CN116328367A - 一种新型小配体磁珠亲和纯化抗体材料 - Google Patents

一种新型小配体磁珠亲和纯化抗体材料 Download PDF

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崔新玲
胡志上
李红梅
林玲
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Beijing Technology and Business University
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Beijing Technology and Business University
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Abstract

本发明公开了一种新型小配体磁珠亲和纯化抗体材料，属于生物分离工程和生物医药领域，涉及一类纯化抗体及Fc融合蛋白的亲和分离材料，旨在提供一类理化性质稳定、生物安全性良好、可纯化多种来源的抗体的亲和分离材料。它由磁珠本体和修饰在磁珠本体表面的功能性氨基酸六聚体构成。本发明所述的亲和分离材料不仅可用于实验室纯化抗体，更适宜于工业中规模纯化抗体，且分离材料纯化抗体的特异性高、可反复多次使用、生物安全性良好、价格低廉、易保存。

Description

一种新型小配体磁珠亲和纯化抗体材料
技术领域
本发明属于生物分离工程和生物医药领域，具体涉及一种在氨基化的磁珠材料上修饰一个线性六聚体肽配体制得的材料及其在含Fc抗体或Fc融合蛋白纯化中的应用。
背景技术
免疫球蛋白G是血浆中含量最多的抗体，由一个恒定部分(称为Fc域)和一个可变部分(称为Fab域)组成(参见图1，Fc域代表抗体的底部)Y形IgG分子，在所有抗体中都是相同的。Fab结构域是分子的上部，其结构根据靶抗原而变化。单克隆抗体(Mabs)是最重要的治疗性蛋白之一，已被用于治疗多种疾病，如肿瘤、炎症和自身免疫性疾病等。目前，单克隆抗体技术正在不断发展，已成功开发了许多疗效和安全性显著提高的单抗药物。单克隆抗体药物在生物技术制药中占有重要地位，并逐渐成为生物医药领域发展的主要方向。从全球市场来看，抗体药物成了国际制药业争夺的焦点，并购成为国际制药业巨头快速切入抗体产业的捷径。
重组单克隆抗体是新一代生物工程技术产品，需经过多步纯化才能获得高纯度的抗体。现有技术中，亲和层析可以在更少的步骤中获得高回收率的多倍纯化。目前市场上的所有治疗性抗体中有一半是通过亲和层析纯化的，使用蛋白A或蛋白G作为配体。这些配体很昂贵，因为它们必须从细菌来源中高度纯化；此外还有可能泄漏到产品中，它们有可能在患者中引起免疫原性反应，并且由于苛刻的洗脱条件、洗涤和灭菌条件，它们往往会失去活性。因此，人们对用于抗体纯化的替代亲和配体非常感兴趣。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型小配体磁珠亲和纯化抗体材料。本发明的多肽六聚体磁珠亲和材料，克服了现有抗体纯化技术中的不足，且合成成本低，纯化效果好，无脱落，生物安全性好，可用于带Fc的抗体及Fc融合蛋白纯化中。
本发明所提供的多肽小配体磁珠亲和材料，通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)磁珠制备
在碱性条件下，使得Fe3O4与硅酸烷基酯反应，得到Fe3O4@SiO2-OH纳米颗粒，即磁珠；
2)纳米颗粒表面修饰
将Fe3O4@SiO2-OH纳米颗粒分散于溶剂中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，50-65℃搅拌下反应20-26h，磁性分离，将所得磁性纳米颗粒与丁二酸酐反应，得到Fe3O4@SiO2-COOH，再将Fe3O4@SiO2-COOH中的羧基活化，得到表面修饰的纳米颗粒；
3)磁珠固定多肽
先配制多肽溶液，加入步骤2)得到的表面修饰的纳米颗粒，反应，磁性分离，收集磁珠，将所得磁珠用缓冲溶液清洗去除未键合的多肽，即得，
所述多肽的氨基酸序列为：HWRGWV。
上述方法步骤1)中，所述硅酸烷基酯可为正硅酸乙酯、正硅酸甲酯、正硅酸异丙酯中的至少一种；
Fe3O4与硅酸烷基酯的配比可为500mg：0.8-1.5mL；
所述反应在有机溶剂与水的混合体系中进行，所述有机溶剂具体可为乙醇、甲醇、异丙醇中的至少一种；更具体可为体积比40:1乙醇与水的混合溶液；
所述反应的温度可为60-80℃，具体可为70℃，所述反应的时间可为4-8h，具体可为6h。
上述方法步骤2)中，所述溶剂具体可为异丙醇；
Fe3O4@SiO2-OH与3-氨丙基三乙氧基硅烷、丁二酸酐的配比依次可为200mg：0.8-1.5mL：0.8-1.2mg；
所述与丁二酸酐反应的温度可为室温，时间可为20-26h；
所述活化的操作为：将Fe3O4@SiO2-COOH与羧基活化剂反应，即可，
其中，所述羧基活化剂具体可为质量比5:2的EDC/NHS混合物；
Fe3O4@SiO2-COOH与所述EDC/NHS混合物的质量比可为100mg：40-60mg，具体可为50mg；
所述活化的时间可为1.5-2.5h，具体可为2h。
上述方法步骤3)中，采用IAP缓冲液将所述多肽配制成多肽溶液，所述多肽溶液的浓度可为4-6mg/mL，具体可为5mg/mL；
所述IAP缓冲液的组成为：50mMPBS,50mMNaCl,10mMNaH2PO4,pH＝7.6；
表面修饰的纳米颗粒与多肽的配比为：200mg：4-6mg；
所述反应的温度为2-8℃，具体可为4℃，所述反应的时间可为10-14h，具体可为12h。
所述缓冲溶液可为Tris+甘氨酸缓冲溶液，组成为：0.1MTris-HCl+0.75M甘氨酸，pH＝8.3。
上述多肽小配体磁珠亲和材料在带Fc抗体及Fc融合蛋白的亲和层析纯化中的应用也属于本发明的保护范围。
所述带Fc抗体具体可为免疫球蛋白G。
本发明还提供一种带Fc抗体或Fc融合蛋白的亲和层析纯化方法。
本发明所提供的带Fc抗体或Fc融合蛋白的亲和层析纯化方法，包括如下步骤：将上述多肽小配体磁珠材料与待纯化带Fc抗体或Fc融合蛋白溶液混合，孵育2-3小时，孵育完毕后，磁力架分离，去除上清，将所得磁珠重悬，磁力架分离，去除上清，在所得磁珠中加入洗脱液，混匀，孵育5-6分钟，磁力架分离，收集上清，即可。
所述方法中，多肽小配体磁珠材料与待纯化带Fc抗体或Fc融合蛋白的配比可为5mg：25-100μg，具体可为5mg：25μg；
所述洗脱液具体可为0.2MPB(磷酸盐缓冲液)，pH3；
每10-20μL原始磁珠体积，加入100μL洗脱液。
本发明具有以下优点：
本发明所述的亲和分离材料不仅可用于实验室纯化抗体，更适宜于工业中规模化纯化抗体，且分离材料纯化抗体的特异性高、可反复多次使用、生物安全性良好、价格低廉、易保存。
附图说明
图1为抗体结构图。
图2为本发明实施例1制得的多肽小配体磁珠材料的透射电镜扫描结果图。
图3为本发明实施例1中磁珠材料氨基酸六聚体修饰前后的IR图(未修饰指的未结合多肽的磁珠材料，修饰是指结合了多肽后的磁珠材料)。
图4本发明实施例2中多肽小配体磁珠材料在简单基质-标准抗体中的应用SDS-PAGE结果图。A:5mg小配体磁珠&5mgProA磁珠各自亲和25μg-IgG1标准抗体SDS-PAGE图；B:重复实验。
图5为本发明实施例3中多肽小配体磁珠材料在复杂基质CHO表达的IgG1型抗体细胞上清中的应用SEC结果图。上:多肽小配体磁珠材料在复杂基质CHO表达的IgG1型抗体细胞上清中的应用SEC结果图；下:多肽小配体磁珠材料与ProA磁珠材料富集对比图。
图6为本发明实施例4中多肽小配体磁珠材料在复杂基质CHO表达的Fc融合型蛋白1细胞上清中的应用SEC结果图。上:多肽小配体磁珠材料在在复杂基质CHO表达的Fc融合型蛋白1细胞上清中的应用SEC结果图；下:多肽小配体磁珠材料与ProA磁珠材料富集对比图。
图7本发明实施例5中多肽小配体磁珠材料在复杂基质CHO表达的Fc融合型蛋白2细胞上清中的应用SEC结果图。上:多肽小配体磁珠材料在在复杂基质CHO表达的Fc融合型蛋白2细胞上清中的应用SEC结果图；下:多肽小配体磁珠材料与ProA磁珠材料富集对比图。
图8本发明实施例6中多肽小配体磁珠材料在复杂基质荷瘤小鼠血清中富集抗体的应用SEC结果图。A:多肽小配体磁珠材料在复杂基质荷瘤小鼠血清中富集抗体(多种类抗体)的应用SEC结果图；B:多肽小配体磁珠材料与ProA磁珠材料富集对比图。
图9氨基偶联磁珠结合HWRGWV后亲和纯化标准抗体的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、小配体磁珠材料的制备
1)磁珠制备
合成Fe3O4
取2.64g氯化铁(III)六水合物溶于22毫升的乙二醇于100mL三颈烧瓶中，超声15min，160℃的条件下搅拌约10分钟(磁子搅拌)。然后加入0.85g柠檬酸三钠二水合物和2.96g无水乙酸钠，在160℃下再混合15分钟使其充分溶解。然后将溶液置于不锈钢高压釜中，并加热到200℃12小时。冷却到室温后，黑色顺磁性产物经磁铁分离，用去离子水洗涤5次。最后的产品冻干成黑色粉末供进一步使用。
Fe3O4@SiO2-OH
将500mgFe3O4均匀分散于乙醇(200mL)、去离子水(5mL)超声15min，后加入氨水5mL(28-30wt％)于混合物三颈烧瓶中，超声15min。然后加入正硅酸乙酯(1mL)，70℃水浴搅拌(搅拌棒搅拌)6h后，用甲醇洗涤三次，水洗涤三次，最终产品冻干成粉末。
2)纳米颗粒表面修饰
将200mgFe3O4@SiO2-OH分散于50mL异丙醇(先加入约5mL，超声至固体分散均匀)，逐滴加入1.0mL3-氨丙基三乙氧基硅烷(先与异丙醇混合后加入至50mL离心管中，直至加满液封)，60℃机械搅拌24h。磁性分离后去除上清，并用50％异丙醇水溶液清洗3次。将清洗好的磁性纳米颗粒添加到丁二酸酐的DMF溶液中(50mL，2wt％)。将混合物在室温下搅拌24小时。之后，用去离子水和乙醇洗涤并在真空下干燥。得到Fe3O4@SiO2-COOH。取100mg的Fe3O4@SiO2-COOH，加入到100mM的PBS缓冲液中，并添加5:2(m/m)的EDC/NHS混合物50mg，旋转反应2h，磁性分离后去掉上清，并用PBS清洗3次以上。
3)磁珠固定多肽
用IAP缓冲液(50mMPBS,50mMNaCl,10mMNaH2PO4,pH＝7.6)1mL将多肽(氨基酸序列为HWRGWV，委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成)溶解成5mg/mL，加入制备好的磁珠(200mg)4℃旋转反应12h。
磁性分离后，将上清转移备用，将磁珠用0.5mLTris+甘氨酸缓冲溶液(0.1MTris-HCl+0.75M甘氨酸，pH＝8.3)将未键合的多肽冲洗干净(清洗3次)。用PBS置换残留的清洗缓冲液1次。
加入100mM的PBS存储制备好的多肽固定磁珠，长期保存建议加入0.01％叠氮化钠抑菌。
实施例2、小配体磁珠材料在简单基质-标准抗体中的应用
取5mg实施例1制备的多肽小配体磁珠材料，同时取5mgProA磁珠材料。抗体(一种人源化IgG1κ单克隆抗体标准物质，GBW(E)091164)配制成终浓度50μg/mL的抗体工作液。置于冰上备用。将上述材料进行磁性分离，吸除上清1(目的为清洗材料)，加入500μL抗体工作液(磁珠材料与抗体的配比为：5mg：25μg)。重悬后在室温翻转混合仪上翻转孵育2小时。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清2。加入500μL的PBS，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清3。重复洗涤三次。用0.2MPB(磷酸盐缓冲液)，pH3进行抗体的洗脱，每10-20μL原始磁珠体积，加入100μL洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中。离心管中提前加入0.1MNaOH(pH9)。收集上清，即洗脱液(抗体部分)。后用2％醋酸水溶液清洗材料，即洗填料。
结果显示：与ProA磁珠材料相比，多肽小配体磁珠材料的纯化能力更强，上清中残留的抗体较少，性能较好。具体结果见附图4。
实施例3、小配体磁珠材料在复杂基质CHO-K1表达的IgG1型抗体细胞上清(CHO-K1细胞中试生产IgG1型抗体第10天的经过深层过滤的细胞上清)中的应用
取25mg实施例1制备的多肽小配体磁珠材料，同时取25mgProA磁珠材料。将上述材料进行磁性分离，吸除上清，加入500μL细胞上清液。其他与实施例2中的步骤一致。
结果显示：与ProA磁珠材料相比，多肽小配体磁珠材料的纯化能力更强，其产率高于ProA磁珠材料，且纯度较高。具体结果见附图5。
实施例4、小配体磁珠材料在复杂基质CHO-K1表达的Fc融合型蛋白1细胞上清(CHO-K1细胞中试生产Fc融合型蛋白1第11天的经过深层过滤的细胞上清)中的应用
取25mg实施例1制备的多肽小配体磁珠材料，同时取25mgProA磁珠材料。将上述材料进行磁性分离，吸除上清，加入500μL细胞上清液。其他与实施例2中的步骤一致。
结果显示：与ProA磁珠材料相比，多肽小配体磁珠材料的纯化Fc融合型蛋白1能力更强，其产率高于ProA磁珠材料，且纯度较高。具体结果见附图6。
实施例5、小配体磁珠材料在复杂基质CHO-K1表达的Fc融合型抗体2(CHO-K1细胞中试生产Fc融合型蛋白2第11天的经过深层过滤的细胞上清)细胞上清中的应用
取25mg该多肽小配体磁珠材料，同时取25mgProA磁珠材料。将上述材料进行磁性分离，吸除上清，加入500μL细胞上清液。其他与实施例2中的步骤一致。
结果显示：与ProA磁珠材料相比，多肽小配体磁珠材料的纯化Fc融合型蛋白2能力更强，其产率高于ProA磁珠材料，且纯度较高。具体结果见附图7。
实施例6、小配体磁珠材料在复杂基质荷瘤小鼠血清(VitalRiver6-8周BALB/c裸鼠,适应一周后接人源化肺癌细胞养至10-12周，取血清)中富集抗体的应用
取25mg该多肽小配体磁珠材料，同时取25mgProA磁珠材料。将上述材料进行磁性分离，吸除上清，加入500μL荷瘤小鼠血清。其他与实施例1中的步骤一致。
结果显示：与ProA磁珠材料相比，多肽小配体磁珠材料在复杂基质-荷瘤小鼠血清中富集抗体效果较好，其产率高于ProA磁珠材料，且富集到多种抗体。具体结果见附图8。
对比例
氨基磁珠的制备
(1)将二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散于乙醇中，使得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒的浓度在5mg/mL，获得二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒分散液；
(2)向步骤(1)中加入烷基化试剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基三甲氧基硅烷、以及氨水，使得每0.1g二氧化硅包被的四氧化三铁纳米磁珠颗粒，对应添加烷基化试剂6mmol、以及氨水0.15mL，维持纳米颗粒的分散状态获得前体分散液；
(3)对于步骤(2)中获得的前体分散液，在室温至100℃反应8～12h发生烷基化反应，洗涤烘干后获得所述氨基磁珠。
氨基磁珠与HWRGWV配体结合
1、磁珠预处理：混匀磁珠后，取100μL磁珠到1mLEP管中，磁吸去除上清液，用200μLPBS溶液(50mMPBS，pH7.4)洗涤3次，磁吸去上清；
2、戊二醛活化：加入新鲜配制的100μL戊二醛溶液(15％)到EP管中，漩涡混匀使磁珠充分悬浮，用锡箔纸包裹后25℃反应1h(反应避光，以避免戊二醛自身发生聚合)，该期间保持磁珠的悬浮状态(可利用垂直混合仪进行颠倒混匀)；
3、活化后洗涤：磁珠活化后，磁吸去上清，用50mMPBS，pH7.4缓冲液洗涤3次；
4、磁珠偶联：磁珠与多肽配体(HWRGWV)的配比为：200mg：5mg；(合适用量及浓度需要根据具体实验进行优化，保持溶液pH≈8.0，必要时可加入0.05％Tween-20以提高磁珠分散性)，轻柔地混匀；用锡箔纸包裹(反应避光)后25℃偶联3h，或25℃偶联1h后放置4℃偶联过夜，偶联期间保持磁珠的悬浮状态(可利用垂直混合仪进行颠倒混匀)；
5、偶联后封闭：将EP管置于磁分离架上磁性分离去除上清液，加入500μLBSA/PBS溶液(pH7.2，含5％BSA)重悬磁珠(可根据需要进行超声)，25℃反应1h封闭磁珠表面非特异性吸附位点，该期间保持磁珠的悬浮状态(可利用垂直混合仪进行颠倒混匀)；
6、保存：将EP管置于磁性分离架上磁性分离去除上清液，用200μLPBS溶液(pH7.2)或保存溶液洗涤3次后，重新悬浮于保存溶液中(可根据需要来确定保存溶液的加入量，以调整偶联配体磁珠的浓度)，最后保存于4℃。必要时可以在保存溶液中加入0.02％(w/v)叠氮化钠(NaN3)抑制细菌生长。
取5mg氨基偶联结合多肽小配体磁珠材料，同时取5mgProA磁珠材料(商业化：ProteinA磁珠，P2108)。抗体(一种人源化IgG1κ单克隆抗体标准物质，GBW(E)091164)配制成终浓度50μg/mL的抗体工作液。置于冰上备用。将上述材料进行磁性分离，吸除上清1(目的为清洗材料)，加入500μL抗体工作液(磁珠材料与抗体的配比为：5mg：25μg)。重悬后在室温翻转混合仪上翻转孵育2小时。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清2。加入500μL的PBS，用移液器轻轻吹打重悬磁珠。置于磁力架上分离10秒，去除上清3。重复洗涤三次。用0.2MPB(磷酸盐缓冲液)，pH3进行抗体的洗脱，每10-20μL原始磁珠体积，加入100μL洗脱液，混匀后置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育5分钟。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，将上清转移到新的离心管中。离心管中提前加入0.1MNaOH(pH9)。收集上清，即洗脱液(抗体部分)。后用2％醋酸水溶液清洗材料两次，即wash1/2。
图9为氨基偶联磁珠结合HWRGWV后亲和纯化标准抗体的结果。
氨基偶联磁珠结合HWRGWV后亲和能力较差，不如ProA磁珠效果好，大部分蛋白存在于上清中。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (8)

1.一种多肽小配体磁珠亲和材料，通过包括如下步骤的方法制备得到：
1)磁珠制备
在碱性条件下，使得Fe3O4与硅酸烷基酯反应，得到Fe3O4@SiO2-OH纳米颗粒，即磁珠；
2)纳米颗粒表面修饰
将Fe3O4@SiO2-OH纳米颗粒分散于溶剂中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，50-65℃搅拌下反应20-26h，磁性分离，将所得磁性纳米颗粒与丁二酸酐反应，得到Fe3O4@SiO2-COOH，再将Fe3O4@SiO2-COOH中的羧基活化，得到表面修饰的纳米颗粒；
3)磁珠固定多肽
先配制多肽溶液，加入步骤2)得到表面修饰的纳米颗粒，反应，磁性分离，收集磁珠，将所得磁珠用缓冲溶液清洗去除未键合的多肽，即得，
所述多肽的氨基酸序列为：HWRGWV。
2.根据权利要求1所述的多肽小配体磁珠亲和材料，其特征在于：步骤1)中，所述硅酸烷基酯为正硅酸乙酯、正硅酸甲酯、正硅酸异丙酯中的至少一种；
Fe3O4与硅酸烷基酯的配比为500mg：0.8-1.5mL；
所述反应的温度为60-80℃，所述反应的时间为4-8h。
3.根据权利要求1所述的多肽小配体磁珠亲和材料，其特征在于：步骤2)中，所述溶剂为异丙醇；
Fe3O4@SiO2-OH与3-氨丙基三乙氧基硅烷、丁二酸酐的配比依次为200mg：0.8-1.5mL：0.8-1.2mg；
所述与丁二酸酐反应的温度为室温，时间为20-26h；
所述活化的操作为：将Fe3O4@SiO2-COOH与羧基活化剂反应，即可。
4.根据权利要求3所述的多肽小配体磁珠亲和材料，其特征在于：所述羧基活化剂为质量比5:2的EDC/NHS混合物；
Fe3O4@SiO2-COOH与所述EDC/NHS混合物的质量比为100mg：40-60mg；
所述活化的时间为1.5-2.5h。
5.根据权利要求1所述的多肽小配体磁珠亲和材料，其特征在于：步骤3)中，采用IAP缓冲液将所述多肽配制成多肽溶液，所述多肽溶液的浓度为4-6mg/mL；
表面修饰的纳米颗粒与多肽的配比为：200mg：4-6mg；
所述反应的温度为2-8℃，所述反应的时间为10-14h；
所述缓冲溶液为Tris+甘氨酸缓冲溶液，组成为：0.1MTris-HCl+0.75M甘氨酸，pH＝8.3。
6.权利要求1-5中任一项所述的多肽小配体磁珠亲和材料在带Fc抗体及Fc融合蛋白的亲和层析纯化中的应用。
7.一种带Fc抗体或Fc融合蛋白的亲和层析纯化方法，包括如下步骤：将权利要求1-5中任一项所述的多肽小配体磁珠亲和材料与待纯化带Fc的抗体或Fc融合蛋白溶液混合，孵育2-3小时，孵育完毕后，磁力架分离，去除上清，将所得磁珠重悬，磁力架分离，去除上清，在所得磁珠中加入洗脱液，混匀，孵育5-6分钟，磁力架分离，收集上清，即可。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述多肽小配体磁珠材料与待纯化带Fc抗体或Fc融合蛋白的配比为5mg：25-100μg；
所述洗脱液为0.2MPB，pH3；
每10-20μL原始磁珠体积，加入100μL洗脱液。
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