CN116348482A

CN116348482A - 用于治疗胶质母细胞瘤的方法和组合物

Info

Publication number: CN116348482A
Application number: CN202180072324.4A
Authority: CN
Inventors: 伊冯娜·于-轩·陈; 安德鲁·J·候
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2023-06-27
Also published as: EP4203990A2; JP2023539871A; US20230322894A1; US20230364139A1; WO2022046935A3; EP4204443A1; CA3193009A1; JP2023539870A; WO2022046938A1; CA3193006A1; WO2022046935A2

Abstract

本公开内容提供了用于治疗胶质母细胞瘤(也称为GBM或多形性胶质母细胞瘤)的新的多特异性CAR分子。本公开内容还描述了编码多肽的核酸、包含所述核酸的表达载体、表达所述多肽和/或包含本公开内容的核酸或表达载体的细胞和/或细胞群体，以及包含所述多肽、核酸或细胞的组合物。

Description

用于治疗胶质母细胞瘤的方法和组合物

本申请要求于2020年8月26日提交的美国临时申请No.63/070,550、于2021年4月6日提交的美国临时申请No.63/171,187以及于2021年7月6提交的美国临时申请No.63/218,761的优先权权益，其各自在此均通过引用整体并入。

背景

本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助No.CA211015下的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

II.技术领域

本发明总体上涉及分子生物学和免疫治疗的领域。

III.背景技术

多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)是成人中最常见的原发性脑肿瘤类型，并且在过去的数十年期间，中位生存期保持在自诊断时间开始12至16个月。常规治疗例如手术、化学治疗和放射几乎总是不能根除肿瘤，导致在数周或数月内复发。因此，GBM已经成为研究新的治疗方案(例如过继性T细胞治疗)的活跃领域。迄今为止，两个主要的挑战限制了T细胞治疗对GBM的效力。首先，GBM肿瘤微环境具有强烈的免疫抑制性，其特征在于高水平的转化生长因子β(TGF-β)，所述转化生长因子β同时促进肿瘤生长并有效地抑制T细胞的功能。其次，GBM肿瘤在抗原表达方面是高度异质性的，因此经改造以靶向单一抗原的T细胞通常不能识别和根除所有存在的肿瘤细胞。因此，本领域需要改进的GBM治疗。

发明内容

本公开内容通过提供用于治疗胶质母细胞瘤(也称为GBM或多形性胶质母细胞瘤)的新的多特异性CAR分子满足了本领域的需求。因此，本公开内容的一些方面涉及包含多特异性嵌合抗原受体的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含SEQ ID NO：4或20的IL13多肽、胶质母细胞瘤抗原结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区；其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含GD2或EGFRvIII结合区。

另一个方面涉及包含多特异性嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含SEQ ID NO：4或20的IL13多肽、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区。

又一些方面涉及包含多特异性嵌合抗原受体(CAR)的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含胶质母细胞瘤抗原结合区、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区；其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗GD2 scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO：48(HCDR1)、SEQID NO：49(HCDR2)和SEQ ID NO：50(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO：51(LCDR1)、SEQID NO：52(LCDR2)和SEQ ID NO：53(LCDR3)。另一些方面涉及包含多特异性嵌合抗原受体(CAR)的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含胶质母细胞瘤抗原结合区、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区；其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗GD2 scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO：46的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO：47的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

还提供了包含多特异性嵌合抗原受体(CAR)的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含胶质母细胞瘤抗原结合区、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区；其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含EGFRvIII结合区。

本公开内容还描述了编码本公开内容的多肽的核酸、包含本公开内容的核酸的表达载体、表达本公开内容的多肽和/或包含本公开内容的核酸或表达载体的细胞和/或细胞群体，以及包含本公开内容的多肽、核酸或细胞的组合物。所述组合物可以是可药用制剂的形式。

本公开内容的一些方面还涉及制备表达多肽的细胞的方法，其包括将本公开内容的核酸引入到细胞中。方法的另一些方面涉及用于在对象中治疗胶质母细胞瘤或刺激免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的本公开内容的组合物、细胞或多肽。还提供了用于体外扩增治疗性T细胞的方法，所述方法包括在体外使本公开内容的T细胞与包含TGF-β的组合物接触。

本公开内容的一些方面涉及包含一个或更多个胶质母细胞瘤抗原结合区的多肽。在一些方面中，胶质母细胞瘤抗原结合区包含GD2结合区。GD2的结构是本领域已知的。GD2是属于b系列神经节苷脂的二唾液酸神经节苷脂。其包含五个与神经酰胺相连的单糖，碳水化合物序列为GalNAcβ1-4(NeuAcα2-8NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1。GD2结合区，例如抗GD2抗体结合区是本领域已知的。在一些方面中，GD2结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗GD2 scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO：48(HCDR1)、SEQ ID NO：49(HCDR2)和SEQ ID NO：50(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO：51(LCDR1)、SEQ ID NO：52(LCDR2)和SEQ ID NO：53(LCDR3)。

在一些方面中，胶质母细胞瘤抗原结合区包含EGFRvIII抗原结合区。EGFRvIII是EGFR的变体，其缺乏第6至273位氨基酸，并且那些268个氨基酸的缺失在第5和274位氨基酸之间产生了具有新的甘氨酸残基的结合位点。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗EGFRvIII scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO：40(HCDR1)、SEQ ID NO：41(HCDR2)和SEQ ID NO：42(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO：43(LCDR1)、SEQ ID NO：44(LCDR2)和SEQ ID NO：45(LCDR3)。

在一些方面中，多肽包含TGF-β结合区。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO：31(HCDR1)、SEQ ID NO：32(HCDR2)和SEQ ID NO：33(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO：34(LCDR1)、SEQ ID NO：35(LCDR2)和SEQ ID NO：36(LCDR3)。

在一些方面中，GD2、EGRvIII或TGF-β结合区的LCDR1包含分别与SEQ ID NO：51、43或34具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，GD2、EGRvIII或TGF-β结合区的LCDR2包含分别与SEQ ID NO：52、44或35具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，GD2、EGRvIII或TGF-β结合区的LCDR3包含分别与SEQ ID NO：53、45或36具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，GD2、EGRvIII或TGF-β结合区的HCDR1包含分别与SEQ ID NO：48、40或31具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，GD2、EGRvIII或TGF-β结合区的HCDR2包含分别与SEQ ID NO：49、41或32具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，GD2、EGRvIII或TGF-β结合区的HCDR3包含分别与SEQ ID NO：50、42或33具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面中，GD2结合区包含具有与SEQ ID NO：46具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO：47具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。在一些方面中，GD2结合区包含具有SEQ ID NO：46的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列的VL。在一些方面中，GD2结合区包含VH和/或VL，所述VH具有与SEQ ID NO：46具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列，所述VL具有与SEQ ID NO：47具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。GD2结合区也可以是包含具有与SEQ ID NO：26具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗GD2 scFv的结合区。在一些方面中，GD2结合区包含具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的抗GD2 scFv。另一些方面包括包含抗GD2 scFv的GD2结合区，所述抗GD2 scFv具有与SEq ID NO：26具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，GD2结合区包含与膜结合GD2抗原结合的结合区。在一些方面中，GD2结合区包含与可溶性GD2抗原结合的结合区。在一些方面中，GD2结合区包含与膜结合GD2抗原和可溶性GD2抗原结合的结合区。

在一些方面中，多肽包含TGF-β结合区。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中VH区包含SEQ ID NO：56(HCDR1)、SEQ ID NO：57(HCDR2)和SEQ ID NO：58(HCDR3)，并且VL区包含SEQ ID NO：59(LCDR1)、SEQ ID NO：60(LCDR2)和SEQ ID NO：61(LCDR3)。在一些方面中，多肽包含TGF-β结合区。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中VH区包含SEQ ID NO：64(HCDR1)、SEQ ID NO：65(HCDR2)和SEQ ID NO：66(HCDR3)，并且VL区包含SEQ ID NO：67(LCDR1)、SEQ ID NO：68(LCDR2)和SEQ ID NO：69(LCDR3)。

在一些方面中，TGF-β结合区的LCDR1包含与SEQ ID NO：59或67具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的LCDR2包含与SEQ ID NO：60或68具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的LCDR3包含与SEQ ID NO：61或69具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的HCDR1包含与SEQ ID NO：56或64具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的HCDR2包含与SEQ ID NO：57或65具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的HCDR3包含与SEQ IDNO：58或66具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有与SEQ ID NO：54具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO：55具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO：55的氨基酸序列的VL。在一些方面中，TGF-β结合区包含VH和/或VL，所述VH具有与SEQ ID NO：54具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列，所述VL具有与SEQ ID NO：55具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有与SEQ ID NO：62具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO：63具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO：63的氨基酸序列的VL。在一些方面中，TGF-β结合区包含VH和/或VL，所述VH具有与SEQ ID NO：62具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列，所述VL具有与SEQ ID NO：63具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面中，TGF-β结合区的LCDR1包含与SEQ ID NO：34具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的LCDR2包含与SEQ ID NO：35具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的LCDR3包含与SEQ ID NO：36具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的HCDR1包含与SEQ ID NO：31具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的HCDR2包含与SEQ ID NO：32具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区的HCDR3包含与SEQ ID NO：33具有、具有至少、具有至多或具有约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有与SEQ ID NO：29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO：30具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有SEQ IDNO：29的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VL。在一些方面中，TGF-β结合区包含VH和/或VL，所述VH具有与SEQ ID NO：29具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列，所述VL具有与SEQ ID NO：30具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面中，EGFRvIII结合区包含VH和/或VL，所述VH具有与SEQ ID NO：38具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列，所述VL具有与SEQ ID N0：39具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含具有与SEQ ID NO：38具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO：39具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VL。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VL。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含具有与SEQ ID NO：27具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗EGFRvIII scFv。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含抗EGFRvIII scFv，所述抗EGFRvIII scFv具有与SEQ ID NO：27具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的抗EGFRvIII scFv。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含与膜结合EGFRvIII抗原结合的结合区。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含与可溶性EGFRvIII抗原结合的结合区。在一些方面中，EGFRvIII结合区包含与膜结合EGFRvIII抗原和可溶性EGFRvIII抗原结合的结合区。

本公开内容的一些方面包括包含TGF-β结合区的多肽和CAR。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有与SEQ ID NO：29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO：30具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。在一些方面中，TGF-β结合区包含VH和/或VL，所述VH具有与SEQ ID NO：29具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列，所述VL具有与SEQ ID NO：30具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的VL。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有与SEQ ID NO：11具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。在一些方面中，TGF-β结合区包含抗TGF-βscFv，所述抗TGF-βscFv具有与SEQ ID NO：11具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

GD2结合区可包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗GD2scFv，其中VH区包含来自SEQ ID NO：46的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且VL区包含来自SEQ ID NO：47的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。EGFRvIII结合区可包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗EGFRvIII scFv，其中VH区包含来自SEQ ID NO：38的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且VL区包含来自SEQ ID NO：39的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。TGF-β结合区可包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中VH区包含来自SEQ ID NO：29的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且VL区包含来自SEQ ID NO：30的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。TGF-β结合区可包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中VH区包含来自SEQ ID NO：54的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且VL区包含来自SEQ ID NO：55的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。TGF-β结合区可包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中VH区包含来自SEQ ID NO：62的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且VL区包含来自SEQ ID NO：63的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些方面中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3通过Kabat方法确定。在一些方面中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3通过IMGT方法确定。在一些方面中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3通过Chothia方法确定。在一些方面中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3通过paratome方法确定。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域的至少一部分，例如各自的CDR，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些方面中，预期scFv包含重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3以及轻链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3。还预期CDR1、CDR2或CDR3可分别包含本文中作为CDR1、CDR2或CDR3提供的以SEQ ID NO列出的序列或由其组成。CDR还可包含在特定CDR序列的一侧或两侧侧翼的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、16、18、19、20、21、22、23个或更多个连续氨基酸残基(或其中可推导出的任何范围)；因此，在特定CDR序列(例如SEQ ID NO：31至36、40至45、48至53、56至61和64至69中示出的那些)的N末端或C末端可存在一个或更多个另外的氨基酸。

本公开内容的一些方面还涉及包含IL13多肽和胶质母细胞瘤抗原结合区的多特异性多肽。在一些方面中，所述多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR以从氨基近末端到羧基近末端的顺序包含：IL13多肽、胶质母细胞瘤抗原结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区。

预期IL13多肽可以是邻近胶质母细胞瘤抗原结合区的氨基。在另一些方面中，IL13多肽可以是邻近胶质母细胞瘤抗原结合区的羧基。TGF-β结合区可以是邻近胶质母细胞瘤抗原结合区的氨基，或者TGF-β结合区可以是邻近胶质母细胞瘤抗原结合区的羧基。IL13多肽可以是邻近TGF-β结合区的氨基，或者IL13多肽可以是邻近TGF-β结合区的羧基。预期TGF-β结合区可与IL13多肽相邻，这意味着没有介入的结合区，尽管相邻的任何两个结合区可被接头区隔开。IL13多肽可与胶质母细胞瘤抗原结合区相邻，或者胶质母细胞瘤抗原结合区可与TGF-β结合区相邻。

多肽可包含一个或更多个分隔区域的接头或还包含一个或更多个分隔区域的接头。例如，多肽可在两个结合区之间包含接头，例如在IL13多肽与胶质母细胞瘤抗原结合区之间的接头。多肽可在TGF-β结合区与胶质母细胞瘤抗原结合区之间包含接头，和/或在IL13多肽与TGF-β结合区之间包含接头。在某些方面中，多肽包含含有TGF-β结合区的三特异性CAR。三特异性CAR可包含TGF-β结合区、IL13多肽和胶质母细胞瘤抗原结合区。

在一些方面中，IL13Rα结合区是IL13Rα2结合区。在一些方面中，IL13多肽不包含由SEQ ID NO：4的第3至114位氨基酸组成的IL13多肽。在一些方面中，IL13多肽不包含由SEQ ID NO：4的第11至122位氨基酸组成的IL13多肽。在一些方面中，IL13多肽包含SEQ IDNO：4或20的C端112个氨基酸和N端处的至少一个另外的氨基酸。在一些方面中，IL13多肽包含SEQ ID NO：4或20的C端112个氨基酸和N端处的至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的氨基酸。作为替代或补充，在一些方面中，IL13多肽包含SEQ ID NO：4或20的C端112个氨基酸和C端处的至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的氨基酸。

在另一些方面中，CAR分子还包含可用于在宿主细胞中分选和/或鉴定CAR分子的标签。在一些方面中，标签被进一步限定为治疗性对照。在一些方面中，标签或治疗性对照小于全长多肽并且是截短的。例如，从标签中去除一个或更多个功能性结构域。在某些方面中，截短的蛋白质是EGFR(EGFRt)，其可用于检测CAR的表达。在另一个方面中，截短的蛋白质是截短的低亲和力神经生长因子受体或(dNGFR)。在另一些方面中，标签是比色性的或发荧光的。在一些方面中，可通过切割位点从CAR分离标签。

在一些方面中，VH是邻近VL的氨基。在一些方面中，VH是邻近VL的羧基。当第一区域与第二区域的羧基端连接时，第一区域是邻近第二区域的羧基。在第一区域与第二区域之间可具有其他介入的氨基酸残基。因此，除非特别说明不具有介入的氨基酸残基，否则所述区域不需要紧邻。术语“氨基近末端”被类似地定义为当第一区域与第二区域的氨基端连接时，第一区域是第二区域的氨基近末端。类似地，除非另有说明，否则在第一区域与第二区域之间可存在另外的介入的氨基酸残基。

在一个特定方面中，CAR以从氨基近末端至羧基近末端的顺序包含：IL13多肽、胶质母细胞瘤抗原结合区、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区。

多肽的两个区域之间(例如两个结合区之间或同一结合区的VH与VL之间)的接头可以是包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸的接头。在一些方面中，接头包含具有SEQ ID NO：10或28的氨基酸序列的多肽或者由其组成。在一些方面中，接头的长度为4至40个氨基酸。在一些方面中，接头的长度为、至少为、至多为、或者约为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(或其中可推导出的任何范围)个氨基酸残基。在一些方面中，接头包含至少4个甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些方面中，接头包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(或其中可推导出的任何范围)个甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些方面中，接头包含(GGGGS)_n，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)。在一些方面中，接头包含氨基酸序列：(EAAAK)_n或由其组成，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)。

多肽还可包含第二嵌合抗原受体(CAR)，其包含至少一个抗原结合区、第二肽间隔区、第二跨膜结构域以及含有第二共刺激区和第二主要胞内信号传导结构域的第二胞质区。第二CAR可以是单特异性或多特异性CAR，例如双特异性或三特异性CAR。在某些方面中，第二CAR包含针对TGF-β的抗原结合区。第一CAR和第二CAR可被一个或更多个肽切割位点隔开。肽切割位点可以是本领域已知的肽切割位点，例如弗林蛋白酶切割位点或2A切割位点。2A切割位点可包含P2A、F2A、E2A或T2A切割位点中的一个或更多个。在一些方面中，肽切割位点包含T2A切割位点。T2A切割位点可包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。还考虑了其中切割位点与SEQ ID NO：24具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的一些方面。

本公开内容的CAR可在跨膜结构域和胞质区之间包含扭转接头或还包含扭转接头。在一些方面中，扭转接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基(或其中可推导出的任何范围)或由其组成。在一些方面中，氨基酸残基包含丙氨酸残基或由其组成。在一些方面中，扭转接头包含至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)个丙氨酸残基。在一些方面中，扭转接头包含至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)个连续的丙氨酸残基。在一些方面中，扭转接头由2或4个丙氨酸残基组成。在一些方面中，扭转接头包含至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)个连续的丙氨酸残基。在一些方面中，扭转接头由2个丙氨酸残基组成。

本公开内容的CAR可在抗原结合结构域与跨膜结构域之间包含肽间隔区。类似地，本公开内容的第二CAR可在第二CAR的抗原结合结构域与第二跨膜结构域之间包含肽间隔区。肽间隔区或第二肽间隔区可包含IgG4铰链区。在一些方面中，IgG4铰链区包含与SEQ IDNO：12具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，IgG4铰链区包含具有与SEQ ID NO：12具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，IgG4铰链区包含具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，IgG4铰链区包含具有与SEQ ID NO：5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，IgG4铰链区包含具有与SEQ ID NO：5具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，IgG4铰链区包含具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，肽间隔区或第二肽间隔区包含IgG4 CH2和CH3区或还包含IgG4 CH2和CH3区。在一些方面中，肽间隔区或第二肽间隔区包含IgG4 CH2和CH3区或还包含IgG4 CH2和CH3区。在一些方面中，IgG4 CH2和CH3区包含具有与SEQ ID NO：37具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，IgG4 CH2和CH3区包含包含具有与SEQ ID NO：37具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，IgG4 CH2和CH3区包含具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽。在一些方面中，CH2区包含L235E和/或N297Q替换。肽间隔区的长度可以为8至1000个氨基酸。在一些方面中，肽间隔区的长度为8至500个氨基酸。在一些方面中，肽间隔区的长度为100至300个氨基酸。在一些方面中，肽间隔区具有少于100个氨基酸。在一些方面中，肽间隔区为至少、至多、恰好8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49v50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499或500个氨基酸(或其中可推导出的任何范围)。

跨膜结构域或第二跨膜结构域可包含来自CD28蛋白的跨膜结构域。在一些方面中，跨膜结构域或第二跨膜结构域包含具有与SEQ ID NO：6具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域。在一些方面中，跨膜结构域或第二跨膜结构域包含具有与SEQ IDNO：6具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域。在一些方面中，跨膜结构域或第二跨膜结构域包含具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的跨膜结构域。在一些方面中，跨膜结构域为T细胞受体的α或β链、CD28、CD3ε(ε)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154跨膜结构域。

本文中所述的肽和CAR中的共刺激区或第二共刺激区可包含来自4-1BB蛋白或来自CD28蛋白的共刺激区。在一些方面中，共刺激区或第二共刺激区包含具有与SEQ ID NO：7、14或18具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的共刺激区。在一些方面中，共刺激区或第二共刺激区包含具有与SEQ ID NO：7、14或18具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的共刺激区。在一些方面中，共刺激区或第二共刺激区包含具有SEQ ID NO：7、1 4或18的氨基酸序列的共刺激区。在一些方面中，胞质区包含两个共刺激结构域。在一些方面中，一个或更多个共刺激结构域包含来自4-1BB(CD137)、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和/或ICOS(CD278)中的一个或更多个的共刺激结构域。在一些方面中，一个或更多个共刺激结构域包含来自CD28的共刺激结构域或来源于CD28的共刺激结构域。

本文中所述的多肽和CAR的主要胞内信号传导结构域或第二主要胞内信号传导结构域可包含来自CD3ζ蛋白的胞内信号传导结构域。在一些方面中，主要胞内信号传导结构域或第二主要胞内信号传导结构域包含具有与SEQ ID NO：8或15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的胞内信号传导结构域。在一些方面中，主要胞内信号传导结构域或第二主要胞内信号传导结构域包含具有与SEQ ID NO：8或15具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列的胞内信号传导结构域。在一些方面中，主要胞内信号传导结构域或第二主要胞内信号传导结构域包含具有SEQ ID NO：8或15的氨基酸序列的胞内信号传导结构域。

多肽可包含SEQ ID NO：136至147中一者的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：136至147中一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。多肽可包含与SEQ ID NO：136至147中一者具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。多肽可包含SEQ ID NO：1、9、13、16、17、19、21至23和25中一者的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1、9、13、16、17、19、21至23和25中一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。多肽可包含与SEQ ID NO：1、9、13、16、17、19、21至23和25中一者具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。

本公开内容的多肽可包含一种或更多种分子标签或还包含一种或更多种分子标签。在一些方面中，一种或更多种分子标签包含FLAG和/或HA标签。本公开内容的多肽可包含一个或更多个信号序列或还包含一个或更多个信号序列。在一些方面中，信号序列包含与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，信号序列包含与SEQ ID NO：2具有或具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中可推导出的任何范围)序列同一性的氨基酸序列。在一些方面中，信号序列包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。多肽也可在本公开内容的CAR中不包含FLAG标签。

本公开内容的一些方面还描述了编码多肽的核酸和包含该核酸的表达载体。表达构建体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体或来源于逆转录病毒的载体。在一些方面中，病毒载体是慢病毒载体或来源于慢病毒的载体。一些方面涉及包含编码本公开内容的多肽的序列的慢病毒载体。一些方面还涉及包含本公开内容的核酸的病毒颗粒。在一些方面中，表达载体，例如病毒载体已被整合到宿主细胞的基因组中。细胞可以是离体的。还预期了细胞是体内的。本公开内容的一些方面还涉及表达本公开内容的多肽和/或包含本公开内容的核酸的细胞。本公开内容的细胞可包含编码第二CAR的核酸或还包含编码第二CAR的核酸。本公开内容的细胞可包含含有第二CAR的多肽或还包含含有第二CAR的多肽或者表达含有第二CAR的多肽。

本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含IL13Rα结合区和TGF-β结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含GD2结合区的CAR。本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含IL13Rα结合区和TGF-β结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含EGFRvIII结合区的CAR。本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含IL13Rα结合区和GD2结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含TGF-β结合区的CAR。本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含IL13Rα结合区和EGFRvIII结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含TGF-β结合区的CAR。本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含TGF-β结合区和EGFRvIII结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含IL13Rα结合区的CAR。本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含TGF-β结合区和GD2结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含IL13Rα结合区的CAR。本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含TGF-β结合区和GD2结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含IL13Rα结合区和EGFRvIII结合区的双特异性CAR。本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含TGF-β结合区和EGFRvIII结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含IL13Rα结合区和GD2结合区的双特异性CAR。本公开内容的细胞可包含编码表达的第一多肽和第二多肽的核酸或者包含表达的第一多肽和第二多肽，所述第一多肽具有包含IL13Rα结合区和TGFβ结合区的双特异性CAR，所述第二多肽具有包含EGFRvIII结合区和GD2结合区的双特异性CAR。

在多个方面中提供了核酸，所述核酸包含序列，所述序列编码本文中公开的多肽，及其部分。核酸可包含RNA或DNA。在某些方面中，核酸是表达构建体。在一些方面中，表达构建体是载体。在某些方面中，载体是病毒载体。在一些特定的方面中，病毒载体是逆转录病毒载体或来源于逆转录病毒。在一些方面中，逆转录病毒载体包含慢病毒载体或来源于慢病毒。注意到，在某些方面中，病毒载体是整合核酸。另外，核酸可以是参与基因编辑的分子，使得编码CAR的核酸(例如指导RNA)用于将CAR编码序列并入到基因组(例如TRAC基因)的特定基因座中。这可涉及基因编辑系统，例如CRISPR/Cas9。在比对时，核酸、多核苷酸或多核苷酸区(或者多肽或多肽区)与另一序列具有一定百分比(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％--或其中可推导出的任何范围)的“序列同一性”或“同源性”，意味着在比较两个序列时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。比对和百分比同源性或序列同一性可使用本领域已知的软件程序来确定，所述软件程序例如在Ausubel etal.eds.(2007)Current Protocols in Molecular Biology中描述的那些。预期核酸可与本文中提供的任何核酸SEQ ID NO具有这样的序列同一性或同源性。

在另一些方面中，存在这样的细胞或细胞群体，其包含编码本文中讨论的任何多肽的全部或一部分的核酸。在某些方面中，细胞或细胞群体在其基因组内包含编码本文中所述的任何多肽的序列。这包括但不限于已整合到细胞基因组中的慢病毒或逆转录病毒。在一些方面中，细胞或细胞群体表达本文中讨论的任何CAR的全部或一部分，包括但不限于具有SEQ ID NO：1至147中任一者的氨基酸序列和/或包含其氨基酸序列的那些。其中引入了编码多肽的核酸的细胞之后代(F1、F2及以后)包括在本文公开的细胞或细胞群体中。在一些方面中，细胞或细胞群体是T细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞、自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT)、恒定自然杀伤T细胞(invariant natural killer Tcell，iNKT)、干细胞、淋巴样祖细胞、外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell，PBMC)、造血干细胞和祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell，HSPC)、造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)、CD34+细胞、外周血干细胞(peripheral bloodstem cell，PBSC)、骨髓细胞、胎儿肝细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS细胞)。一些具体方面涉及是T细胞或NK细胞的细胞。在一些方面中，T细胞包含初始记忆T细胞(

memory T cell)。在一些方面中，初始记忆T细胞包含CD4+或CD8+T细胞。在一些方面中，细胞是包含CD4+和CD8+T细胞二者的细胞群体。在一些方面中，细胞是包含初始记忆T细胞的细胞群体，所述初始记忆T细胞包含CD4+和CD8+T细胞。在一些方面中，T细胞包含来自CD14耗竭、CD25耗竭和/或CD62L富集的PBMC的群体的T细胞。

在一些方面中，本公开内容涉及包含一种或更多种本文中所述的多肽的细胞。在一些方面中，细胞是免疫细胞。在一些方面中，细胞是祖细胞或干细胞。在一些方面中，祖细胞或干细胞在体外分化为免疫细胞。在一些方面中，细胞是T细胞。在一些方面中，细胞是CD4+或CD8+T细胞。在一些方面中，细胞是自然杀伤细胞。在一些方面中，细胞是离体的。术语免疫细胞包含免疫系统的细胞，其参与机体针对感染性疾病和外来物质二者的防御。免疫细胞可包括例如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞(例如B细胞和T细胞)和单核细胞。T细胞可包括，例如CD4+、CD8+、T辅助细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、抑制性T细胞和自然杀伤T细胞。在一个具体方面中，T细胞是调节性T细胞。

在一些方面中，细胞群体包含10³至10⁸个细胞。在一些方面中，群体为约、为至少约或为至多约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²个细胞(或其中可推导出的任何范围)。在某些方面中，细胞对于将接受它们的患者而言是自体的。在另一些方面中，细胞不是自体的并且可以是同种异体的。

在本公开内容的一些方面中，方法方面涉及其中细胞被编码本公开内容的多肽的病毒感染。另一些方面涉及包含本公开内容的多肽和/或核酸的病毒。在一些方面中，病毒包含慢病毒或慢病毒来源的病毒或载体。在一些方面中，细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT)、干细胞、淋巴样祖细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓细胞、胎儿肝细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)。在一些方面中，细胞是T细胞或NK细胞。在一些方面中，T细胞包含初始记忆T细胞。在一些方面中，初始记忆T细胞包含CD4+或CD8+T细胞。在一些方面中，细胞还不是T细胞或NK细胞，所述方法还包括在促进细胞分化为T细胞或NK细胞的条件下培养细胞。在一些方面中，所述方法还包括在将核酸引入细胞之前和或之后在扩增细胞的条件下培养细胞。在一些方面中，将细胞用无血清培养基培养。

另外的方法涉及治疗患有胶质母细胞瘤的患者，其包括向患者施用有效量的组合物，所述组合物包含表达本公开内容的多肽的细胞群体。在一些方面中，患者患有复发性或复现性癌症。另一些方面包括向患者施用另外的治疗的步骤。如本文中所述，患者可以是已被诊断为患有胶质母细胞瘤和/或具有GD+或EGFRvIII+细胞的胶质母细胞瘤的患者。如本文中所述，患者可以是已被确定为患有胶质母细胞瘤和/或具有GD+或EGFRvIII+细胞的胶质母细胞瘤的患者。在一些方面中，对象是处于患有胶质母细胞瘤和/或GD2+或EGFRvIII+胶质母细胞瘤之风险中的对象。在一些方面中，患者先前已经针对癌症进行过治疗。在一些方面中，患者已被确定为对先前的治疗具有抗性。先前的治疗可以是本文中所述的癌症治疗，例如描述为另外的治疗的那些。另一些方面包括向患者施用化学治疗和/或放射的步骤。在一些方面中，另外的治疗包含免疫治疗。在一些方面中，另外的治疗包含本文中所述的另外的治疗。在一些方面中，免疫治疗包含免疫检查点抑制剂治疗。在一些方面中，免疫治疗包含本文中所述的免疫治疗。在一些方面中，免疫检查点抑制剂治疗包含PD-1抑制剂和/或CTLA-4抑制剂。在一些方面中，免疫检查点抑制剂治疗包含本文中所述的一种或更多种免疫检查点蛋白的一种或更多种抑制剂。

在一些方面中，癌症包含GD2+癌症，其中GD2+癌症是这样的癌症，其包含GD2+细胞或者包含肿瘤细胞群体中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％GD2+癌细胞。

在一些方面中，癌症包含EGFRvIII+癌症，其中EGFRvIII+癌症是这样的癌症，其包含EGFRvIII+细胞或者包含肿瘤细胞群体中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％EGFRvIII+癌细胞。

在一些方面中，癌症包含胶质母细胞瘤。本公开内容的CAR多肽可具有区域、结构域、接头、间隔区、或其的其他部分，其包含与本文中所述的氨基酸序列的全部或一部分具有至少、至多或恰好50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导出的任何范围)的氨基酸序列或者由其组成。在某些方面中，CAR多肽包含与SEQ ID NO：1至147中的任一者具有、具有至少、具有至多或恰好50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(或其中可推导出的任何范围)的氨基酸序列或者由其组成。

在本公开内容的一些方面中，该方法可包括刺激免疫应答，其中刺激免疫应答包含提高免疫刺激细胞因子和/或分子的表达和/或分泌。在一些方面中，免疫刺激细胞因子和/或分子是TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子中的一种或更多种。在一些方面中，刺激免疫应答包含提高免疫细胞的增殖。免疫细胞可以是T细胞。在一些方面中，细胞是离体的。细胞还可以在需要免疫刺激的对象体内。对象可以是产生内源性TGF-β和/或过量的内源性TGF-β的对象。本文中所述的表达或增殖的提高可以是相对于基线表达水平例如对照(无疾病、无TGF-β或无抗原结合多肽对照)的至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、500或1000倍提高。在一些方面中，一些方法用于治疗患有适应证的人，其中所述适应证的特征在于TGF-β的致病性表达水平。

对象可以是哺乳动物，例如人、大鼠、小鼠或非人灵长类。在一个具体方面中，对象是人。对象还可以是山羊、猪、马、猫或狗。本公开内容的组合物、多肽、细胞和核酸的施用途径可以是本文中所述的施用途径。在一些方面中，所述组合物经心室内、经脑室内、经瘤内、经静脉内施用或施用到肿瘤切除腔中。在一些方面中，所述组合物被配制成用于心室内、脑室内、瘤内或静脉内施用或者用于施用到肿瘤切除腔中。

在一些方面中，该方法还包括向对象施用TGF-β。在本公开内容的组合物中，该组合物可包含1至50ng/mL的TGF-β。在一些方面中，组合物包含至少、至多或约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100ng/mL的TGF-β(或其中可推导出的任何范围)。

在一些方面中，组合物还包含IL-2。在一些方面中，该组合物包含20至400U/mL的IL-2。在一些方面中，组合物包含至少、至多或约5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，205，210，215，220，225，230，235，240，245，250，255，260，265，270，275，280，285，290，295，300，305，310，315，320，325，330，335，340，345，350，355，360，365，370，375，380，385，390，395，400，405，410，415，420，425，430，435，440，445，450，455，460.465，470，475，480，485，490，495，500.505，510，515，520，525，530，535，540，545，550，555，560，565，570，575，580，585，590，595.600U/mL的IL-2(或其中可推导出的任何范围)。在一些方面中，该组合物还包含IL-15。在一些方面中，该组合物包含0.1至10ng/mL的IL-15。在一些方面中，组合物包含至少、至多或约0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50，0.55，0.60，0.65，0.70，0.75，0.80，0.85，0.90，0.95，1，00，1，05，1.10，1.15，1.20，1.25，1.30，1.35，1.40，1.45，1.50，1.55，1.60，1.65，1.70，1.75，1.80，1.85，1.90，1.95，2.00，2.05，2.10，2.15，220，2.25，2.30，2.35，2.40，2.45，2.50，2.55，2.60，2.65，2.70，2.75，2.80，2.85，2.90，2.95，3.00，3.05，3.10，3.15，3.20，3.25，3.30，3.35，3.40，3.45，3.50，3.55，3.60，3.65，3.70，3.75，3.80，3.85，3.90，3.95，4.00，4.05，4.10，4.15，4.20，4.25，4.30，4.35，4.40，4.45，4.50，4.55，4.60，4.65，4.70，4.75，4.80，4.85，490，495，5.00，5.05，5.10.5.15，5.20，5.25，5.30，5.35，5.40，5.45，5.50，5.55，5.60，5.65，5.70，5.75，580，5.85，5.90，5.95，6.00，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9，5，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，30，40或50ng/mL的IL-5(或其中可推导出的任何范围)。在一些方面中，组合物包含IL-7、IL-12和/或IL-21或还包含IL-7、IL-12和/或IL-21。在一些方面中，组合物包含至少、至多或约0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0，45，0.50，0.55，0.60，0.65，0.70，0.75.0.80，0.85，0，90，0.95，1.00，1.05，1.10，1.15，1.20，1.25，1.30，1.35，1.40，1.45，1.50，1.55，160，1.65，1.70，1.75，1.80，1.85，1.90，1.95，2.00，2.05，2.1002.15，2.20，2.25，2.30，235，2.40.2.45，2.50，2.55，2.60，2.65，2.70，2.75，2.80，2.85，2.90，2.95，3.00，3.05，3.10，3.15，320，3.25，3.30，3.35，3.40，3.45，3.50，3.55，3.60，3.65，3.70，3.75，3.80，3.85，3.90，3.95，4.00，4.05，4.10，4.15，4.20，4.25，4.30，4.35，4.40，4.45，4.50，4.55，4.60，465，4.70，4.75，480，485，490，495，5.00，5.05，5.10，5.15，5.20，5.25，5.30，5.35，540，5.45，5.50，5.55，5.60，5.65，5.70，5.75，580，5.85，5.90，5.95，6.00，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9，5，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，30，40，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，115，120，125，130，135，140，145，150，155，160，165，170，175，180，185，190，195，200，205，210，215，220，225，230，235，240，245，250，255，260，265，270，275，280，285，290，295，300，305，310，315，320，325，330，335，340，345，350，355，360365，370，375，380，385，390，395，400，405，410，415，420，425，430，435，440，445，450，455，460，465，470，475，480，485，490，495，500，505，510，515，520525，530，535，540545，550，555，560，565，570，575，580，585，590，595，600pg/mL，ng/mL，μg/mL或mg/ml的IL-7、IL-12和/或IL-21(或其中可推导出的任何范围)。

在一些方面中，所述方法还包括使细胞与饲养细胞接触。在一些方面中，对饲养细胞进行辐照。饲养细胞或支持细胞可包括例如成纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞、JK1细胞、SNL 76/7细胞、人胎儿皮肤细胞、人成纤维细胞和人包皮成纤维细胞。

在一些方面中，所述方法不包括使T细胞与饲养细胞接触。在一些情况下，排除的饲养细胞与T细胞来自不同的动物物种。

在某些方面中，本公开内容通篇描述的多肽是分离的，这意味着其未在细胞环境中发现。在一些情况中，多肽是纯化的，这意味着如果没有完全从多肽中分离，则大多数多肽具有不同的氨基酸序列和/或化学式。

在一些方面中，本公开内容提供了用于治疗患有癌症的对象的方法，其包括向对象施用有效量的细胞群体或药物组合物，所述细胞群体或药物组合物包含嵌合多肽或编码嵌合多肽的核酸。

“治疗”及其变化形式可以是指对哺乳动物中疾病的任何治疗，包括：(i)遏止(supress)疾病，即通过在诱发事件之后但在疾病的临床表现或再现之前施用保护性组合物使疾病的临床症状不发生；(ii)抑制疾病，即通过在临床症状最初出现之后施用保护性组合物来阻止临床症状的发展；和/或(iii)缓解疾病，即通过在临床症状最初出现之后施用保护性组合物使临床症状消退。在一些方面中，治疗可以排除疾病的预防。

可基于本文中所述的任何方法使用一种或更多种序列或组合物。本申请中通篇讨论了另一些方面和实施方案。关于本公开内容的一个方面讨论的任何实施方案或方面同样可应用于本公开内容的另一些方面，反之亦然。例如，本文中所述的方法中的任何步骤均可应用于任何其他方法。此外，本文中所述的任何方法均可排除任何步骤或步骤的组合。实施例部分中的实施方案应理解为是可应用于本文中所述技术的所有方面的实施方案。

特别预期了本文中所述的任何方法、组合物、细胞、多肽或核酸实施方案或方面可互换使用并彼此组合使用。此外，预期了本公开内容的一些实施方案和方面可特别地排除本文中所述的一些实施方案或方面。

在提供值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值，直至下限单位的十分之一，以及在该规定范围内的任何其他规定值或中间值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且也涵盖在本发明内，但要遵守规定范围内的任何明确排除的限制。当规定的范围包含一个或两个限制时，排除那些被包含的限制之一或二者的范围也包含在本发明中。

在本申请通篇，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的清晰且普通含义使用，以指示值包含用于确定该值所采用的装置或方法的误差的标准偏差。

当与术语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词的使用可意指“一个/种”，但是其也符合“一个/种或更多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义。

如本文中所用，术语“或/或者”和“和/或/或者”用于描述组合或相互排斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”，“x或(y和z)”或“x或y或z”。特别地预期x、y或z可被特别地排除在一个实施方案或方面之外。

词语“包含”(及其任何变化形式)、“具有”(及其任何变化形式)、“包括”(及其任何变化形式)、“特征为”(及其任何变化形式)或“含有”(及其任何变化形式)是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未记载的要素或方法步骤。

所述组合物和方法根据其用途可“包含/包括”在本说明书通篇公开的任何成分或步骤、“基本上由其组成”或“由其组成”。短语“由……组成”不包括任何未指定的要素、步骤或成分。短语“基本上由……组成”将所述主题的范围限制为指定的物质或步骤以及不实质影响其基本的和新的特征的那些物质或步骤。预期在术语“包含/包括”的上下文中所述的实施方案和方面也可在术语“由……组成”或“基本上由……组成”的上下文中实施。

特别预期了关于本发明的一个实施方案或方面所讨论的任何限制均可应用于本发明的任何另一个实施方案或方面。此外，本发明的任何组合物均可用于本发明的任何方法，并且本发明的任何方法均可用于产生或利用本发明的任何组合物。在实施例中阐述的实施方案的一些方面也是可在不同实施例中的其他地方或在本申请中的其他地方(例如在发明内容、具体实施方式、权利要求书和附图说明中)讨论的一些实施方案的背景下实施的实施方案。

通过以下详细描述，本发明的另一些目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，尽管具体实施方式和具体实施例指示了本发明的一些具体实施方案，但是它们仅以举例说明的方式给出，因为从该详细描述中，本发明的精神和范围内的多种变化和修改对本领域技术人员而言将变得明显。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一幅或更多幅，可更好地理解本发明。

图1：FLAG(CAR)表面表达(无抗原刺激)。示出了三次重复的平均值，其中误差棒表示±1标准偏差。每组的两个条从左至右表示SP和全IL13R构建体的数据。

图2A至2D：(2A)在21小时刺激之后的CD69活化标志物表达。(2B)在21小时刺激之后的CD25活化标志物表达。(2C)在21小时刺激之后的FLAG(CAR)表面表达。(2D)在21小时刺激之后的FLAG(CAR)表面表达。PBT106 NS是表达IL-13Rα2的肿瘤系。示出了三次重复的平均值，其中误差棒表示±1标准偏差。每组的三个条从左至右表示1)仅培养基；2)5ng/mLTGF-β；和3)100％IL13Rα2+PBT 106NS的数据。

图3A至3F：(3A至3B)在92小时共孵育之后的有生存力的肿瘤计数。(3C至3D)在92小时共孵育之后的有生存力的T细胞计数。(3E至3F)在92小时共孵育之后T细胞中的CTV稀释。将T细胞用CellTrace Violet(CTV)染料染色，该染料随着每次T细胞分裂而稀释。因此，CTV MFI越低，T细胞分裂的次数越多。示出了三次重复的平均值，误差棒表示±1标准偏差。每组的16个条从左至右表示以下的数据：1)SP-IL13Rα2.BBz；2)完整-IL13Rα2.BBz；3)SP-IL13Rα2/TGF-β.BBz；4)完整-IL13Rα2/TGF-β.BBz；5)SP-IL13Rα2.BBz KR；6)完整-IL13Rα2.BBz KR；7)SP-IL13Rα2/TGF-β.BBz KR；8)SP-IL13Rα2.28z；9)完整-IL13Rα2.28z；10)SP-IL13Rα2/TGF-β.28z；11)完整-IL13Rα2/TGF-β.28z；12)SP-IL13Rα2/TGF-β.BBz+GD2.AA.28z；13)完整-IL13Rα2/TGF-β.BBz+GD2.AA.28z；14)SP-IL13Rα2.BBz+TGF-βDNR；15)完整-IL13Rα2.BBz+TGF-βDNR和16)scFv-较少CAR。

图4.向NOD/scid/γ/(NSG)小鼠颅内植入2.5×10^5个稳定表达萤火虫荧光素酶的PBT106多形性胶质母细胞瘤(GBM)神经球细胞。在肿瘤注射之后7天，用0.5×10^6CAR+细胞处理荷瘤小鼠。通过生物发光成像监测肿瘤进展。每条迹线代表一只小鼠，其中“x”标记达到人道终点的小鼠的处死时间。生存以卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curve)示出。

具体实施方式

I.定义

本公开内容的肽涉及包含嵌合抗原受体或CAR的肽。CAR是经改造的受体，其能够将任意特异性植入到免疫效应细胞上。在一些情况中，这些受体用于将单克隆抗体的特异性植入到T细胞上。受体被称为嵌合的，因为其由来自不同来源的部分构成。

当涉及基因产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。

“同源性”或“同一性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可通过比较每个序列中的位置来确定同一性，所述序列可出于比较目的而对齐。当比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置共有序列同一性。序列之间的同一性程度是序列共有的匹配或同源位置数目的函数。“无关”或“非同源”序列与本公开内容的序列之一共有小于60％的同一性，小于50％的同一性，小于40％的同一性，小于30％的同一性或小于25％的同一性。

如本文中所用，术语“氨基近端”、“N端”、“氨基端”等用于指多肽区域的顺序。此外，当某物在区域的N端或氨基近端时，其不一定在整个多肽的末端(或端部)，而仅在该区域或结构域的N端。类似地，如本文中所用，术语“羧基近端”、“C端”、“羧基端”等用于指多肽区域的顺序，并且当某物在区域的C端或羧基近端时，其不一定在整个多肽的末端(或端部)，而是仅在该区域或结构域的C端。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的一些非限制性实例：基因或基因片段(例如探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核昔酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可在多核苷酸组装之前或之后赋予核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合之后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语也指双链和单链分子二者。除非另有说明或要求，否则本发明的作为多核苷酸的任何实施方案或方面既涵盖双链形式，也涵盖已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式中的每一个。

“编码”特定蛋白质的“基因”、“多核苷酸”、“编码区”、“序列”、“区段”、“片段”或“转基因”是当在适当调节序列的控制下时在体外或体内被转录并任选地还翻译成基因产物(例如多肽)的核酸分子。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA形式存在。当以DNA形式存在时，核酸分子可以是单链(即有义链)或双链。编码区的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。基因可包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列和合成DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3’。

术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体和抗体片段，其可以是人的、小鼠的、人源化的、嵌合的或来源于其他物种。“单克隆抗体”是从针对特定抗原位点的基本上均质的抗体群获得的抗体。

“抗体或其功能性片段”意指与特定抗原或表位特异性结合或者与其进行免疫反应的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体二者。术语抗体包括免疫球蛋白的经遗传改造或以其他方式修饰的形式，例如胞内抗体(intrabody)、肽抗体(peptibody)、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和杂缀合抗体(heteroconjugate antibody)(例如双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体)。术语功能性抗体片段包括抗体的抗原结合片段，包括例如Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rlgG和scFv片段。术语scFv是指单链Fv抗体，其中传统双链抗体的重链和轻链的可变结构域已连接形成一条链。

如本文中所用，术语“结合亲和力”是指两种物质的可逆结合的平衡常数，并表示为解离常数(Kd)。结合亲和力可比抗体对不相关氨基酸序列的结合亲和力大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、或者大至少1000倍或更多倍(或其中可推导出的任何范围)。如本文中所用，术语“亲合力”是指两种或更多种物质的复合物在稀释之后对解离的抗性。术语“免疫反应性”和“优先结合”在本文中关于抗体和/或抗原结合片段可互换使用。

术语“结合”是指由于例如共价的、静电的、疏水的和离子的和/或氢键的相互作用，包括例如盐桥和水桥的相互作用，在两个分子之间的直接缔合。

“个体”、“对象”和“患者”可互换使用，并且可指人或非人。

术语“降低/减少(lower)”、“降低的/减少的(reduced)”、“降低/减少(reduction)”、“减少/降低(decrease)”或“抑制”在本文中均一般用于意指统计学上显著量的减少。然而，为了避免疑问，“降低/减少”、“降低的/减少的”、“降低/减少”、“减少/降低”或“抑制”意指与参照水平相比至少10％的减少/降低，例如与参照水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或者多至并且包括100％(即，与参照样品相比不存在的水平)的减少/降低、或者10％至100％之间的任意减少/降低。

术语“增加的/提高的(increased)”、“增加/提高(increase)”、“增强(enhance)”或“激活/活化(activate)”在本文中均一般用于意指统计学上显著量的增加；为了避免疑问，术语“增加的/提高的”、“增加/提高”、“增强”或“激活/活化”意指与参照水平相比至少10％的增加/提高，例如与参照水平相比至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或者多至并且包括100％的增加/提高或者10％至100％之间的任意增加/提高，或者与参照水平相比，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加/提高，或者2倍至10倍或更高的任意增加/提高。

II.多肽

A.信号肽

本公开内容的多肽可包含信号肽。“信号肽”是指引导蛋白质在细胞内转运和定位(例如，至某个细胞器(例如内质网)和/或细胞表面)的肽序列。在一些方面中，信号肽将新生蛋白引导至内质网中。如果受体要被糖基化并锚定在细胞膜中，则这是必不可少的。一般而言，使用天然连接到最氨基端组分的信号肽(例如，在具有轻链-接头-重链取向的scFv中，使用轻链的天然信号)。

在一些方面中，信号肽在通过内质网(endoplasmic reticulum，ER)之后被切割，即，是可切割的信号肽。在一些方面中，限制位点位于信号肽的羧基末端以促进切割。

B.抗原结合结构域

本公开内容的多肽可包含一个或更多个抗原结合结构域。“抗原结合结构域”描述了在适当条件下能够结合抗原的多肽区域。在一些方面中，抗原结合结构域是基于一种或更多种抗体(例如，CD20抗体)的单链可变片段(scFv)。在一些方面中，抗原结合结构域包含重可变(VH)区和轻可变(VL)区，其中VH和VL区位于同一多肽上。在一些方面中，抗原结合结构域在VH与VL区之间包含接头。接头可使抗原结合结构域能够形成用于抗原结合的期望结构。

本公开内容的多肽的抗原结合结构域的可变区可通过使VH和/或VL CDR 1、CDR 2和/或CDR 3区内的氨基酸残基突变来进行修饰，以改善抗体的一种或更多种结合特性(例如亲和力)。术语“CDR”是指互补决定区，其基于分别由B细胞和T细胞产生的免疫球蛋白(抗体)和T细胞受体中的可变链的一部分，其中这些分子结合其特异性抗原。由于与免疫球蛋白和T细胞受体相关的大多数序列变异存在于CDR中，因此有时将这些区域称为高变区。突变可通过定点诱变或PCR介导的诱变引入，并且对抗体结合或其他目的功能特性的影响可在适当的体外或体内测定中进行评价。优选地，引入保守的修饰，并且通常改变CDR区域内的不超过1、2、3、4或5个残基。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失。

可对抗体进行框架修饰以降低免疫原性，例如，通过将一个或更多个框架残基“回复突变”为相应的种系序列。

还预期了通过使抗原结合结构域与结合同一抗原(多价)或不同抗原(多特异性)的VH和VL区对多聚，抗原结合结构域可以是多特异性或多价的。

抗原结合区例如可变区(重链和/或轻链可变区)或CDR的结合亲和力可为至少10^- ⁵M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10-¹³M。在一些方面中，抗原结合区例如可变区(重链和/或轻链可变区)或CDR的KD可为至少10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10^-13M(或其中可推导出的任何范围)。

结合亲和力、KA或KD可通过本领域已知的方法来确定，例如通过基于表面等离振子共振(surface plasmon resonance，SRP)的生物传感器，通过动力学排斥测定(kineticexclusion assay，KinExA)，通过基于偏振调制斜入射反射差(oblique-incidencerefiectivity difference，OI-RD)用于微阵列检测的光学扫描仪，或通过ELISA。

在一些方面中，与包含非人源化结合区(例如来自小鼠的结合区)的多肽相比，包含人源化结合区的多肽在宿主细胞中具有相等、更好或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、104％、106％、106％、108％、109％、110％、115％或120％的结合亲和力和/或表达水平。

在一些方面中，相对于小鼠框架，人框架的框架区(例如FR1、FR2、FR3和/或FR4)可各自或共同具有至少、至多或恰好1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，344，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199或200个(或其中可推导出的任何范围)氨基酸替换、连续氨基酸添加或连续氨基酸缺失。

在一些方面中，相对于人框架，小鼠框架的框架区(例如FR1、FR2、FR3和/或FR4)可各自或共同具有至少、至多或恰好1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199或200个(或其中可推导出的任何范围)氨基酸替换、连续氨基酸添加或连续氨基酸缺失。

替换可在重链或轻链可变区的FR1、FR2、FR3或FR4的第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99或100位。

C.肽间隔区

肽间隔区，例如胞外间隔区可将抗原结合结构域连接至跨膜结构域。在一些方面中，肽间隔区具有足够的柔性以允许抗原结合结构域以不同方向取向以促进抗原结合。在一个方面中，间隔区包含来自IgG的铰链区。在一些方面中，间隔区包含或还包含免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。在一些方面中，CH2CH3区可具有L235E/N297Q或L235D/N297Q修饰，或与CH2CH3区具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列同一性。在一些方面中，间隔区来自IgG4。胞外间隔区可包含铰链区。

如本文中所用，术语“铰链”是指提供结构柔性和分隔侧翼多肽区域的柔性多肽连接区(本文中也称为“铰链区”)，并且可由天然或合成多肽组成。来源于免疫球蛋白(例如，IgG1)的“铰链”通常被定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.，22：161-206)。通过将形成重链间二硫键(S-S)的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对。铰链区可以是天然存在的或非天然存在的，包括但不限于如美国专利No.5，677，425(通过引用并入本文)中描述的改变的铰链区。铰链区可包含来源于与CH1结构域的抗体不同类别或亚类的抗体的完整铰链区。术语“铰链”还可包含来源于CD8以及在提供柔性和分隔侧翼区域方面提供类似功能的其他受体。

胞外间隔区的长度可为至少、至多或恰好4，5，6，7，8，9，10，12，15，16，17，18，19，20，20，25，30，35，40，45，50，75，100，110，119，120，130，140，150，160，170，180，190，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238.239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，260，270，280，290，300，325、350或400个氨基酸(或其中可推导出的任何范围)。在一些方面中，胞外间隔区由来自免疫球蛋白(例如IgG)的铰链区组成或包含来自免疫球蛋白(例如IgG)的铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列是本领域已知的；参见例如Tan et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：162；和Huck et al.(1986)Nucl.Acids Res。

胞外间隔区的长度可影响CAR的信号传导活性和/或响应于抗原刺激的CAR信号传导的CAR-T细胞的扩增特性。在一些方面中，使用了较短的间隔区，例如少于50、45、40、30、35、30、25、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。在一些方案中，较长的间隔区，例如至少50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，260，270，280或290个氨基酸的那些可具有提高的体内或体外扩增的优势。

作为非限制性实例，免疫球蛋白铰链区可包括以下氨基酸序列之一：

表：示例性铰链区

序列	SEQ ID NO：
		DKTHT	70
CPPC	71
		CPEPKSCDTPPPCPR	72
ELKTPLGDTTHT	73
		KSCDKTHTCP	74
KCCVDCP	75
		KYGPPCP	76
EPKSCDKTHTCPPCP	77
		ELKTPLGDTTHTCPRCP	78
SPNMVPHAHHAQ	79
		ESKYGPPCPPCP	80
EPKSCDKTYTCPPCP	81

胞外间隔区可包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、铰链区的氨基酸序列。与野生型(天然存在的)铰链区相比，胞外间隔区还可包含一个或更多个氨基酸替换和/或插入和/或缺失。例如，人IgG1铰链的His229可被Tyr替换，使得铰链区包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQID NO：81)。

胞外间隔区可包含来源于人CD8的氨基酸序列；例如，铰链区可包含氨基酸序列：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO：82)或其变体。

胞外间隔区可包含CH2区或还包含CH2区。示例性CH2区是

(SEQ ID NO：83)。胞外间隔区可包含CH3区或还包含CH3区。示例性CH3区是

(SEQ ID NO：84)。

当胞外间隔区包含多个部分时，在多个部分之间的任何地方可存在0至50个氨基酸。例如，在铰链与CH2或CH3区之间或在CH2与CH3区之间(当二者都存在时)，可存在至少、至多或恰好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸(或其中可推导出的任何范围)。在一些方面中，胞外间隔区基本上由铰链、CH2和/或CH3区组成，这意味着铰链、CH2和/或CH3区是存在的仅有的可鉴别区域，并且排除了所有其他结构域或区域，但是还可能存在不是可鉴别区域的一部分的氨基酸。

D.跨膜结构域

本公开内容的多肽可包含跨膜结构域。在一些方面中，跨膜结构域是跨越膜的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域可导致不同的受体稳定性。

在一些方面中，跨膜结构域插入在胞外间隔区与胞质区之间。在一些方面中，跨膜结构域插入在胞外间隔区与一个或更多个共刺激区之间。在一些方面中，接头位于跨膜结构域与一个或更多个共刺激区之间。

提供将多肽插入真核(例如哺乳动物)细胞的细胞膜中的任何跨膜结构域都可适合于使用。在一些方面中，跨膜结构域来源于CD28、CD8、CD4、CD3-ζ、CD134或CD7。

可用于本公开内容的任何方面的示例性跨膜结构域包括下表中的那些：

表：示例性跨膜结构域序列

E.胞质区

在抗原识别之后，本公开内容的受体可聚集并且信号通过胞质区传递到细胞。在一些方面中，本文中所述的共刺激结构域是胞质区的一部分。在一些方面中，胞质区包含胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域可包含初级信号传导结构域和一个或更多个共刺激结构域。

适用于本公开内容的多肽的胞质区和/或共刺激区包括任何所期望的信号传导结构域，其响应于通过抗原与抗原结合结构域结合的激活而提供不同且可检测的信号(例如，通过细胞一种或更多种细胞因子的产生提高；靶基因转录的变化；蛋白质活性的变化；细胞行为的变化，例如细胞死亡；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导应答的调节等)。在一些方面中，胞质区包含至少一个(例如一个、两个、三个、四个、五个、六个等)如本文中所述的ITAM基序。在一些方面中，胞质区包含DAP10/CD28型信号传导链。

适用于本公开内容的多肽的胞质区包括包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的胞内信号传导多肽。ITAM基序是YX1X2(L/I)，其中X1和X2独立地为任何氨基酸。在一些情况下，胞质区包含1、2、3、4或5个ITAM基序。在一些情况下，ITAM基序在胞内结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一和第二个实例彼此由6至8个氨基酸隔开，例如(YX1X2(L/I))(X3)n(YX1X2(L/I))，其中n为6至8的整数，并且6至8个X3各自可以是任何氨基酸。

合适的胞质区可以是来源于含ITAM基序多肽的含ITAM基序部分。例如，合适的胞质区可以是来自任何含ITAM基序蛋白质的含ITAM基序结构域。因此，合适的胞内结构域无需包含其所来源的整个蛋白质的整个序列。合适的含ITAM基序多肽的一些实例包括但不限于：DAP12、DAP10、FCER1G(Fcε受体Iγ链)；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD3-ζ；和CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。

示例性胞质区是本领域已知的。下面所示的胞质区还提供了可并入本公开内容的CAR中的区域的实例：

在一些方面中，合适的胞质区可包含全长DAP12氨基酸序列的含ITAM基序部分。在一些方面中，胞质区来源于FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ-链；fc-εRl-γ；fcRγ；fceRIγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体；高亲和力γ链等)。在一些方面中，合适的胞质区可包含全长FCER1G氨基酸序列的含ITAM基序部分。

在一些方面中，胞质区来源于T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-δ；T3D；CD3抗原，δ亚基；CD3δ；CD3δ；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合物)；OKT3，δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链等)。在一些方面中，合适的胞质区可包含全长CD3δ氨基酸序列的含ITAM基序部分。在一些方面中，胞质区来源于T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、CD3ε；T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3-ε、T3e等)。在一些方面中，合适的胞质区可包含全长CD3ε氨基酸序列的含ITAM基序部分。在一些方面中，胞质区来源于T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、CD3γ、T细胞受体T3γ链、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。在一些方面中，合适的胞质区可包含全长CD3γ氨基酸序列的含ITAM基序部分。在一些方面中，胞质区来源于T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、CD3ζ、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一些方面中，合适的胞质区可包含全长CD3ζ氨基酸序列的含ITAM基序部分。

在一些方面中，胞质区来源于CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白；等)。在一些方面中，合适的胞质区可包含全长CD79A氨基酸序列的含ITAM基序部分。

具体的示例性胞质区在本领域中是已知的并且在下表中进一步示出。

表：胞质区

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F.共刺激区

合适的共刺激区(例如包括在胞质区中的那些)的一些非限制性实例包括但不限于来自4-lBB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR和HVEM的多肽。

共刺激区可具有至少、至多或恰好20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或300个氨基酸或其中可推导出的任何范围的长度。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白4-1BB(也称为TNFRSF9；CD137；CDwl37；ILA；等)的胞内部分。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白CD28(也称为Tp44)的胞内部分。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白ICOS(也称为AILIM、CD278和CVID1)的胞内部分。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白OX-40(也称为TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX40、TXGP1L)的胞内部分。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白BTLA(也称为BTLA1和CD272)的胞内部分。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白CD27(也称为S 152、T14、TNFRSF7和Tp55)的胞内部分。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白CD30(也称为TNFRSF8、D1S166E和Ki-1)的胞内部分。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357和GITR-D)的胞内部分。在一些方面中，共刺激区来源于跨膜蛋白HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR和TR2)的胞内部分。

具体示例性共刺激结构域由以下氨基酸序列表示：

表：共刺激结构域

G.检测肽

在一些方面中，本文中所述的多肽还可包含检测肽。合适的检测肽包括血细胞凝聚素(hemagglutinin，HA；例如，YPYDVPDYA(SEQ ID NO：122)；FLAG(例如，DYKDDDDK(SEQ IDNO：3))；c-myc(例如，EQKLISEEDL；(SEQ ID NO：123)))等。其他合适的检测肽是本领域已知的。

H.肽接头

在一些方面中，本公开内容的多肽包括肽接头(有时称为接头)。可使用肽接头来隔开任何本文中所述的肽结构域/区。例如，接头可在信号肽与抗原结合结构域之间、抗原结合结构域的VH与VL之间、抗原结合结构域与肽间隔区之间、肽间隔区与跨膜结构域之间、侧接共刺激区或在共刺激区的N-或C-区上、和/或在跨膜结构域与胞内结构域之间。肽接头可具有多种氨基酸序列中的任一种。结构域和区可通过一般具有柔性性质的肽接头连接，但是不排除其他化学键联。接头可以是长度为约6至约40个氨基酸、或长度为约6至约25个氨基酸的肽。这些接头可通过使用合成的编码接头的寡核苷酸来偶联蛋白质而产生。

可使用具有一定柔性程度的肽接头。肽接头实际上可具有任何氨基酸序列，应记住合适的肽接头将具有导致一般柔性肽的序列。使用小氨基酸(例如甘氨酸和丙氨酸)以用于产生柔性肽。这样的序列的产生对于本领域技术人员是常规的。

合适的接头可容易地选择并且可具有任何合适的长度，例如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

合适的接头可容易地选择并且可具有任何合适的不同长度，例如1个氨基酸(例如Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(G4S)n和(GGGS)n，其中n是至少1的整数。在一些方面中，n是至少、至多、或者恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)。甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。可使用甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物；Gly和Ser二者均是相对未结构化的，并且因此可充当组分之间的中性链(tether)。可使用甘氨酸聚合物；甘氨酸比甚至丙氨酸获得显著更多的phi-psi空间，并且比具有更长侧链的残基的限制少得多。示例性的间隔区可包含氨基酸序列，其包括但不限于GGSG(SEQ ID NO：125)，GGSGG(SEQ ID NO：126)，GSGSG(SEQ ID NO：127)，GSGGG(SEQ ID NO：128)，GGGSG(SEQID NO：129)，GSSSG(SEQ ID NO：124)，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：28等。在一些方面中，接头包含重复，例如SEQ ID NO：124至129、10和28中的一个或更多个的连续重复，例如包含对应于SEQ ID NO：124至129、10和28中的一者重复至少、至多或恰好2、3、4、5、6、7、8、9或10次(或其中可推导出的任何范围)的氨基酸序列的接头。

在另一些方面中，接头包含(EAAAK)n(SEQ ID NO：130)，其中n是至少1的整数。在一些方面中，n是至少、至多、或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10(或其中可推导出的任何范围)。

I.治疗性对照

在本文中所述的方法和组合物的一些方面中，CAR分子与治疗性对照共表达。

治疗性对照调节细胞增殖，促进细胞选择(例如选择表达本发明的嵌合抗原受体的细胞)或其组合。在一个方面中，调节细胞增殖包括上调细胞增殖以促进细胞繁殖。在另一个方面中，调节细胞增殖包括下调细胞增殖以降低或抑制细胞繁殖。在一些方面中，用作治疗性对照的药剂可促进细胞的富集，所述细胞表达可导致治疗性优势的嵌合抗原受体。在一些方面中，用作治疗性对照的药剂可与另外的组合物进行生化相互作用以调节治疗性对照的功能。例如，EGFRt(治疗性对照)可与西妥昔单抗进行生化相互作用以调节EGFRt在选择、追踪、细胞消融、或其组合中的功能。

示例性的治疗性对照包括截短的表皮生长因子受体(truncated epidermalgrowth factor receptor，EGFRt)、嵌合细胞因子受体(chimeric cytokine receptor，CCR)和/或二羟基叶酸受体(dihydroxyfolate receptor，DHFR)(例如，突变DHFR)。可通过IRES序列或通过编码可切割接头的多核苷酸序列来连接编码CAR和治疗性对照的多核苷酸。构建本发明的CAR，使得其可在细胞中表达，所述细胞继而响应于至少一种与至少一种抗原特异性靶向区相互作用的分子(例如抗原)的存在而增殖。在另一些方面中，治疗性对照包含细胞表面蛋白，其中所述蛋白缺乏胞内信号传导结构域。预期可使用缺乏胞内信号传导或经修饰(例如通过截短)以缺乏胞内信号传导的任何细胞表面蛋白。治疗性对照的另一些实例包括截短的LNGFR、截短的CD19等，其中截短的蛋白质缺乏胞内信号传导结构域。

如本文所用的“共表达”是指两个或更多个基因的同时表达。基因可以是编码例如单个蛋白或作为单个多肽链的嵌合蛋白的核酸。例如，本公开内容的CAR可与治疗性对照(例如，截短的表皮生长因子(EGFRt))共表达，其中CAR由第一多核苷酸链编码并且治疗性对照由第二多核苷酸链编码。在一个方面中，第一和第二多核苷酸链通过编码可切割接头的核酸序列连接。编码CAR和治疗性对照系统的多核苷酸可通过IRES序列连接。或者，CAR和治疗性对照由不通过接头连接而是由例如两个不同的载体编码的两个不同的多核苷酸编码。此外，本公开内容的CAR可与治疗性对照和CCR、治疗性对照和DHFR(例如突变DHFR)或治疗性对照以及CCR和DHFR(例如突变DHFR)共表达。CAR、治疗性对照和CCR可分别由第一、第二和第三多核苷酸序列共表达并编码，其中第一、第二和第三多核苷酸序列通过IRES序列或编码可切割接头(例如，T2A)的序列连接。或者，这些序列不通过接头连接，而是通过例如不同的载体编码。CAR、治疗性对照和DHFR(例如突变DHFR)可分别由第一、第二和第四多核苷酸序列共表达并编码，其中第一、第二和第四多核苷酸序列通过IRES序列或通过编码可切割接头的序列连接。或者，这些序列不通过接头连接，而是通过例如不同的载体编码。CAR、治疗性对照、CCR和DHFR(例如突变DHFR)可分别由第一、第二、第三和第四多核苷酸序列共表达并编码，其中第一、第二、第三和第四多核苷酸序列通过IRES序列或编码可切割接头的序列连接。或者，这些序列不通过接头连接，而是通过例如不同的载体编码。如果前述序列由不同的载体编码，则这些载体可同时或依次进行转染。

用于本公开内容的组合物的治疗性对照、CAR分子和使用方法的另一些方面可见于美国专利No.：9447194中，其出于所有目的通过引用并入本文。

J.另外的修饰和多肽增强

另外，本公开内容的多肽可以是经化学修饰的。可改变多肽的糖基化，例如，通过修饰多肽序列内的一个或更多个糖基化位点以提高多肽对抗原的亲和力(美国专利No.5,714,350和6,350,861)。

预期本公开内容的多肽的区域或片段可相对于SEQ ID NO：1至147中任一者具有、具有至少或具有至多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200个或更多个氨基酸替换、连续氨基酸添加、或连续氨基酸缺失。或者，本公开内容的多肽的区域或片段可具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：与SEQ ID NO：1至147中任一者具有、具有至少、或具有至多50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(或其中可推导出的任何范围)同一性。此外，在一些方面中，区域或片段包含在SEQ ID NO：1至147中任一者中起始于第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，60；361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476.477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500位(其中第1位处于SEQ ID NO的N端)的具有4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330.331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500个或更多个连续氨基酸的氨基酸区域。本公开内容的多肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个或更多个变体氨基酸，或者本公开内容的多肽可与SEQ ID NO：1至147中任一者的至少、或至多3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15.16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，300，400，500，550，600个或更多个连续氨基酸、或其中可推导出的任何范围的连续氨基酸具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相似性、同一性或同源性。

本公开内容的多肽可包含至少、至多、或恰好1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，39i，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500，501，502，503，504，505，506，507，508，509，510，511，512，513，514，515，516，517，518，519，520，521，522，523，524，525，526，527，528，529，530，531，532，533，534，535，536，537，538，539，540，541，542，543，544，545，546，547，548，549，550，551，552，553，554，555，556，557，558，559，560，561，562，563，564，565，566，567，568，569，570，571，572，573，574，575，576，577，578，579，580，581，582，583，584，585，586，587，588，589，590，591，592，593，594，595，596，597，598，599，600，601，602，603，604，605，606，607，608，609，610，611，612，613，614或615(或其中可推导出的任何范围)个替换。

替换可在SEQ ID NO：1至147中任一者的第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283，284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296，297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348，349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361，362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374，375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387，388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400，401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439，440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452，453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465，466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478，479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491，492，493，494，495，496，497，498，499，500，501，502，503，504，505，506，507，508，509，510，511，512，513，514，515，516，517，518，519，520，521，522，523，524，525，526，527，528，529，530，531，532，533，534，535，536，537，538，539，540，541，542，543，544，545，546，547，548，549，550，551，552，553，554，555，556，557，558，559，560，561，562，563，564，565，566，567，568，569，570，571，572，573，574，575，576，577，578，579，580，581，582，583，584，585，586，587，588，589，590，591，592，593，594，595，596，597，598，599，600，601，602，603，604，605，606，607，608，609，610，611，612，613，614或650(或其中可推导出的任何范围)位氨基酸处，并且可以是用任何氨基酸进行的替换，或者可以是用丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸进行的替换。

本文中所述的多肽的固定长度可为至少、至多或恰好5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，300，400，500，550，1000(或其中可推导出的任何范围)个或更多个氨基酸。

替换变体通常包含在蛋白质内的一个或更多个位点处一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可设计成在丧失或不丧失其他功能或特性的情况下调节多肽的一种或更多种性质。替换可以是保守的，也就是说，一个氨基酸被一个相似形状和电荷的氨基酸替代。保守替换是本领域公知的并且包括，例如，以下改变：丙氨酸到丝氨酸；精氨酸到赖氨酸；天冬酰胺到谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸到谷氨酸；半胱氨酸到丝氨酸；谷氨酰胺到天冬酰胺；谷氨酸到天冬氨酸；甘氨酸到脯氨酸；组氨酸到天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸到亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸到缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸到精氨酸；甲硫氨酸到亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸到酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸到苏氨酸；苏氨酸到丝氨酸；色氨酸到酪氨酸；酪氨酸到色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸到异亮氨酸或亮氨酸。或者，替换可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守的改变通常包括将残基用化学上相异的残基替换，例如用极性或带电荷的氨基酸替换非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。

蛋白质可以是重组的或体外合成的。或者，非重组或重组蛋白质可从细菌分离。还预期包含这样变体的细菌可应用于组合物和方法中。因此，不需要分离蛋白质。

如本文中所用，术语“功能等同的密码子”是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六个密码子，并且也指编码生物学等同的氨基酸的密码子。

还将理解的是，氨基酸和核酸序列可分别包含另外的残基，例如另外的N-或C-端氨基酸，或者5’或3’序列，并且仍然基本上如本文中所公开的一个序列所示，只要序列符合以上提出的标准即可，所述标准包括在涉及蛋白质表达的情况下，维持生物学蛋白质活性。末端序列的添加特别适用于这样的核酸序列，其可例如包括位于编码区的5’或3’部分侧翼的多个非编码序列。

以下是基于改变蛋白质的氨基酸以产生等同的或甚至改善的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可替换蛋白质结构中的其他氨基酸，而不明显损失相互作用结合能力。结构，例如如酶催化结构域或相互作用组分可具有被替换以维持这样的功能的氨基酸。由于限定蛋白质的生物学功能活性的是该蛋白质的相互作用能力和性质，因此可在蛋白质序列及其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸替换，并且尽管如此仍产生具有相似特性的蛋白质。因此，本发明人预期，可在基因的DNA序列中做出多种改变而不明显损失其生物学效用或活性。

在另一些方面中，通过引入一个或更多个替换来实现多肽功能的改变。例如，某些氨基酸可替换蛋白质结构中的其他氨基酸，以改变相互作用组分的相互作用结合能力。结构，例如如蛋白质相互作用结构域、核酸相互作用结构域和催化位点可具有被替换以改变这样的功能的氨基酸。由于决定蛋白质的生物学功能活性的是该蛋白质的相互作用能力和性质，因此可在蛋白质序列及其基础DNA编码序列中进行某些氨基酸替换，并且尽管如此仍产生具有不同特性的蛋白质。因此，本发明人预期，可在基因的DNA序列中做出多种改变而不明显改变其生物学效用或活性。

在进行这样的变化时，可考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。氨基酸亲水指数在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常理解的(Kyte andDoolittle，1982)。公认的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，其转而限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。

本领域中还应理解的是，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。美国专利4,554,101(通过引用并入本文)声称：蛋白质的最大局部平均亲水性(如受其邻近氨基酸的亲水性控制)与蛋白质的生物学特性相关。应理解的是，氨基酸可替换具有相似亲水性值的另一氨基酸，并且仍产生生物学上等同和免疫上等同的蛋白质。

如以上所概括的，氨基酸替换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、尺寸等。将多个前述特征考虑在内的示例性替换是公知的，并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

在一些具体的方面中，全部或部分本文中所述蛋白质也可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。多种自动合成仪可商购获得并且可根据已知的方案使用。参见，例如，Stewart and Young(1984)；Tam et al.，(1983)；Merrifield，(1986)；和Barany andMerrifield(1979)，其各自通过引用并入本文。或者，可使用重组DNA技术，其中将编码肽或多肽的核苷酸序列插入表达载体中，转化或转染到适当的宿主细胞中，并在适合表达的条件下培养。

一个方面包括将基因转移至细胞(包括微生物)以用于产生和/或呈递蛋白质的用途。可将目的蛋白的基因转移到适当的宿主细胞中，随后在适当的条件下培养细胞。可使用编码几乎任何多肽的核酸。本文中讨论了重组表达载体的产生以及其中包含的元件。或者，待产生的蛋白质可以是通常由用于蛋白质产生的细胞合成的内源性蛋白质。

III.细胞

某些方面涉及包含本公开内容的多肽或核酸的细胞。在一些方面中，细胞是免疫细胞或T细胞。“T细胞”包括所有类型的表达CD3的免疫细胞，包括T辅助细胞、恒定自然杀伤T(iNKT)细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(T-regulatory cell，Treg)γ-δT细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞。T细胞可指CD4+或CD8+T细胞。

合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)No.CCL-2)、CHO细胞(例如ATCC No.CRL9618、CCL61、CRL9096)、人胚肾(human embryonic kidney，HEK)293细胞(例如ATCC No.CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如ATCC No.CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如ATCC No.CCL10)、PC12细胞(ATCCNo.CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)、RATI细胞、小鼠L细胞(ATCCNo.CCLI.3)、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如，NKL、NK92和YTS)等。

在一些情况下，细胞不是永生化细胞系，而是从个体获得的细胞(例如，原代细胞)。例如，在一些情况下，细胞是从个体获得的免疫细胞。作为一个实例，细胞是从个体获得的T淋巴细胞。作为另一个实例，细胞是从个体获得的细胞毒性细胞。作为另一个实例，细胞是从个体获得的干细胞(例如，外周血干细胞)或祖细胞。

IV.用于修饰基因组DNA的方法

在某些方面中，对基因组DNA进行修饰以包含另外的突变、插入或缺失，或者以整合本公开内容的某些分子构建体，使得该构建体从基因组DNA表达。在一些方面中，将编码本公开内容的多肽的核酸整合到细胞的基因组DNA中。在一些方面中，核酸通过病毒转导整合到细胞中，例如通过慢病毒或逆转录病毒转导进行的基因转移。在一些方面中，通过逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体将编码本公开内容的多肽(例如，CAR)的核酸整合到宿主细胞的基因组中来修饰基因组DNA。

在一些方面中，整合是靶向整合。在一些方面中，靶向整合通过使用DNA消化剂/多核苷酸修饰酶例如位点特异性重组酶和/或靶向内切核酸酶来实现。术语“DNA消化剂”是指能够切割核酸的核苷酸亚基之间的键(即磷酸二酯键)的试剂。一个特异性靶标是TRAC(T细胞受体α恒定(T cell receptor alpha constant))基因座。例如，首先，将用由与靶向TRAC(T细胞受体α恒定)基因座的单指导RNA(single-guide RNA，sgRNA)复合的Cas9蛋白组成的核糖核蛋白(RNP)复合物对细胞进行电穿孔。电穿孔之后十五分钟，将用携带编码CAR的HDR模板的AAV6处理细胞。在另一个实例中，双链或单链DNA包含HDR模板并通过电穿孔与RNP复合物一起被引入到细胞中。

因此，一方面，本公开内容包括靶向整合。实现此的一种方式是通过使用外源核酸序列(即，着陆垫(1anding pad))，其包含至少一种多核苷酸修饰酶，例如位点特异性重组酶和/或靶向内切核酸酶的至少一种识别序列。位点特异性重组酶是本领域公知的，并且通常可被称为转化酶、解离酶或整合酶。位点特异性重组酶的一些非限制性实例可包括λ整合酶、Cre重组酶、FLP重组酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶、ΦC31整合酶、Bxb1整合酶和R4整合酶。位点特异性重组酶识别特异性识别序列(或识别位点)或其变体，所有这些都是本领域公知的。例如，Cre重组酶识别LoxP位点，而FLP重组酶识别FRT位点。

预期的靶向内切核酸酶包括锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)、兆核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)、CRISPR/Cas样内切核酸酶、I-Tevl核酸酶或相关单体杂合体、或人工靶向DNA双链断裂诱导剂。示例性的靶向内切核酸酶在下面进一步描述。例如，通常来说，锌指核酸酶包含DNA结合结构域(即，锌指)和切割结构域(即，核酸酶)，其二者均在下面描述。多核苷酸修饰酶的定义中还包括本领域技术人员已知的任何其他有用的融合蛋白，例如可包含DNA结合结构域和核酸酶。

着陆垫序列是包含至少一个被特定的多核苷酸修饰酶(例如位点特异性重组酶和/或靶向内切核酸酶)选择性地结合并修饰的识别序列的核苷酸序列。一般而言，着陆垫序列中的识别序列不内源性地存在于待修饰细胞的基因组中。例如，在待修饰的细胞是CHO细胞的情况下，着陆垫序列中的识别序列不存在于内源性CHO基因组中。可通过选择不内源性地存在于靶细胞的基因组内的针对高效核苷酸修饰酶的识别序列，来提高靶向整合的速率。选择不内源性地存在的识别序列还降低了潜在的脱靶整合。在另一些方面中，可期望使用在待修饰细胞中为天然的识别序列。例如，在着陆垫序列中使用多个识别序列的情况下，一个或更多个可以是外源性的，并且一个或更多个可以是天然的。

本领域普通技术人员可容易地确定被位点特异性重组酶和/或靶向内切核酸酶结合和切割的序列。

可使用的靶向内切核酸酶的另一个实例是包含至少一个核定位信号的RNA指导的内切核酸酶，其允许内切核酸酶进入真核细胞的细胞核中。RNA指导的内切核酸酶还包含至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用的结构域。通过指导RNA将RNA指导的内切核酸酶引导至特定的染色体序列，使得RNA指导的内切核酸酶切割特定的染色体序列。由于指导RNA提供了靶向切割的特异性，因此RNA指导的内切核酸酶的内切核酸酶是通用的，并且可与不同的指导RNA一起使用以切割不同的靶染色体序列。以下进一步详细讨论了示例性的RNA指导的内切核酸酶蛋白。例如，RNA指导的内切核酸酶可以是CRISPR/Cas蛋白或CRISPR/Cas样融合蛋白、来源于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularlyinterspersed short palindromic repeat，CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统的RNA指导的内切核酸酶。

靶向内切核酸酶也可以是兆核酸酶。兆核酸酶是特征在于大的识别位点(即，识别位点通常为约12个碱基对至约40个碱基对)的内切脱氧核糖核酸酶。作为该要求的结果，识别位点通常在任何给定的基因组中仅出现一次。在兆核酸酶中，称为“LAGLIDADG”的归巢内切核酸酶(homing endonuclease)家族已成为研究基因组和基因组工程的有价值的工具。兆核酸酶可通过使用本领域技术人员公知的技术修饰其识别序列来靶向特定的染色体序列。参见，例如，Epinat et al，2003，Nuc.Acid Res.，31(11)：2952-62和Stoddard，2005，Quarterly Review ofBiophysics，第1至47页。

可使用的靶向内切核酸酶的另一个实例是转录激活子样效应物(TALE)核酸酶。TALE是来自植物病原体黄单胞菌属(Xanthomonas)的转录因子，其可容易地被改造成结合新的DNA靶标。TALE或其截短形式可与内切核酸酶(例如FokI)的催化结构域连接，以产生被称为TALE核酸酶或TALEN的靶向内切核酸酶。参见，例如，Sanjana et al.，2012，NatureProtocols 7(1)：171-192；Bogdanove A J，Voytas D F.，2011，Science，333(6051)：1843-6；Bradley P，Bogdanove A J，Stoddard B L.，2013，Curr Opin Struct Biol.，23(1)：93-9。

V.方法

本公开内容的一些方面涉及用于治疗癌症(例如胶质母细胞瘤)的方法。在另一些方面中，本文中所述的治疗性受体(例如，CAR)可用于刺激免疫应答。免疫应答刺激可在体外、体内或离体进行。在一些方面中，本文中所述的治疗性受体用于预防复发。所述方法通常涉及用包含编码本公开内容的多肽的核苷酸序列的表达载体或DNA、RNA(例如体外经转录的RNA)或腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)对哺乳动物细胞进行遗传修饰，或将多肽直接转移到细胞中。细胞可以是免疫细胞(例如，T淋巴细胞或NK细胞)、干细胞、祖细胞等。在一些方面中，细胞是本文中所述的细胞。

在一些方面中，遗传修饰是离体进行的。例如，从个体获得的T淋巴细胞、干细胞或NK细胞(或本文中所述的细胞)；以及从个体获得的细胞被遗传修饰以表达本公开内容的多肽。在一些情况下，经遗传修饰的细胞离体被激活。在另一些情况下，将经遗传修饰的细胞引入个体(例如，从其获得细胞的个体)；并且经遗传修饰的细胞在体内被激活。

VI.另外的治疗

A.免疫治疗

在一些方面中，所述方法包括施用癌症免疫治疗。癌症免疫治疗(有时称为免疫肿瘤学(immuno-oncology)，缩写IO)是利用免疫系统来治疗癌症。可将免疫治疗分类为主动治疗、被动治疗或混合治疗(主动治疗和被动治疗)。这些方法运用了以下事实：癌细胞通常在其表面具有可被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)；它们通常是蛋白质或其他大分子(例如碳水化合物)。主动免疫治疗通过靶向TAA引导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫治疗增强现有的抗肿瘤应答，并包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。下面描述可用于本公开内容方法中的免疫治疗。

1.检查点抑制剂和组合治疗

本公开内容的一些方面可包括施用免疫检查点抑制剂(也称为检查点抑制剂治疗)，下面对其进行进一步描述。检查点抑制剂治疗可以是仅靶向一种细胞检查点蛋白的单一治疗，或者可以是靶向至少两种细胞检查点蛋白的组合治疗。例如，检查点抑制剂单一治疗可包含以下之一：PD-1、PD-L1或PD-L2抑制剂，或者可包含CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂之一。检查点抑制剂组合治疗可包含以下之一：PD-1、PD-L1或PD-L2抑制剂，并且还可组合包含CTLA-4、B7-1或B7-2抑制剂之一。组合治疗中的抑制剂组合不需要在同一组合物中，而是可同时、基本同时或以包括定期施用两种抑制剂的给药方案来施用，其中周期可以是本文中所述的时间段。

a.PD-1、PD-L1和PD-L2抑制剂

PD-1可在其中T细胞遇到感染或肿瘤的肿瘤微环境中发挥作用。活化的T细胞上调PD-1并继续在外周组织中表达它。细胞因子(例如IFN-γ)诱导上皮细胞和肿瘤细胞上PD-L1的表达。PD-L2在巨噬细胞和树突细胞上表达。PD-1的主要作用是在免疫应答过程中限制外周中效应T细胞的活性并防止对组织的过度损害。本公开内容的抑制剂可阻断PD-1和/或PD-L1活性的一种或更多种功能。

“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PD-L1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PD-L2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些方面中，PD-1、PD-L1和PD-L2是人PD-1、PD-L1和PD-L2。

在一些方面中，PD-1抑制剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。在另一个方面中，PD-L1抑制剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个方面中，PD-L2抑制剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体方面中，PD-L2结合配偶体是PD-1。抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利No.8,735,553、8,354,509和8,008,449，其全部通过引用并入本文。用于本文中提供的方法和组合物中的其他PD-1抑制剂是本领域已知的，例如描述于美国专利申请No.US2014/0294898、US2014/022021和US2011/0008369中，其全部通过引用并入本文。

在一些方面中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些方面中，抗PD-1抗体选自：纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和皮地利珠单抗(pidilizumab)。在一些方面中，PD-1抑制剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的胞外部分或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些方面中，PD-L1抑制剂包含AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

)是描述于WO2006/121168中的抗PD-1抗体。派姆单抗(也称为MK-3475、Merck 3475、兰洛利珠单抗(lambrolizumab)、/>

和SCH-900475)是描述于WO2009/114335中的抗PD-1抗体。皮地利珠单抗(也称为CT-011、hBAT或hBAT-1)是描述于WO2009/101611中的抗PD-1抗体。AMP-224(也称为B7-DCIg)是描述于WO2010/027827和WO2011/066342中的PD-L2-Fc融合可溶性受体。另外的PD-1抑制剂包括MEDI0680，也称为AMP-514和REGN2810。

在一些方面中，免疫检查点抑制剂是PD-L1抑制剂，例如德瓦鲁单抗(Durvalumab)，也称为MEDI4736；阿特珠单抗(atezolizumab)，也称为MPDL3280A；阿维单抗(avelumab)，也称为MSB00010118C、MDX-1105、BMS-936559；或其组合。在某些方面中，免疫检查点抑制剂是PD-L2抑制剂，例如rHIgM12B7。

在一些方面中，抑制剂包含纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个方面中，抑制剂包含纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及纳武单抗、派姆单抗或皮地利珠单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个方面中，抗体与上述抗体竞争PD-1、PD-L1或PD-L2上相同表位的结合和/或与之结合。在另一个方面中，抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中可推导出的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。

b.CTLA-4、B7-1和B7-2抑制剂

在本文中提供的方法中可靶向的另一免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-1ymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，并且当与抗原呈递细胞表面上的B7-1(CD80)或B7-2(CD86)结合时充当“关闭”开关。CTLA-4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA-4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且两个分子均与抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2结合。CTLA-4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。胞内CTLA-4也存在于调节性T细胞中并且对其功能可能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达提高。本公开内容的抑制剂可阻断CTLA-4、B7-1和/或B7-2活性的一种或更多种功能。在一些方面中，抑制剂阻断CTLA-4和B7-1的相互作用。在一些方面中，抑制剂阻断CTLA-4和B7-2的相互作用。

在一些方面中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。

适用于本发明方法中的抗人CTLA-4抗体(或来源于其的VH和/或VL结构域)可使用本领域公知的方法来产生。或者，可使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。例如，公开于以下中的抗CTLA-4抗体可用于本文中公开的方法中：US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；原名替西木单抗(ticilimumab))、美国专利No.6,207,156；Hurwitz et al.，1998.。每个上述出版物的教导在此通过引用并入。也可使用与这些本领域公认的抗体中任一者竞争与CTLA-4结合的抗体。例如，人源化CTLA-4抗体描述于国际专利申请No.WO2001/014424、WO2000/037504和美国专利No.8,017,114中；所有均通过引用并入本文。

在本公开内容的方法和组合物中可用作检查点抑制剂的另外的抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和

)或者其抗原结合片段和变体(参见，例如WO01/14424)。

在一些方面中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个方面中，抑制剂包含曲美木单抗或伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及曲美木单抗或伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个方面中，抗体与上述抗体竞争PD-1、B7-1或B7-2上相同表位的结合和/或与之结合。在另一个方面中，抗体与上述抗体具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％(或其中可推导出的任何范围)的可变区氨基酸序列同一性。

2.共刺激分子的抑制

在一些方面中，免疫治疗包含共刺激分子的抑制剂。在一些方面中，抑制剂包含B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、ICOS、OX40(TNFRSF4)、4-1BB(CD137；TNFRSF9)、CD40L(CD40LG)、GITR(TNFRSF18)及其组合的抑制剂。抑制剂包括抑制性抗体、多肽、化合物和核酸。

3.树突细胞治疗

树突细胞治疗通过使树突细胞将肿瘤抗原呈递给淋巴细胞来引发抗肿瘤应答，这活化它们，引发它们杀伤呈递抗原的其他细胞。树突细胞是哺乳动物免疫系统中的抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)。在癌症治疗中，它们有助于靶向癌症抗原。基于树突细胞的细胞癌治疗的一个实例是sipuleucel-T。

诱导树突细胞呈递肿瘤抗原的一种方法是通过用自体肿瘤裂解物或短肽(对应于癌细胞上蛋白质抗原的小部分蛋白质)进行疫苗接种。这些肽通常以与佐剂(高免疫原性物质)组合来提供，以提高免疫和抗肿瘤应答。其他佐剂包括吸引或活化树突细胞的蛋白质或其他化学物质，例如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)。

树突细胞也可通过使肿瘤细胞表达GM-CSF在体内被活化。这可通过对肿瘤细胞进行遗传改造以产生GM-CSF来实现，或通过用表达GM-CSF的溶瘤病毒感染肿瘤细胞来实现。

另一策略是从患者的血液中去除树突细胞并在身体外部活化它们。树突细胞在存在肿瘤抗原的情况下被活化，肿瘤抗原可以是单个肿瘤特异性肽/蛋白质或肿瘤细胞裂解物(分解肿瘤细胞的溶液)。这些细胞(与任选的佐剂)被输注并引发免疫应答。

树突细胞治疗包括使用与树突细胞表面上的受体结合的抗体。抗原可添加至抗体并可诱导树突细胞成熟并提供对肿瘤的免疫。

4.细胞因子治疗

细胞因子是由在肿瘤内存在的许多类型的细胞产生的蛋白质。它们可调节免疫应答。肿瘤经常运用它们来使其生长并降低免疫应答。这些免疫调节作用使得它们被用作引发免疫应答的药物。两种常用的细胞因子是干扰素和白介素。

干扰素由免疫系统产生。它们通常参与抗病毒响应，但对于癌症也有用途。它们分为三组：I型(IFNα和IFNβ)、II型(IFNγ)和III型(IFNλ)。

白介素具有一系列免疫系统作用。IL-2是示例性的白介素细胞因子治疗。

5.过继性T细胞治疗

过继性T细胞治疗是通过输注T细胞(过继性细胞转移)的被动免疫接种的一种形式。T细胞存在于血液和组织中，并且通常在其发现外来病原体时会活化。具体地，当T细胞的表面受体遇到在其表面抗原上显示出部分外来蛋白质的细胞时，它们就会活化。这些可以是感染的细胞，或是抗原呈递细胞(APC)。它们存在于正常组织中和肿瘤组织中，在那里它们被称为肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)。它们在存在APC(例如呈递肿瘤抗原的树突细胞)的情况下被活化。尽管这些细胞可攻击肿瘤，但肿瘤内的环境具有高度免疫抑制作用，这阻止免疫介导的肿瘤死亡。

已经开发了产生和获得肿瘤靶向T细胞的多种方式。对肿瘤抗原具有特异性的T细胞可从肿瘤样品(TIL)中除去，或从血液过滤。随后的活化和培养离体进行，并将所得物进行再输注。肿瘤靶向T细胞可通过基因治疗产生。肿瘤靶向T细胞可通过将T细胞暴露于肿瘤抗原来扩增。

在一些方面中，过继性细胞治疗中使用的治疗性细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。CAR是融合蛋白，通常由胞外抗原结合结构域(其可以是scFv)、胞外间隔区、跨膜结构域、共刺激信号传导区(其数量根据特定的CAR设计而变化)和CD3-ζ信号传导结构域/内结构域构成。

在一些方面中，过继性细胞治疗中使用的治疗性细胞表达经改造的T细胞受体(T-cell receptor，TCR)，其是靶向肿瘤抗原的异源TCR分子。免疫细胞(包括T细胞和自然杀伤(NK)细胞)可通过本领域已知的多种方法(包括病毒转导、DNA核转染和RNA核转染)来改造以表达CAR或TCR。CAR或TCR与抗原靶标的结合可使表达CAR或TCR的人T细胞活化，这可导致对荷有抗原的细胞的杀伤或一些其他的免疫应答。

在一些方面中，细胞包含癌症特异性CAR或TCR。在CAR或TCR多肽的上下文中的术语“癌症特异性”是指对癌症特异性分子例如癌症特异性抗原具有抗原结合特异性的多肽。在一些方面中，癌症特异性CAR和另外的CAR位于不同的多肽上。

B.溶瘤病毒

在一些方面中，另外的治疗包含溶瘤病毒。溶瘤病毒是优先感染并杀伤癌细胞的病毒。当感染的癌细胞被溶瘤作用破坏时，它们释放出新的感染性病毒颗粒或病毒粒子来帮助破坏剩余的肿瘤。认为溶瘤病毒不仅造成肿瘤细胞的直接破坏，而且还刺激宿主的抗肿瘤免疫应答以进行长期的免疫治疗。

C.多糖

在一些方面中，另外的治疗包含多糖。存在于蘑菇中的某些化合物(主要是多糖)可上调免疫系统并可具有抗癌特性。例如，β-葡聚糖(例如香菇多糖)在实验室研究中已显示出刺激巨噬细胞、NK细胞、T细胞和免疫系统细胞因子，并在临床试验中已经作为免疫佐剂进行了研究。

D.新生抗原

在一些方面中，另外的治疗包括新生抗原突变的靶向。许多肿瘤表达突变。这些突变潜在地产生新的可靶向抗原(新生抗原)以用于T细胞免疫治疗。如使用RNA测序数据所确定的，在具有高突变负荷的肿瘤中，癌症病变中CD8+T细胞的存在较高。与自然杀伤细胞和T细胞的细胞溶解活性相关的转录水平与许多人肿瘤中的突变负荷呈正相关。

E.化学治疗

在一些方面中，另外的治疗包括化学治疗。合适的化学治疗剂类别包括：(a)烷化剂，例如氮芥类(例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺类(例如，六甲基三聚氰胺、噻替派(thiotepa))、烷基磺酸酯类(例如白消安(busulfan))、亚硝基脲类(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、氯脲菌素(chlorozoticin)、链脲菌素(streptozocin))和三嗪类(例如，达卡巴嗪(dicarbazine))；(b)抗代谢物，例如叶酸类似物(例如，甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如，5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、氮尿苷)以及嘌呤类似物和相关物质(例如，6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁(pentostatin))；(c)天然产物，例如长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱)、表鬼臼毒素(epipodophylotoxin)(例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、抗生素(例如，放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)和米托蒽醌(mitoxanthrone))、酶(例如，L-天冬酰胺酶)，和生物响应调节剂(例如，干扰素-α)；以及(d)其他药剂，例如铂配位复合物(例如，顺铂、卡铂)、经取代脲(例如，羟基脲)、甲基肼(methylhydiazine)衍生物(例如，丙卡巴肼(procarbazine)，和肾上腺皮质抑制剂(例如，泰素(taxol)和米托坦(mitotane))。在一些方面中，顺铂是特别合适的化学治疗剂。

顺铂已经被广泛用于治疗癌症，例如如转移性睾丸或卵巢癌、晚期膀胱癌、头颈癌、宫颈癌、肺癌或其他肿瘤。顺铂不经口吸收并因此必须通过其他途径例如如静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射来递送。顺铂可单独使用或与其他药剂组合使用，在某些方面中，预期在临床应用中使用的有效剂量包括：约15mg/m2至约20mg/m2持续每三周5天，总共三个疗程。在一些方面中，与包含与编码治疗性多肽的多核苷酸有效连接的Egr-1启动子的构建体联合递送至细胞和/或对象的顺铂的量少于单独使用顺铂时将递送的量。

其他合适的化学治疗剂包括抗微管剂，例如紫杉醇(“泰素”)和盐酸多柔比星(“多柔比星”)。确定通过腺病毒载体递送的Egr-1启动子/TNFα构建体与多柔比星的组合在克服对化学治疗和/或TNF-α的抗性方面是有效的，这表明构建体与多柔比星的组合治疗克服了对多柔比星和TNF-α二者的抗性。

多柔比星吸收差，并且优选静脉内施用。在某些方面中，对于成人，合适的静脉内剂量包括：约60mg/m2至约75mg/m2，以约21天的间隔；或者约25mg/m2至约30mg/m2，以约3周至约4周的间隔，以连续2或3天中的每一者重复；或者约20mg/m2，每周一次。在年长患者中，当存在先前化学治疗或肿瘤性骨髓浸润(neoplastic marrow invasion)导致的先前骨髓抑制或当药物与其他骨髓生成抑制药物组合时，应使用最低剂量。

氮芥类是可用于本公开内容方法中的另一合适的化学治疗剂。氮芥类可包括但不限于二氯甲基二乙胺(HN2)、环磷酰胺和/或异环磷酰胺、美法仑(L-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥。环磷酰胺(

可从Mead Johnson获得，而/>

可从Adria获得)是另一合适的化学治疗剂。对于成人，合适的经口剂量包括：例如约1mg/kg/天至约5mg/kg/天，静脉内剂量包括：例如，最初在约2天至约5天的时间内约40mg/kg至约50mg/kg的分剂量，或者约每7天至约10天约10mg/kg至约15mg/kg，或者每周两次约3mg/kg至约5mg/kg，或者约1.5mg/kg/天至约3mg/kg/天。由于不利的胃肠道作用，因此优选静脉内途径。药物有时也通过渗透或进入体腔内肌内施用。

另外的合适的化学治疗剂包括嘧啶类似物，例如阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside))、5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶；5-FU)和氟尿苷(氟脱氧尿苷(fluorode-oxyuridine)；FudR)。5-FU可以以约7.5至约1000mg/m2之间的任何剂量施用于对象。此外，5-FU给药方案可以是多种时间段，例如长至六周，或由本公开内容所属领域的普通技术人员确定。

另一种合适的化学治疗剂吉西他滨二磷酸(

Eli Lilly&Co.，“吉西他滨”)被推荐用于治疗晚期和转移性胰腺癌，并且因此也将可用于本公开内容以用于这些癌症。

递送至患者的化学治疗剂的量可以是可变的。在一个合适的方面中，当化学治疗与构建体一起施用时，化学治疗剂可以以有效地在宿主中引起癌症的停止或消退的量来施用。在另一些方面中，化学治疗剂可以以比化学治疗剂的化学治疗有效剂量少2至10,000倍之间的任何量来施用。例如，化学治疗剂可以以比化学治疗剂的化学治疗有效剂量少约20倍、少约500倍或甚至少约5000倍的量来施用。本公开内容的化学治疗剂可在体内与构建体组合测试用于期望的治疗活性，以及用于确定有效剂量。例如，这样的化合物在人中进行测试之前可在合适的动物模型系统中测试，包括但不限于大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、兔等。如实施例中所述，还可使用体外测试来确定合适的组合和剂量。

F.放射治疗

在一些方面中，另外的治疗或先前的治疗包括辐射，例如电离辐射。如本文中所用，“电离辐射”意指包括通过核相互作用具有足够能量或可产生足够能量以产生电离(电子的获得或损失)的粒子或光子的辐射。一个示例性和优选的电离辐射是x辐射。用于将x辐射递送至靶组织或细胞的手段是本领域公知的。

在一些方面中，电离辐射的量大于20Gy并且以一剂施用。在一些方面中，电离辐射的量为18Gy并且以三剂施用。在一些方面中，电离辐射的量为至少、至多或恰好是2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或40Gy(或其中可推导出的任何范围)。在一些方面中，电离辐射以至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9或10剂(或其中可推导出的任何范围)施用。当施用多于一剂时，剂量可相隔约1、4、8、12或24小时，或者1、2、3、4、5、6、7或8天，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16周，或其中可推导出的任何范围。

在一些方面中，IR的量可表示为IR的总剂量，其然后以分次剂量施用。例如，在一些方面中，总剂量为50Gy，以每次5Gy的10次分次剂量施用。在一些方面中，总剂量为50至90Gy，以每次2至3Gy的20至60次分次剂量施用。在一些方面中，IR的总剂量为至少、至多或约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140或150(或其中可推导出的任何范围)。在一些实施方案中，总剂量以至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45或50Gy(或其中可推导出的任何范围)的分次剂量施用。在一些方面中，施用至少、至多或恰好2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100(或其中可推导出的任何范围)次分次剂量。在一些方面中，每天施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12(或其中可推导出的任何范围)次分次剂量。在一些方面中，每周施用至少、至多或恰好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30(或其中可推导出的任何范围)次分次剂量。

G.手术

约60％的患有癌症的人将经历一些类型的手术，其包括预防性、诊断性或阶段性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中将所有或部分的癌组织物理地去除、切除和/或破坏，并且可与其他治疗，例如本发明一些方面的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或替代治疗联合使用。肿瘤切除是指物理去除至少部分的肿瘤。除肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制的手术(莫氏手术(Mohs’surgery))。

在切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可在体内形成腔。治疗可通过灌注、直接注射或在该区域局部施加另外的抗癌治疗来完成。这样的治疗可例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复进行。这些治疗也可具有多种剂量。

H.其他药剂

考虑可将其他药剂与本发明一些方面的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效力。这些另外的药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞抑制剂和分化剂、细胞黏附抑制剂、提高过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的药剂，或其他生物药剂。通过提高GAP连接数而提高胞间信号传导将提高对邻近过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在另一些方面中，细胞抑制剂或分化剂可与本发明一些方面的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。考虑了细胞黏附抑制剂以提高本发明一些方面的效力。细胞黏附抑制剂的一些实例是黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)抑制剂和洛伐他汀。还考虑了可将提高过度增殖细胞对凋亡的敏感性的其他药剂(例如抗体c225)与本发明一些方面的某些方面组合使用以提高治疗效力。

预期癌症治疗可排除本文中所述的任何癌症治疗。此外，本公开内容的一些方面包括先前针对本文中所述的治疗进行过治疗、当前正在针对本文中所述的治疗进行治疗、或尚未针对本文中所述的治疗进行治疗的患者。在一些方面中，患者是已经确定对本文中所述的治疗具有抗性的患者。在一些方面中，患者是已经确定对本文中所述的治疗敏感的患者。

VII.药物组合物

本公开内容包括用于在有此需要的对象中治疗疾病和调节免疫应答的方法。本公开内容包括可为药物组合物形式的细胞，所述药物组合物可用于诱导或修饰免疫应答。

根据本公开内容的组合物的施用将通常经由任何常见途径进行。这包括但不限于肠胃外、原位、皮内、皮下、经口、经皮、瘤内、肌内、腹膜内、腹膜内、眼内、通过植入、通过吸入、心室内、脑室内、鼻内、静脉内注射或者施用到肿瘤切除腔中。

通常，本公开内容的组合物和治疗以与剂量制剂相容的方式并且以将是治疗有效和免疫修饰的这样的量施用。待施用的数量取决于待治疗的对象。需要施用的活性成分的确切量取决于从业者的判断。

施加的方式可广泛地变化。用于施用包含细胞组分的药物组合物的任何常规方法都是适用的。药物组合物的剂量将取决于施用途径，并且将根据对象的身材大小和健康而变化。

在许多情况下，将期望具有至多约或至少约3、4、5、6、7、8、9、10或更多次的多次施用。施用可为2天至12周间隔，更通常为一至两周间隔。施用过程之后可进行对于同种异体反应性免疫应答和T细胞活性的测定。

短语“可药用”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不良反应、变应性反应或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文中所用，“可药用载体”包含任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在免疫原性和治疗性组合物中的使用。本公开内容的药物组合物是可药用组合物。

本公开内容的组合物可配制成用于肠胃外施用，例如，配制成用于经由静脉内、肌内、皮下或甚至腹膜内途径注射。通常，这样的组合物可制备成作为液体溶液剂或混悬剂的可注射剂，并且制剂还可被乳化。

适合于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂。其在制造和储存条件下也应该是稳定的，并且必须被保存以免受微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。

通过将活性成分(即，本公开内容的细胞)以需要的量与以上列举的多种其他成分(根据需要)一起并入适当溶剂中随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般而言，通过将多种经灭菌的活性成分并入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基础分散介质和所需要的来自以上列举的那些的其他成分。

基于预期目标确定组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于对象中的物理离散单位，每个单位包含经计算以产生与其施用(即适当的途径和方案)相关的本文中讨论的所期望响应的预定量的组合物。根据治疗次数和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的结果和/或保护。组合物的确切量还取决于从业者的判断，并且对于每个个体是特有的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目标(症状的减轻与治愈)，以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在配制之后，溶液以与剂量制剂相容的方式并且以治疗或预防有效的量来施用。制剂易于以多种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型。

本公开内容的组合物和相关方法，特别是本公开内容的组合物的施用，也可与另外的治疗例如本文中所述的另外的治疗的施用组合使用，或者与本领域已知的其他传统治疗组合使用。

本文中公开的治疗性组合物和治疗可在另一治疗或药剂之前、与之同时和/或之后进行，间隔为数分钟至数周。在将药剂分开施加于细胞、组织或生物体的方面中，通常将确保在每次递送的时间之间重要的时间段没有到期，使得治疗剂仍将能够对细胞、组织或生物体发挥有利的组合作用。例如，在这样的情况下，预期可使细胞、组织或生物体与两种、三种、四种或更多种药剂或治疗基本同时(即，在小于约一分钟内)接触。在另一些方面中，一种或更多种治疗剂或治疗可在施用另一治疗剂或治疗之前和/或之后在以下时间内施用或提供：1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、45分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或更长时间，以及其中可推导出的任何范围。

治疗可包括多种“单位剂量”。单位剂量被定义为包含预定量的治疗性组合物。待施用的量以及特定途径和制剂在临床领域技术人员的技能决定范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，但可包括在设定时间段内连续输注。在一些方面中，单位剂量包含单一可施用剂量。

根据治疗次数和单位剂量二者，待施用的量取决于所期望的治疗效果。有效剂量被理解为是指达到特定效果所需的量。在某些方面中的实践中，预期在10mg/kg至200mg/kg范围内的剂量可影响这些药剂的保护能力。因此，预期剂量包括以下剂量：约0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、和200、300、400、500、1000μg/kg、mg/kg、μg/天、或mg/天、或其中可推导出的任何范围。此外，这样的剂量可在一天内、和/或在数天、数周或数月内多次施用。

在一些方面中，无论通过一次施用或是更多次施用，施用于人的免疫检查点抑制剂(例如抗体和/或微生物调节剂)的治疗有效量或足够量将在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围内。在一些方面中，使用的治疗为例如每天施用约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01至约35mg/kg、约0.01至约30mg/kg、约0.01至约25mg/kg、约0.01至约20mg/kg、约0.01至约15mg/kg、约0.01至约10mg/kg、约0.01至约5mg/kg、或约0.01至约1mg/kg。在一个方面中，本文中所述的治疗在21天周期的第1天以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的剂量施用于对象。剂量可作为单剂量或作为多剂量(例如，2或3次剂量)施用，例如输注。这种治疗的进展容易通过常规技术进行监测。

在某些方面中，药物组合物的有效剂量是可提供约1μM至150μM的血液水平的剂量。在另一个方面中，有效剂量提供约4μM至100μM；或约1μM至100μM；或约1μM至50μM；或约1μM至40μM；或约1μM至30μM；或约1μM至20μM；或约1μM至10μM；或约10μM至150μM；或约10μM至100μM；或约10μM至50μM；或约25μM至150μM；或约25μM至100μM；或约25μM至50μM；或约50μM至150μM；或约50μM至100μM(或其中可推导出的任何范围)的血液水平。在另一些方面中，剂量可提供药剂的以下血液水平(其是由向对象施用的治疗剂产生的)：约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100μM或其中可推导出的任何范围。在某些方面中，施用于对象的治疗剂在体内被代谢为经代谢的治疗剂，在这种情况下，血液水平可指该治疗剂的量。或者，到了治疗剂不被对象代谢的程度，本文中讨论的血液水平可指未经代谢的治疗剂。

治疗性组合物的确切量还取决于从业者的判断并且对每个个体是特有的。影响剂量的因素包括患者的身体和临床状态、施用途径、预期的治疗目标(症状的减轻与治愈)，以及对象可能正在经历的特定治疗性物质或其他治疗的效力、稳定性和毒性。

本领域技术人员将理解并意识到，可将μg/kg或mg/kg体重的剂量单位转换并以μg/ml或mM(血液水平)的相当浓度单位(例如4μM至100μM)来表示。还应理解，摄取依赖于物种和器官/组织。待进行的与摄取和浓度测量有关的适用的转换因素和生理假设是公知的，并且将允许本领域技术人员将一种浓度测量转换为另一种浓度测量，并且对本文中所述的剂量、效力和结果做出合理的比较和结论。

VIII.治疗方法

本公开内容的组合物可用于体内、体外或离体施用。组合物的施用途径可以是例如皮内、皮下、静脉内、局部、表面和腹膜内施用。

在一些方面中，所公开的方法是针对用于治疗癌症的方法。癌症可以是实体瘤、转移性癌症或非转移性癌症。在某些方面中，癌症是胶质母细胞瘤，并且可以是复现的、转移性的、复发性的或第1、II、III或IV期的。

IX.序列

可用于本公开内容的方法和组合物中的示例性嵌合多肽和CAR分子的氨基酸序列在下表1中提供。

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X.实施例

以下实施例被包括在内以展示本公开内容的一些优选方面和实施方案。本领域技术人员应理解的是，以下实施例中公开的技术表示由发明人发现在本公开内容的实践中发挥良好作用的技术，并因此可以被认为构成了用于本公开内容实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可在不偏离本公开内容的精神和范围的情况下，对所公开的具体实施方案作出许多修改并且仍获得同样或相似的结果。实施例不应以任何方式解释为限制。所有引用的参考文献(包括参考文献、已授权的专利、已公布的专利申请和本申请通篇引用的GenBank登录号)的内容通过引用明确并入本文。当通过引用并入本文的文件中的术语定义与本文中使用的术语定义冲突时，以本文中使用的定义为准。

实施例1：用多特异性嵌合抗原受体治疗多形性胶质母细胞瘤。

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是成人中最常见的原发性脑肿瘤类型，并且在过去的数十年期间，中位生存期保持在自诊断时间开始12至16个月。常规治疗例如手术、化学治疗和放射几乎总是不能根除肿瘤，导致在数周或数月内复发。因此，GBM已经成为研究新的治疗方案(例如过继性T细胞治疗)的活跃领域。迄今为止，两个主要的挑战限制了T细胞治疗对GBM的效力。首先，GBM肿瘤微环境具有强烈的免疫抑制性，其特征在于高水平的转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)，所述转化生长因子β同时促进肿瘤生长并有效地抑制T细胞的功能。其次，GBM肿瘤在抗原表达方面是高度异质性的，因此经改造以靶向单一抗原的T细胞通常不能识别和根除所有存在的肿瘤细胞。

本发明人提出通过使用双特异性嵌合抗原受体(CAR)-T细胞来克服针对GBM的过继性T细胞治疗的两个主要挑战，所述双特异性嵌合抗原受体(CAR)-T细胞可同时靶向GBM相关表面抗原并将TGF-β从免疫抑制细胞因子转化为经改造T细胞的强效刺激剂。重要的是，TGF-βCAR既可抑制内源性TGF-β信号传导(通过与内源性TGF-β受体竞争与TGF-β配体结合)，又可在可溶性TGF-β和固化TGF-β二者存在的情况下触发T细胞活化。概念是CAR-T细胞的TGF-β转化功能可改变肿瘤微环境，从而促进经改造T细胞和内源性免疫细胞二者的抗肿瘤功能。

本发明人已构建了一系列同时对TGF-β加IL-13Rα2和脑肿瘤细胞表面上存在的抗原具有响应的双特异性CAR。特别地，他们构建了以下双特异性CAR：

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所有的构建体从蛋白质的N端至C端包含以下组分：鼠K链信号序列、被(Gly4Ser1)x4隔开的各自的结合结构域、IgG4铰链、CD28跨膜结构域和CD3ζ胞质结构域。一些CAR在跨膜结构域与CD3ζ结构域之间含有CD28胞质结构域；另一些包含4-1BB胞质结构域而不是CD28胞质结构域。

上述构建体7、14和15共表达单输入IL-13Rα2CAR与显性阴性TGF-β受体(DNR)，所述显性阴性TGF-β受体是缺失其胞质结构域的TGF-β受体链2。这些构建体被构建为对照以用于针对L-13Rα2/TGF-β双特异性CAR进行比较。

用一组在IL-13突变蛋白的N端带有SP二肽或LTCLGGFASP(“完整”)多肽的单输入IL-13Rα2或双特异性IL-13Rα2/TGF-βCAR转导T细胞。每个CAR与N-端FLAG标签融合，以使得能够通过抗体染色进行表面检测。在培养的第7天，针对FLAG标记的CAR的表面表达，对经转导的T细胞进行染色。具有N端SP的IL-13突变蛋白相对于具有完整N端的IL-13突变蛋白的CAR表达的相对强度是构建体依赖性的。示出了三次重复的平均值，其中误差棒表示±1标准偏差。(图1)。

为了评价CAR信号是否响应于抗原，将CAR-T细胞分别在单独的培养基中或者在5ng/mL重组人TGF-β1或IL-13Rα2+PBT106神经球(neurosphere)存在下培养21小时。随后针对CD69(图2A)、CD25(图2B)和FLAG(图2C、D)的表面表达对T细胞进行染色。单输入IL-13Rα2和双特异性IL-13Rα2/TGF-βCAR-T细胞二者均被抗原表达PBT106肿瘤细胞强烈活化，而仅双特异性IL-13Rα2/TGF-βCAR被TGF-β活化，如通过CD69和CD25的上调以及表面FLAG表达的下调所证明的(图2A至D)。此外，与具有完整IL-13突变蛋白N端的CAR相比，具有N端SP的CAR赋予了更大的CD25上调，表明与完整N端相比，IL-13突变蛋白的较短SP N端赋予了更大的功能。示出了三次重复的平均值，其中误差棒表示±1标准偏差。

为了评估体外抗肿瘤功能，将CAR-T细胞用CellTraceViolet(CTV)染料标记，并与IL13Rα2+PBT106神经球以指定的E：T比率共培养4天。进行流式细胞术以量化有生存力的肿瘤细胞计数(图3A、B)、有生存力的T细胞计数(图3C)、有生存力的CAR+T细胞计数(图3D)、所有T细胞中的CTV稀释(图3E)和CAR+T细胞中的CTV稀释(图3F)。图3B示出了与图3A相同的数据，但其中去除了scFv-较少CAR条件，以使得能够清楚地可视化。与携带完整IL-13突变蛋白N端的CAR相比，携带IL-13突变蛋白的N端SP的CAR赋予了更强的肿瘤细胞杀伤和更大的T细胞增殖(如通过CTV稀释评估的)。示出了三次重复的平均值，其中误差棒表示±1标准偏差(图3)。

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根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法均无需过度实验即可进行和实施。虽然已经根据一些优选实施方案描述了本公开内容的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本公开内容的概念、精神和范围的情况下，可对本文中所述方法以及本文中所述方法的步骤或步骤序列施加变化。更特别地，明显的是，可用某些在化学和生理学两个方面均相关的试剂替代本文中所述的试剂，同时实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的是所有这样的类似替代和修改被认为在由所附权利要求书所限定的本公开内容的精神、范围和概念内。

在本申请中列举的参考文献就其提供了补充本文中阐述的那些的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。

参考文献

在说明书通篇引用的以下参考文献和出版物，就其提供了补充本文中阐述的那些的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。

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Chang，Z.L.，Lorcnzini，M.H.，Zah，E.，Tran，U.，Chen，Y.Y.(2018).Rewiring T-cell responses to soluble factors with chimeric antigen receptors.NatureChemical Biology，14(3)：317-324.

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Hou，A.J.，Chang，Z.L.，Lorenzini，M.H.，Zah，E.，and Chen，Y.Y.(2018)，TGF-β-responsive CAR-T cells promote anti-tumor immune function.Bioengineering andTranslational Medieine，3(2)：75-86.

Kahlon，K.S.etal，(2004).Specifie recognition and killing ofglioblastoma multifonme by interleukin 13-zetakine redirected evtolytie Tcells.Cancer Research，64：9160-6.

Claims

1.包含多特异性嵌合抗原受体的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含具有SEQ IDNO:4或20的氨基酸序列的IL13多肽、胶质母细胞瘤抗原结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区；其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含GD2或EGFRvIII结合区。

2.权利要求1所述的多肽，其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含GD2结合区。

3.权利要求2所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗GD2 scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO:46的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO:47的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

4.权利要求2或3所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗GD2 scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO:48(HCDR1)、SEQ ID NO:49(HCDR2)和SEQ ID NO:50(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO:51(LCDR1)、SEQ ID NO:52(LCDR2)和SEQ ID NO:53(LCDR3)。

5.权利要求2至4中任一项所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有与SEQ ID NO:46具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO:47具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。

6.权利要求5所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL。

7.权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有与SEQ ID NO:26具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗GD2scFv。

8.权利要求7所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有SEQ ID NO:26氨基酸序列的抗GD2 scFv。

9.权利要求1所述的多肽，其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含EGFRvIII结合区。

10.权利要求9所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗EGFRvIII scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO:38的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO:39的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

11.权利要求9或10所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗EGFRvIII scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO:40(HCDR1)、SEQ ID NO:41(HCDR2)和SEQ ID NO:42(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO:43(LCDR1)、SEQ ID NO:44(LCDR2)和SEQ ID NO:45(LCDR3)。

12.权利要求9至11中任一项所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有与SEQ IDNO:38具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO:39具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。

13.权利要求12所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL。

14.权利要求9至13中任一项所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有与SEQ IDNO:27具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗EGFRvIII scFv。

15.权利要求14所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的抗EGFRvIII scFv。

16.权利要求1至15中任一项所述的多肽，其中所述CAR以从氨基近末端至羧基近末端的顺序包含：IL13多肽、胶质母细胞瘤抗原结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区。

17.权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述多肽在所述IL13多肽与所述胶质母细胞瘤抗原结合区之间包含接头。

18.权利要求1至17中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含含有TGF-β结合区的三特异性CAR。

19.权利要求18所述的多肽，其中所述CAR以从氨基近末端至羧基近末端的顺序包含：IL13多肽、胶质母细胞瘤抗原结合区、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区。

20.权利要求18或19所述的多肽，其中所述多肽在所述胶质母细胞瘤抗原结合区或所述IL13多肽与所述TGF-β结合区之间包含接头。

21.权利要求17至20中任一项所述的多肽，其中所述接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸。

22.权利要求21所述的多肽，其中所述接头包含具有SEQ ID NO:10或28的氨基酸序列的多肽或者由其组成。

23.包含多特异性嵌合抗原受体(CAR)的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含具有SEQ ID NO:4或20的氨基酸序列的IL13多肽、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区。

24.包含多特异性嵌合抗原受体(CAR)的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含胶质母细胞瘤抗原结合区、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区；其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗GD2 scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO:46的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO:47的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

25.权利要求24所述的多肽，其中所述抗GD2 scFv包含可变重(VH)区和可变轻(VL)区，其中所述VH区包含SEQ ID NO:48(HCDR1)、SEQ ID NO:49(HCDR2)和SEQ ID NO:50(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO:51(LCDR1)、SEQ ID NO:52(LCDR2)和SEQ ID NO:53(LCDR3)。

26.权利要求24或25所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有与SEQ ID NO:46具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO:47具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。

27.权利要求26所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL。

28.权利要求24至27中任一项所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有与SEQ ID NO:26具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗GD2scFv。

29.权利要求28所述的多肽，其中所述GD2结合区包含具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的抗GD2 scFv。

30.包含多特异性嵌合抗原受体(CAR)的多肽，所述多特异性嵌合抗原受体包含胶质母细胞瘤抗原结合区、TGF-β结合区、肽间隔区、跨膜结构域以及含有共刺激区和主要胞内信号传导结构域的胞质区；其中所述胶质母细胞瘤抗原结合区包含EGFRvIII结合区。

31.权利要求30所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗EGFRvIII scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO:38的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO:39的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

32.权利要求30或31所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的抗EGFRvIII scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO:40(HCDR1)、SEQ ID NO:41(HCDR2)和SEQ ID NO:42(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO:43(LCDR1)、SEQ ID NO:44(LCDR2)和SEQ ID NO:45(LCDR3)。

33.权利要求30至32中任一项所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有与SEQID NO:38具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO:39具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。

34.权利要求33所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL。

35.权利要求30至34中任一项所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有与SEQID NO:27具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗EGFRvIII scFv。

36.权利要求35所述的多肽，其中所述EGFRvIII结合区包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的抗EGFRvIII scFv。

37.权利要求18至36中任一项所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO:29的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO:30的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

38.权利要求18至37中任一项所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO:31(HCDR1)、SEQ ID NO:32(HCDR2)和SEQ ID NO:33(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO:34(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:36(LCDR3)。

39.权利要求18至38中任一项所述的多肽，其中所述scFv在所述VH区与所述VL区之间包含接头。

40.权利要求39所述的多肽，其中所述接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。

41.权利要求40所述的多肽，其中所述接头包含SEQ ID NO:10或28的氨基酸序列或者由其组成。

42.权利要求23至41中任一项所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有与SEQ IDNO:29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO:30具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。

43.权利要求42所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL。

44.权利要求23至43中任一项所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有与SEQ IDNO:11具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

45.权利要求44所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

46.权利要求1至45中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含第二嵌合抗原受体，所述第二嵌合抗原受体包含至少一个抗原结合区、第二肽间隔区、第二跨膜结构域以及含有第二共刺激区和第二主要胞内信号传导结构域的第二胞质区。

47.权利要求46所述的多肽，其中所述第二CAR是单特异性CAR或多特异性CAR。

48.权利要求46或47所述的多肽，其中所述第二CAR包含针对TGF-β的抗原结合区。

49.权利要求48所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO:29的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO:30的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

50.权利要求48或49所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO:31(HCDR1)、SEQ ID NO:32(HCDR2)和SEQID NO:33(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO:34(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQID NO:36(LCDR3)。

51.权利要求49或50所述的多肽，其中所述scFv在所述VH区与所述VL区之间包含接头。

52.权利要求51所述的多肽，其中所述接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。

53.权利要求52所述的多肽，其中所述接头包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成。

54.权利要求48至53中任一项所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有与SEQ IDNO:29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO:30具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。

55.权利要求54所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL。

56.权利要求48至55中任一项所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有与SEQ IDNO:11具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

57.权利要求56所述的多肽，其中所述TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

58.权利要求46至56中任一项所述的多肽，其中第一CAR与所述第二CAR被一个或更多个肽切割位点隔开。

59.权利要求58所述的多肽，其中所述一个或更多个切割位点包含2A切割位点。

60.权利要求59所述的多肽，其中所述2A切割位点包含P2A、F2A、E2A或T2A切割位点中的一个或更多个。

61.权利要求60所述的多肽，其中所述切割位点包含具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列或具有与SEQ ID NO:24具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的T2A切割位点。

62.权利要求1至61中任一项所述的多肽，其中所述肽间隔区在抗原结合结构域与跨膜结构域之间，和/或所述第二肽间隔区在所述第二CAR的抗原结合结构域与第二跨膜结构域之间。

63.权利要求1至62中任一项所述的多肽，其中所述肽间隔区或所述第二肽间隔区包含IgG4铰链区。

64.权利要求63所述的肽间隔区，其中所述IgG4铰链区包含具有与SEQ ID NO:12或5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

65.权利要求64所述的肽间隔区，其中所述IgG4铰链区包含具有SEQ ID NO:12或5的氨基酸序列的多肽。

66.权利要求1至65中任一项所述的多肽，其中所述肽间隔区或所述第二肽间隔区包含IgG4 CH2和CH3区或还包含IgG4 CH2和CH3区。

67.权利要求66所述的多肽，其中所述IgG4 CH2和CH3区包含具有与SEQ ID NO:37具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽。

68.权利要求64所述的肽间隔区，其中所述IgG4 CH2和CH3区包含具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的多肽。

69.权利要求1至68中任一项所述的多肽，其中所述跨膜结构域或所述第二跨膜结构域包含来自CD28蛋白的跨膜结构域。

70.权利要求1至69中任一项所述的多肽，其中所述跨膜结构域或所述第二跨膜结构域包含具有与SEQ ID NO:6具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域。

71.权利要求1至70中任一项所述的多肽，其中所述跨膜结构域或所述第二跨膜结构域包含具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的跨膜结构域。

72.权利要求1至71中任一项所述的多肽，其中所述共刺激区或所述第二共刺激区包含来自4-1BB蛋白或来自CD28蛋白的共刺激区。

73.权利要求1至72中任一项所述的多肽，其中所述共刺激区或所述第二共刺激区包含具有与SEQ ID NO:7、14或18具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的共刺激区。

74.权利要求1至73中任一项所述的多肽，其中所述共刺激区或所述第二共刺激区包含具有SEQ ID NO:7、14或18的氨基酸序列的共刺激区。

75.权利要求1至74中任一项所述的多肽，其中所述主要胞内信号传导结构域或所述第二主要胞内信号传导结构域包含来自CD3ζ蛋白的胞内信号传导结构域。

76.权利要求1至75中任一项所述的多肽，其中所述主要胞内信号传导结构域或所述第二主要胞内信号传导结构域包含具有与SEQ ID NO:8或15具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的胞内信号传导结构域。

77.权利要求1至76中任一项所述的多肽，其中所述主要胞内信号传导结构域或所述第二主要胞内信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:8或15的氨基酸序列的胞内信号传导结构域。

78.权利要求1至77中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含一种或更多种分子标签。

79.权利要求78所述的多肽，其中所述一种或更多种分子标签包含FLAG和/或HA标签。

80.权利要求1至79中任一项所述的多肽，其中所述CAR和/或所述第二CAR在所述跨膜结构域与所述胞质区之间包含扭转接头。

81.权利要求80所述的多肽，其中所述扭转接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基。

82.权利要求81所述的多肽，其中所述氨基酸残基包含丙氨酸残基或由其组成。

83.权利要求82所述的多肽，其中所述扭转接头由2或4个丙氨酸残基组成。

84.权利要求1至83中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NOS:136至147中的一者或与SEQ ID NOS:136至147中的一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

85.权利要求1至84中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含一个或更多个信号序列。

86.权利要求85所述的多肽，其中所述信号序列包含与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

87.权利要求86所述的多肽，其中所述信号序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

88.分离的核酸，其编码权利要求1至87中任一项所述的多肽。

89.权利要求88所述的核酸，其中所述核酸是表达构建体。

90.权利要求89所述的核酸，其中所述表达构建体是病毒载体。

91.权利要求90所述的核酸，其中所述病毒载体包含逆转录病毒载体、来源于逆转录病毒的载体。

92.权利要求91所述的核酸，其中所述病毒载体是慢病毒载体或来源于慢病毒的载体。

93.慢病毒载体，其包含编码权利要求1至87中任一项所述的多肽的序列。

94.细胞，其包含权利要求88至93中任一项所述的核酸。

95.权利要求94所述的细胞，其中所述病毒载体已经整合到所述细胞的基因组中。

96.权利要求94或95所述的细胞，其中所述细胞还包含编码第二CAR的第二核酸。

97.权利要求96所述的细胞，其中所述第二CAR是单特异性CAR或多特异性CAR。

98.权利要求96或97所述的细胞，其中所述第二CAR包含针对TGF-β的抗原结合区。

99.权利要求98所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO:29的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO:30的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

100.权利要求98或99所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO:31(HCDR1)、SEQ ID NO:32(HCDR2)和SEQID NO:33(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO:34(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQID NO:36(LCDR3)。

101.权利要求99或100所述的细胞，其中所述scFv在所述VH区与所述VL区之间包含接头。

102.权利要求101所述的细胞，其中所述接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。

103.权利要求102所述的细胞，其中所述接头包含SEQ ID NO:10或28的氨基酸序列或者由其组成。

104.权利要求98至103中任一项所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有与SEQ IDNO:29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO:30具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。

105.权利要求98至104中任一项所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有SEQ IDNO:29的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL。

106.权利要求98至105中任一项所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有与SEQ IDNO:11具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

107.权利要求106所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

108.权利要求96至107中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR包含针对EGFRvIII的抗原结合区。

109.权利要求96至108中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR包含针对GD2的抗原结合区。

110.权利要求94至99中任一项所述的细胞，其中所述细胞是离体的。

111.细胞，其表达权利要求1至87中任一项所述的多肽。

112.权利要求111所述的细胞，其中所述细胞还包含含有第二CAR的第二多肽。

113.权利要求112所述的细胞，其中所述第二CAR是单特异性CAR或多特异性CAR。

114.权利要求112或113所述的细胞，其中所述第二CAR包含针对TGF-β的抗原结合区。

115.权利要求114所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含来自SEQ ID NO:29的VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL区包含来自SEQ ID NO:30的VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

116.权利要求114或115所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有可变重(VH)区和可变轻(VL)区的scFv，其中所述VH区包含SEQ ID NO:31(HCDR1)、SEQ ID NO:32(HCDR2)和SEQ ID NO:33(HCDR3)，并且所述VL区包含SEQ ID NO:34(LCDR1)、SEQ ID NO:35(LCDR2)和SEQ ID NO:36(LCDR3)。

117.权利要求115或116所述的细胞，其中所述scFv在所述VH区与所述VL区之间包含接头。

118.权利要求117所述的细胞，其中所述接头包含甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。

119.权利要求118所述的细胞，其中所述接头包含SEQ ID NO:10或28的氨基酸序列或者由其组成。

120.权利要求114至119中任一项所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有与SEQID NO:29具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VH和/或具有与SEQ ID NO:30具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的VL。

121.权利要求114至120中任一项所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有SEQ IDNO:29的氨基酸序列的VH和/或具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL。

122.权利要求114至121中任一项所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有与SEQID NO:11具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

123.权利要求122所述的细胞，其中所述TGF-β结合区包含具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的抗TGF-βscFv。

124.权利要求112至123中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR包含针对EGFRvIII的抗原结合区。

125.权利要求112至124中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR包含针对GD2的抗原结合区。

126.权利要求94至125中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT)、干细胞、淋巴样祖细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓细胞、胎儿肝细胞、胚胎干细胞、造血干细胞或祖细胞(HSPC)、脐带血细胞或诱导多能干细胞(iPS细胞)。

127.权利要求126所述的细胞，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。

128.权利要求127所述的细胞，其中所述T细胞包含初始记忆T细胞。

129.权利要求128所述的细胞，其中所述初始记忆T细胞包含CD4+或CD8+T细胞。

130.细胞群体，其包含权利要求123至129中任一项所述的细胞。

131.权利要求130所述的细胞群体，其中所述群体包含10³至10⁸个细胞。

132.组合物，其包含权利要求130或131所述的细胞群体，其中所述组合物是可药用制剂。

133.制备表达多肽的细胞的方法，其包括将权利要求88至93中任一项所述的核酸引入到细胞中。

134.权利要求133所述的方法，其中所述细胞被编码所述多肽的病毒感染。

135.权利要求134所述的方法，其中所述病毒包含慢病毒或者慢病毒来源的病毒或载体。

136.权利要求133至135中任一项所述的方法，其中所述细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞(NKT)、恒定自然杀伤T细胞(iNKT)、干细胞、淋巴样祖细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、骨髓细胞、胎儿肝细胞、胚胎干细胞、脐带血细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)。

137.权利要求136所述的方法，其中所述细胞是T细胞或NK细胞。

138.权利要求137所述的方法，其中所述T细胞包含初始记忆T细胞。

139.权利要求138所述的方法，其中所述初始记忆T细胞包含CD4+或CD8+T细胞。

140.权利要求133至139中任一项所述的方法，其中所述细胞还不是T细胞或NK细胞，所述方法还包括在促进所述细胞分化成T细胞或NK细胞的条件下培养所述细胞。

141.权利要求133至140中任一项所述的方法，其还包括在将所述核酸引入到所述细胞中之前和或之后在扩增所述细胞的条件下培养所述细胞。

142.权利要求141所述的方法，其中将所述细胞用无血清培养基培养。

143.治疗患有胶质母细胞瘤的患者的方法，其包括向所述患者施用有效量的权利要求132所述的组合物。

144.权利要求143所述的方法，其中所述方法还包括向所述对象施用另外的治疗。

145.权利要求144所述的方法，其中所述另外的治疗包含免疫治疗。

146.权利要求143至145中任一项所述的方法，其中所述组合物经心室内、经脑室内、经瘤内、经静脉内施用或施用到肿瘤切除腔中。

147.用于在对象中刺激免疫应答或治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的权利要求132所述的组合物。

148.权利要求147所述的方法，其中刺激免疫应答包括提高免疫刺激细胞因子和/或分子的表达和/或分泌。

149.权利要求147或148所述的方法，其中所述免疫刺激细胞因子和/或分子是以下中的一种或更多种：TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。

150.权利要求147至149中任一项所述的方法，其中刺激免疫应答包括提高免疫细胞的增殖。

151.权利要求150所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。

152.权利要求147至151中任一项所述的方法，其中所述细胞在需要免疫刺激的对象体内。

153.权利要求152所述的方法，其中所述对象是产生内源性TGF-β的对象。

154.权利要求147至153中任一项所述的方法，其中所述癌症包含胶质母细胞瘤。

155.权利要求147至154中任一项所述的方法，其中所述对象是人对象。

156.权利要求147至155中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述对象施用TGF-β。

157.用于体外扩增治疗性T细胞的方法，所述方法包括在体外使权利要求127至129中任一项所述的T细胞与包含TGF-β的组合物接触。

158.权利要求157所述的方法，其中所述组合物包含1至50ng/mL的TGF-β。

159.权利要求157或158所述的方法，其中所述组合物还包含IL-2。

160.权利要求159所述的方法，其中所述组合物包含20至400U/mL的IL-2和/或0.1至10ng/ml的IL-15。

161.权利要求157至160中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述细胞与饲养细胞接触。

162.权利要求161所述的方法，其中对所述饲养细胞进行辐照。

163.权利要求157至162中任一项所述的方法，其中所述方法不包括所述T细胞与饲养细胞的接触。