversion of lignocellulose:Biofuels,platform chemicals&biorefineryconcept in bioconversion of lignocellulose:Biofuels,platform chemicals&biorefinery concept.Progress in Energy and Combustion Science，2012年8月，第38(4)卷，522-550)和Prasad等人2019(Bioethanol production from wastelignocelluloses:A review on microbial degradation potential Chemosphere第231卷，2019年9月，第588-60页)。
在本发明中，术语“含有木质纤维素的生物质”应理解为包含本领域技术人员已知的包含有木质纤维素的所有种类的生物质。根据本发明的特别优选的含有木质纤维素的生物质包括木材、谷物秸秆(例如但不限于小麦秸秆、水稻秸秆、大麦秸秆、黑麦秸秆和燕麦秸秆)和/或其壳和/或麸皮、甘蔗渣、燕麦壳、柳枝稷、纤维素、原纸浆(从纸浆和纸生产获得)及其混合物。另外的组分可以包含以下组分中的一种或多种：纯化的纤维素、纸浆、牛奶乳清或糖蜜。根据本发明的方法，特别适合水解的木质纤维素生物质选自谷物秸秆、谷物麸皮、谷物壳、木材、甘蔗渣及其混合物。
在一个优选的实施方案中，含有木质纤维素的材料含有至少25wt％，优选至少40wt％，更优选至少70wt％，甚至更优选至少80wt％，并且最优选至少90wt％的木质纤维素。应理解，含有木质纤维素的材料还可包含其它化合物，例如蛋白质材料、淀粉、糖，例如可发酵糖和/或不可发酵糖。
在本发明的方法中，发酵培养基含有5至450g/L的葡萄糖和2至300g/L的木糖，其中葡萄糖含量优选为5至420g/L、8至400g/L和10至280g/L，其中木糖含量优选为3至280g/L、3至270g/L和4至260g/L。进一步优选的葡萄糖范围为10至450g/L、40-400g/L和50至350g/L，而进一步优选的木糖范围为10至280g/L、30至250g/L和50至220g/L。进一步优选的为葡萄糖与木糖的比率选自5至1的范围，例如选自3至1、4.0至1.5、3.5至1.5或3.0至1.5的范围。选自2.5至1.0的范围的比率是最优选的，因为在水解期间从木质纤维素生物质中释放了最大量的葡萄糖和木糖，使得全培养液酶组合物的产量更高。
源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基的高密度为0.90至2.00kg/L，优选0.95至1.90kg/L，更优选1.00至1.50kg/L，最优选1.05至1.35kg/L。
源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基干物质含量为10至75wt％，优选10至70wt％，进一步优选20至65wt％，30至65wt％或40至60wt％，而10至20wt％和10至15wt％的干物质含量也是优选的。
根据本发明方法的步骤(a)的发酵培养基的“提供”可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何方法和任何手段进行。在优选的实施方案中，源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基在分批或补料分批反应器中提供，其优选配备搅拌装置和冷却装置。
在本发明方法的优选实施方案中，发酵培养基中糠醛的含量为小于0.5g/L，优选小于0.2g/L，进一步优选小于0.1g/L，还优选小于0.05g/L，并且最优选选自0.001mg/L至0.5g/L或0.01mg/L至0.25g/L的范围。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，发酵培养基中羟甲基糠醛的含量为小于0.5g/L，优选小于0.2g/L，进一步优选小于0.1g/L，还优选小于0.05g/L，并且最优选选自0.001mg/L至0.5g/L或0.01mg/L至0.25g/L的范围。
在另一个优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(a)和/或(b)期间加入0.05至5wt％的氮。进一步优选的范围是0.08至5wt％、0.1至5wt％和0.5至5wt％。氮可以以本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何形式加入，并且可以以硫酸铵、氨、尿素或其组合的形式加入。在本发明方法的步骤(a)和/或(b)期间的任何时间，可以通过向发酵培养基中补料或加入总量来加入氮的量。因此，优选氮以25％(wt./wt.)的氨溶液或40％(wt./wt.)的尿素溶液的形式加入。
在另一个优选的实施方案中，在本发明方法的步骤(a)和/或(b)期间加入0.5至350mg/L FeSO4、MnSO4、MgSO4和/或ZnSO4。在本发明方法的步骤(a)和/或(b)期间的任何时间，可以通过向发酵培养基中补料或加入总量来加入FeSO4、MnSO4、MgSO4和/或ZnSO4的量。因此，优选FeSO4的加入量为0.5至35mg/l，MgSO4的加入量为200至350mg/l。
在本发明方法的特别优选的实施方案中，在本发明方法期间的任何时间均不向源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基中加入单糖和/或二糖，特别是葡萄糖、果糖或木糖。
在本发明方法的优选实施方案中，发酵培养基的pH已被调节至选自pH 2.0至6.0的pH值，其中特别优选pH 3.0至5.5和pH 3.5至5.5以及pH 3.5至5.0的pH值。pH的调节可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段和方法进行。在本发明的方法中，优选通过加入酸，例如硫酸或乙酸、NaOH、H3PO4或氨来调节pH。
在本发明方法的优选实施方案中，方法进一步包含步骤(ai)：通过蒸发、膜过滤、薄层蒸发、降膜或下游蒸发浓缩发酵培养基，以将发酵培养基的重量减少2至6倍，其中发酵培养基的重量减少2.5至6倍、3至6倍、3.5至6倍和4至6倍也是优选的。因此，发酵培养基重量的减少主要是由于原始发酵培养基含水量的减少而实现的。因此，通过在进行步骤(b)之前仅浓缩部分培养基并将浓缩的和未浓缩的培养基共混，或通过将全部发酵培养基分别浓缩至所需的最终含量，各自期望的重量减少，可以实现发酵培养基重量的减少。
在本发明方法的另一优选实施方案中，源自木质纤维素生物质的发酵培养基有机酸含量为小于5wt％、无机酸含量为小于6wt％、无机盐含量为小于3wt％和/或阿拉伯糖含量为小于1wt％，其中以下含量是特别优选的：有机酸含量为0.5至2.5wt％、无机酸含量为0.5至5wt％、无机盐含量为0.2至2.5wt％和/或阿拉伯糖含量为0.05至0.75wt％。因此，还特别优选水溶性氯化物的含量为低于0.5wt％、乙酸的含量为低于35g/L和/或Na-D/L-乳酸盐的含量为低于15g/L。
根据本发明方法的步骤(b)，将其中SEQ ID NO：1已被破坏的至少一种丝状真菌细胞加入到发酵培养基中。可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明方法的任何手段和措施进行加入。在一个优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞的以每g发酵培养基102至1010个细胞，优选103至108个细胞，最优选104-107个细胞的量加入。因此，至少一种丝状真菌细胞可以以如分生孢子的干燥形式或以含有剩余预培养基的预培养物形式加入。至少一种丝状真菌细胞还可以以完全培养基(也称主培养物)形式加入。
在本发明中，术语“丝状真菌细胞”应理解为来自天然存在的和/或本领域技术人员已知的任何丝状真菌的任何细胞。术语还包含天然来源或修饰的任何丝状真菌细胞。术语“修饰的”是指基因和非基因修饰的真菌。即，已经通过基因方法(例如，转化)和非基因方法(例如，化学诱变或辐射)修饰的真菌，这两者都是本领域技术人员已知的。在一个优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞选自枝顶孢菌属、曲霉属、毛壳菌属、裸孢壳属(Emericella)、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属(Irpex)、巨座壳属(Magnaporte)、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属，其中特别优选木霉属和曲霉属，最优选里氏木霉(有性型：红褐肉座菌)。在本发明的另一个优选实施方案中，至少一种丝状真菌细胞是基因修饰的丝状真菌细胞，其具有表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白，优选属于β-葡糖苷酶类、木聚糖酶类、β-木糖苷酶类和/或裂解多糖单加氧酶类的酶的能力。
在此类优选实施方案中，至少一种异源水解酶优选源自另一种丝状真菌，例如但不限于枝顶孢菌属、曲霉属、毛壳菌属、裸孢壳属、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属、耙菌属、巨座壳属、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉菌属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。在一个特别优选的实施方案中，至少一种丝状真菌细胞是里氏木霉细胞，并且至少一种异源水解酶源自枝顶孢菌属、阿耶罗菌属、链格孢属、蜜环菌属、节皮菌属、曲霉素、生赤壳属、平脐蠕孢属、拟腊菌属、毛壳菌属、枝孢瓶霉属、红腐菌属(Clohesyomyces)、炭疽霉属，毛孢壳属、梨孢霉属、间座壳属、褥盘孢属、裸孢壳属、附球菌属、外瓶霉属、层孔菌属、着色霉属、镰刀菌属、赤霉菌属、蓝菌属(Grosmannia)、滑锈伞属、何德霉属、腐质霉属、肉座菌属、炭团菌属、耙菌属、棒束孢属、Kuraishia、白环蘑属、马杜拉分支菌属、梨孢菌属、盘单隔孢属、绿僵菌属、丛梗霉皮伞属、毁丝霉属、链孢菌属、脉孢菌属、树粉孢属、长喙壳菌属、拟青霉菌属、拟球腔菌属、青霉菌属、厚毛平革菌属、瓶霉属、侧耳属、普可尼亚属、假尾孢属、假裸囊菌属、核腔菌属、踝节菌属、啄枝孢霉属、根霉菌属、根球虫属、喙孢属、毛球腔菌属、亚球壳属、孢子丝菌属、葡萄穗霉属、匍柄霉属、篮状菌属、蚁巢伞属、腥黑粉菌属、虫壳属、栓菌属、木霉属、毛癣菌属、Uncinocarpus和/或黑腐皮壳属物种。
根据本发明，至少一种丝状真菌细胞是其中SEQ ID NO：1已被破坏的丝状真菌细胞。因此，“破坏”可以通过本领域技术人员已知的适用于破坏目的的任何手段和措施进行。术语“破坏”尤其包含导致基因不再转录或导致由基因编码的蛋白质不再产生或仅以失活形式产生的所有技术。
可用于本发明的示例性方法是：
-从基因组中部分或完全去除基因、编码蛋白质的区域和/或启动子或基因表达所需的其它区域(＝“敲除”)
-改变编码区的DNA序列，使得产生缩短的蛋白质(＝产生终止密码子)或具有改变的氨基酸序列的蛋白质，其不再执行未改变的蛋白质的功能(＝“突变”)
-修饰启动子或基因表达所需的其它区域的DNA序列，使得基因不再被转录(＝没有RNA，因此没有蛋白质产生)
-具有与靶基因互补序列的RNA的表达。这导致两种RNA的杂交(＝互补序列的配对)并导致该双链RNA的降解。结果，没有靶基因的RNA可用于蛋白质合成(＝RNA干扰)。
在本发明中，SEQ ID NO：1在序列方案中定义。
根据本发明方法的步骤(c)的混合进行1分钟至10天，优选10小时至7天，进一步优选24小时至5天的时间期间，优选在持续搅拌下，功率输入为150至20000W/m3，并且更优选为500至15000W/m3，并且在氧气控制条件下。平均溶解氧水平为优选选自0.01％至80％，优选0.1％至50％，特别优选5％至30％，最优选12％至28％。在特别优选的实施方案中，溶解氧水平通过搅拌器或压缩空气流或内部反应器压力或这些措施中的两种或三种的组合来控制。此外，根据本发明方法的步骤(c)的混合在20至35℃的温度下，优选在21至34℃的温度下进行，其中选自22至33℃的温度也是优选的。
根据本发明方法的步骤(c)的“混合”优选以分批模式(不连续)，以补料分批模式或以连续模式进行。最优选地，本发明的方法以分批模式进行。
根据本发明方法的步骤(d)的“获得”优选通过在步骤(c)期间用于混合的时间期间结束时收获全发酵培养液来进行，而未经进一步处理。然而，在替代实施方案中也可以根据本发明方法的步骤(e)进行固液分离。根据步骤(e)的固-液分离通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何措施进行，例如但不限于过滤、压制、膜分离、浮选、沉淀、倾析和离心或其组合。优选基于过滤器的固-液分离。进一步特别优选使用压滤机。过滤后的残留物应具有最小固体含量为20％(wt./wt.)，优选25％(wt./wt.)，特别优选30％(wt./wt.)，并且最优选40％(wt./wt.)固体含量。根据步骤(e)的另一种分离方法是通过例如使用倾析器离心。在根据本发明的方法涉及固液分离的情况下，根据本发明方法的步骤(d)获得的全培养液酶组合物被认为是液体级分。
在本发明方法的优选实施方案中，方法进一步包含以下步骤：
(aii)根据步骤(a)的发酵培养基或根据步骤(ai)的浓缩发酵培养基的灭菌。
因此，可以通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段或措施进行灭菌。在优选的实施方案中，灭菌通过过滤，例如但不限于膜过滤方法或通过超高温加热进行。两种或多种灭菌方法的组合也是可以的，然而，特别优选仅应用超高温加热(也称为UHT)。UHT处理优选在100至155℃的温度下进行10至30秒的持续时间，更优选在120至140℃的温度下进行10至20秒的持续时间。
另一方面，本发明涉及丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1已被破坏。SEQ ID NO：1的破坏可通过本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何手段和措施进行。在说明书中已经定义了可以和优选的方法和措施。在优选的实施方案中，SEQ ID NO：1已经通过启动子或任何其它调节序列的敲除、突变、修饰，以产生终止密码子或RNA干扰而被破坏。术语“丝状真菌细胞”已在说明书中定义。给出的所有定义均适用。
在优选的实施方案中，丝状真菌细胞是具有表达至少一种异源水解酶的能力的基因修饰的丝状真菌细胞。在特别优选的实施方案中，丝状真菌细胞含有至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。相应的异源酶序列可源自本领域技术人员已知的适用于本发明目的的任何真菌或微生物。在一个优选的实施方案中，异源酶序列源自另一种丝状真菌。
在另一方面，本发明涉及根据如上定义的方法制备的全培养液酶组合物。
在进一步的方面，本发明涉及如上定义的全培养液酶组合物用于水解木质纤维素生物质的用途。在说明书中对“水解”和“木质纤维素生物质”的定义适用。
一般优选实施方案
在下文中，列出了本发明的一般优选实施方案，其不在任何方面限制本发明的范围和/或权利要求的范围。一般优选实施方案说明了通过丝状真菌里氏木霉用于生产全培养液酶组合物的特别合适的实施方案。
一般优选实施方案1
用于生产全培养液酶组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，其葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L和干物质含量为30至65wt％；
(b)加入至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1已经通过启动子或任何其它调节序列的敲除、突变、修饰，以产生终止密码子或RNA干扰而被破坏；
(c)将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞在20℃至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间期间；
(d)获得全培养液酶组合物。
一般优选实施方案2
用于生产全培养液酶组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，该木质纤维素生物质选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、水稻秸秆、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆；葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65wt％、氮含量为0.05至5wt％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％；
(b)加入至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1已经通过启动子或任何其它调节序列的敲除、突变、修饰，以产生终止密码子或RNA干扰而被破坏；
(c)将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞在20℃至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间期间；
(d)获得全培养液酶组合物。
一般优选实施方案3
用于生产全培养液酶组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，该木质纤维素生物质选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、水稻秸秆、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆；葡萄糖含量为40至400g/L、木糖含量为50至200g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65wt％、氮含量为0.05至5wt％、MgSO4含量为200至350mg/L，平均溶解氧水平为5至30％和pH为3.5至5；
(b)加入至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1已经通过启动子或任何其它调节序列的敲除、突变、修饰，以产生终止密码子或RNA干扰而被破坏；
(c)将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞在20℃至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间期间；
(d)获得全培养液酶组合物含有通过至少一种里氏木霉细胞产生的至少一种属于纤维素酶类的酶和至少一种属于半纤维素酶类的酶。
一般优选实施方案4
用于生产全培养液酶组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，其葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量为2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L和干物质含量为30至65wt％；
(b)加入至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1已经通过启动子或任何其它调节序列的敲除、突变、修饰，以产生终止密码子或RNA干扰而被破坏；
(c)将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞在20℃至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间期间；
(d)获得全培养液酶组合物。
一般优选实施方案5
用于生产全培养液酶组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，该木质纤维素生物质选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、水稻秸秆、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆；葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量为2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65wt％、氮含量为0.05至5wt％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％；
(b)加入至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1已经通过启动子或任何其它调节序列的敲除、突变、修饰，以产生终止密码子或RNA干扰而被破坏；
(c)将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞在20℃至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间期间；
(d)获得全培养液酶组合物。
一般优选实施方案6
用于生产全培养液酶组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，该木质纤维素生物质选自小麦秸秆、大麦秸秆、燕麦秸秆、水稻秸秆、黑麦秸秆、甘蔗渣或玉米秸秆；葡萄糖含量为5至25g/L、木糖含量为2至15g/L、密度为1.05至1.35kg/L、干物质含量为30至65wt％、氮含量为0.05至5wt％、MgSO4含量为200至350mg/L、平均溶解氧水平为5至30％和pH为3.5至5；
(b)加入至少一种里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1已经通过启动子或任何其它调节序列的敲除、突变、修饰，以产生终止密码子或RNA干扰而被破坏；
(c)将发酵培养基和至少一种里氏木霉细胞在20℃至35℃的温度下混合1分钟至10天的时间期间；
(d)获得全培养液酶组合物含有通过至少一种里氏木霉细胞产生的至少一种属于纤维素酶类的酶和至少一种属于半纤维素酶类的酶。
一般优选实施方案7
用于生产如一般优选实施方案1至6中任一项所定义的全培养液酶组合物的方法，其中里氏木霉细胞通过基因方法(例如，转化)和/或非基因方法(例如，化学诱变或辐射)进行进一步基因修饰，并且其中该进一步基因修饰的里氏木霉细胞能够表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白。
一般优选实施方案8
里氏木霉细胞，其中SEQ ID NO：1已经通过启动子或任何其它调节序列的敲除、突变、修饰，以产生终止密码子或RNA干扰而被破坏，并且其中里氏木霉细胞是基因修饰的里氏木霉细胞，其中里氏木霉细胞包含至少一种异源β葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。
一般优选实施方案9
如一般优选实施方案8所定义的里氏木霉细胞，其中至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列源自枝顶孢菌属物种、假尾孢属物种和/或踝节菌属物种，并且其中至少一种木聚糖酶编码序列源自层孔菌属物种，其中至少一种β-木糖苷酶编码序列源自曲霉属物种，并且其中至少一种裂解多糖单加氧酶编码序列源自曲霉属物种、木霉属物种或肉座菌属物种。
一般优选实施方案10
根据如一般优选实施方案1至7中任一项所定义的方法生产的全培养液酶组合物，其含有至少一种通过如一般优选实施方案8或9所定义的基因修饰的里氏木霉细胞产生的异源β-葡糖苷酶，并且含有这些里氏木霉细胞的全部或部分。
一般优选实施方案11
一种如一般优选实施方案8或9所定义的基因修饰的里氏木霉细胞在生产如一般优选实施方案10所定义的用于水解木质纤维素生物质的全培养液酶组合物的用途。
附图说明
通过以下附图和实施例描述本发明。由此强调，附图和实施例不限制本发明和权利要求的范围，而仅仅构成本发明、本发明的目的和通过本发明的方法实现的益处的进一步说明。
附图列表
图1:pSEQ1D转化体DSEQ1-1至DSEQ1-3和对比菌株M18.2b的培养物上清液中的生物质浓度。提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。
图2:pSEQ1D转化体DSEQ1-1至DSEQ1-3和对比菌株M18.2b的培养物上清液中的生物质浓度。提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。
图3:pSEQ1D转化体DSEQ1-1至DSEQ1-3和对比菌株M18.2b的培养液的粘度。
提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。
图4:pSEQ1D转化体DSEQ1-1至DSEQ1-3和对比菌株M18.2b的培养物上清液的SDS-PAGE凝胶。对比条带(“标记物”泳道)对应于250、150、100、75、
50、37、25和20kD。
图5:pSEQ1M1-HygR转化体M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和对比菌株M18.2b的培养物上清液中的生物质浓度。提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。
图6:pSEQ1M1-HygR转化体和M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和对比菌株M18.2b的培养物上清液中的生物质浓度。提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。
图7:pSEQ1M1-HygR转化体M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和对比菌株M18.2b的培养液的粘度。提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。
图8:pSEQ1M1-HygR转化体M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和对比菌株M18.2b的培养物上清液的SDS-PAGE凝胶。对比条带(“标记物”泳道)对应于250、150、100、
75、50、37、25和20kD。
图9:pSEQ1M2-HygR转化体M2SEQ1-1和对比菌株M18.2b的培养物上清液中的生物质浓度。提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。
图10:pSEQ1M2-HygR转化体M2SEQ1-1和对比菌株M18.2b的培养物上清液中的生物质浓度。提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。
图11:pSEQ1M2-HygR转化体M2SEQ1-1和对比菌株M18.2b的培养液的粘度。提供了相对于宿主菌株M18.2b上清液中的平均生物质浓度的值，其设定为1。图12:pSEQ1M2-HygR转化体M2SEQ1-1和对比菌株M18.2b的培养物上清液的SDS-PAGE凝胶。对比条带(“标记物”泳道)对应于250、150、100、75、50、
37、25和20kD。
一般
实施例描述了失活里氏木霉SEQ1基因的三种不同方法-敲除大部分编码序列、将早期密码子改变为终止密码子的突变和导致移码的插入-并显示了SEQ1基因失活对里氏木霉的蛋白质生产、生物质形成和培养液粘度的影响。
实施例1：SEQ1的敲除
SEQ1敲除载体的构建
本领域技术人员已知的以及例如由Sambrook和Russel(Molecular Cloning-Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)或由Jansohn等人(Gentechnische Methoden，Elsevier，München)所描述的用于DNA琼脂糖凝胶电泳、DNA纯化、大肠杆菌转化、质粒增殖和纯化、通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段和从里氏木霉中分离基因组DNA的标准方法。连接非依赖的克隆技术(LIC)基本上如由Aslanidis和deJong(1990，Nucleic Acid Res.18(20)，6069)所描述的进行。
使用来自里氏木霉M18.2b(DSM 19984)的基因组DNA作为模板、引物SEQ1D5fw(5‘-GACTCTCTATCTGCATCAAC-3‘)和序列SEQ1D5rv
(5‘-TGACCTGGAAAGCTTTCAATGTAGAGGTAGACTAGTCAAAGAAGACATCACGAC-3‘)和来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶，根据制造商的说明书(退火温度：64.8℃、延伸时间：1分钟25秒、30个循环)，通过PCR扩增SEQ1 5’侧翼区。使用来自Promega的WizardPCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.7kb)。
使用来自里氏木霉M18.2b(DSM 19984)的基因组DNA作为模板、引物SEQ1D3fw(5‘-CGCATGGTGGGCGTCGTGATGTCTTCTTTGACTAGTCTACCTCTACATTGAAAGC-3‘)和SEQ1D3rv(5‘-GATTACCTGTCAAGTCTATG-3‘)和来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶，根据制造商的说明书(退火温度：62.4℃、延伸时间：1分钟25秒、30个循环)，通过PCR扩增SEQ1 3’侧翼区。使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.7kb)。
使用Phusion聚合酶(Thermo Fisher Scientific)和聚合酶提供的缓冲液和dNTP溶液通过PCR融合SEQ1 5’和3’侧翼区。将100ng纯化的SEQ1 5’PCR扩增子、100ng纯化的SEQ1 3’PCR扩增子、10μl 5x Phusion HF缓冲液、1μl 10mM dNTP溶液、1U Phusion聚合酶和PCR级别水混合至终体积为48μl。将混合物首先在98℃下孵育30℃，然后进行在98℃下10秒、在65℃下30秒和在72℃下2分钟40秒的10个循环，然后冷却至10℃。然后加入1μl的20μM引物SEQ1Dnestrfw(5’-GACAGTCCTGCAGGAGTCACTGCCTTTGAAAG-3’)的溶液和1μl的20μM引物SEQ1Dnestrv(5’-GACAGTCCTGCAGGTGTAAGGATAAAGGACGAC-3’)的溶液，并将混合物在98℃下孵育30秒，然后进行在98℃下10秒、在66.2℃下30秒和在72℃下1分钟20秒的30个循环。在72℃下的孵育时间每个循环增加5秒。最后，将混合物在72℃下孵育10分钟，然后冷却至10℃。使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(5.2kb)。
纯化的SEQ1 5’-3’侧翼融合产物用SbfI(New England Biolabs)根据制造商的说明书消化，并使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
质粒pUC19(New England Biolabs)用SbfI(New England Biolabs)根据制造商的说明书消化，并使用Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
SbfI-消化的SEQ1 5’-3’侧翼融合产物和pUC19使用“Mighty Mix”DNA连接试剂盒(Takara),根据制造商的说明书，使用摩尔插入片段/载体比率为5比1连接。将连接混合物转化到大肠杆菌Mach 1(Thermo Fisher Scientific)中，并铺在含有100mg·l-1氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37℃下孵育20小时后，从平板上挑取菌落，并用于接种3ml含有100mgΜl-1氨苄青霉素的LB液体培养基。在37℃孵育20小时后，分离质粒DNA，并用Sbfi消化以鉴定含有插入片段的克隆。含有插入片段的质粒命名为pSEQ1-5’-3’。
质粒pSEQ1-5’-3’用SpeI(New England Biolabs)根据制造商的说明书消化，并用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。将各自1ul的10μM寡核苷酸LIC1fw(5’-CTAGGAGTTCTGCCTTGGGTTTAAACGAGAGAAAGACTC-3’)和LIC1rv(5’-CTAGGAGTCTTTCTCTCGTTTAAACCCAAGGCAGAACTC-3’)溶液混合，置于PCR循环仪中，并在2小时内从70℃冷却至20℃。然后将寡核苷酸混合物与750ng纯化的、SpeI-消化的pSEQ1-5’-3’、1μl 10x T4连接酶缓冲液、1μl500g/l PEG3350、1μl T4 DNA连接酶(5U/μl；Thermo Fisher Scientific)和2μl PCR级别水混合。将混合物在20℃下孵育1小时，使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化，并将DNA在50μl PCR级别水中洗脱。向该溶液中补充6μl的Taq聚合酶缓冲液(Promega)，并加入PCR级别水至终体积为60μl。然后将混合物转化到大肠杆菌Mach 1(Thermo FisherScientific)中，并铺在含有100mg·l-1氨苄青霉素的LB琼脂平板上。在37℃下孵育20小时后，从平板上挑取菌落，并用于接种3ml具有100mg·l-1氨苄青霉素的LB液体培养基。在37℃下孵育20小时后，分离质粒DNA，并用SpeI和SspI(New England Biolabs)根据制造商的说明书消化，以鉴定含有插入片段的克隆。含有插入片段的质粒命名为pSEQ1-5’-3’-LIC。
质粒pSEQ1-5’-3’-LIC用PmeI(New England Biolabs)根据制造商的说明书消化，并使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
潮霉素B抗性盒(HygR)(SEQ ID NO：4)由Thermo Scientific合成。HygR使用来自Thermo Scientific的DNA作为模板、引物SEQ1MHygRfw(5’-GTTCTGCCTTGGGTTTAACAAGACACAGCCCTATAAC-3’)和SEQ1MHygRrv(5’-GTCTTTCTCTCGTTTAACAGACAAGAGCCCTATAAC-3‘)和来自Thermo Fisher Scientific的Phusion聚合酶，(退火温度：68.5℃、延伸时间：40秒、30个循环)，根据制造商的说明书，通过PCR扩增。使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.4kb)。
使用连接非依赖性克隆(LIC)将PCR扩增的HygR与PmeI消化的pSEQ1-5’-3’-LIC融合。在dATP的存在下用T4 DNA聚合酶处理线性化的载体。在dTTP的存在下用T4 DNA聚合酶处理PCR扩增的HygR。如Aslanidis和de Jong(1990，Nucleic Acid Res.18(20)，6069)所描述的，将T4 DNA聚合酶处理的载体和HygR混合并退火。然后在化学感受态大肠杆菌Mach 1(Thermo Fisher Scientific)中转化测定物，铺在含有100mg·l-1氨苄青霉素的LB琼脂平板上，在37℃下孵育24小时。使用牙签从琼脂平板上挑取菌落，转移到含有100mg·l-1氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃下振荡(250RPM)孵育24小时。分离质粒DNA，用SbfI通过消化验证插入片段的融合。通过Sanger测序验证质粒克隆，将一个具有正确序列的质粒命名为pSEQ1D。
SEQ1敲除载体转化里氏木霉
根据制造商的说明书用SbfI(New England Biolabs)消化载体pSEQ1D，并通过琼脂糖凝胶电泳和来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化敲除盒(7.8kb)。如
等人(1987)Gene 61:155-164或Gruber等人(1990)Curr Genet 18:71-76中所描述，用消化的载体转化里氏木霉M18.2b(DSM 19984)。在含有100mg·l-1潮霉素和1M山梨醇的马铃薯葡萄糖琼脂平板上选择转化体，并通过奇异化进行纯化。通过在30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂平板上生长它们直到平板被孢子覆盖来制备纯化菌株的分生孢子储备液。分生孢子用无菌氯化钠(0.9g·l-1)-Triton X-100(0.01g·l-1)溶液收获，调节至OD600＝10，补充50g·l-1甘油，并储存在-80℃下。
从转化体和宿主菌株的菌丝体中分离基因组DNA。SEQ1敲除盒在预期基因座处的融合通过根据制造商的说明书使用来自Thermo Fisher Scientific的Phusion聚合酶、来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1DKO1fw(5’-ACTCTCTATCTGCATCAAC-3’)和SEQ1DKO1rv(5’-GTAGTGTATTGACCGATTC-3’)(退火温度：62.6℃、延伸时间：1分钟20秒、30个循环)和引物SEQ1DKO2fw(5’-TGATGTGCTTGATATTGGGC-3’)和SEQ1DKO2rv(5’-CTCCATCGCTCAACTATGTG-3’)(退火温度：57.5℃、延伸时间：1分钟15秒、30个循环)来验证。具有引物SEQ1DKO1fw和SEQ1DKO1rv的3.9kb条带表明敲除盒在SEQ1基因座处融合，而SEQ1DKO2fw和SEQ1DKO2rv(1.2kb扩增子)扩增的一部分SEQ1基因被pSEQ1D取代，因此仅当SEQ1基因仍然存在时才提供条带。来自菌株M18.2b的基因组DNA作为对照也进行了测试。
在SEQ1基因座处融合了来自pSEQ1D的敲除盒的三个菌株命名为DSEQ1-1至DSEQ1-3。
SEQ1敲除菌株在摇瓶中的生长
菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3和M18.2b在摇瓶中在水解产物培养基1中生长。水解产物培养基1含有(g·l-1)：
用HCl或NaOH将培养基调节至pH 5.5，并通过高压灭菌(在121℃下20分钟)进行灭菌。
将15ml培养基分配到无菌罩下的50ml锥形摇瓶中。将菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3和M18.2b的分生孢子储备液解冻，将75μl分生孢子悬浮液移液到无菌罩下的具有培养基的锥形瓶中，并用橡胶泡沫盖封闭烧瓶。每个菌株接种三个烧瓶。将烧瓶在30℃下振荡(250RPM)孵育6天。6天后，将培养物倒入15ml管中。取出等分试样，离心(3220xg、4℃、15分钟)，并将上清液储存在4℃下，同时将剩余的培养液用于测定生物质和粘度(参见下文)。
培养物上清液和培养液的表征：蛋白质浓度、SDS-PAGE、生物质、粘度
根据供应商的说明书，使用Quick StartTMBradford试剂(BioRad)和BSA标准溶液(BioRad)测量菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3和M18.2b的离心培养物上清液中的蛋白质浓度。测量结果如图1所示。从这些数据显而易见的是菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3比宿主菌株M18.2b产生显著较多的蛋白质。
对于生物质测定，将WhatmanTM过滤盘(P1)在60℃下干燥直至其重量保持恒定持续24小时。菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3和M18.2b的培养液使用那些干燥的过滤盘过滤，并且用至少十倍于培养液体积的去离子水洗涤菌丝体。然后在60℃下将具有菌丝体的干燥盘干燥直至其重量保持恒定达24小时。称重具有干燥菌丝体的干燥盘。然后通过从具有菌丝体的干燥的过滤盘的质量中减去干燥过滤盘的质量，然后将该值除以已过滤的培养液的体积，来计算培养液中的生物质浓度。测量结果如图2所示。从这些数据显而易见的是菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3比宿主菌株M18.2b产生显著较少的生物质。
菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3和M18.2b的培养液的粘度使用具有Vane工具的MalvernKinexus Lab+KNX2110旋转流变仪(4Vnn：CUPnn)根据制造商的说明书来测量。在20℃的温度下和18.11RPM(“每分钟转数”)的旋转速度下进行测量。粘度描绘在图3中，并且相对于菌株M18.2b的培养液的粘度呈现，其设定为1。从这些数据显而易见的是，用DSEQ1-1至DSEQ-3产生的培养液的粘度显著低于宿主菌株M18.2b的粘度。
菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3和M18.2b的离心培养物上清液的SDS-PAGE分析使用本领域技术人员已知的方法(例如，由Jansohn等人(Gentechnische Methoden,Elsevier,München)和Criterion XT system(BioRad)所描述)进行。在每个泳道中负载等体积的培养物上清液。Precision Plus ProteinTMAll Blue Standards(BioRad)用作蛋白质尺寸对照。凝胶图像如图4所示。本领域技术人员将认识到，SEQ1敲除菌株DSEQ1-1至DSEQ1-3的蛋白质模式与宿主菌株M18.2b的蛋白质模式是无法区分的。
总结
综上所述，这些数据证明SEQ1基因的敲除导致显著更有效的蛋白质生产、形成较多的蛋白质和较少的生物质。通过SDS-PAGE对分泌蛋白的分析显示，其组成没有显著变化，表明蛋白产量普遍增加。此外，培养液的粘度也显著降低。
实施例2：SEQ1基因的突变(早期终止密码子)
SEQ1突变载体的构建
SEQ ID NO：2，其含有将突变G174T(根据SEQ ID NO：1的位置)引入至SEQ1基因的侧翼区，和用于插入标记基因的LIC位点，通过Thermo Fisher Scientific合成并克隆到pUC19衍生的质粒中。所得质粒命名为pSEQ1M1。
根据制造商的说明书用SrfI(New England Biolabs)消化质粒pSEQ1M1，并用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
潮霉素B抗性盒(HygR)(SEQ ID NO：4)由Thermo Scientific合成。使用来自Thermo Scientific的DNA作为模板、引物SEQ1MHygRfw(5’-AACAAGACACAGCCCTATAAC-3’)和SEQ1MHygRrv(5’-AACAGACAAGAGCCCTATAAC-3‘)和来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶，根据制造商的出说明书(退火温度：68.5℃、延伸时间：40秒、30个循环)，通过PCR扩增HygR。使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.4kb)。
使用连接非依赖性克隆(LIC)将PCR扩增的HygR标记与线性化的pSEQ1M1融合。在dTTP的存在下，用T4 DNA聚合酶处理线性化载体。在dATP的存在下，用T4 DNA聚合酶处理扩增的启动子。将T4 DNA聚合酶处理的载体和启动子混合，并如参考文献中所描述的进行退火。然后在化学感受态大肠杆菌XL1-Blue cells(Agilent)中转化测定物，铺在含有100mg·l-1氨苄青霉素(LB-Amp)的LB-琼脂平板上，并在37℃下孵育24小时。使用牙签从琼脂平板上挑取菌落，转移到液体LB-Amp培养基中，并在37℃下振荡(250RPM)孵育24小时。分离质粒DNA，用XmnI通过消化验证插入片段的融合。通过Sanger测序验证质粒克隆，将一个具有正确序列的质粒命名为pSEQ1M1-HygR。
SEQ1突变载体转化至里氏木霉
根据制造商的说明书，用XmnI(New England Biolabs)消化载体pSEQ1M1-HygR，并通过琼脂糖凝胶电泳和Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化突变盒(6.0kb)。基本上如
等人(1987)Gene 61:155-164或Gruber等人(1990)Curr Genet 18:71-76中所描述的，用消化的载体转化里氏木霉M18.2b(DSM 19984)。在含有100mg·l-1潮霉素和1M山梨醇的马铃薯葡萄糖琼脂平板上选择转化体，并通过奇异化进行纯化。通过在30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂平板上生长它们直到平板被孢子覆盖来制备纯化菌株的分生孢子储备液。分生孢子用无菌氯化钠(0.9g·l-1)-Triton X-100(0.01g·l-1)溶液收获，调节至OD600＝10，补充50g·l-1甘油，并储存在-80℃下。
从转化体和宿主菌株的菌丝体中分离基因组DNA。根据制造商的说明书，使用来自Thermo Fisher Scientific的Phusion聚合酶、来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1M1KOfw(5’-GATGGCTGTGTAGAAGTAC-3’)和SEQ1M1KOrv(5’-ATGAATAGGAGTGTGTGTG-3’)(退火温度：62.0℃、延伸时间：1分钟25秒、30个循环)，通过PCR验证SEQ1突变盒在预期基因座处的融合。具有引物SEQ1M1KOfw和SEQ1M1KOrv的2.5kb条带表明突变盒在SEQ1基因座处的融合。来自菌株M18.2b的基因组DNA作为对照也进行了测试。为了验证预期的突变已经插入到SEQ1 ORF中，根据制造商的说明书，使用来自Thermo Fisher Scientific的Phusion聚合酶、来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1M1Seqfw(5’-ATACTCGTCAACTCCATC-3’)和SEQ1M1Seqrv(5’-ATCGCTCAACTATGTGAC-3’)(退火温度：56.3℃、延伸时间：50秒、30个循环)，通过PCR扩增各个区域。使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化1.5kb扩增子，并使用引物M1Seq-01(5’-AGCAAGTCAAAGTCATGAGG-3’)测序。
在SEQ1 ORF中含有来自pSEQ1M1-HygR的突变的三个菌株命名为M1SEQ1-1至M1SEQ1-3。
SEQ1突变菌株在摇瓶培养中的生长
菌株M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和M18.2b在摇瓶中在如上述实施例1所定义的水解产物培养基1中生长。用HCl或NaOH将培养基调节至pH 5.5，并通过高压灭菌(在121℃下20分钟)进行灭菌。
将15毫升培养基分配到无菌罩下的50ml锥形瓶中。将菌株M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和M18.2b的分生孢子储备液解冻，将75μl分生孢子悬浮液移液到无菌罩下的具有培养基的锥形瓶中，并用橡胶泡沫盖封闭烧瓶。每个菌株接种三个烧瓶。将烧瓶在30℃下振荡(250RPM)孵育6天。6天后，将培养物倒入15ml管中。取出等分试样，离心(3220xg、4℃、15分钟)，并将上清液储存在4℃下，同时将剩余的培养液用于测定生物质和粘度(参见下文)。
培养物上清液和培养液的表征：蛋白质浓度、SDS-PAGE、生物质、粘度
根据供应商的说明书，使用Quick StartTMBradford试剂(BioRad)和BSA标准溶液(BioRad)测量菌株M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和M18.2b的离心培养物上清液中的蛋白质浓度。测量结果如图5所示。从这些数据显而易见的是菌株M1SEQ1-1至M1SEQ1-3比宿主菌株M18.2b产生显著较多的蛋白质。
对于生物质测定，将WhatmanTM过滤盘(P1)在60℃下干燥直至其重量保持恒定持续24小时。菌株M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和M18.2b的培养液使用那些干燥的过滤盘过滤，并且用至少十倍于培养液体积的去离子水洗涤菌丝体。然后在60℃下将具有菌丝体的干燥盘干燥直至其重量保持恒定达24小时。称重具有干燥菌丝体的干燥盘。然后通过从具有菌丝体的干燥的过滤盘的质量中减去干燥过滤盘的质量，然后将该值除以已过滤的培养液的体积，来计算培养液中的生物质浓度。测量结果如图6所示。从这些数据显而易见的是菌株M1SEQ1-1至M1SEQ1-3比宿主菌株M18.2b产生显著较少的生物质。
菌株M1SEQ1-1至M1SEQ1-3的培养液的粘度使用具有Vane工具的Malvern KinexusLab+KNX2110旋转流变仪(4Vnn：CUPnn)根据制造商的说明书来测量。在20℃的温度下和18.11RPM(“每分钟转数”)的旋转速度下进行测量。粘度描绘在图7中，并且相对于菌株M18.2b的培养液的粘度呈现，其设定为1。从这些数据显而易见的是，用M1SEQ1-1至M1SEQ3产生的培养液的粘度显著低于宿主菌株M18.2b的粘度。
菌株M1SEQ1-1至M1SEQ1-3和M18.2b的离心培养物上清液的SDS-PAGE分析使用本领域技术人员已知的方法(例如，由Jansohn等人(Gentechnische Methoden,Elsevier,München)和Criterion XT system(BioRad)所描述)进行。在每个泳道中负载等体积的培养物上清液。Precision Plus ProteinTMAll Blue Standards(BioRad)用作蛋白质尺寸对照。凝胶图像如图8所示。本领域技术人员将认识到，SEQ1突变菌株M1SEQ1-1至M1SEQ3的蛋白质模式与宿主菌株M18.2b的蛋白质模式是无法区分的。
总结
综上所述，这些数据证明产生早期终止密码子对SEQ1基因的突变导致显著更有效的蛋白质生产、形成较多的蛋白质和较少的生物质。通过SDS-PAGE对分泌蛋白的分析显示，其组成没有显著变化，表明蛋白产量普遍增加。此外，培养液的粘度也显著降低。
实施例3：SEQ1基因的突变(移码)
SEQ1突变载体的构建
SEQ ID NO：3，其含有将T874后的G(根据SEQ ID NO：1的位置)引入SEQ1基因的侧翼区，和用于插入标记基因的LIC位点，通过Thermo Fisher Scientific合成并克隆到pUC19衍生的质粒中。所得质粒命名为pSEQ1M2。
根据制造商的说明书，用SrfI(New England Biolabs)消化质粒pSEQ1M2，并用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化。
潮霉素B抗性盒(HygR)(SEQ ID NO:4)由Thermo Scientific合成。使用来ThermoScientific的DNA作为模板、引物SEQ1MHygRfw(5’-AACAAGACACAGCCCTATAAC-3’)和SEQ1MHygRrv(5’-AACAGACAAGAGCCCTATAAC-3‘)和来自Thermo Fisher Scientific的phusion聚合酶，根据制造商的出说明书(退火温度：68.5℃、延伸时间：40秒、30个循环)，通过PCR扩增HygR。使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化扩增子(2.4kb)。
使用连接非依赖性克隆(LIC)将PCR扩增的HygR标记与线性化的pSEQ1M1融合。在dTTP的存在下，用T4 DNA聚合酶处理线性化载体。在dATP的存在下，用T4 DNA聚合酶处理扩增的启动子。将T4 DNA聚合酶处理的载体和启动子混合，并如参考文献中所描述的进行退火。然后在化学感受态大肠杆菌XL1-Blue cells(Agilent)中转化测定物，铺在含有100mg·l-1氨苄青霉素(LB-Amp)的LB-琼脂平板上，并在37℃下孵育24小时。使用牙签从琼脂平板上挑取菌落，转移到液体LB-Amp培养基中，并在37℃下振荡(250RPM)孵育24小时。分离质粒DNA，用XmnI通过消化验证插入片段的融合。通过Sanger测序验证质粒克隆，将一个具有正确序列的质粒命名为pSEQ1M2-HygR。
SEQ1突变载体转化至里氏木霉
根据制造商的说明书，用XmnI(New England Biolabs)消化载体pSEQ1M2-HygR，并通过琼脂糖凝胶电泳和Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化突变盒(6.4kb)。基本上如
等人(1987)Gene 61:155-164或Gruber等人(1990)Curr Genet 18:71-76中所描述的，用消化的载体转化里氏木霉M18.2b(DSM 19984)。在含有100mg·l-1潮霉素和1M山梨醇的马铃薯葡萄糖琼脂平板上选择转化体，并通过奇异化进行纯化。通过在30℃下在马铃薯葡萄糖琼脂平板上生长它们直到平板被孢子覆盖来制备纯化菌株的分生孢子储备液。分生孢子用无菌氯化钠(0.9g·l-1)-Triton X-100(0.01g·l-1)溶液收获，调节至OD600＝10，补充50g·l-1甘油，并储存在-80℃下。
从转化体和宿主菌株的菌丝体中分离基因组DNA。根据制造商的说明书，使用来自Thermo Fisher Scientific的Phusion聚合酶、来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1M2KOfw(5’-GATGGCTGTGTAGAAGTAC-3’)和SEQ1M2KOrv(5’-ATGAATAGGAGTGTGTGTG-3’)(退火温度：62.2℃、延伸时间：1分钟25秒、30个循环)，通过PCR验证SEQ1突变盒在预期基因座处的融合。具有引物SEQ1M2KOfw和SEQ1M2Korv的2.5kb条带表明突变盒在SEQ1基因座处的融合。来自菌株M18.2b的基因组DNA作为对照也进行了测试。为了验证预期的突变已经插入到SEQ1 ORF中，根据制造商的说明书，使用来自Thermo Fisher Scientific的Phusion聚合酶、来自转化体的基因组DNA作为模板和引物SEQ1M2Seqfw(5’-GACAGAAGCTCAAAGATTAG-3’)和SEQ1M2Seqrv(5’-CAAGTCAAAGTCATGAGG-3’)(退火温度：63.6℃、延伸时间：50秒、30个循环)，通过PCR扩增各个区域。使用来自Promega的Wizard PCR纯化试剂盒纯化1.5kb扩增子，并使用引物M2Seq-01(5’-CACTCTGTAAAGGCAAAGGG-3’)测序。
在SEQ1 ORF中含有来自pSEQ1M2-HygR的突变的三个菌株命名为M2SEQ1-1。
SEQ1突变菌株在摇瓶中的生长
菌株M2SEQ1-1和M18.2b在摇瓶中在如上述实施例1所定义的水解产物培养基1中生长。用HCl或NaOH将培养基调节至pH 5.5，并通过高压灭菌(在121℃下20分钟)进行灭菌。
将15毫升培养基分配到无菌罩下的50ml锥形瓶中。将菌株M2SEQ1-1和M18.2b的分生孢子储备液解冻，将75μl分生孢子悬浮液移液到无菌罩下的具有培养基的锥形瓶中，并用橡胶泡沫盖封闭烧瓶。每个菌株接种三个烧瓶。将烧瓶在30℃下振荡(250RPM)孵育6天。6天后，将培养物倒入15ml管中。取出等分试样，离心(3220xg、4℃、15分钟)，并将上清液储存在4℃下，同时将剩余的培养液用于测定生物质和粘度(参见下文)。
培养物上清液和培养液的表征：蛋白质浓度、SDS-PAGE、生物质、粘度
根据供应商的说明书，使用Quick StartTMBradford试剂(BioRad)和BSA标准溶液(BioRad)测量菌株M2SEQ1-1和M18.2b的离心培养物上清液中的蛋白质浓度。测量结果如图9所示。从这些数据显而易见的是菌株M2SEQ1-1比宿主菌株M18.2b产生显著较多的蛋白质。
对于生物质测定，将WhatmanTM过滤盘(P1)在60℃下干燥直至其重量保持恒定持续24小时。菌株M2SEQ1-1和M18.2b的培养液使用那些干燥的过滤盘过滤，并且用至少十倍于培养液体积的去离子水洗涤菌丝体。然后在60℃下将具有菌丝体的干燥盘干燥直至其重量保持恒定达24小时。称重具有干燥菌丝体的干燥盘。然后通过从具有菌丝体的干燥的过滤盘的质量中减去干燥过滤盘的质量，然后将该值除以已过滤的培养液的体积，来计算培养液中的生物质浓度。测量结果如图10所示。从这些数据显而易见的是菌株M2SEQ1-1比宿主菌株M18.2b产生显著较少的生物质。
菌株M2SEQ1-1和M18.2b的培养液的粘度使用具有Vane工具的Malvern KinexusLab+KNX2110旋转流变仪(4Vnn：CUPnn)根据制造商的说明书来测量。在20℃的温度下和18.11RPM(“每分钟转数”)的旋转速度下进行测量。粘度描绘在图11中，并且相对于菌株M18.2b的培养液的粘度呈现，其设定为1。从这些数据显而易见的是，用M2SEQ1-1产生的培养液的粘度显著低于宿主菌株M18.2b的粘度。
菌株M2SEQ1-1和M18.2b的离心培养物上清液的SDS-PAGE分析使用本领域技术人员已知的方法(例如，由Jansohn等人(Gentechnische Methoden,Elsevier,München)和Criterion XT system(BioRad)所描述)进行。在每个泳道中负载等体积的培养物上清液。Precision Plus ProteinTMAll Blue Standards(BioRad)用作蛋白质尺寸对照。凝胶图像如图12所示。本领域技术人员将认识到，SEQ1突变菌株M2SEQ1-1的蛋白质模式与宿主菌株M18.2b的蛋白质模式是无法区分的。
发明内容
综上所述，这些数据证明通过产生移码对SEQ1基因的突变导致显著更有效的蛋白质生产、形成较多的蛋白质和较少的生物质。通过SDS-PAGE对分泌蛋白的分析显示，其组成没有显著变化，表明蛋白产量普遍增加。此外，培养液的粘度也显著降低。
序列表
SEQ ID NO：1
SEQ1天然基因
ATGAGGGCCTATCAGATCGAGATGCTCGACAAGAGCCTCAAGCAAAATGTCATTGTTGCTGTATGTTGAAGTTTCTCTCCAATCCCCCGTCTCCCCCTTTGCTGTCGTTGTCTTCGACGTTGAAAGACATGTCCATTGACCAAGGGGCGTTGTTATAAATCTAGATGGACACGGGAAGTGGCAAGACTCAAGTGTAAGTTGTGCATCTTCATCATCGGCAGCCCACGTAACCTGTGCCAGCCCTTAGCACCCTTCTTCGCAAAAGACTGACTTGGCGCTTGCATCAGAGCTGTGCTTCGTATCAAGAAGGAGCTGGAAATCTGCGATGCATCAAAGGTGAGTCTGCCGTCTGGATACAGTTGCACAACGACCTGGACAGCTGCACTGACGCAGCACGCATCAGATCATCTGGTTCATCGCGCCAACAGTTTCGCTGTGTCATCAGCAACACGATGTGCTCAAGTTGCAGATACCTGCCGTGCCCATGATGACACTGGCCGGGAACTCCAATATCGATGCTTGGGGGCCGGATATCTGGGCCATTCTTCTCGACACGGTTCGAATTGTCATATCCACACCCCAGGTTCTGCTCGATGCCCTTGACCATGCTTACCTGAACTTGGGTCTTCTGGCGCTGCTTGTATTTGATGAAGGTATGGGACGACCTGCCTTCACTCTGTAAAGGCAAAGGGGCCGCCAGAAGTTGCAAATCGCTGACGTGTCTTGTGCAAAAGTCCACAACTGCATTGGCAGAAGTCCAGGCGGCAAAATCATGCTCCACCACTACCATCCGCGCAAGCTGGCTGGTGAAAGCGTGCCTGCTGTTCTGGGTCTGACGGCAACTCCGAGCATTCAGTCTGAGCTTGCCGATATTGATGCCTTGGAATGGCTGATGGATGCAAGATGCGTCTCGCCCACTCTCCATCGCGACGAACTGCTCAAATGCGTCAAGAGGCCCAATATCAAGCACATCATCTATAAAGCCGGCAAAGAAGACATCACGACGCCCACCATGCGCGACTTGGATCGGGTCTACCGGGCGCTGGACATTCTCGAAGACCCCTACATACTCATGCTGCGCAACAACCCTACGGACCGAAACAACCGCCTGCTGCTAACAGCCATTGAAAAGTACGATACCTACACACAGAACCAGATGAAGTCGTTCTGCGCCCGATCAAGAGAGATATGCAAGCAACTCGGTCCCTGGGCTGCTGACCTCTTCATCTGGAAGGCCATCTCAGCTCACTTGGACAAGGTGGACAGGCAGACGGATGGAGTTGACGAGTATGGCAACAAGTGGTCGTCGGGGTCGACAAGCTTCCTGGAAAAGAAGCACCTGGCCGACATCTATCGTCGAGTCAAGGTCCAACGTCCTTCCGATGTGCCACAGGTCTTTGAAGACATTTCCGACAAGGTCGGTAAGCTAATCTTTGAGCTTCTGTCGGTAGAGGAGCCCACGGTGGGCATCATCTTCGTCGAGGAACGAGTCATGGTTGCTATGCTGGCCGAGGTTCTCTCTGTCAACCACACAATCACGTCCCGGTACCGGATCGGGACCATGGTTGGCACCTCAAATTACGCTGGGCGGCGGAAGGCCGTTTATGACTTCGACCAGAAAACGGACTACAAGGACCTGCAGAGCTTCCGCTCCGGCAAGATTAACCTGCTGATTGCGACGTCAGTGCTGGAGGAGGGCATCGACGTGCCTGCCTGCAACCTAGTCATATGCTTTGACACTCCGACGACCCCAAAGTCCTTTATCCAGCGGCGCGGACGGGCTCGCTCCAAGGACTCGAATCTCCTTCTTTTCTTTGACGATGCCAACCCTGCGATCTTGAAGTGGCAGGCGAAAGAGGAGGAGATGAACAGGATCTTCGAAGACGAAGAGAGGGCGATTCGCGAACTCGGCAAACTGGAAGATTCGGAGAGTCCGAGCACCATCTCCTTCACCGTCCCGTCTACCGGCGCAAGGCTAGATTTTGACAATGCGAAGCAGCACCTCGAGCACTTCTGCAGAGTCTTGTGCCCGTCGGACTTTGTGGACAGCCGCCCGGACTACATCATCCGCAGGGAGCAGGACTCTCCTTTGTTGACTGCCATTGTACTGCTCCCTCCGTTTCTGCCGGTGAATCTGAGGCAGCACACCAGTGCTTCTCCTTGGCGCTCCGAGAAGAACGCCACCAAGGATGCTGCGTATCAGGCGTATATAGCCCTGTATGACGCGAAGCTCGTCAACGAGAACCTGCTGCCCTTCAAGTCCAGCGACATGCTCGGAATCGATAAGCGAGTATCCGAGGTGCCGGTCGAGCCGTTGATGAAGCCATGGCATCGTGTCGCTCCTGCGTGGCGGGAAGCTGGCGACAAGTGGCTTTACTCCTTGAGCTGCGTGGAGGAGGACGGCCGAGTAAGTGCAGAGTACGAGGTTCTGCTGCCAGTCTGGCTGAACCAGCCTCAGCCCCTGAAAATGTTCCTCGACCGCAATCACCAGGTGGAGTTGCAGCTGAAGGCCGGGATACCCGTGCCGCACGAGCAAGTTGCGTCCCTGCCAGATCATACATCGACTTTGCTGGCGCTGCATTTCGGTCATCGATGGCCTCTCGAGCAGAAAGAGCACGTCATTCGGGTCTGGGCCAAGGATCAACCCCTATCGCTGAACCAAATTGGCGAGCTCACATACGATCCACAGAATGAGAGCGTCAGCCGGGGAGAGTTTCTCATCCGGGACAACACCAGAGCCCCCTACCTGTACAAGGATACCATTGCGTTCAAGCCCGAACCGAGCCAGGTCCAGAATACCTTTTACGAGTACGACAAGGCGCCCGAAGACGTGCCGTATCTCGTGCTCACCAAATGGACGCGGCGGACCGACTTTCTGCATCGCCTCCAAGGGAATCCCGCCAAGAATGAGGTTAGTAGCAAGCCATACGCACGCGTATATCCGCTGTCGTGGGCGACAGTCGATACCATCCCCGCCAGGCACGCCCAGTTTGGCATGCTGATCCCGACCATGATCCACGAGCTCGGCGTCATGCTCATGGCCAAGGAGCTGGCCTACTCCGTTCTCGACGAGGTTGGCATTTCGGATCTGCAGCTGGTCAAGGAGGCCATCAGCGCGCGGAGTGCCTCGGAGCCGGTGAATTACGAGAGGCTGGAGTTTTTGGGCGACTCGATTCTCAAGTTTTGTGCCTGTATGCGCGCCGCTGCTGAAAGTAAGTTGCTCAAGCGTTTTACTCATATATGACTCCTGTGTGCACCTGTCCTCTGACATGGAACTGTTTTGCTGACCACATTTGATACTGCCTAGAACCCGACTATCCCGAGGGCTATCTCTCGTATTGGAGAGACCGACTCGTCTCCAACTCGAGGCTGTACAAAGCCGCTCTCGAGTTTGGGCTGCCGAGGTTCATCTTGACGAAACCTTTTACCGGTCAAAAGTGGCGCCCACTCTACCTGGACGAGGTCCTCCAGCAAGGGGACGTCGCTACGCCGGAGAAGAGAAAATTATCGACCAAGACGCTCGCAGACGTGGTCGAGGCGCTGATCGGGGCCTCATACGTCGATGGAGGCCTTTCAAAGGCAGTGACTTGCATCTCAAAATTCGTCCCCGAAGGCTCGTGGACCAGTGTTGATGCAGATAGAGAGTCTCTCTTTGCGAGAGTGCCAGACGGCGAGCCTCTCCCGCCGCCATTGGAGCCGCTGGAGAAGTTGATCGGCTACACGTTCCAGAAAAAGGCGCTCTTGATGGAGGCTCTGACGCATGCCTCGTATGCTGCAGACTTCGGAACGCGATCTCTCGAGAGGCTCGAATTCATAGGAGACGCTGTCCTGGACAACATTATCGTTACGAAGCTCTTTAGGCTGAAGCCAGCGCTGCCCCATTTCAGGATGCATACGCTGAAGACGGGCCTGGTGAATGGGGACTTTCTTGCTTTCATGACAATGGAGCACGGAGTGCAACTGGCGGCGGACCCTGTGGTGACAGAAGAAGCTACGGTGGAGGTCCCGGAAACGATTTCCTACCTGTGGTCGTTTTTGAGGCAGGCCTCTTTTCCCATTGCCATCGAGCTGAAGGAGACGAACAAGCGGCACGCTGCCCTGAGAGAGCAGATTCACGAAGCAATGGACAATGACGATCATTACCCCTGGGCGCTGCTGGCCGCCCTGAGCCCGAAGAAGTTCTACTCTGACCTCTTCGAGGCGGTTCTCGGCGCTGTGTGGATCGACTCCGGGTCGCTGGCGGCGTGCGAGGGCATGGTTGCGCAGTTTGGGATCTTAAAGTACATGGATCGGCTGCTGCGTGACGAAGTCCACGTGCAGCATCCTAAGGAGGAGCTGGGCATGTGGGCAAACACAGAGACTGTGACGTACGAGCTCGAGATGAAGGGGAGCGAGGAGAGCGCGGGGGAGAGGGAGTATTTCTGCAAGGTGTTTGTTGGAAAGAGGGAGGTTGTGGAGGTTCGTGGGGGGGTCAATAAGGAGGAGGTGAAGACGAAGGGTGCGACGGAGGCGTTGCGGATTTTGAGGGAGGAGAAAAGGCGCGGTGCTGAGGATGTGGTGATGGTGGGATAA
SEQ ID NO:2
SEQ1突变侧翼1
GACTGAAGGCCTTCATCAAATACAAGCAGCGCCAGAAGACCCAAGTTCAGGTAAGCATGGTCAAGGGCATCGAGCAGAACCTGGGGTGTGGATATGACAATTCGAACCGTGTCGAGAAGAATGGCCCAGATATCCGGCCCCCAAGCATCGATATTGGAGTTCCCGGCCAGTGTCATCATGGGCACGGCAGGTATCTGCAACTTGAGCACATCGTGTTGCTGATGACACAGCGAAACTGTTGGCGCGATGAACCAGATGATCTGATGCGTGCTGCGTCAGTGCAGCTGTCCAGGTCGTTGTGCAACTGTATCCAGACGGCAGACTCACCTTTGATGCATCGCAGATTTCCAGCTCCTTCTTGATACGAAGCACAGCTCTGATGCAAGCGCCAAGTCAGTCTTTTGCGAAGAAGGGTGCTAAGGGCTGGCACAGGTTACGTGGGCTGCCGATGATGAAGATGCACAACTTACACTTGAGTCTTGCCACTTCACGTGTCCATCTAGATTTATAACAACGCCCCTTGGTCAATGGACATGTCTTTCAACGTCGAAGACAACGACAGCAAAGGGGGAGACGGGGGATTGGAGAGAAACTTCAACATACAGCAACAATGACATTTTGCTTGAGGCTCTTGTCGAGCATCTCGATCTGATAGGCCCTCATGACTTTGACTTGCTCTCCCTCCTCGCCCAGCAGTGCTGCCTGGGAGCCTGAGGTTGTTGTCGGGATGGCTCCATCTTGACCGGGCGTAGGCTGCTTGATATCAGCTCCAGGCACGGCAGCCTCGTCGGCGACATGGCCATCGGGAGCACCATCCGACCCCGTGGCCGCGCCCGCCCCTTTCTCGACGGCGTGGCCAGTCACATAGTTGAGCGATGGAGCCACGTCTCCAGAGGAGCAAGACGACCATGAATCCGCGTCCGACGACGACGACGAGCGTGGGCGCACCCGCGGCACGTCATCCCCAGCGCTCGCCAGGCCCGGAGCAGCAGCCGAAGCAGCGCGGACAGGACCAGGACCAGACCCAGGCCCTGACCCTGACCCTGATGGCAGCCCAGGGCCAGCCGCCGCTACTAGCTGCAACATGGAAAGGCGACGGCGGCAGTTTGGCGCTCCCGCGGCGGCGGATCCCGGGGTGTGACTCAGGCAGCGGCCCCTGCGAAGCACCCGCAGCCTCAGGGAGCGTATTCTGACGTGTCGGGCAGACGCAACGAGTGCGTATCGAGCGACTAGCTGCGCGTGAATCCCGGCTCGCGATGCCTCACGGCGACGGCGGCGGAGTTGGTTGCGGGGTTGGCGACTCGACGCTGGCGGGCTGGGACGCGGATTTGCACCTGGATCACCTGGATCTGGAGCTGGAGCTGCTGGATTCATGCCCCTGCTCGGCGGGAAGCCGGTGATTTGCGTGGCTGCCACTGGGGAGCTAAGAGAGAGGCAAGCCGTAGTCTTAGTCGTAGTTATATGTAGTTGTAAGGTAAGGCAAGGTACATGTAGTCGTCTGTAGGGCCTGTCTAGCGAACCTTGAGGTTTCCTGGATCCACGGCGAGCTTGGCCAGCATCAGAGAGAGGAGGAGGAGGCAGAGAGGCGTCAACAGCTGAGGCGTCACGGCTCGAGTGTCACAGGCATCGCTTCCCCGCAGGTGGAACAAGGCGTGTGTCCTTTCGTTGGGCTGCTGAGATGCCAATTGCTTGCTTGCTGGGGGTGAGAGAGAGGCCGCAGAGGTGTAGGAGGAGGAGACGCAATTGGGTGACGTGGGGGGAGTGAATGAATACAACGTCAAAGCAGGACTGCGAATTCAATCTATGGCAGGCAAGGACACTCGTGCACGACAGGCTACATAGCTACTATTAGCAAACGGAGGATGTTGTTTTTGTGTTGGTTCATGCAGCCACTCATGCAGAGCCCCGGCCTCTTCTCACCTTGTTTGGGTTGTTGAAGCTTGTTTCGTGGCTTGATAGTGAGCCGCTGCGTTAAGATTCAAACTGTCACCGTTAGCGTCGGCAGCCTCGTTCACGGCCTCTCCTTGGTTTCTGGAACTCTCACAGGTATGTCAAGCAAGAATGTAACAAGACACAGCCCGGGCTCTTGTCTGTTACCAGGTCATATGAGCCAGGGATCAAGAAATCCGCGGAAAGGTCAATAAAATGGGAGTTACTGAGTATATTCCGTCCCGTGCCTTTTCTTCATGCTGGTCTCTGGAGGAAATCTCACGGCTATCGTCACGAATGGCCGAATAAGTGCGACCATCTTCAGAGCTTCGTGTGACTGGCGACCATCTTTACCCGAAGTCAGATAGACAGGAATCACCATTGGTAGCAGTGACTAATTAATGCACTGTTACAACACATGACTGACAAGTTTCGAAAACCAAGAATAAGGTACTATCAATATCATAAGTACCTAGGATCTAAGGTATGTAGGCAGACCGTCATCATCACCTTCAAACCCCCGACAGGACAGGCCTCAATCCCCGGCAGTAGGTACATACTCTATCTCCGGGACTTGACGACCCACCATTGCGATTGCCGCCTCAATGCCAGAAGGAACTTTTGTCCTCCCAGTGCTTTGTCCTGCTACTGTCATTACCAAGCAAGCCTTAGGAGTCATAAGAGTCATACTGAACCTTAGGTACTTGTTGGGCAGAGCCATGTGGCCTACACTCCCAAACTCAAAATTACTGGTCCGTTCATGCCTTGGATCATGTATCTTTCCATTTGCCAATCATAGGCCTCCCGGAACTTTCAAGCAATAGAGAGGTCAGCTCGATGCTGGACAGGGCAGACCGTACTTACACGTACCTAGGTAGCCTCTCTGTAGAACCTTTGACCCTCAAAAGGTTCATCACCAAGTTATTGCGTAGCATGACCTAGAATACTGAAATTAGATCGCGCAAGTAGCAATAATTCGCTATACTATGTATGCGGCAAGTCGCATTTCAGAAGCCGGTTCTGTTCAACCACAGTCCAACCGTCGTCAATCTGGAGATGCGTCACAGGAGCCGCAGGTGACTGCACAGCGATGCACCGTGGTGATGACATTGAATCTGCCTAGGTATAATTACCTACATTTTCAATGTCTGTCTTCAAAAATAGAATAAAGTGCCACTTGGCATTCGACAATTGTTGTGTTGAACAATTGGGAGTATCTACGTCGTGAATCATGTTGCAAGCAAGAGGTATAGGTAGGTACCTTACCTGTTGAAGCAGCTAGCGCCCTAGAGGCAGCCTCTGATGTCGTCTTGTCATTTTTTGATCCATCTCAAACAAGTCTCAACAACGCATCCCATGCACCATGGAGCTTTTCGCAACAGGCTTCAACGCCTGGAACCAGCTCACTTTCACCAAAGGCAGCCCCCAAGAGGCCATCCCAGAGGAACCAGATGACCTCTTCGGCTTTACAAAAGTTCTCTCCGCCACATCCATTGAACGGCCAGTATCGCGCCTCACTTACACCATCGGTACCTTATATCAAATCACAACCTATCTCATACCCCATCACACCTCCCTTTTACGCCCTATAAAAGACCATTACCGCCTAAACCTCAACAATCAAACCACAAACTGACAAAAGATTTCCCCCCCCTCCAGTCCGAAAAGACGACCACCTCATCCTCGCCGGCCATGGCCCCTCGCAGCACAACCTCGAGCACCTCTACGCGTCCGCCGAAACGTTTCGACT
SEQ ID NO:3
SEQ1突变侧翼2
GACTGAAGTACTTCATCTGGTTCTGTGTGTAGGTATCGTACTTTTCAATGGCTGTTAGCAGCAGGCGGTTGTTTCGGTCCGTAGGGTTGTTGCGCAGCATGAGTATGTAGGGGTCTTCGAGAATGTCCAGCGCCCGGTAGACCCGATCCAAGTCGCGCATGGTGGGCGTCGTGATGTCTTCTTTGCCGGCTTTATAGATGATGTGCTTGATATTGGGCCTCTTGACGCATTTGAGCAGTTCGTCGCGATGGAGAGTGGGCGAGACGCATCTTGCATCCATCAGCCATTCCAAGGCATCCAATATCGGCAAGCTCAGACTGAATGCTCGGAGTTGCCGTCAGACCCAGAACAGCAGGCACGCTTTCACCAGCCAGCTTGCGCGGATGGTAGTGGTGGAGCATGATTTTGCCGCCTGGACTTCTGCCAATGCAGTTGTGGACTTTTGCACAAGACACGTCAGCGATTTGCAACTTCTGGCGGCCCCTTTGCCTTTACAGAGTGAAGGCAGGTCGTCCCATACCTTCATCAAATACAAGCAGCGCCAGAAGACCCAAGTTCAGGTAAGCATGGTCAAGGGCATCGAGCAGAACCTGGGGTGTGGATATGACAATTCGAACCGTGTCGAGAAGAATGGCCCAGATATCCGGCCCCCAAGCATCGATATTGGAGTTCCCGGCCAGTGTCATCATGGGCACGGCAGGTATCTGCAACTTGAGCACATCGTGTTGCTGATGACACAGCGAAACTGTTGGCGCGATGAACCAGATGATCTGATGCGTGCTGCGTCAGTGCAGCTGTCCAGGTCGTTGTGCAACTGTATCCAGACGGCAGACTCACCTTTGATGCATCGCAGATTTCCAGCTCCTTCTTGATACGAAGCACAGCTCTGATGCAAGCGCCAAGTCAGTCTTTTGCGAAGAAGGGTGCTAAGGGCTGGCACAGGTTACGTGGGCTGCCGATGATGAAGATGCACAACTTACACTTGAGTCTTGCCACTTCCCGTGTCCATCTAGATTTATAACAACGCCCCTTGGTCAATGGACATGTCTTTCAACGTCGAAGACAACGACAGCAAAGGGGGAGACGGGGGATTGGAGAGAAACTTCAACATACAGCAACAATGACATTTTGCTTGAGGCTCTTGTCGAGCATCTCGATCTGATAGGCCCTCATGACTTTGACTTGCTCTCCCTCCTCGCCCAGCAGTGCTGCCTGGGAGCCTGAGGTTGTTGTCGGGATGGCTCCATCTTGACCGGGCGTAGGCTGCTTGATATCAGCTCCAGGCACGGCAGCCTCGTCGGCGACATGGCCATCGGGAGCACCATCCGACCCCGTGGCCGCGCCCGCCCCTTTCTCGACGGCGTGGCCAGTCACATAGTTGAGCGATGGAGCCACGTCTCCAGAGGAGCAAGACGACCATGAATCCGCGTCCGACGACGACGACGAGCGTGGGCGCACCCGCGGCACGTCATCCCCAGCGCTCGCCAGGCCCGGAGCAGCAGCCGAAGCAGCGCGGACAGGACCAGGACCAGACCCAGGCCCTGACCCTGACCCTGATGGCAGCCCAGGGCCAGCCGCCGCTACTAGCTGCAACATGGAAAGGCGACGGCGGCAGTTTGGCGCTCCCGCGGCGGCGGATCCCGGGGTGTGACTCAGGCAGCGGCCCCTGCGAAGCACCCGCAGCCTCAGGGAGCGTATTCTGACGTGTCGGGCAGACGCAACGAGTGCGTATCGAGCGACTAGCTGCGCGTGAATCCCGGCTCGCGATGCCTCACGGCGACGGCGGCGGAGTTGGTTGCGGGGTTGGCGACTCGACGCTGGCGGGCTGGGACGCGGATTTGCACCTGGATCACCTGGATCTGGAGCTGGAGCTGCTGGATTCATGCCCCTGCTCGGCGGGAAGCCGGTGATTTGCGTGGCTGCCACTGGGGAGCTAAGAGAGAGGCAAGCCGTAGTCTTAGTCGTAGTTATATGTAGTTGTAAGGTAAGGCAAGGTACATGTAGTCGTCTGTAGGGCCTGTCTAGCGAACCTTGAGGTTTCCTGGATCCACGGCGAGCTTGGCCAGCATCAGAGAGAGGAGGAGGAGGCAGAGAGGCGTCAACAGCTGAGGCGTCACGGCTCGAGTGTCACAGGCATCGCTTCCCCGCAGGTGGAACAAGGCGTGTGTCCTTTCGTTGGGCTGCTGAGATGCCAATTGCTTGCTTGCTGGGGGTGAGAGAGAGGCCGCAGAGGTGTAGGAGGAGGAGACGCAATTGGGTGACGTGGGGGGAGTGAATGAATACAACGTCAAAGCAGGACTGCGAATTCAATCTATGGCAGGCAAGGACACTCGTGCACGACAGGCTACATAGCTACTATTAGCAAACGGAGGATGTTGTTTTTGTGTTGGTTCATGCAGCCACTCATGCAGAGCCCCGGCCTCTTCTCACCTTGTTTGGGTTGTTGAAGCTTGTTTCGTGGCTTGATAGTGAGCCGCTGCGTTAAGATTCAAACTGTCACCGTTAGCGTCGGCAGCCTCGTTCACGGCCTCTCCTTGGTTTCTGGAACTCTCACAGGTATGTCAAGCAAGATAACAAGACACAGCCCGGGCTCTTGTCTGTTACCAGGTCATATGAGCCAGGGATCAAGAAATCCGCGGAAAGGTCAATAAAATGGGAGTTACTGAGTATATTCCGTCCCGTGCCTTTTCTTCATGCTGGTCTCTGGAGGAAATCTCACGGCTATCGTCACGAATGGCCGAATAAGTGCGACCATCTTCAGAGCTTCGTGTGACTGGCGACCATCTTTACCCGAAGTCAGATAGACAGGAATCACCATTGGTAGCAGTGACTAATTAATGCACTGTTACAACACATGACTGACAAGTTTCGAAAACCAAGAATAAGGTACTATCAATATCATAAGTACCTAGGATCTAAGGTATGTAGGCAGACCGTCATCATCACCTTCAAACCCCCGACAGGACAGGCCTCAATCCCCGGCAGTAGGTACATACTCTATCTCCGGGACTTGACGACCCACCATTGCGATTGCCGCCTCAATGCCAGAAGGAACTTTTGTCCTCCCAGTGCTTTGTCCTGCTACTGTCATTACCAAGCAAGCCTTAGGAGTCATAAGAGTCATACTGAACCTTAGGTACTTGTTGGGCAGAGCCATGTGGCCTACACTCCCAAACTCAAAATTACTGGTCCGTTCATGCCTTGGATCATGTATCTTTCCATTTGCCAATCATAGGCCTCCCGGAACTTTCAAGCAATAGAGAGGTCAGCTCGATGCTGGACAGGGCAGACCGTACTTACACGTACCTAGGTAGCCTCTCTGTAGAACCTTTGACCCTCAAAAGGTTCATCACCAAGTTATTGCGTAGCATGACCTAGAATACTGAAATTAGATCGCGCAAGTAGCAATAATTCGCTATACTATGTATGCGGCAAGTCGCATTTCAGAAGCCGGTTCTGTTCAACCACAGTCCAACCGTCGTCAATCTGGAGATGCGTCACAGGAGCCGCAGGTGACTGCACAGCGATGCACCGTGGTGATGACATTGAATCTGCCTAGGTATAATTACCTACATTTTCAATGTCTGTCTTCAAAAATAGAATAAAGTGCCACTTGGCATTCGACAATTGTTGTGTTGAACAATTGGGAGTATCTACGTCGTGAATCATGTTGCAAGCAAGAGGTATAGGTAGGTACCTTACCTGTTGAAGCAGCTAGCGCCCTAGAGGCAGCCTCTGATGTCGTCTTGTCATTTTTTGATCCATCTCAAACAAGTCTCAACAACGCATCCCATGCACCATGGAGCTTTTCGCAACAGGCTTCAACGCCTGGAACCAGCTCACTTTCACCAAAGGCAGCCCCCAAGAGGCCATCCCAGAGGAACCAGATGACCTCTTCGGCTTTACAAAAGTTCTCTCCGCCACATCCATTGAACGGCCAGTATCGCGCCTCACTTACACCATCGGTACCTTATATCAAATCACAACCTATCTCATACCCCATCACACCTCCCTTTTACGCCCTATAAAAGACCATTACCGCCTAAACCTCAACAATCAAACCACAAACTGACAAAAGATTTCCCCCCCCTCCAGTCCGAAAATTTTCGACT
SEQ ID NO:4
潮霉素B抗性标记
GTTAACAAGACACAGCCCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATAACGGTGAGACTAGCGGCCGGTCCCCTTATCCCAGCTGTTCCACGTTGGCCTGCCCCTCAGTTAGCGCTCAACTCAATGCCCCTCACTGGCGAGGCGAGGGCAAGGATGGAGGGGCAGCATCGCCTGAGTTGGAGCAAAGCGGCCCGGCCGCCATGGGAGCAGCGAACCAACGGAGGGATGCCGTGCTTTGTCGTGGCTGCTGTGGCCAATCCGGGCCCTTGGTTGGCTCACAGAGCGTTGCTGTGAGACCATGAGCTATTATTGCTAGGTACAGTATAGAGAGAGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGGAAAAAAGGTGAGGTTGAAGTGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCAACCACTGACGGCTGCCGGCTCTGCCACCCCCCTCCCTCCACCCCAGACCACCTGCACACTCAGCGCGCAGCATCACCTAATCTTGGCTCGCCTTCCCGCAGCTCAGGTTGTTTTTTTTTTCTCTCTCCCTCGTCGAAGCCGCCCTTGTTCCCTTATTTATTTCCCTCTCCATCCTTGTCTGCCTTTGGTCCATCTGCCCCTTTGTCTGCATCTCTTTTGCACGCATCGCCTTATCGTCGTCTCTTTTTTCACTCACGGGAGCTTGACGAAGACCTGACTCGTGAGCCTCACCTGCTGATTTCTCTCCCCCCCTCCCGACCGGCTTGACTTTTGTTTCTCCTCCAGTACCTTATCGCGAAGCCGGAAGAACCTCTTAACCTCTAGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCCACGTCTGTCGAGAAGTTCCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTCAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCACCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGATGCATGGCTTTCGTGACCGGGCTTCAAACAATGATGTGCGATGGTGTGGTTCCCGGTTGGCGGAGTCTTTGTCTACTTTGGTTGTCTGTCGCAGGTCGGTAGACCGCAAATGAGCAACTGATGGATTGTTGCCAGCGATACTATAATTCACATGGATGGTCTTTGTCGATCAGTAGCTAGTGAGAGAGAGAGAACATCTATCCACAATGTCGAGTGTCTATTAGACATACTCCGAGAATAAAGTCAACTGTGTCTGTGATCTAAAGATCGATTCGGCAGTCGAGTAGCGTATAACAACTCCGAGTACCAGCGAAAGCACGTCGTGACAGGAGCAGGGCTTTGCCAACTGCGCAACCTTGCTTGAATGAGGATACACGGGGTGCAACATGGCTGTACTGATCCATCGCAACCAAAATTTCTGTTTATAGATCAAGCTGGTAGATTCCAATTACTCCACCTCTTGCGCTTCTCCATGACATGTAAGTGCACGTGGAAACCATACCCAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGGGCTCTTGTCTGTTAAC
Claims (19)
1.一种用于生产全培养液酶组合物的方法，其包含以下步骤：
(a)提供源自水解木质纤维素生物质的发酵培养基，其葡萄糖含量为5至450g/L、木糖含量为2至300g/L、密度为1至2kg/L和干物质含量为10至75wt％；
(b)加入至少一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO:1已被破坏；
(c)在20至35℃的温度下，将所述发酵培养基和所述至少一种丝状真菌细胞混合1分钟至10天的时间；
(d)获得全培养液酶组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中根据步骤(a)的所述发酵培养基的pH已被调节至选自pH 2.0至6.0的pH值。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述葡萄糖与所述木糖的比率为1.0至3.5。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(ai)通过蒸发、膜过滤、或薄层蒸发浓缩所述发酵培养基，以将所述发酵培养基的重量减少2至6倍。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤：
(aii)对根据步骤(a)的所述发酵培养基或根据步骤(ai)浓缩的发酵培养基进行灭菌。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤(a)的所述发酵培养基中糠醛的含量为小于0.5g/L。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中根据步骤(a)的所述发酵培养基羟甲基糠醛(HMF)的含量为小于0.5g/L。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含以下步骤：
(e)对根据步骤(c)发酵的培养基进行固液分离以获得固体部分和液体部分。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间加入0.05wt％至5wt％的氮。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述方法的步骤(a)和/或(b)期间加入0.5至350mg/L FeSO4、MnSO4、MgSO4和/或ZnSO4。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自枝顶孢菌属、曲霉属、毛壳菌属、裸孢壳属(Emericella)、镰刀菌属、腐质霉属、肉座菌属(Hypocrea)、耙菌属(Irpex)、巨座壳属(Magnaporte)、毁丝霉属、链孢菌属、青霉菌属、根霉属、篮状菌属、木霉属和栓菌属。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌细胞包含至少一种异源β-葡糖苷酶。
13.一种丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1已被破坏。
14.根据权利要求13所述的丝状真菌细胞，其中SEQ ID NO：1已经通过以下而被破坏：启动子或任何其它调节序列的缺失、突变、修饰，终止密码子产生，或RNA干扰。
15.根据权利要求13或14中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是基因修饰的丝状真菌细胞，其具有表达至少一种异源水解酶、至少一种异源果胶酶、至少一种异源氧化酶和/或至少一种异源辅助蛋白的能力。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的丝状真菌细胞，其中所述至少一种丝状真菌细胞是基因修饰的丝状真菌细胞，其包含至少一种异源β-葡糖苷酶编码序列、至少一种异源β-木糖苷酶编码序列、至少一种异源木聚糖酶编码序列、至少一种异源果胶酶编码序列、至少一种异源裂解多糖单加氧酶编码序列、至少一种异源氧化酶编码序列和/或至少一种异源辅助蛋白编码序列。
17.根据权利要求1至12中任一项所定义的方法生产的全培养液酶组合物。
18.根据权利要求13至16中任一项所定义的丝状真菌细胞用于生产全培养液酶组合物的用途。
19.根据权利要求18的全培养液酶组合物用于水解木质纤维素生物质的用途。
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