CN116323973A - 一种分析经固定的细胞的组分的方法 - Google Patents

一种分析经固定的细胞的组分的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116323973A
CN116323973A CN202180060435.3A CN202180060435A CN116323973A CN 116323973 A CN116323973 A CN 116323973A CN 202180060435 A CN202180060435 A CN 202180060435A CN 116323973 A CN116323973 A CN 116323973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
cells
kit
sequence
capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180060435.3A
Other languages
English (en)
Inventor
施威扬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Wancheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Wancheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Wancheng Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Wancheng Biotechnology Co ltd
Publication of CN116323973A publication Critical patent/CN116323973A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了一种分析经固定的细胞的组分的方法，其包括将至多1个所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同包裹在分隔区中，所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述细胞中的组分或其部分；在使得所述分隔区中的所述细胞组分或其部分解交联、且在使经解交联的所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获的条件下孵育所述分隔区；从所述分隔区中释放所述粒子；通过分析经释放的所述粒子上的多核苷酸序列来分析所述经固定的细胞的组分或其成分。还提供了一种用于分析经固定的细胞的组分的试剂盒，以及一种分析经固定的细胞的组分的系统。

Description

一种分析经固定的细胞的组分的方法 技术领域
本申请涉及高通量测序技术领域，具体涉及一种分析经固定的细胞的组分的方法及其应用。
背景技术
细胞是生物结构与功能的基本组成单位，对于研究生物体运动规律有重要作用。不同类型的细胞结构、功能有很大的区别。单细胞基因组可以展示不同细胞的特征，解决细胞异质性问题，而且对于研究不同种类单细胞的行为、机制以及与机体的关系有重要的意义。目前，将高通量测序运用于单细胞研究的测序方法成为一种有效的研究方式。
Macosko等人通过Drop-Seq技术，将单个细胞分离到纳升(nanoliter)大小的液滴中，从而将不同的条码与每个细胞的RNA相连以标记活细胞，并将其一起进行测序，实现高通量的转录组测序(参见Macosko,E.Z.,Basu,A.,Satija,R等人(2015).Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets.Cell,161(5),1202–1214)。
然而该方法无法对活细胞内部的蛋白进行标记，并且由于很多信号通路的蛋白只有修饰后才有活性，所测得的蛋白总量并不能反映信号通路的活性，不能反映其活性成分。并且，利用活细胞进行测序的方法限制了实验的灵活性，处理样品中发生的细胞死亡、mRNA降解会影响测序的准确性。同时，对于固定的病理样品或石蜡包埋的样品无法利用此方法进行单细胞测序。因此，亟待开发新的单细胞高通量测序方法来满足研究需要。
发明内容
本申请提供了一种分析经固定的细胞的组分的方法及其应用。本申请提供的方法具有以下特点：1)可以分析经固定的细胞及其组分；2)可以高通量地定量分析单个经固定的细胞的转录组信息；3)可以高通量地定量分析经固定的细胞的蛋白质组信息；4)可以同时获得经固定的细胞的蛋白质组和转录组信息。
本申请提供了一种分析经固定的细胞的组分的方法，所述方法包括下述步骤：a)将至多1个所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同包裹在分隔区中，所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述细胞中的组分或其部分；b)在使得所述分隔区中的所述细胞组分或其部分解交联、且在使经解交联的所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获的条件下孵育所述分隔区；c)从所述 分隔区中释放所述粒子；d)通过分析经释放的所述粒子上的多核苷酸序列来分析所述经固定的细胞的组分或其成分。
在某些实施方式中，所述经固定的细胞经过固定剂固定，所述固定剂选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。在某些实施方式中，所述固定剂的浓度为至少0.1％v/v。在某些实施方式中，其中待分析的所述经固定的细胞包含至少10 5个细胞。
在某些实施方式中，各分隔区中包含至多1个所述包含多核苷酸的粒子。
在某些实施方式中，在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：在固定所述细胞前将其重悬于缓冲液中，且所述缓冲液包括PBS缓冲液。
在某些实施方式中，所述固定的温度为5-35℃。在某些实施方式中，所述固定的时间为至少5分钟。
在某些实施方式中，在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：向所述细胞中加入固定终止剂来终止固定，所述固定终止剂包括甘氨酸。在某些实施方式中，所述固定终止剂的浓度为至少0.1M。在某些实施方式中，所述终止固定的温度为5-35℃。在某些实施方式中，所述终止固定的时间为至少3分钟。
在某些实施方式中，在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：在所述终止固定后，将所述经固定的细胞保存在至少4℃以下条件下。
在某些实施方式中，在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：将所述经固定的细胞重悬于捕获缓冲液中，所述捕获缓冲液包括PBS缓冲液。在某些实施方式中，所述捕获缓冲液还包括BSA和RNA酶抑制剂。在某些实施方式中，所述BSA的浓度为至少0.1％v/v；和/或，所述RNA酶抑制剂的浓度为至少0.1v/v。在某些实施方式中，所述捕获缓冲液的pH为6-9。
在某些实施方式中，所述细胞组分包含蛋白质，且在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：将所述经固定的细胞和与所述蛋白质特异性结合的结合试剂共同孵育，使所述结合试剂与所述蛋白质结合。在某些实施方式中，所述结合试剂包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。在某些实施方式中，所述结合试剂的种类为至少一种。在某些实施方式中，所述共同孵育的温度为1℃-10℃。在某些实施方式中，所述共同孵育的时间为0.5小时-5小时。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体标签。在某些实施方式中，所述抗体标签包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列彼此不 同。
在某些实施方式中，在所述步骤a)之前，所述方法还包括如下的步骤：在所述共同孵育完成后，去除未与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合的所述结合试剂。
在某些实施方式中，在所述步骤a)之前，所述方法还包括如下的步骤：在所述共同孵育完成后，将经所述捕获孵育的细胞重悬在所述捕获缓冲液中。
在某些实施方式中，在所述步骤a)中，所述粒子包括微球。
在某些实施方式中，所述分隔区选自以下组：微油滴、微乳液滴和多孔板中的孔。在某些实施方式中，所述分隔区通过微流控设备形成。
在某些实施方式中，所述识别序列包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列，其中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列相同，且不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列彼此不同。在某些实施方式中，同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列彼此不同。
在某些实施方式中，所述细胞组分包含转录组，且所述捕获序列能够直接捕获所述转录组。在某些实施方式中，所述捕获序列通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。在某些实施方式中，所述捕获序列包含poly T。
在某些实施方式中，每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目为至少10 7个。
在某些实施方式中，所述分隔区中包含细胞裂解液，所述细胞裂解液中包含蛋白酶、去垢剂和盐。在某些实施方式中，所述蛋白酶包括蛋白酶K。在某些实施方式中，所述去垢剂选自以下组：SDS、Tween、Triton、sarkysol和NP-40。在某些实施方式中，所述盐选自以下组：氯化钠、氯化钙、氯化钾、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。
在某些实施方式中，在步骤b)中，所述孵育的温度为50℃-80℃。在某些实施方式中，在步骤b)中，所述孵育的时间为0.5小时-3小时。
在某些实施方式中，在步骤c)中，所述释放包括使所述分隔区破裂。
在某些实施方式中，所述的方法还包括回收所述经释放的粒子。
在某些实施方式中，在步骤d)中，所述分析包括延伸和/或扩增所述回收的粒子上的所述多核苷酸，得到经扩增的多核苷酸。在某些实施方式中，所述延伸和/或扩增的方法包括PCR。
在某些实施方式中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞转录组核酸。在某些实施方式中，通过分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目。在某些实施方式中，通过 分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞抗体标签组核酸。在某些实施方式中，通过分析所述单细胞抗体标签组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞中的每种蛋白质的数目。
另一方面，本申请还提供了用于分析经固定的细胞的组分的试剂盒，其包括：1)包含多核苷酸的粒子，所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述经固定的细胞中的组分或其部分；以及2)使所述细胞组分或其部分解交联的试剂。
在某些实施方式中，所述的试剂盒中所述粒子包括微球。
在某些实施方式中，所述的试剂盒中所述识别序列包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列，其中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列相同，且不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列彼此不同。在某些实施方式中，同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列彼此不同。在某些实施方式中，所述的试剂盒中所述捕获序列包含poly T。
在某些实施方式中，每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目为至少10 7个。
在某些实施方式中，所述使所述细胞组分或其部分解交联的试剂包括细胞裂解液，所述细胞裂解液中包含缓冲液、蛋白酶、去垢剂和盐。在某些实施方式中，所述缓冲液包括PBS和/或Tris。在某些实施方式中，所述蛋白酶包括蛋白酶K。在某些实施方式中，所述去垢剂选自以下组：SDS、Tween、Triton、sarkysol和NP-40。在某些实施方式中，所述盐选自以下组：氯化钠、氯化钙、氯化钾、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。在某些实施方式中，所述试剂盒还包含固定所述经固定的细胞的固定剂，所述固定剂选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。在某些实施方式中，所述固定剂的浓度为至少0.1％v/v。
在某些实施方式中，所述试剂盒还包括固定缓冲液，所述固定缓冲液包括PBS缓冲液。
在某些实施方式中，所述试剂盒还包括终止所述固定的固定终止剂，所述固定终止剂包含甘氨酸。在某些实施方式中，所述固定终止剂的浓度为至少0.1M。在某些实施方式中，所述试剂盒还包括捕获缓冲液，所述捕获缓冲液包括PBS缓冲液。在某些实施方式中，所述捕获缓冲液还包括BSA和RNA酶抑制剂。在某些实施方式中，所述BSA的浓度为至少0.1％v/v；和/或，所述RNA酶抑制剂的浓度为至少0.1v/v。在某些实施方式中，所述捕获缓冲液的pH为6-9。
在某些实施方式中，所述试剂盒还包括结合试剂，所述结合试剂与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合。在某些实施方式中，所述结合试剂包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。在某些实施方式中，所述结合试剂的种类为至少一种。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体标签。在某些实施方式中，所述抗体标签包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列彼此不同。
在某些实施方式中，所述细胞组分包含转录组，且所述捕获序列能够直接捕获所述转录组；和/或，其中所述捕获序列通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。在某些实施方式中，其还包括用于扩增所述多核苷酸所需的试剂。在某些实施方式中，所述扩增多核苷酸所需的试剂选自以下组：引物、Mg 2+、DNA聚合酶和逆转录酶。
另一方面，本申请提供了一种分析经固定的细胞的组分的系统，所述系统包括：a)分隔模块，其用于将所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同分隔至分隔区中，其中所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述细胞中的组分或其部分；b)孵育模块，其用于孵育所述分隔区，从而使所述分隔区中的所述细胞组分或其部分解交联、且使经解交联的所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获；c)裂解模块，其用于从所述分隔区中释放所述粒子；d)分析模块，其能够通过分析经释放的所述粒子上的多核苷酸序列而分析所述经固定的细胞的组分。在某些shishifang中在所述分隔模块前，所述系统还包括i)固定模块，其用于获得所述经固定的细胞。
在某些实施方式中，所述经固定的细胞经过固定剂固定，所述固定剂选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。在某些实施方式中，所述固定剂的浓度为至少0.1％v/v。在某些实施方式中，所述固定的温度为5-35℃。在某些实施方式中，所述固定的时间为至少5分钟。在某些实施方式中，在所述固定模块中，其还可以用于在固定所述细胞前，将所述细胞重悬于缓冲液中，且所述缓冲液包括PBS缓冲液。
在某些实施方式中，在所述固定模块中，其还可以用于终止固定所述细胞，所述终止固定利用固定终止剂，所述固定终止剂包括甘氨酸。在某些实施方式中，所述固定终止剂的浓度为至少0.1mol。在某些实施方式中，所述终止固定的温度为5-35℃。在某些实施方式中，所述终止固定的时间为至少3分钟。在某些实施方式中，在所述固定模块中，其还可以用于在所述终止固定后，将所述经固定的细胞保存在4℃以下条件下。在某些实施方式中，在所述 固定模块中，其还可以用于将所述经固定的细胞重悬于捕获缓冲液中，所述捕获缓冲液包括PBS缓冲液。在某些实施方式中，所述捕获缓冲液还包括BSA和RNA酶抑制剂。在某些实施方式中，所述BSA的浓度为至少0.1％v/v；和/或，所述RNA酶抑制剂的浓度为至少0.1v/v。在某些实施方式中，所述捕获缓冲液的pH为6-9。
在某些实施方式中，所述细胞组分包含蛋白质，在所述固定模块中，其还可以用于将所述经固定的细胞和与所述蛋白质特异性结合的结合试剂共同孵育，使所述结合试剂与所述蛋白质结合。在某些实施方式中，所述结合试剂包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。在某些实施方式中，所述结合试剂的种类为至少一种。
在某些实施方式中，所述共同孵育的温度为1℃-10℃。在某些实施方式中，所述共同孵育的时间为0.5小时-5小时。
在某些实施方式中，所述抗体包含抗体标签。在某些实施方式中，所述抗体标签包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列彼此不同。
在某些实施方式中，在所述固定模块中，其还可以用于在所述共同孵育完成后，去除未与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合的所述结合试剂。在某些实施方式中，在所述固定模块中，其还可以用于在所述共同孵育完成后，将经所述捕获孵育的细胞重悬在所述捕获缓冲液中。
在某些实施方式中，其中待分析的所述经固定的细胞包含至少10 5个细胞。
在某些实施方式中，各分隔区中包含至多1个所述包含多核苷酸的粒子。在某些实施方式中，在所述分隔模块中，所述粒子包括微球。在某些实施方式中，所述分隔区选自以下组：微油滴、微乳液滴和多孔板中的孔。在某些实施方式中，所述分隔区通过微流控设备形成。
在某些实施方式中，所述识别序列包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列，其中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列相同，且不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列彼此不同。在某些实施方式中，同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列彼此不同。
在某些实施方式中，所述细胞组分包含转录组，且所述捕获序列能够直接捕获所述转录组。在某些实施方式中，所述捕获序列通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。在某些实施方式中，其中所述捕获序列包含poly T。
在某些实施方式中，每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目为至少10 7个。
在某些实施方式中，所述分隔区中包含细胞裂解液，所述细胞裂解液中包含蛋白酶、去 垢剂和盐。在某些实施方式中，所述蛋白酶包括蛋白酶K。在某些实施方式中，所述去垢剂选自以下组：SDS、Tween和Triton。在某些实施方式中，所述盐选自以下组：氯化钠、氯化钙、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。
在某些实施方式中，在所述孵育模块中，所述孵育的温度为50℃-80℃。在某些实施方式中，在所述孵育模块中，所述孵育的时间为0.5小时-3小时。在某些实施方式中，在所述裂解模块中，所述释放包括使所述分隔区破裂。
在某些实施方式中，所述系统还包括回收所述经释放的粒子。
在某些实施方式中，在所述分析模块中，所述分析包括延伸和/或扩增所述回收的粒子上的所述多核苷酸，得到经扩增的多核苷酸。在某些实施方式中，所述延伸和/或扩增的系统包括PCR。
在某些实施方式中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞转录组核酸。
在某些实施方式中，通过分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目。
在某些实施方式中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞抗体标签组核酸。
在某些实施方式中，通过分析所述单细胞抗体标签组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种蛋白质的数目。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本公开的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本公开的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本公开的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是哺乳动物细胞系新鲜细胞和甲醛固定细胞单细胞转录组测序比较结果。固 定细胞与新鲜细胞单细胞转录组关键参数对比。
图2显示的是哺乳动物细胞系新鲜细胞和甲醛固定细胞单细胞基因表达谱比较结果。固定细胞及新鲜细胞降维分析。
图3显示的是哺乳动物细胞系新鲜细胞和甲醛固定细胞单细胞单个基因进行表达相似度比较结果。单细胞表达谱相关度统计分析，R＝0.82。
图4显示的是新鲜和固定的人细胞系及小鼠细胞系单细胞转录本检测数目的结果。基因检测数目相似。
图5显示的是人细胞系大量细胞，新鲜单细胞与固定单细胞转录组相关性(R分析)的结果。固定单细胞与新鲜单细胞相关性高。
图6显示的是微流控芯片的通道示意图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“经固定的细胞”通常是指通过固定剂固定后获得的细胞。固定剂可以使细胞内的蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应，防止细胞的自溶，以免抗原扩散至组织间质，从而保持细胞的固有形态和结构。在本申请中，所述固定剂可选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。
在本申请中，术语“多核苷酸”通常是指核苷酸聚合成的链状化合物，一般可由15个以上的核苷酸聚合而成，例如，由15个以上，16个以上，17个以上，18个以上，19个以上，20个以上，21个以上，22个以上，23个以上，24个以上，25个以上等的核苷酸聚合而成。本申请中多核苷酸可含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列。
在本申请中，术语“粒子”通常是指包含能够直接或间接捕获本申请所述经固定的细胞中的组分或其部分的所述多核苷酸的微粒，其直径可约为0.1至100μm。在本申请中，所述粒子包含的所述多核苷酸可含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述细胞中的组分或其部分。
在本申请中，术语“分隔区”通常是指包裹有待检测的所述经固定的细胞和所述粒子的单独分离的、微小的空间。在本申请中，所述分隔区可包裹有至多1个所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子。在本申请中，所述分隔区可选自以下组：微油滴、微乳液滴和多孔板中的孔。在本申请中，所述分隔区可通过微流控设备形成。
在本申请中，术语“微流控设备”通常是指利用微流体(Microfluidics)把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程。本申请中所述微流控设备可包括微流控芯片。
在本申请中，术语“识别序列”通常是指所述粒子上带有的可以特异性标识所述经固定的细胞和/或所述经固定的细胞中的组分或其部分的序列。在本申请中，所述识别序列可细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列和捕获序列。
在本申请种，术语“PCR处理序列”是指所有粒子上共有的序列，其目的是待粒子捕获单细胞转录组核酸后便于PCR延伸和/或扩增所述识别序列。
在本申请中，术语“细胞特异性识别序列”通常是指所述粒子上带有的可以特异性识别某种细胞的核酸序列。在本申请中，同一粒子上包含的所述细胞特异性识别序列相同，且不同粒子上包含的所述细胞特异性识别序列彼此不同。在本申请中，所述细胞特异性识别序列可包括细胞条形码序列(cell barcode)。在本申请中，术语“条形码序列”通常是指识别细胞的引物上所带识别序列(例如至少包括12个碱基的识别序列)。所述条形码序列可以通过至少12轮的分类-汇合过程中DNA寡核苷酸标记而制得，在每一轮的分类-汇合中，先将所述粒子等分成四组，再向每组粒子中分别加入A、T、C和G四种不同的碱基，再将四组粒子汇合混匀以便下一轮的标记。经过12轮的分类-汇合后，共获得至少4 12(16777216)种排列组合。例如，通过至少13轮的分类-汇合过程，共获得至少4 13种排列组合；通过至少14轮的分类-汇合过程，共获得至少4 14种排列组合；通过至少15轮的分类-汇合过程，共获得至少4 15种排列组合；通过至少16轮的分类-汇合过程，共获得至少4 16种排列组合；通过至少17轮的分类-汇合过程，共获得至少4 17种排列组合；通过至少18轮的分类-汇合过程，共获得至少4 18种排列组合；通过至少19轮的分类-汇合过程，共获得至少4 19种排列组合；通过至少20轮的分类-汇合过程，共获得至少4 20种排列组合等。在本申请中，所述条形码序列还可以由其他方法合成获得，例如，可以通过combinatory labeling，或者数轮标记的方法获得。在所述数轮标记的方法中，每一轮扩增都可以由固定数目的模板序列完成。例如，所述数轮标记的方法可以为96×96×96标记。
在本申请中，术语“分子特异性识别序列”通常是指可以特异性识别某种分子的核酸序列。在本申请中，所述分子特异性识别序列可包括特异性分子识别符(unique molecular identifier，UMI)。在本申请中，术语“特异性分子识别符”是指每个分子上带有的至少包括8个碱基的识别序列，每个碱基可分别有A、T、C和G四种选择，其共有至少4 8(65536)种排列组合的特异性识别序列，所述特异性识别序列即为所述分子的UMI。例如，每个分子 上带有至少9个碱基，共有至少4 9种排列组合；每个分子上带有至少10个碱基，共有至少4 10种排列组合；每个分子上带有至少11个碱基，共有至少4 11种排列组合；每个分子上带有至少12个碱基，共有至少4 12种排列组合；每个分子上带有至少13个碱基，共有至少4 13种排列组合；每个分子上带有至少14个碱基，共有至少4 14种排列组合；每个分子上带有至少15个碱基，共有至少4 15种排列组合等。
在本申请中，术语“捕获序列”通常是指能够直接或间接捕获所述经固定的细胞中的组分或其部分的序列。例如，所述捕获序列可以与所述经固定的细胞中的mRNA结合。和/或，所述捕获序列可以与能够特异性结合所述经固定的细胞中的蛋白质的抗体上的标签结合。在本申请中，所述捕获序列可以位于所述识别序列末端，并且可以为约30bp长的poly T序列。术语“poly T”是指仅具有重复的胸腺嘧啶残基的寡核苷酸。所述捕获序列可出现在本申请所述任何序列的末端，可用于捕获细胞中的组分或其部分，例如mRNA或DNA寡核苷酸。
在本申请中，术语“细胞中的组分或其部分”通常是指所述经固定的细胞的转录组和/或蛋白质组。
在本申请中，术语“解交联”通常是指去除固定剂造成的蛋白质与蛋白质之间以及蛋白质与核酸之间的化学交联作用。在本申请中，解交联还包括释放和细胞中抗原结合的抗体上的DNA寡核苷酸标签。
在本申请中，术语“捕获”通常是指通过所述粒子上的识别序列特异性识别并结合细胞中的组分或其部分。在本申请中，可利用捕获缓冲液进行捕获。
在本申请中，术语“释放”通常是指已特异性结合了细胞中的组分或其部分(例如mRNA或DNA寡核苷酸)的微粒从所述液滴或其他形式的分隔区中脱离的过程。在本申请中，所述释放包括使所述分隔区破裂。
在本申请中，术语“固定剂”通常是指用于固定细胞或其他组分所使用的试剂，其可防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质和RNA的分解作用，使细胞内的各种成分如核酸、蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质。常见的固定剂可包括四氧化锇、甲醛、甲醇、戊二醛等。
在本申请中，术语“结合试剂”通常是指包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体的溶液。
在本申请中，术语“单细胞转录组核酸”通常是单个所述经固定的细胞的转录产物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA以及其他各种非编码RNA。在本申请中，通过分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可以鉴别来 源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目。
在本申请中，术语“单细胞抗体标签组核酸”通常是指特异性结合于单个所述经固定的细胞中的蛋白质的结合试剂(例如，抗体)上所带有的标签的集合。在本申请中，通过分析所述单细胞抗体标签组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可以鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种蛋白质的数目。
在本申请中，术语“分隔模块”通常是指本申请所述系统中用于将所述固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同分隔至分隔区中的模块，其可包括通过微流控设备形成的微油滴、微乳液滴和多孔板中的孔。在本申请中，所述分隔模块可包括微球。
在本申请中，术语“孵育模块”通常是指通过提供特定的反应条件而使得从分隔模块获得的细胞组分或其部分解交联、且使经解交联得所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获的模块。
在本申请中，术语“裂解模块”通常是指用于释放分隔模块中获得所述粒子的模块。
在本申请中，术语“分析模块”通常是指用于分析经释放的所述粒子上的多核苷酸序列进而分析所述经固定的细胞的组分或其部分的模块。
在本申请中，术语“固定模块”通常是指用于获得所述经固定的细胞的模块。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
如本申请中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本申请中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
方法
本申请提供了一种分析经固定的细胞的组分的方法，所述方法可包括下述步骤：a)将至多1个所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同包裹在分隔区中，所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述细胞中的组分或其部分；b)在使得所述分隔区中的所述细胞组分或其部分解交联、且在使经解交联的所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获的条件下孵育所述分隔区；c)从所述分隔区中释放所述粒子；d)通过分析经释放的所述粒子上的多核苷酸序列来分析所述经固定的细胞的组分或其成分。
在本申请所述的方法中，所述经固定的细胞经过固定剂固定，所述固定剂可选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。在本申请中，所述固定剂的浓度可至少为0.1％v/v。例如，所述固定剂的浓度可至少为1.5％v/v，可至少为2％v/v，可至少为2.5％v/v，可至少为3％v/v，可至少为3.5％v/v，可至少为4％v/v，可至少为4.5％v/v等。例如，所述固定剂的浓度可以为至少1％v/v。
在本申请所述的方法中，待分析的所述经固定的细胞可至少为10 5个细胞。例如，所述经固定的细胞可至少为1.1×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.2×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.3×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.4×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.5×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.6×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.7×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.8×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.9×10 5个，所述经固定的细胞可至少为2×10 5个等。
在本申请所述的方法中，各分隔区中可至多包含1个所述包含多核苷酸的粒子。
在本申请的所述步骤a)之前，所述方法还可包括下述步骤：在固定所述细胞前将其重悬于缓冲液中，且所述缓冲液包括PBS缓冲液。在某些实施方式中，所述固定的温度可为5-35℃，例如，所述固定的温度可为10-30℃，所述固定的温度可为15-28℃，所述固定的温度可为20-25℃，所述固定的温度可为21-25℃，所述固定的温度可为22-25℃，所述固定的温度可为23-25℃等。所述固定的时间可为至少5分钟，例如，所述固定的时间可为至少10分钟，所述固定的时间可为至少15分钟，所述固定的时间可为至少20分钟，所述固定的时间可为至少25分钟，所述固定的时间可为至少30分钟等。
在本申请的所述步骤a)之前，所述方法还可包括下述步骤：向所述细胞中加入固定终止剂来终止固定，所述固定终止剂包括甘氨酸。在本申请中，所述固定终止剂的浓度可至少为0.1M例如，所述固定终止剂的浓度可至少为0.11M，所述固定终止剂的浓度可至少为0.12M，所述固定终止剂的浓度可至少为0.125M，所述固定终止剂的浓度可至少为0.13M等。在某些实施方式中，所述终止固定的温度可为5-35℃，例如，所述终止固定的温度可为5-35℃，所述终止固定的温度可为10-30℃，所述终止固定的温度可为15-28℃，所述终止固定的温度可为20-25℃，所述终止固定的温度可为21-25℃，所述终止固定的温度可为22-25℃，所述终止固定的温度可为23-25℃等。所述终止固定的时间可为至少3分钟，例如，所述固定的时间可为至少4分钟，所述固定的时间可为至少5分钟，所述固定的时间可为至少6分钟，所述固定的时间可为至少7分钟，所述固定的时间可为至少8分钟，所述固定的时间可为至少9分钟，所述固定的时间可为至少10分钟等。
在本申请的所述步骤a)之前，所述方法还可包括下述步骤：在所述终止固定后，将所述经固定的细胞可以保存在4℃以下条件下。例如，所述经固定的细胞可以保存在-20℃以下条件下；或者，所述经固定的细胞可以保存在-80℃以下条件下.
在本申请的所述步骤a)之前，所述方法还可包括下述步骤：将所述经固定的细胞重悬于捕获缓冲液中，所述捕获缓冲液可包括PBS缓冲液。在某些实施方式中，所述捕获缓冲液还可包括BSA和RNA酶抑制剂。在某些实施方式中，所述BSA的浓度可至少为0.1％v/v，(例如，所述所述BSA的浓度可为至少0.2％v/v，至少0.3％v/v，至少0.4％v/v或至少0.5％v/v或更高)；和/或，所述RNA酶抑制剂的浓度可至少为0.1v/v(例如，所述所述RNA酶抑制剂的浓度可为至少0.2％v/v，至少0.3％v/v，至少0.4％v/v或至少0.5％v/v或更高)。在某些实施方式中，所述捕获缓冲液的pH可为6-9(例如，所述捕获缓冲液的pH可以为6，可以为6.5，可以为7，可以为7.5，可以为8，可以为8.5或可以为9)。
在本申请中，所述细胞组分可包含蛋白质，且在所述步骤a)之前，所述方法还可包括下述步骤：将所述经固定的细胞和与所述蛋白质特异性结合的结合试剂共同孵育，使所述结合试剂与所述蛋白质结合。在某些实施方式中，所述结合试剂可包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。在某些实施方式中，所述结合试剂的种类可至少为一种。
在本申请中，所述共同孵育的温度可为1℃-10℃，例如，所述共同孵育的温度可为2℃-9℃，所述共同孵育的温度可为3℃-8℃，所述共同孵育的温度可为3℃-7℃，所述共同孵育的温度可为3℃-6℃，所述共同孵育的温度可为3℃-5℃等。所述共同孵育的时间可为0.5小时-5小时，例如，所述共同孵育的时间可为0.5小时-4小时，所述共同孵育的时间可为0.5小时-3小时，所述共同孵育的时间可为0.5小时-2小时等。
在本申请中，所述抗体可包含抗体标签。在本申请中，所述抗体标签可包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸可包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列彼此不同。
在本申请的所述步骤a)之前，所述方法还可包括如下的步骤：在所述共同孵育完成后，去除未与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合的所述结合试剂。
在本申请的所述步骤a)之前，所述方法还可包括如下的步骤：在所述共同孵育完成后，将经所述捕获孵育的细胞重悬在所述捕获缓冲液中。
在本申请的所述步骤a)中，所述粒子可包括微球。
在本申请中，所述分隔区可选自以下组：微油滴、微乳液滴和多孔板中的孔。在本申请中，所述分隔区可通过微流控设备形成。在微流控设备中，液滴可以通过丁字节点(T junctions)或流动聚焦(flow focusing)的方式形成(参见Xu,J.H.,Li,S.W.,Tan,J.,&Luo,G.S.(2008). Correlations of droplet formation in T-junction microfluidic devices:From squeezing to dripping.Microfluidics and Nanofluidics,5(6),711–717)。具体来说，在丁字节点中，可以通过由于剪切力和流体与流体界面处的界面张力，产生分散相的液滴，例如，液滴可以通过横流剪力法(cross-flow shear method)形成，具体可分为挤出方式(squeezing regime)，滴出方式(dripping regime)和瞬时方式(transient regime)(参见Xu,J.H.,Li,S.W.,Tan,J.,&Luo,G.S.(2008).Correlations of droplet formation in T-junction microfluidic devices:From squeezing to dripping.Microfluidics and Nanofluidics,5(6),711–717)。在流动聚焦(flow focusing)的方式中，注入连续相让其通过两个外部通道和分散阶段，然后使其通过中央通道注入狭窄的孔口来形成液滴(参见Xu,J.H.,Li,S.W.,Tan,J.,&Luo,G.S.(2008).Correlations of droplet formation in T-junction microfluidic devices:From squeezing to dripping.Microfluidics and Nanofluidics,5(6),711–717)。
在本申请中，所述识别序列可包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列。在某些实施方式中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列可相同，且不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列可彼此不同。在某些实施方式中，同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列可彼此不同。
在本申请中，所述细胞组分可包含转录组，且所述捕获序列可直接捕获所述转录组。
在本申请中，所述捕获序列可通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。在本申请中，所述捕获序列可包含poly T。
在本申请中，每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目可至少为10 7个，例如，可至少为1.1×10 7个，可至少为1.2×10 7个，可至少为1.3×10 7个，可至少为1.4×10 7个，可至少为1.5×10 7个，可至少为2×10 7个等。
在本申请中，所述分隔区中可包含细胞裂解液，所述细胞裂解液中可包含缓冲液、蛋白酶、去垢剂和盐。所述细胞裂解液可提供适合的裂解环境，抑制核酸酶对核酸的破坏。所述去垢剂可通过使蛋白质变性，破坏膜结构，并解开与核酸相连的蛋白质。所述缓冲液可以包括PBS和/或Tris。蛋白酶可将蛋白质消化成更小的片段，促进核酸与蛋白质的分离，便于后续的纯化操作以获得更纯的核酸。在本申请中，所述蛋白酶可包括蛋白酶K。所述蛋白酶K为枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，可用于蛋白酶的降解。在某些实施方式中，所述去垢剂可选自以下组：SDS、Tween、Triton、sarkysol和NP-40。在某些实施方式中，所述盐选可自以下组：氯化钠、氯化钙、氯化钾、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。
在本申请的所述步骤b)中，所述孵育的温度可为50℃-80℃，例如，孵育的温度可为57℃ -78℃，孵育的温度可为60℃-80℃，孵育的温度可为65℃-75℃，孵育的温度可为50℃-78℃，孵育的温度可为55℃-78℃，孵育的温度可为50℃-75℃，孵育的温度可为55℃-75℃，孵育的温度可为50℃-65℃或孵育的温度可为50℃-60℃。所述孵育的时间可为0.5小时-3小时，例如，孵育的时间可为0.6小时-2.9小时，孵育的时间可为0.7小时-2.8小时，孵育的时间可为1小时-2.5小时，孵育的时间可为1小时-2小时等。
在本申请的所述步骤c)中，所述释放可包括使所述分隔区破裂，破裂可包括微油滴、微乳液滴等分隔区在剪应力的作用下自然破裂；也可包括在人工施加的外界作用下破裂。例如，可以通过利用电场精确操纵带电液滴的破裂使分隔区破裂(参见Ruffert,C.(2016).Magnetic bead-magic bullet.Micromachines,7(2))。又例如，可以通过添加有机溶剂(例如烷类化合物，全氟醇)并加以机械震荡而使分隔区破裂。
本申请所述的方法还可包括回收所述经释放的粒子。例如，可以利用磁珠进行回收(参见Ruffert,C.(2016).Magnetic bead-magic bullet.Micromachines,7(2))，可以利用生物素或链霉素亲和系统进行回收(参见Chodosh,Lewis A.,and Stephen Buratowski."Purification of DNA‐Binding Proteins Using Biotin/Streptavidin Affinity Systems."Current protocols in protein science 12.1(1998):9-7.)。
在本申请的所述步骤d)中，所述分析可包括延伸和/或扩增所述回收的粒子上的所述多核苷酸，得到经扩增的多核苷酸。
在本申请中，所述延伸和/或扩增的方法可包括PCR。
在本申请中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可以鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞转录组核酸。通过分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可以鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目。
具体而言，由于每个分隔区中包括至多一个粒子，同一个粒子上带有的细胞特异性识别序列相同，包含被同一个分隔区中的粒子捕获的单细胞转录组核酸的所述经扩增的多核苷酸中的所述细胞特异性识别序列相同。本申请所述的方法通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞转录组核酸。
由于每个所述粒子上的所述多核苷酸中的所述分子特异性识别序列(例如，UMI)可以经随机排列组合产生而不同，包含被同一个分隔区中的粒子捕获的单细胞转录组核酸的所述经扩增的多核苷酸中的所述分子特异性识别序列各自不同。通过对不同的所述分子特异性识 别序列进行分别计数，可以获知所述分子特异性识别序列所对应的每种转录基因的数目。因此，本申请所述的方法通过分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目。
在本申请中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可以鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞抗体标签组核酸。通过分析所述单细胞抗体标签组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可以鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种蛋白质的数目。
具体而言，由于每个分隔区中包括至多一个粒子，同一个粒子上带有的细胞特异性识别序列相同，包含被同一个分隔区中的粒子捕获的单细胞抗体标签组核酸的所述经扩增的多核苷酸中的所述细胞特异性识别序列相同。本申请所述的方法通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞抗体标签组核酸。
由于每个所述粒子上的所述多核苷酸中的所述分子特异性识别序列(例如，UMI)可以经随机排列组合产生而不同，包含被同一个分隔区中的粒子捕获的单细胞抗体标签组核酸的所述经扩增的多核苷酸中的所述分子特异性识别序列各自不同。通过对不同的所述分子特异性识别序列进行分别计数，可以获知所述分子特异性识别序列所对应的每种抗体标签所对应的每种蛋白质的数目。因此，本申请所述的方法通过分析所述单细胞抗体标签组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，可鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种蛋白质的数目。
试剂盒
本申请提供了一种用于分析经固定的细胞的组分的试剂盒，其可包括：1)包含多核苷酸的粒子，所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述经固定的细胞中的组分或其部分；以及2)使所述细胞组分或其部分解交联的试剂。
在本申请所述的试剂盒中，所述粒子可包括微球。所述微球可为磁微粒，水凝胶微粒，琼脂糖微粒等。所述微球表面可以进行包被和修饰，例如，可以进行生物素修饰(可以包括荧光素生物素修饰，链霉抗生素修饰或辣根过氧化物修饰等)；可以用抗谷胱甘肽抗体包被，可以用适配体进行包被或用固定化靶向DNA进行修饰等(参见Sugaya,Sari et al.“Microfluidic Production of Single Micrometer-Sized Hydrogel Beads Utilizing Droplet Dissolution in a Polar Solvent.”Biomicrofluidics 7.5(2013):054120.PMC；Ruffert,C.(2016).Magnetic bead-magic bullet.Micromachines,7(2)；Thompson,J.A.,&Bau,H.H.(2010).Microfluidic,bead-based assay:Theory and experiments.Journal of Chromatography B:Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences,878(2),228–236)。所述微球的直径可小于50μm，所述微球的直径可小于25μm，所述微球的直径可小于10μm，所述微球的直径可小于5μm，所述微球的直径可小于2μm，例如所述微球的直径可小于1μm，所述微球的直径可小于500nm，所述微球的直径可小于400nm，所述微球的直径可小于300nm，所述微球的直径可小于200nm，所述微球的直径可小于100nm，所述微球的直径可小于50nm等。
在本申请所述的试剂盒中，所述识别序列可包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列。在某些实施方式中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列可相同，不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列可彼此不同。在某些实施方式中，同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列可彼此不同。
在本申请所述的试剂盒中，所述捕获序列可包含poly T。
在本申请所述的试剂盒中，每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目可至少为10 7个。
在本申请所述的试剂盒中，所述使所述细胞组分或其部分解交联的试剂可包括细胞裂解液，所述细胞裂解液中可包含缓冲液、蛋白酶、去垢剂和盐。在某些实施方式中，所述缓冲液可以包括PBS和/或Tris。在某些实施方式中，所述蛋白酶可包括蛋白酶K。在某些实施方式中，所述去垢剂可选自以下组：SDS、Tween，Triton、sarkysol和NP-40。在某些实施方式中，所述盐可选自以下组：氯化钠、氯化钙、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。在某些实施方式中，所述试剂盒还可包含固定所述经固定的细胞的固定剂，所述固定剂可选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。
在本申请所述的试剂盒中，所述固定剂的浓度可至少为0.1％v/v。例如，所述固定剂的浓度可以为至少1％v/v。
在本申请所述的试剂盒中，所述试剂盒还可包括固定缓冲液，所述固定缓冲液可包括PBS缓冲液。
在本申请所述的试剂盒中，所述试剂盒还可包括终止所述固定的固定终止剂，所述固定终止可包含甘氨酸。在某些实施方式中，所述固定终止剂的浓度可至少为0.1M。
在本申请所述的试剂盒中，所述试剂盒还可包括捕获缓冲液，所述捕获缓冲液可包括PBS缓冲液。
在本申请所述的试剂盒中，所述捕获缓冲液还可包括BSA和RNA酶抑制剂。
在本申请所述的试剂盒中，所述BSA的浓度可至少为0.1％v/v(例如，所述所述BSA的 浓度可为至少0.2％v/v，至少0.3％v/v，至少0.4％v/v或至少0.5％v/v或更高)；和/或，所述RNA酶抑制剂的浓度可至少0.1v/v(例如，所述所述RNA酶抑制剂的浓度可为至少0.2％v/v，至少0.3％v/v，至少0.4％v/v或至少0.5％v/v或更高)。
在本申请所述的试剂盒中，所述捕获缓冲液的pH可为6-9(例如，所述捕获缓冲液的pH可以为6，可以为6.5，可以为7，可以为7.5，可以为8，可以为8.5或可以为9)。在本申请中，所述试剂盒还可包括结合试剂，所述结合试剂可与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合。
在本申请所述的试剂盒中，所述结合试剂可包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。在本申请中，所述结合试剂的种类可至少为一种。
在本申请所述的试剂盒中，所述抗体可包含抗体标签。抗体标签可包括标签肽，其可包括融合蛋白或重组蛋白，例如抗Flag标签抗体，抗His标签抗体，抗GST标签抗体，抗Myc标签抗体，抗HA标签抗体等。抗体标签还可包括寡核苷酸(参见CN102732512B)。在某些实施方式中，所述抗体标签可包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸可包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列可彼此不同。
在本申请所述的试剂盒中，所述细胞组分可包含转录组，且所述捕获序列可以直接捕获所述转录组；和/或，其中所述捕获序列可以通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。
在本申请所述的试剂盒中，其还可包括用于扩增所述多核苷酸所需的试剂。例如，在本申请所述的试剂盒中，所述扩增多核苷酸所需的试剂可选自以下组：引物、Mg 2+、DNA聚合酶和逆转录酶。例如，本申请中的试剂盒可使用DNA聚合酶，其可具有相对较高的热稳定性，在95℃下的半衰期可约为40分钟，在70℃时可以每秒60个碱基的速度引入核苷酸，扩增长度可约为5kb。例如，所述DNA聚合酶可为TaqDNA聚合酶。本申请中的试剂盒可使用逆转录酶，所述反转录酶可耐受42-50℃，合成的cDNA片段长度可达13kb，试剂盒可包含重组RNA酶抑制剂，其可耐受55℃高温，防止RNA降解，试剂盒可含有oligo(dT)18和随机六聚体引物，所述随机六聚体引物可与模板非特异性地结合，以总RNA中任何RNA为模板合成cDNA。oligo(dT)18可选择性和RNA的3’的poly(A)配对结合，只以有poly(A)尾巴的mRNA为模板合成cDNA。本申请中的试剂盒也可采用序列特异性引物，合成的第一链cDNA可直接用作PCR或荧光定量PCR的模板、第二链cDNA的合成或线性RNA扩增，也可用于需要用带有放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验。本申请中的试剂盒中的Mg 2+可作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。
系统
本申请还提供了一种分析经固定的细胞的组分的系统，所述系统可包括：a)分隔模块，其可用于将所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同分隔至分隔区中，其中所述粒子可包含的所述多核苷酸可含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列可以直接或间接捕获所述细胞中的组分或其部分；b)孵育模块，其可用于孵育所述分隔区，从而使所述分隔区中的所述细胞组分或其部分解交联、且使经解交联的所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获；c)裂解模块，其可用于从所述分隔区中释放所述粒子；d)分析模块，其可以通过分析经释放的所述粒子上的多核苷酸序列而分析所述经固定的细胞的组分。本申请所述的系统中在所述分隔模块前，所述系统还可包括i)固定模块，其用于获得所述经固定的细胞。
在使用本申请所述的系统分析经固定的细胞时，首先在固定模块中，获得所述经固定的细胞；在固定所述细胞前，将所述细胞重悬于缓冲液中；可利用固定细胞的固定剂固定细胞；终止固定所述细胞；在所述终止固定后，将所述经固定的细胞保存在至少-80℃条件下；将所述经固定的细胞重悬于捕获缓冲液中；将所述经固定的细胞和与所述蛋白质特异性结合的结合试剂共同孵育，使所述结合试剂与所述蛋白质结合；在所述共同孵育完成后，去除未与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合的所述结合试剂；在所述共同孵育完成后，将经所述捕获孵育的细胞重悬在所述捕获缓冲液中。
在本申请中，所述固定剂可选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。例如，所述固定剂的浓度可以为至少0.1％v/v。在本申请中，所述固定剂的浓度为至少1％v/v(例如所述固定剂的浓度可至少为1.5％v/v，可至少为2％v/v，可至少为2.5％v/v，可至少为3％v/v，可至少为3.5％v/v，可至少为4％v/v，可至少为4.5％v/v等)。在本申请中，所述固定的温度可为5-35℃(例如，所述固定的温度可为10-30℃，所述固定的温度可为15-28℃，所述固定的温度可为20-25℃，所述固定的温度可为21-25℃，所述固定的温度可为22-25℃，所述固定的温度可为23-25℃等)。在本申请中，所述固定的时间可至少为5分钟(例如，所述固定的时间可为至少10分钟，所述固定的时间可为至少15分钟，所述固定的时间可为至少20分钟，所述固定的时间可为至少25分钟，所述固定的时间可为至少30分钟等)。在本申请中，所述缓冲液可以包括PBS缓冲液。所述终止固定可利用固定终止剂，所述固定终止剂可包括甘氨酸。在某些实施方式中，所述固定终止剂的浓度可至少为0.1M(例如，所述固定终止剂的浓度可至少为0.11M，所述固定终止剂的浓度可至少为0.12M，所述固定终止剂的浓度可至少为0.125M，所述固定终止剂的浓度可至少为0.13M等)。在本申请中，所述终止固定的温度可为5-35℃(例如，所述终止固定的 温度可为5-35℃，所述终止固定的温度可为10-30℃，所述终止固定的温度可为15-28℃，所述终止固定的温度可为20-25℃，所述终止固定的温度可为21-25℃，所述终止固定的温度可为22-25℃，所述终止固定的温度可为23-25℃等。)。在本申请中，所述终止固定的时间可至少为3分钟(例如，所述固定的时间可为至少4分钟，所述固定的时间可为至少5分钟，所述固定的时间可为至少6分钟，所述固定的时间可为至少7分钟，所述固定的时间可为至少8分钟，所述固定的时间可为至少9分钟，所述固定的时间可为至少10分钟等)。在本申请中，所述捕获缓冲液可包括PBS缓冲液。在本申请所述的系统中，所述捕获缓冲液还可以包括BSA和RNA酶抑制剂。在本申请所述的系统中，所述BSA的浓度可至少为0.1％v/v(例如，所述所述BSA的浓度可为至少0.2％v/v，至少0.3％v/v，至少0.4％v/v或至少0.5％v/v或更高)；和/或，所述RNA酶抑制剂的浓度可至少为0.1v/v(例如，所述所述RNA酶抑制剂的浓度可为至少0.2％v/v，至少0.3％v/v，至少0.4％v/v或至少0.5％v/v或更高)。在本申请所述的系统中，所述捕获缓冲液的pH可为6-9(例如，所述捕获缓冲液的pH可以为6，可以为6.5，可以为7，可以为7.5，可以为8，可以为8.5或可以为9)。在本申请中，所述细胞组分可包含蛋白质。在本申请中，所述结合试剂可包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。在本申请中，所述结合试剂的种类可至少为一种。在本申请中，所述共同孵育的温度可为1℃-10℃(例如，所述共同孵育的温度可为2℃-9℃，所述共同孵育的温度可为3℃-8℃，所述共同孵育的温度可为3℃-7℃，所述共同孵育的温度可为3℃-6℃，所述共同孵育的温度可为3℃-5℃等)。在本申请中，所述共同孵育的时间可为0.5小时-5小时(例如，所述共同孵育的时间可为0.5小时-4小时，所述共同孵育的时间可为0.5小时-3小时，所述共同孵育的时间可为0.5小时-2小时等)。在本申请中，所述抗体可包含抗体标签。在某些实施方式中，所述抗体标签可包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸可包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列可彼此不同。在本申请中，其中待分析的所述经固定的细胞包含至少10 5个细胞(例如，所述经固定的细胞可至少为1.1×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.2×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.3×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.4×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.5×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.6×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.7×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.8×10 5个，所述经固定的细胞可至少为1.9×10 5个，所述经固定的细胞可至少为2×10 5个等)。
例如，可利用含0.1％v/v BSA，0.1v/v RNA酶抑制剂的PBS缓冲液重悬10 5个待固定细胞，所述缓冲液pH为8，然后加入1％浓度的甲醛，于5-35℃固定至少5分钟，然后加入含有0.1M甘氨酸的固定终止剂于5-35℃终止固定至少3分钟，然后将经固定的细胞保存在-80℃ 的条件下。
然后，在分隔模块中，通过微流控设备形成分隔区，并将所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同分隔至分隔区中。
在本申请中，各分隔区中可包含至多1个所述包含多核苷酸的粒子。在本申请中，在所述分隔模块中，所述粒子可包括微球。在本申请中，所述分隔区可选自以下组：微油滴、微乳液滴和多孔板中的孔。在本申请中，所述分隔区可通过微流控设备形成。在本申请中，所述识别序列可包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列。在本申请中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列可相同，且不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列可彼此不同。在本申请中，同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列可彼此不同。在本申请中，所述细胞组分可包含转录组，且所述捕获序列可以直接捕获所述转录组。在本申请中，所述捕获序列可以通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。在本申请中，所述捕获序列可包含poly T。在本申请中，每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目可至少为10 7个(例如，可至少为1.1×10 7个，可至少为1.2×10 7个，可至少为1.3×10 7个，可至少为1.4×10 7个，可至少为1.5×10 7个，可至少为2×10 7个等)。在本申请中，所述分隔区中可包含细胞裂解液，所述细胞裂解液中可包含蛋白酶、去垢剂和盐。在本申请中，所述蛋白酶可包括蛋白酶K。在本申请中，所述去垢剂可选自以下组：SDS、Tween和Triton。在本申请中，所述盐可选自以下组：氯化钠、氯化钙、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。
例如，加入含有DNA寡核苷酸标签的结合试剂，在微流控设备中形成分隔区。
然后，在孵育模块中，使所述分隔区中的所述细胞组分或其部分解交联、且使经解交联的所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获。
在本申请所述的系统的孵育模块中，所述孵育的温度为50℃-80℃(例如，孵育的温度可为57℃-78℃，孵育的温度可为60℃-80℃，孵育的温度可为65℃-75℃，孵育的温度可为50℃-78℃，孵育的温度可为55℃-78℃，孵育的温度可为50℃-75℃，孵育的温度可为55℃-75℃，孵育的温度可为50℃-65℃或孵育的温度可为50℃-60℃)。在本申请中，在所述孵育模块中，所述孵育的时间为0.5小时-3小时(例如，孵育的时间可为0.6小时-2.9小时，孵育的时间可为0.7小时-2.8小时，孵育的时间可为1小时-2.5小时，孵育的时间可为1小时-2小时等)。
例如，将从微流控设备中形成的分隔区于1-10℃中孵育0.5-5小时。
然后，在裂解模块中，从所述分隔区释放所述粒子和回收所述经释放的粒子。
在本申请中，所述释放可包括使所述分隔区破裂。
例如，利用剪应力使所述分隔区破裂，然后释放并回收所述粒子。
然后，在分析模块中，延伸和/或扩增所述回收的粒子上的所述多核苷酸，得到经扩增的多核苷酸；分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞转录组核酸；分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目；分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目；分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞抗体标签组核酸；分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞抗体标签组核酸。
在本申请中，所述分析单元可包含对所述核酸测序的结果进行分析的试剂和装置，例如可包括进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)、BioEdit软件或MEGA软件分析所需的设备和装置。在本申请中，所述延伸和/或扩增的系统包括PCR。
例如，利用PCR延伸和/或扩增所述回收的粒子上的所述多核苷酸，并用BLAST对其所包含的核酸序列进行测序与数据分析。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的装置、方法和系统的工作方式，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例1 制备经甲醛固定的细胞
取1mL 10 6浓度293T细胞用PBS重悬，加入4％终浓度的甲醛或多聚甲醛，于室温固定10分钟。然后加入甘氨酸至终浓度0.125M，于室温固定5分钟后终止固定，然后于-80℃保存细胞。
实施例2 抗体标签的制备
抗体标签DNA寡核苷酸引物为5’氨基修饰的oligo序列，为5’-amino-PCR handle-抗体barcode碱基序列-dA30序列，通过商业的抗体-蛋白偶联试剂盒，例如Thunderlink等，将所述DNA寡核苷酸引物和特异性标签抗体进行偶联并纯化，获得带有DNA标签的抗体以用于后续步骤。
其中oligo序列为5’-amino-C6-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(如SEQ ID NO：1所示)-6bp barcode碱基序列-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(如SEQ ID NO：2所示)。
实施例3 用抗体标签特异性标记细胞
将从实施例1中制得的细胞从-80℃取出重悬于PBS和0.1％BSA的混合溶液中(其中可包含0.1v/v RNA酶抑制剂)。将从实施例2中制得的带有抗体标签的结合试剂与所述细胞在4℃孵育1小时，随后用PBS洗脱去除抗体以便进一步蛋白质定量测定。然后，将细胞重悬于PBS和0.1％BSA的混合溶液中(其中可包含0.1v/vRNA酶抑制剂)。
实施例4 通过微流控设备分隔经固定的细胞
如图6所示，将从实施例3中获得的所述细胞悬浮于加入10mM Tris·Cl；50mM KCl；1.5mM MgCl 2；0.45％Tween 20；0.5％Triton X-100，1％SDS，10ug/ml蛋白酶K的细胞裂解液中，从微流控芯片的中央通道(central channel)缓缓加入，将细胞和细胞裂解液及细胞标记微球包裹成为液滴。然后进行解交联，对液滴等包含细胞和微球进行分隔加热至65℃，加热180分钟来解除蛋白质与核酸的交联及释放和细胞中抗原结合的抗体上的DNA寡核苷酸标签。
实施例5 从分隔区释放粒子
在捕获序列捕获经解交联的所述细胞组分或其部分后，于25℃孵育分隔区，孵育时间为0.5-3小时。随后，加入全氟辛醇破碎乳液滴，从分隔区中释放所述微球并回收特异结合了细胞中mRNA以及抗体标记DNA寡核苷酸的粒子。
实施例6 建立转录组文库并分析被固定细胞组分
将从实施5中得到的微球进行逆转录得到cDNA，然后扩增cDNA，获得单细胞cDNA文库以及抗体标签文库，将其构建为Illumina NGS测序文库进行测序，随后利用生物信息学方法通过分析单细胞转录组核酸中具有相同所述分子特异性识别序列的经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞中的每种转录基因的数目。
逆转录：在试管中建立反应体系如下所示：微球、1xRT buffer、1mM dNTP、1uM引物(AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG，如SEQ ID NO：3所示)、2.5mM MgCl 2、1u/ul Reverse Transcriptase、反应过程：25摄氏度30min，42摄氏度90min。
用10mM Tris溶液洗涤微球并进行下一步反应。
cDNA扩增，在试管中建立如下反应体系：洗涤后微球、1xPCR Taq Buffer、1mM dNTP、0.5uM引物CCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(如SEQ ID NO：4所示)、0.5uM引物AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(如SEQ ID NO：5所示)、2.5mM MgCl 2、1u/ul PCR Taq酶。
进行如下PCR循环
步骤1. 94摄氏度3min
步骤2. 94摄氏度30sec
60摄氏度30sec
72摄氏度3min
本步骤12-24循环
步骤3. 72摄氏度5min
最终获得数百ng的cDNA，进行如下处理：
文库构建：
首先使用Illumnia Nextera试剂盒进行文库打断
1ng cDNA in 24ul buffer、25u 2xTD Buffer、1ul Nextera enzyme，55摄氏度7min，5ul Tn5stop buffer。
随后进行如下文库扩增反应
上述Tn5打断cDNA，1xPCR Taq Buffer、1mM dNTP、0.5uM Trueseq D引物、0.5uM Nextera N引物、2.5mM MgCl 2、1u/ul PCR Taq酶。
进行如下PCR循环
步骤1. 72摄氏度5min
步骤2. 94摄氏度3min
步骤3. 94摄氏度30sec
60摄氏度30sec
72摄氏度3min
本步骤18循环
步骤4. 72摄氏度5min
纯化PCR产物，获得最终测序文库，进行PE150测序。
实施例7 哺乳动物细胞系新鲜细胞跟甲醛固定细胞单细胞转录组测序比较
取1mL 10 6新鲜的293T使用Dropseq平台进行高通量单细胞测序。和实施例1中所获得的甲醛固定的293T高通量单细胞测序数据进行比较，具体步骤为：先将实施例6中得到的单细胞cDNA文库中的数据与对照基因组进行比对以发现cDNA的基因起始位点。随后根据细胞的条形码序列重新排列数据，并记录每个细胞中每个基因的分子特异性识别序列。
取约150个细胞的单细胞转录组进行分析和对比，记录其基因数据读数，分子特异性识别序列数(UMI数)和线粒体基因百分比，结果如图1所示。
由图1结果可以看到，在新鲜细胞与经甲醛固定的细胞中检测到的总基因数目与UMI数 目基本相同。结果显示，本申请所述方法可以检测到甲醛固定过的细胞中的基因表达。
实施例8 哺乳动物细胞系新鲜细胞与甲醛固定细胞单细胞表达图谱比较
将实施例7中获得的150个细胞的转录组基因在一起分析进行二维表达分析(tSNE)，并根据组别对数据进行分类，结果如图2所示。
由图2可以看出，两组细胞的数据没有出现明现的群集，两者表达图谱无法区分。结果显示，运用本申请所述方法对经甲醛固定的细胞进行单细胞转录组进行测序得到的结果与用活细胞的转录组测序得到的结果相一致。
实施例9 哺乳动物细胞系新鲜细胞与甲醛固定细胞单细胞对单个基因进行表达相似度的相关性分析
比较两组细胞转录组结果对单个基因表达的相关性，在每组150个细胞转录组中不同基因表达结果进行分析，结果如图3所示。
结果显示，同一个基因在不同组中的表达量基本一致，在图3中表现为大部分点集中在对角线上，说明二者基因表达高度相似(R＝0.82)，利用本申请所述方法所得到的转录组基因可真实反映细胞中实际的转录情况与其他细胞活动情况。
实施例10 制备甲醇固定的细胞
制备293细胞并重悬在1xPBS中，在细胞中加入10倍体积-20摄氏度预先冷冻的100％甲醇，混匀后保存在-20摄氏度。
实施例11 测量甲醇固定细胞的单细胞转录组
取10^6甲醇固定细胞，离心，去除上清，加1xPBS，离心洗涤3次。将甲醛固定细胞，细胞捕获微球，如实施实例4-6中，将细胞分散到分隔区中，并进行解交联，释放mRNA并被捕获微球所捕获，随后对微球进行逆转录cDNA合成，cDNA文库扩增，以及cDNA打断和测序文库构建。
实施例12 甲醇固定的单细胞转录组与新鲜细胞基因检测比较比较及相关性分析
将新鲜或甲醇固定的人或小鼠细胞系的单细胞转录组进行统计(图4)，可以看到二者在转录本数目，基因数目相似，
实施例13 甲醇固定的人细胞系单细胞转录组与新鲜细胞基因检测相关性分析
对人细胞系的大量细胞RNA-seq转录组以及新鲜和固定的细胞单细胞转录组进行相关性分析，发现新鲜细胞固定细胞相关性高达0.95，说明二者基本一致。而两种单细胞数据与大量细胞数据也有很高的相关性(新鲜细胞0.79，固定细胞0.85)，如图5所示。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本 文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (126)

  1. 一种分析经固定的细胞的组分的方法，所述方法包括下述步骤：
    a)将至多1个所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同包裹在分隔区中，所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述细胞中的组分或其部分；
    b)在使得所述分隔区中的所述细胞组分或其部分解交联、且在使经解交联的所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获的条件下孵育所述分隔区；
    c)从所述分隔区中释放所述粒子；
    d)通过分析经释放的所述粒子上的多核苷酸序列来分析所述经固定的细胞的组分或其成分。
  2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述经固定的细胞经过固定剂固定，所述固定剂选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。
  3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述固定剂的浓度为至少0.1％v/v。
  4. 根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中待分析的所述经固定的细胞包含至少10 5个细胞。
  5. 根据权利要求2-4中任一项所述的方法，各分隔区中包含至多1个所述包含多核苷酸的粒子。
  6. 根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：在固定所述细胞前将其重悬于缓冲液中，且所述缓冲液包括PBS缓冲液。
  7. 根据权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述固定的温度为5-35℃。
  8. 根据权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述固定的时间为至少5分钟。
  9. 根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：向所述细胞中加入固定终止剂来终止固定，所述固定终止剂包括甘氨酸。
  10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述固定终止剂的浓度为至少0.1M。
  11. 根据权利要求9-10中任一项所述的方法，其中所述终止固定的温度为5-35℃。
  12. 根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中所述终止固定的时间为至少3分钟。
  13. 根据权利要求8-12中任一项所述的方法，其中在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：在所述终止固定后，将所述经固定的细胞保存在-4℃以下条件下。
  14. 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：将所述经固定的细胞重悬于捕获缓冲液中，所述捕获缓冲液包括PBS缓冲液。
  15. 根据权利要求14所述的方法，其中，所述捕获缓冲液还包括BSA和RNA酶抑制剂。
  16. 根据权利要求15所述的方法，其中，所述BSA的浓度为至少0.1％v/v；和/或，所述RNA酶抑制剂的浓度为至少0.1v/v。
  17. 根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，所述捕获缓冲液的pH为6-9。
  18. 根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述细胞组分包含蛋白质，且在所述步骤a)之前，所述方法还包括下述步骤：将所述经固定的细胞和与所述蛋白质特异性结合的结合试剂共同孵育，使所述结合试剂与所述蛋白质结合。
  19. 根据权利要求18所述的方法，其中，所述结合试剂包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。
  20. 根据权利要求18-19中任一项所述的方法，其中，所述结合试剂的种类为至少一种。
  21. 根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中，所述共同孵育的温度为1℃-10℃。
  22. 根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中，所述共同孵育的时间为0.5小时-5小时。
  23. 根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中，所述抗体包含抗体标签。
  24. 根据权利要求23所述的方法，其中，所述抗体标签包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列彼此不同。
  25. 根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中，在所述步骤a)之前，所述方法还包括如下的步骤：在所述共同孵育完成后，去除未与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合的所述结合试剂。
  26. 根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中，在所述步骤a)之前，所述方法还包括如下的步骤：在所述共同孵育完成后，将经所述捕获孵育的细胞重悬在所述捕获缓冲液中。
  27. 根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中，在所述步骤a)中，所述粒子包括微球。
  28. 根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述分隔区选自以下组：微油滴、微乳液滴和多孔板中的孔。
  29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述分隔区通过微流控设备形成。
  30. 根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述识别序列包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列，其中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列相同，且不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列彼此不同。
  31. 根据权利要求30所述的方法，其中同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列彼此不同。
  32. 根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述细胞组分包含转录组，且所述捕获序列能够直接捕获所述转录组。
  33. 根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述捕获序列通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。
  34. 根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述捕获序列包含poly T。
  35. 根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目为至少10 7个。
  36. 根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述分隔区中包含细胞裂解液，所述细胞裂解液中包含缓冲液、蛋白酶、去垢剂和盐，其中所述缓冲液包括PBS和/或Tris。
  37. 根据权利要求36所述的方法，其中所述蛋白酶包括蛋白酶K。
  38. 根据权利要求36-37中任一项所述的方法，其中所述去垢剂选自以下组：SDS、Tween、Triton、sarkysol和NP-40。
  39. 根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述盐选自以下组：氯化钠、氯化钙、氯化钾、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。
  40. 根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中，在步骤b)中，所述孵育的温度为50℃-80℃。
  41. 根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中，在步骤b)中，所述孵育的时间为0.5小时-3小时。
  42. 根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中，在步骤c)中，所述释放包括使所述分隔区破裂。
  43. 权利要求1-42中任一项所述的方法，其还包括回收所述经释放的粒子。
  44. 根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中，步骤d)中，所述分析包括延伸和/或扩增所述回收的粒子上的所述多核苷酸，得到经扩增的多核苷酸。
  45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述延伸和/或扩增的方法包括PCR。
  46. 根据权利要求44-45中任一项所述的方法，其中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞转录组核酸。
  47. 根据权利要求46所述的方法，其中，通过分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同 所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目。
  48. 根据权利要求44-47中任一项所述的方法，其中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞抗体标签组核酸。
  49. 根据权利要求48所述的方法，其中，通过分析所述单细胞抗体标签组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种蛋白质的数目。
  50. 用于分析经固定的细胞的组分的试剂盒，其包括：
    1)包含多核苷酸的粒子，所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述经固定的细胞中的组分或其部分；以及
    2)使所述细胞组分或其部分解交联的试剂。
  51. 根据权利要求50所述的试剂盒，其中所述粒子包括微球。
  52. 根据权利要求50-51中任一项所述的试剂盒，其中所述识别序列包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列，其中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列相同，且不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列彼此不同。
  53. 权利要求52所述的试剂盒，其中同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列彼此不同。
  54. 权利要求50-53中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获序列包含poly T。
  55. 权利要求50-54中任一项所述的试剂盒，其中每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目为至少10 7个。
  56. 权利要求40-58中任一项所述的试剂盒，其中所述使所述细胞组分或其部分解交联的试剂包括细胞裂解液，所述细胞裂解液中包含缓冲液、蛋白酶、去垢剂和盐，其中所述缓冲液包括PBS和/或Tris。
  57. 权利要求56所述的试剂盒，其中所述蛋白酶包括蛋白酶K。
  58. 权利要求56-57中任一项所述的试剂盒，其中所述去垢剂选自以下组：SDS、Tween、Triton、sarkysol和NP-40。
  59. 权利要求56-58任一项所述的试剂盒，其中所述盐选自以下组：氯化钠、氯化钙、氯化钾、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。
  60. 权利要求50-59中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含固定所述经固定的细胞的固定剂，所述固定剂选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。
  61. 权利要求60所述的试剂盒，其中所述固定剂的浓度为至少0.1％v/v。
  62. 权利要求50-61中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括固定缓冲液，所述固定缓冲液包括PBS缓冲液。
  63. 权利要求50-62中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括终止所述固定的固定终止剂，所述固定终止剂包含甘氨酸。
  64. 权利要求63所述的试剂盒，其中所述固定终止剂的浓度为至少0.1M。
  65. 权利要求50-64中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括捕获缓冲液，所述捕获缓冲液包括PBS缓冲液。
  66. 权利要求65所述的试剂盒，其中所述捕获缓冲液还包括BSA和RNA酶抑制剂。
  67. 权利要求66所述的试剂盒，其中所述BSA的浓度为至少0.1％v/v；和/或，所述RNA酶抑制剂的浓度为至少0.1v/v。
  68. 权利要求65-67中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获缓冲液的pH为6-9。
  69. 权利要求50-68中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括结合试剂，所述结合试剂与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合。
  70. 权利要求69所述的试剂盒，其中所述结合试剂包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。
  71. 权利要求69-70中任一项所述的试剂盒，其中所述结合试剂的种类为至少一种。
  72. 权利要求69-71中任一项所述的试剂盒，其中所述抗体包含抗体标签。
  73. 权利要求72所述的试剂盒，其中所述抗体标签包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列彼此不同。
  74. 权利要求50-73中任一项所述的试剂盒，其中所述细胞组分包含转录组，且所述捕获序列能够直接捕获所述转录组；和/或，其中所述捕获序列通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。
  75. 根据权利要求50-74中任一项所述的试剂盒，其还包括用于扩增所述多核苷酸所需的试剂。
  76. 根据权利要求75所述的试剂盒，其中所述扩增多核苷酸所需的试剂选自以下组：引物、Mg 2+、DNA聚合酶和逆转录酶。
  77. 一种分析经固定的细胞的组分的系统，所述系统包括：
    a)分隔模块，其用于将所述经固定的细胞和包含多核苷酸的粒子一同分隔至分隔区中，其中所述粒子包含的所述多核苷酸含有至少一种识别序列以及至少一种捕获序列，所述捕获序列能够直接或间接捕获所述细胞中的组分或其部分；
    b)孵育模块，其用于孵育所述分隔区，从而使所述分隔区中的所述细胞组分或其部分解交联、且使经解交联的所述细胞组分或其部分被所述捕获序列捕获；
    c)裂解模块，其用于从所述分隔区中释放所述粒子；
    d)分析模块，其能够通过分析经释放的所述粒子上的多核苷酸序列而分析所述经固定的细胞的组分。
  78. 根据权利要求77所述的系统，其中在所述分隔模块前，所述系统还包括i)固定模块，其用于获得所述经固定的细胞。
  79. 根据权利要求78所述的系统，其中所述经固定的细胞经过固定剂固定，所述固定剂选自以下组中的一种或多种：甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮、戊二醛、锇酸和重铬酸钾。
  80. 根据权利要求79所述的系统，其中所述固定剂的浓度为至少0.1％v/v。
  81. 根据权利要求79-80中任一项所述的系统，其中，所述固定的温度为5-35℃。
  82. 根据权利要求79-81中任一项所述的系统，其中所述固定的时间为至少5分钟。
  83. 根据权利要求78-82中任一项所述的系统，其中，在所述固定模块中，其还可以用于在固定所述细胞前，将所述细胞重悬于缓冲液中，且所述缓冲液包括PBS缓冲液。
  84. 根据权利要求78-83中任一项所述的系统，其中，在所述固定模块中，其还可以用于终止固定所述细胞，所述终止固定利用固定终止剂，所述固定终止剂包括甘氨酸。
  85. 根据权利要求84所述的系统，其中所述固定终止剂的浓度为至少0.1M。
  86. 根据权利要求84-85中任一项所述的系统，其中所述终止固定的温度为5-35℃。
  87. 根据权利要求84-86中任一项所述的系统，其中所述终止固定的时间为至少3分钟。
  88. 根据权利要求84-87中任一项所述的系统，其中，在所述固定模块中，其还可以用于在所述终止固定后，将所述经固定的细胞保存在至少-80℃条件下。
  89. 根据权利要求78-88中任一项所述的系统，其中，在所述固定模块中，其还可以用于将所述经固定的细胞重悬于捕获缓冲液中，所述捕获缓冲液包括PBS缓冲液。
  90. 根据权利要求89所述的系统，其中，所述捕获缓冲液还包括BSA和RNA酶抑制剂。
  91. 根据权利要求90所述的系统，其中，所述BSA的浓度为至少0.1％v/v；和/或，所 述RNA酶抑制剂的浓度为至少0.1v/v。
  92. 根据权利要求89-91中任一项所述的系统，其中，所述捕获缓冲液的pH为6-9。
  93. 根据权利要求78-92中任一项所述的系统，其中所述细胞组分包含蛋白质，在所述固定模块中，其还可以用于将所述经固定的细胞和与所述蛋白质特异性结合的结合试剂共同孵育，使所述结合试剂与所述蛋白质结合。
  94. 根据权利要求93所述的系统，其中，所述结合试剂包含与所述蛋白质特异性结合的抗体及其片段或变体。
  95. 根据权利要求93-94中任一项所述的系统，其中，所述结合试剂的种类为至少一种。
  96. 根据权利要求93-95中任一项所述的系统，其中，所述共同孵育的温度为1℃-10℃。
  97. 根据权利要求93-96中任一项所述的系统，其中，所述共同孵育的时间为0.5小时-5小时。
  98. 根据权利要求94-97中任一项所述的系统，其中，所述抗体包含抗体标签。
  99. 根据权利要求98所述的系统，其中，所述抗体标签包含DNA寡核苷酸标签，所述DNA寡核苷酸包括条形码序列，每种所述抗体的所述条形码序列彼此不同。
  100. 根据权利要求78-99中任一项所述的系统，其中，在所述固定模块中，其还可以用于在所述共同孵育完成后，去除未与所述经固定的细胞中的蛋白质特异性结合的所述结合试剂。
  101. 根据权利要求78-100中任一项所述的系统，其中，在所述固定模块中，其还可以用于在所述共同孵育完成后，将经所述捕获孵育的细胞重悬在所述捕获缓冲液中。
  102. 根据权利要求78-101中任一项所述的系统，其中待分析的所述经固定的细胞包含至少10 5个细胞。
  103. 根据权利要求78-102中任一项所述的系统，各分隔区中包含至多1个所述包含多核苷酸的粒子。
  104. 根据权利要求78-103中任一项所述的系统，其中，在所述分隔模块中，所述粒子包括微球。
  105. 根据权利要求78-104中任一项所述的系统，其中所述分隔区选自以下组：微油滴、微乳液滴和多孔板中的孔。
  106. 根据权利要求105所述的系统，其中所述分隔区通过微流控设备形成。
  107. 根据权利要求78-106中任一项所述的系统，其中所述识别序列包含细胞特异性识别序列和分子特异性识别序列，其中，同一所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列相同， 且不同所述粒子上包含的所述细胞特异性识别序列彼此不同。
  108. 根据权利要求107所述的系统，其中同一所述粒子上包含的各多核苷酸分子所含有的所述分子特异性识别序列彼此不同。
  109. 根据权利要求78-108中任一项所述的系统，其中所述细胞组分包含转录组，且所述捕获序列能够直接捕获所述转录组。
  110. 根据权利要求98-109中任一项所述的系统，其中所述捕获序列通过与所述抗体上的所述抗体标签特异性结合而捕获所述蛋白质。
  111. 根据权利要求78-110中任一项所述的系统，其中所述捕获序列包含poly T。
  112. 根据权利要求78-111中任一项所述的系统，其中每个所述粒子所包含的所述多核苷酸的数目为至少10 7个。
  113. 根据权利要求78-112中任一项所述的系统，其中所述分隔区中包含细胞裂解液，所述细胞裂解液中包含蛋白酶、去垢剂和盐。
  114. 根据权利要求113所述的系统，其中所述蛋白酶包括蛋白酶K。
  115. 根据权利要求113-114中任一项所述的系统，其中所述去垢剂选自以下组：SDS、Tween和Triton。
  116. 根据权利要求113-115中任一项所述的系统，其中所述盐选自以下组：氯化钠、氯化钙、脱氧胆酸盐和Tris-HCl。
  117. 根据权利要求78-116中任一项所述的系统，其中，在所述孵育模块中，所述孵育的温度为50℃-80℃。
  118. 根据权利要求78-117中任一项所述的系统，其中，在所述孵育模块中，所述孵育的时间为0.5小时-3小时。
  119. 根据权利要求78-118中任一项所述的系统，其中，在所述裂解模块中，所述释放包括使所述分隔区破裂。
  120. 权利要求78-119中任一项所述的系统，其还包括回收所述经释放的粒子。
  121. 根据权利要求78-120中任一项所述的系统，其中，在所述分析模块中，所述分析包括延伸和/或扩增所述回收的粒子上的所述多核苷酸，得到经扩增的多核苷酸。
  122. 根据权利要求121所述的系统，其中所述延伸和/或扩增的系统包括PCR。
  123. 根据权利要求121-122中任一项所述的系统，其中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞转录组核酸。
  124. 根据权利要求123所述的系统，其中，通过分析所述单细胞转录组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种转录基因的数目。
  125. 根据权利要求121-124中任一项所述的系统，其中，通过分析具有相同所述细胞特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的单细胞抗体标签组核酸。
  126. 根据权利要求125所述的系统，其中，通过分析所述单细胞抗体标签组核酸中，具有相同所述分子特异性识别序列的所述经扩增的多核苷酸，鉴别来源于同一个所述经固定的细胞的中的每种蛋白质的数目。
CN202180060435.3A 2020-08-06 2021-08-05 一种分析经固定的细胞的组分的方法 Pending CN116323973A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2020107825458 2020-08-06
CN202010782545 2020-08-06
PCT/CN2021/110898 WO2022028535A1 (zh) 2020-08-06 2021-08-05 一种分析经固定的细胞的组分的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116323973A true CN116323973A (zh) 2023-06-23

Family

ID=80117035

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180060435.3A Pending CN116323973A (zh) 2020-08-06 2021-08-05 一种分析经固定的细胞的组分的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN116323973A (zh)
WO (1) WO2022028535A1 (zh)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106574925B (zh) * 2014-05-23 2019-07-26 萤火虫生物股份有限公司 用于生物测定的底物介导的反应器
EP3645547A4 (en) * 2017-06-26 2021-04-21 Phase Genomics Inc. PROCESS FOR GROUPING DNA SEQUENCES
CN107463801A (zh) * 2017-07-31 2017-12-12 浙江绍兴千寻生物科技有限公司 一种Drop‑seq数据质量控制和分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022028535A1 (zh) 2022-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11161087B2 (en) Methods and compositions for tagging and analyzing samples
EP3788171B1 (en) High throughput multiomics sample analysis
Xu et al. Microfluidic single‐cell omics analysis
KR102531677B1 (ko) 개별 세포 또는 세포 개체군으로부터 핵산을 분석하는 방법
CN112969789A (zh) 使用随机引发的单细胞全转录组分析
AU2015250034B2 (en) Systems and methods for barcoding nucleic acids
EP3619319B1 (en) Single cell analysis
US20210024977A1 (en) Single cell chromatin immunoprecipitation sequencing assay
CN110637084A (zh) Mmlv逆转录酶变体
FI3760737T3 (fi) Alusta lääkinnällisten aineiden löytämiseen ja analysoimiseen
US20230049664A1 (en) Droplet microfluidics-based single cell sequencing and applications
US20240132958A1 (en) Multi-omic analysis in monodisperse droplets
CN116323973A (zh) 一种分析经固定的细胞的组分的方法
CN111801428B (zh) 一种获得单细胞mRNA序列的方法
Geng et al. Forensic typing of single cells using droplet microfluidics
JP7511257B2 (ja) 固相担体を用いた核酸増幅方法
US11976325B2 (en) Quantitative detection and analysis of molecules
US20220025430A1 (en) Sequence based imaging
WO2022188827A1 (en) Chemical sample indexing for high-throughput single-cell analysis
CN114096679B (zh) 使用固相载体的核酸扩增方法
WO2023199311A1 (en) Methods of single cell rna-sequencing
CN117089597A (zh) 一种单细胞文库构建测序方法及其应用
WO2023114190A1 (en) Single-cell epigenomic profiling using fluidics and hydrogels
CN117019248A (zh) 一种微孔芯片与单细胞分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination