CN116323675A - 抗cd47抗体及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及结合CD47(也称为IAP、MER6和OA3)的抗体和抗体衍生物及其使用方法。在某些实施方案中，本文公开的抗CD47抗体或抗体衍生物表现出与红细胞的结合降低。

Description

抗CD47抗体及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月28日提交的国际专利申请号PCT/CN2020/118320的优先权，其内容通过引用方式整体并入本文，并要求其优先权。
技术领域
本公开涉及结合CD47的抗体和抗体衍生物及其使用方法。
背景技术
CD47(也称为IAP、MER6和OA3)是一种膜受体，其具有胞外N末端结构域、五个跨膜结构域和C末端胞内尾部。它结合多种膜整联蛋白和两种可溶性配体，即血小板反应蛋白-1(TSP-1)和信号调节蛋白α(SIRPα)。CD47参与多种细胞过程，包括细胞凋亡、增殖、粘附和迁移。此外，它还在免疫和血管生成应答中发挥关键作用。具体地，CD47作为向巨噬细胞发出的“别吃我”的信号起作用，并有助于在生理条件下维持非恶性细胞的免疫耐受性。广泛范围的肿瘤细胞过表达这种免疫抑制信号传导分子，从而有助于这些肿瘤细胞的存活。考虑到CD47在免疫调节中的重要作用，本领域需要开发靶向CD47的治疗分子和方法用于免疫疗法和癌症治疗。
发明内容
本公开提供了以高亲和力特异性结合CD47的分离的单克隆抗体和抗体衍生物，包括单特异性抗CD47抗体以及结合CD47和一种或多种另外的靶标的多特异性抗体。在某些实施方案中，本文公开的抗体或抗体衍生物包括结合CD47的全长抗体。在某些实施方案中，本文公开的抗体或抗体衍生物包括结合CD47的scFv。本公开还提供了本文公开的抗体和抗体衍生物以及包含其的药物组合物的制备和使用方法，例如用于治疗疾病和病症，例如癌症。本发明部分基于结合CD47的新型抗体的发现，这些新型抗体可靶向肿瘤细胞并且/或者增加针对肿瘤细胞的免疫应答，但对正常细胞(诸如红细胞)的结合和/或毒性降低。
本公开提供了结合CD47的抗体，该抗体包含：a)重链可变区，该重链可变区包含：(1)重链可变区CDR-H1，该CDR-H1包含SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51和61中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)重链可变区CDR-H2，该CDR-H2包含SEQID NO：2、12、22、32、42、52和62中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和(3)重链可变区CDR-H3，该CDR-H3包含SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53和63中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和b)轻链可变区，该轻链可变区包含：(1)轻链可变区CDR-L1，该CDR-L1包含SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54和64中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)轻链可变区CDR-L2，该CDR-L2包含SEQ ID NO：5、15、25、35、45、55和65中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和(3)轻链可变区CDR-L3，该CDR-L3包含SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56和66中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中，抗体以1×10-8M或更低的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以5×10-9M或更低的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-11M至约1×10-8M之间的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-10M至约1×10-8M之间的KD结合CD47。
在某些实施方案中，抗体与参考抗CD47抗体交叉竞争，该参考抗CD47抗体包含：a)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR-L 1，(2)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQID NO：6所示的氨基酸序列的CDR-L3；b)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR-L3；c)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：26所示的氨基酸序列的CDR-L3；d)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQID NO：31所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR-L3；e)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQID NO：42所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的CDR-L3；f)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的CDR-L3；或g)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQID NO：62所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，抗体包含：a)重链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57和67组成的组的氨基酸序列；和b)轻链可变区，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58和68组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ IDNO：13所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQID NO：14所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：26所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQID NO：7所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQID NO：38所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQID NO：57所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体包含人框架。在某些实施方案中，抗体是人抗体。在某些实施方案中，抗体包括全长免疫球蛋白、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双抗体、三抗体、四抗体或它们的任何组合。
在某些实施方案中，抗体包含Fc区。在某些实施方案中，Fc区包括人Fc区。在某些实施方案中，Fc区包括选自由以下项组成的组的Fc区：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区。
在某些实施方案中，Fc区包括选自由以下项组成的组的Fc区：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区。在某些实施方案中，Fc区包括IgG1 Fc区。在某些实施方案中，Fc区包括IgG4Fc区。在某些实施方案中，IgG4Fc区包含S228P的突变。在某些实施方案中，Fc区包含C末端赖氨酸。在某些实施方案中，Fc区包含C末端赖氨酸的缺失。
在某些实施方案中，抗体包含在多特异性抗体(例如，双特异性抗体)中，其中该多特异性抗体包含特异性结合第二抗原的第二抗体部分。在某些实施方案中，第二抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原选自由以下项组成的组：Her-2，EGFR，PDL1，MSLN，c-Met，B细胞成熟抗原(BCMA)，碳酸酐酶IX(CA1X)，癌胚抗原(CEA)，CD5，CD7，CD10，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，CD38，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD123，CD133，CD138，CD276(B7H3)，上皮糖蛋白(EGP2)，滋养层细胞表面抗原2(TROP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-a，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis A(CA 1.9.9)，Lewis Y(LeY)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，粘蛋白16(Muc-16)，粘蛋白1(Muc-1)，NG2D配体，癌胚抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，密封蛋白18.2(CLDN18.2)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，肾母细胞瘤蛋白(WT-1)，1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)，PVR，PVRL2及它们的任何组合。在某些实施方案中，第二抗原是免疫检查点调节剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂选自由以下项组成的组：TIGIT、PD1、CTLA4、LAG-3、2B4、BTLA及它们的任何组合。在某些实施方案中，第二抗原是免疫共刺激分子或T细胞受体/CD3复合物的亚基。在某些实施方案中，免疫共刺激分子选自由以下项组成的组：CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40及它们的任何组合。在某些实施方案中，T细胞受体/CD3复合物的亚基选自由以下项组成的组：CD3γ、CD3δ、CD3ε及它们的任何组合。
本公开提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含与治疗剂或标记连接的本文公开的任何抗体。在某些实施方案中，治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。在某些实施方案中，标记选自由以下项组成的组：放射性同位素、荧光染料和酶。
本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)，该CAR含有包含本文公开的抗体的胞外抗原结合结构域。在某些实施方案中，抗体是scFv。
本公开提供了免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含本文公开的CAR。在某些实施方案中，免疫应答细胞选自由以下项组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和骨髓细胞。在某些实施方案中，免疫应答细胞是T细胞。
本公开还提供了药物组合物。在某些实施方案中，药物组合物包含a)本文公开的抗体、免疫缀合物或免疫应答细胞，和b)药学上可接受的载剂。
本公开还提供了编码本文公开的任何抗体的核酸、包含本文公开的任何核酸的载体和包含本文公开的核酸或载体的宿主细胞。
本公开提供了制备本文公开的抗体的方法。在某些实施方案中，该方法包括在本文公开的宿主细胞中表达抗体，以及从该宿主细胞中分离该抗体。
本公开还提供了减轻受试者的肿瘤负荷的方法。在某些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体、免疫缀合物或药物组合物。
在某些实施方案中，该方法减少肿瘤细胞的数量。在某些实施方案中，该方法减小肿瘤大小。在某些实施方案中，该方法根除受试者的肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤选自由以下项组成的组：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及它们的组合。
本公开还提供了治疗和/或预防受试者的赘生物的方法。在某些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体、免疫缀合物或药物组合物。
本公开还提供了延长患有赘生物的受试者的生存期的方法。在某些实施方案中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体、免疫缀合物或药物组合物。
在某些实施方案中，赘生物选自由以下项组成的组：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及它们的组合。
本公开提供了本文公开的任何抗体，其用作药物。本公开还提供了本文公开的任何抗体，其用于治疗癌症。本公开还提供了本文公开的药物组合物，其用作药物。本公开还提供了本文公开的药物组合物，其用于治疗癌症。在某些实施方案中，癌症选自由以下项组成的组：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及它们的组合。
本公开提供了试剂盒，这些试剂盒包含本文公开的抗体、免疫缀合物、药物组合物、核酸、载体或免疫应答细胞。在某些实施方案中，试剂盒包含用于治疗和/或预防赘生物的书面说明书。
附图说明
图1示出了抗CD47抗体的CD47结合能力。通过流式细胞术测试从原初噬菌体文库(
Figure BDA0004143687210000091
phage library)中选择的抗体与Raji细胞(B细胞淋巴瘤)的结合。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗(magrolimab)类似物)用作阳性对照。IgG同种型对照(抗PD1抗体)用作阴性对照。
图2A和图2B示出了克隆M1变体与肿瘤细胞和正常细胞的CD47结合能力。图2A示出了M1变体与Jurkat(人白血病细胞系)的全细胞结合。图2B示出了M1变体与红细胞(RBC)的全细胞结合。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)用作阳性对照。贝伐单抗(抗VEGF-A抗体)用作阴性对照。
图3A至图3B示出了M1恒定区变体与肿瘤细胞和正常细胞的全细胞结合能力。测试具有恒定区修饰的M1变体与Jurkat细胞(3A)和RBC(3B)的结合。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)用作阳性对照。曲妥珠单抗(抗HER2抗体)用作阴性对照。
图4示出了克隆M1变体对人SIRPα与CD47的结合的阻断。通过流式细胞术测试抗CD47抗体阻断人SIRPα与表达CD47的Raji细胞的结合的能力。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)用作阳性对照。IgG同种型对照(抗PD1抗体)用作阴性对照。抗CD47单克隆抗体阻断人SIRPα与表达CD47的Jurkat细胞的结合，如通过染色的平均荧光强度(MFI)测量的。
图5示出了选择的抗体克隆的血凝反应活性。显示了连续稀释的克隆M1及其变体诱导的红细胞(RBC)凝集。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)用作阳性对照。IgG同种型对照(抗PD1抗体)用作阴性对照。
图6A至图6D示出了M1变体对巨噬细胞介导的对Jurkat细胞和红细胞(RBC)的吞噬的作用。用CFSE标记Jurkat细胞或RBC，并与连续稀释的M1变体、抗CD47参考抗体或同种型对照抗体(抗PD1抗体)一起温育。将抗体-Jurkat混合物与Raw264.7(6A)或PBMC衍生的巨噬细胞(6C)一起温育。将抗体-RBC混合物与Raw264.7(6B)或PBMC衍生的巨噬细胞(6D)一起温育。两小时后，通过流式细胞仪分析巨噬细胞以确定吞噬能力。吞噬能力表示为总F4/80+细胞中CFSE+F4/80+细胞的百分比或总CD14+细胞中CFSE+CD14+细胞的百分比。M1变体诱导对Jurkat的吞噬，如(6A)和(6C)所示。M1变体不诱导对RBC的吞噬，如(6B)和(6D)所示。
图7示出了M1变体在WiDr(人结肠癌)异种移植瘤模型中的抗肿瘤活性。NOD-SCID小鼠(n＝8只/组)皮下移植WiDr。在肿瘤接种后7天腹膜内施用各抗体的第一剂。移植后的小鼠用抗体进行腹膜内处理，每周两次，持续3周。所有数据点均为平均值±SEM。
图8示出了M1变体在NCI-H82(人小细胞肺癌)异种移植瘤模型中的抗肿瘤活性。NOD-SCID小鼠(n＝8只/组)皮下移植NCI-H82细胞。在肿瘤接种后7天施用各抗体的第一剂。移植后的小鼠在指定时间用抗体进行腹膜内处理。肿瘤生长曲线中的所有数据点均为平均值±SEM。
具体实施方式
本公开提供了以高亲和力特异性结合CD47的分离的单克隆抗体和抗体衍生物，包括单特异性抗CD47抗体以及结合CD47和一种或多种另外的靶标的多特异性抗体。在某些实施方案中，本文公开的抗体或抗体衍生物包括结合CD47的全长抗体。在某些实施方案中，本文公开的抗体或抗体衍生物包括结合CD47的scFv。本公开还提供了本文公开的抗体和抗体衍生物以及包含其的药物组合物的制备和使用方法，例如用于治疗疾病和病症，例如癌症。本发明部分基于结合CD47的新型抗体的发现，这些新型抗体可靶向肿瘤细胞并且/或者增加针对肿瘤细胞的免疫应答，但对正常细胞(诸如红细胞)的结合和/或脱靶效应降低。
为了清楚起见而不是作为限制，目前公开的主题的具体实施方式分为以下小节：
1.定义；
2.抗体和抗体衍生物；
3.使用方法；
4.药物配制品；和
5.制品。
1.定义
如本文所提及的术语“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗体片段)。“抗体”可以是独立的分子或抗体衍生物的一部分。示例性抗体衍生物包括但不限于多功能抗体(例如，多特异性抗体(例如，双特异性抗体))、抗原识别受体(例如，嵌合抗原受体)、包含另外的蛋白或非蛋白部分的抗体缀合物(例如，抗体-药物缀合物或聚合物包被的抗体)和包含抗体的其他多功能分子。
“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”是指与天然抗体结构相似或具有包含如本文所定义的Fc区的重链的抗体。在某些实施方案中，全长抗体包含两条重链和两条轻链。在某些实施方案中，轻链和重链的可变区负责抗原结合。重链和轻链的可变区可分别称为“VH”和“VL”。重链和轻链中的可变区均通常含有三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链(LC)CDR，包括LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3；重链(HC)CDR，包括HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3)。本文公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过公知的惯例，例如，如下所述的Kabat、Chothia、MacCallum、IMGT和AHo的惯例来定义或鉴定。重链或轻链的三个CDR被插入称为框架区(FR)的侧边区段之间，这些框架区比CDR更为保守，并形成了支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出多种效应子功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列将抗体分类。抗体的五种主要类别或同种型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别以存在α、δ、ε、γ和μ重链为特征。主要抗体类别中的若干种被分成亚类，诸如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。在某些实施方案中，全长抗体是糖基化的。在某些实施方案中，全长抗体包含与其Fc区连接的聚糖。在某些实施方案中，全长抗体包含支链聚糖。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、“抗体片段”和“抗体部分”是指抗体的保留特异性结合抗原能力的一个或多个片段。已表明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv和scFv-Fc)、单结构域抗体、VHH、VHH-Fc、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或抗体的结合抗原的任何其他片段或其组合。“VHH”是指从骆驼科动物中分离的单结构域抗体。在某些实施方案中，VHH包含骆驼科重链抗体的重链可变区。在某些实施方案中，VHH具有不超过约25kDa的大小。在某些实施方案中，VHH具有不超过约20kDa的大小。在某些实施方案中，VHH具有不超过约15kDa的大小。
与参考抗体“交叉竞争结合的抗体”是指在竞争测定中阻断参考抗体与其抗原的结合达50％以上的抗体，反言之，参考抗体在竞争测定中阻断抗体与其抗原的结合达50％以上。示例性竞争测定描述于Antibodies[抗体]，Harlow和Lane(纽约州冷泉港冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY))中。
“Fv”是含有完整抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。这两个结构域折叠后产生六个高变环(重链和轻链各3个环)，为抗原结合贡献氨基酸残基并为抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或仅包含三个对抗原有特异性的CDR的半个Fv)也可识别并结合抗原，但有时亲和力低于整个结合位点。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接成单条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。在一些实施方案中，scFv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv形成用于抗原结合的期望结构。关于scFv的综述，参见Pl ü ckthun，ThePharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学]，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，纽约施普林格出版社(Springer-Verlag，New York)，第269-315页(1994)。
出于本文的目的，“受体人框架”或“人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与其相同的氨基酸序列，或其可包含氨基酸序列变化。在某些实施方案中，氨基酸变化的数量是10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少、或2个或更少。在某些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列的序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗体与抗原)的成员之间1：1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的方法)测量。下文描述了用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案。
“亲和力成熟的”抗体是指与亲本抗体相比，在一个或多个CDR或高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗体，该亲本抗体不具有此类改变，这些改变使得抗体对抗原的亲和力提高。
如本文所用，“CD47”、“CD47蛋白”或“CD47多肽”是指任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人和食蟹猴))的任何CD47多肽或其任何片段，并且可任选地包含至多一个、至多两个、至多三个、至多四个、至多五个、至多六个、至多七个、至多八个、至多九个或至多十个氨基酸取代、添加和/或缺失。该术语涵盖全长未加工的CD47以及由于在细胞中进行加工而产生的任何形式的CD47。该术语还涵盖CD47的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施方案中，CD47多肽包含或具有与具有NCBI参考号：NP_001768.1、NP_942088.1或NP_001369235.1的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的同源性或同一性的氨基酸序列(本文中的同源性可使用标准软件诸如BLAST或FASTA测定)。在某些实施方案中，CD47多肽包含或具有为SEQ ID NO：103的整体或连续部分的氨基酸序列。
术语“CD47的ECD”是指CD47的胞外结构域。在某些实施方案中，CD47的胞外结构域是CD47的N末端胞外结构域。在某些实施方案中，示例性CD47多肽的N末端ECD可包含SEQ IDNO：104所示的氨基酸序列。
术语“抗CD47抗体”和“结合CD47的抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD47的抗体，使得该抗体可用作靶向CD47的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗CD47抗体与不相关的非CD47蛋白的结合程度小于该抗体与CD47的结合的约10％，如例如通过
Figure BDA0004143687210000131
表面等离子体共振测定法测量的。在某些实施方案中，结合CD47的抗体具有＜约1μM、＜约100nM、＜约10nM、＜约1nM、＜约0.1nM、＜约0.01nM或＜约0.001nM(例如，10-8M或更低，例如10-8M至10-12M，例如10-9M至10-10M)的解离常数(KD)。在某些实施方案中，抗CD47抗体结合在来自不同物种的CD47中保守的CD47表位。在某些实施方案中，抗CD47抗体结合在蛋白质的ECD中的CD47上的表位。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种。在某些实施方案中，本文公开的嵌合抗体包含骆驼科重链可变区和人Fc区。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”意在指重链和/或轻链的可变区内的非连续抗原结合位点。这些特定区域已描述于：Kabat等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，252：6609-6616(1977)；Kabat等人，美国卫生与公共服务部，“Sequences of proteins ofimmunological interest[具有免疫学意义的蛋白质序列]”(1991)；Chothia等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，196：901-917(1987)；Al-Lazikani B.等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，273：927-948(1997)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，262：732-745(1996)；Abhinandan和Martin，Mol.Immunol.[分子免疫学]，45：3832-3839(2008)；Lefranc M.P.等人，Dev.Comp.Immunol.[发展与比较免疫学]，27：55-77(2003)；和Honegger和Pl ü ckthun，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，309：657-670(2001)，其中定义包括当互相比较时重叠的氨基酸残基或氨基酸残基的子集。然而，应用任一定义来指代抗体或移植的抗体或其变体的CDR旨在落入如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖如上文引用的参考文献中的每一篇所定义的CDR的氨基酸残基列于下表1中以供对比。CDR预测算法和界面是本领域已知的，包括例如Abhinandan和Martin，Mol.Immunol.[分子免疫学]，45：3832-3839(2008)；Ehrenmann F.等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，38：D301-D307(2010)；和Adolf-Bryfogle J.等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]，43：D432-D438(2015)。在本段中引用的参考文献的内容通过引用方式整体并入本文，以用于本申请，并且可能包括在本文的一项或多项权利要求中。
表1：CDR定义
Kabat1 Chothia2 MacCallum3 IMGT4 AHo5
VHCDR1 31-35 26-32 30-35 27-38 25-40
VHCDR2 50-65 53-55 47-58 56-65 58-77
VHCDR3 95-102 96-101 93-101 105-117 109-137
VLCDR1 24-34 26-32 30-36 27-38 25-40
VLCDR2 50-56 50-52 46-55 56-65 58-77
VLCDR3 89-97 91-96 89-96 105-117 109-137
1残基编号遵循Kabat等人的命名法(见上文)
2残基编号遵循Chothia等人的命名法(见上文)
3残基编号遵循MacCallum等人的命名法(见上文)
4残基编号遵循Lefranc等人的命名法(见上文)
3残基编号遵循Honegger和P1 ü ckthun的命名法(见上文)
表述“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指Kabat等人(见上文)中的用于抗体编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少的或更多的氨基酸。例如，重链可变结构域可包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的Kabat残基编号。
在某些实施方案中，涵盖单结构域抗体的CDR的氨基酸残基是根据Lefranc等人的IMGT命名法(见上文)定义的。在某些实施方案中，涵盖全长抗体或scFv的CDR的氨基酸残基是根据Kabat等人的Kabat命名法(见上文)定义的。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链(例如Fc区)中的残基编号是如Kabat等人的EU索引(见上文)的编号。“如Kabat的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。
“框架”或“FR”是指除了本文所定义的CDR残基以外的那些可变结构域残基。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR/HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个、通常两个中的基本上全部的可变结构域，其中全部或基本上全部的HVR/CDR对应于非人抗体的HVR/CDR，并且全部或基本上全部的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经过人源化的抗体。
“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体，和/或已使用本文公开的任何用于制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体展示文库)产生人抗体。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，222：581(1991)。还可用于制备人单克隆抗体的是描述于Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法]，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boerner等人，J.Immunol.[免疫学杂志]，147(1)：86-95(1991)中的方法。还参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.[免疫学新见]，5：368-74(2001)。可通过向转基因动物施用抗原制备人抗体，该转基因动物已被修饰以响应于抗原攻击而产生此类抗体，但其内源性基因座已失活，例如免疫的异种小鼠(xenomice)(关于XENOMOUSETM技术，参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)。关于通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体，还参见例如，Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，103：3557-3562(2006)。
关于本文鉴定的多肽和抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”定义为在比对序列(考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分)后，候选序列中与被比较的多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的，可用本领域技术中的多种方式实现比对，例如使用公众可得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)或MUSCLE软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长范围实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序MUSCLE生成氨基酸序列同一性％值(Edgar，R.C.，NucleicAcids Research[核酸研究]32(5)：1792-1797，2004；Edgar，R.C.，BMCBioinformatics[BMC生物信息学]5(1)：113，2004)。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两条比较序列中的两者的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每一者的一个位置被腺嘌呤占据，则该分子在该位置是同源的。两条序列之间的同源性百分比是两条序列具有的匹配或同源位置数除以比较的位置数乘以100的函数。例如，如果两条序列的10个位置中的6个是匹配或同源的，则这两条序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常，当两条序列比对以得到最大同源性时进行比较。
术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，该部分相对于该免疫球蛋白的含有抗原结合位点的另一部分，即可变结构域，具有更保守的氨基酸序列。恒定结构域含有重链的CH1、CH2和CH3结构域(统称为CH)和轻链的CL结构域。
来自任何哺乳动物物种的抗体(例如，免疫球蛋白)的“轻链”都可根据其恒定结构域的氨基酸序列被指定为两种明显不同的类型(称为kappa(“κ”)和lambda(“λ”))之一。
“CH1结构域”(也称为“H1”结构域的“C1”)通常从约氨基酸118延伸至约氨基酸215(EU编号系统)。
“铰链区”通常定义为IgG中对应于人IgG1的Glu216至Pro230的区域(Burton，Molec.Immunol.[分子免疫学]22：161-206(1985))。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可将其他IgG同种型的铰链区与IgGl序列比对。
人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“C2”结构域)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域较为独特，因为它不与另一个结构域紧密配对。相反，两条N连接的糖支链插入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，糖链可提供结构域-结构域配对的替代，并有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec Immunol.[分子免疫学]，22：161-206(1985)。
“CH3结构域”(也称为“C2”结构域)包含CH2结构域与Fc区的C末端之间的残基(即，从约氨基酸残基341至抗体序列的C末端)，通常在IgG的氨基酸残基446或447处)。
本文中的术语“Fc区”或“片段可结晶区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可能不同，但是人IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可例如在抗体的生产或纯化过程中去除，或者通过重组工程改造编码抗体重链的核酸去除。因此，完整抗体的组合物可包括去除了所有K447残基的抗体群体、未去除K447残基的抗体群体以及具有含和不含K447残基的抗体混合物的抗体群体。用于本文所述抗体的合适的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体的Fc区的受体。优选的FcR是天然人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和另选的剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.
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Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]15：203-234(1997))FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度评论]9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods[免疫方法]4：25-34(1994)；和deHaas等人，J.Lab.Clin.Med.[实验室与临床医学杂志]126：330-41(1995)。本文的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来鉴定的FcR。
如本文所用，术语“表位”是指抗体或抗体衍生物所结合的抗原上的特定原子或氨基酸基团。如果两个抗体或抗原结合部分对抗原表现出竞争性结合，则它们可以结合该抗原内的相同表位。
如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性识别”和“对......有特异性”是指可测量和可再现的相互作用，诸如靶标与抗体或抗体部分之间的结合，其决定了在异源分子(包括生物分子)群体存在时靶标的存在。例如，特异性识别靶标(可以是表位)的抗体或抗体部分是以与结合其他靶标相比更大的亲和力或亲合力、更高的就绪性和/或更长的持续时间结合该靶标的抗体或抗体部分。在一些实施方案中，抗体与不相关靶标的结合程度小于抗体与靶标的结合程度的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)测量的。在一些实施方案中，特异性结合靶标的抗体具有≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(KD)。在一些实施方案中，抗体特异性结合在来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不要求排他性结合。抗体或抗原结合结构域的结合特异性可通过本领域已知的方法进行实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹(Western blot)、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试、EIA测试、BIACORETM测试和肽扫描。
“分离的”抗体(或构建体)是已经从其生产环境的组分(例如天然或重组)中鉴定、分离和/或回收的抗体。在某些实施方案中，分离的多肽不与或基本上不与来自其产生环境的所有其他组分结合。
编码本文所述的构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是从在其产生环境中通常与其相关的至少一种污染物核酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子。在某些实施方案中，分离的核酸不与或基本上不与与其生产环境有关的所有组分结合。编码本文所述的多肽和抗体的分离的核酸分子的形式不同于天然存在的形式或背景。因此，分离的核酸分子不同于编码天然存在于细胞中的本文所述的多肽和抗体的核酸。分离的核酸包括通常包含核酸分子的细胞中所含的该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果将前序列或分泌性前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该前序列或分泌性前导序列的DNA与该多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子与该序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位成便于翻译，则该核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情形下是连续的并处于阅读框中。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制位点处进行连接反应来实现连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移至或引入宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已用外源核酸转染、转化或转导的细胞，该细胞包括原代目标细胞及其子代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的子代，而与传代次数无关。子代的核酸含量可能与亲代细胞不完全相同，并且可能含有突变。本文包括与在原始转化细胞中筛选或选择的细胞具有相同的功能或生物学活性的突变子代。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，是指哺乳动物，包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，受试者是人。
药剂的“有效量”是指在期望的剂量和时间段内有效达到期望的治疗或预防结果的量。该特定剂量可根据以下项中的一项或多项而改变：所选择的特定药剂、要遵循的给药方案、该药剂是否与其他化合物组合施用、施用时间、要成像的组织以及携带该药剂的物理递送系统。
本申请的物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可根据疾病状态、年龄、性别和个体体重以及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望的应答的能力等因素而改变。治疗有效量也是该物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用均被治疗有益作用所抵消的量。治疗有效量可以一次或多次施用来递送。
如本文所用，“治疗(treatment或treating)”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本申请的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下项中的一项或多项：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减轻疾病的程度、稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或全部)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病的进展、提高或改善生活质量、提高体重增长和/或延长生存期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理结果(例如，肿瘤体积)。本申请的方法考虑了这些治疗方面中的任一个或多个方面。“治疗”并不一定意味着所治疗的疾病将得到治愈。
应当理解，本文所述的本申请的实施方案包括“由......组成”和/或“基本上由......组成”的实施方案。
如本文所用，术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差范围之内，这将部分地取决于该值是怎样测量或测定的，即，受到测量系统的限制。在某些实施方案中，“约”可意指根据本领域的实践在3个或大于3个标准差之内。在某些实施方案中，“约”可表示给定值的至多20％(例如，至多10％、至多5％或至多1％)的范围。在某些实施方案中，特别是对于生物学系统和方法，该术语可意指在某一值的数量级内，例如5倍内或2倍内。
如本文所用，术语“调节”是指正向或负向改变。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约100％的改变。
如本文所用，术语“增加”是指正向地改变至少约5％。改变可为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％或更多。
如本文所用，术语“减少”是指负向地改变至少约5％。改变可为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或甚至约100％。
本文所用的术语“约X-Y”与“约X至约Y”具有相同的含义。
如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种(a)”、“或(or)”和“这些/该/所述(the)”包括复数指代。
“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型不同而变化。抗体效应子功能的示例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调和B细胞激活。
“免疫缀合物”是指缀合至一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)的抗体。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式，并且不含对该配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指药物配制品中除活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其参与抗体与抗原的结合。在某些实施方案中，天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology[库比免疫学]，第61版，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co.)，第91页(2007))单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，可使用VH或VL结构域从结合抗原的抗体中分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人，J.Immunol.[免疫学杂志]150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature[自然]352：624-628(1991)。
如本文所用，术语“抗原识别受体”是指能够响应于其与抗原的结合而激活免疫应答细胞(例如，T细胞)的受体。抗原识别受体的非限制性示例包括天然和修饰的T细胞受体(“TCR”)和嵌合抗原受体(“CAR”)。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指包含与能够激活或刺激免疫应答细胞的胞内信号传导结构域融合的胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的分子。在某些实施方案中，CAR的胞外抗原结合结构域包含抗体或抗体片段，例如VHH或scFv。在某些实施方案中，抗体(例如，VHH或scFv)与跨膜结构域融合，该跨膜结构域又与胞内信号传导结构域融合。在某些实施方案中，CAR被选择为对抗原具有高结合亲和力或亲合力。
“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞或其祖细胞或子代。
2.抗体和抗体衍生物
本公开提供了抗体和抗体衍生物。在某些实施方案中，本公开部分基于结合CD47的单克隆抗体的发现，这些抗体可用于抗肿瘤治疗，其中抗体选择性靶向肿瘤细胞并且/或者抑制由CD47介导的信号途径，从而诱导针对肿瘤细胞的有益的抗肿瘤作用。在某些实施方案中，本文公开的抗体是拮抗剂抗体，其抑制CD47受体功能。在某些实施方案中，抗CD47抗体抑制CD47受体与其配体中的一者或多者之间的相互作用。在某些实施方案中，抗CD47抗体阻断或降低由CD47受体引起的免疫抑制信号。在某些实施方案中，与参考抗体(例如，莫洛利单抗类似物)相比，抗CD47抗体表现出对正常细胞(例如，红细胞)的结合和/或毒性低或降低。在某些实施方案中，与参考抗体(例如，莫洛利单抗类似物)相比，抗CD47抗体表现出优越的治疗功效。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是或包括单克隆抗体，包括嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在某些实施方案中，本文公开的抗体包括人源化抗体。在某些实施方案中，抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，本文公开的抗体包括人抗体。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab′、scFv、双抗体或F(ab′)2片段。在某些实施方案中，抗体是全长抗体(例如，完整的IgG4抗体)或如本文所定义的其他抗体类别或同种型。在某些实施方案中，本公开的抗体或抗体衍生物可单独或组合地纳入任何特征，如本申请中(例如，本文详述的第2.1-2.12节)所述的。
本公开的抗体和抗体衍生物可用于例如赘生物或癌症的诊断或治疗。在某些实施方案中，可使用本公开的抗体抑制生长的瘤形成和癌症包括通常对免疫疗法有响应的瘤形成和癌症。在某些实施方案中，瘤形成和癌症包括乳腺癌(例如，乳腺细胞癌)、卵巢癌(例如，卵巢细胞癌)和肾细胞癌(RCC)。可使用本公开的方法治疗的其他癌症的示例包括黑色素瘤(例如，转移性恶性黑色素瘤)、前列腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、脑瘤、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、T细胞淋巴瘤)、鼻咽癌、头或颈癌、皮肤癌或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、直肠癌、肛区癌、胃肿瘤、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、乳腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、乳腺癌、骨盆癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、环境诱导的癌症(包括由石棉诱导的癌症(例如，间皮瘤))及上述癌症的组合。
2.1.1示例性抗CD47抗体
本公开提供了结合CD47蛋白的分离的抗体。在某些实施方案中，本公开的抗CD47抗体结合CD47的ECD。在某些实施方案中，抗CD47抗体结合CD47的N末端ECD，该N末端ECD包含SEQ ID NO：104所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD47抗体与本文所述的抗CD47抗体(例如，克隆M1及其变体(例如，M1#21和M1#55))结合相同的表位。
在某些实施方案中，本文公开的抗CD47抗体可用作基于CD47的信号途径的拮抗剂。在某些实施方案中，抗CD47抗体可阻断或降低CD47受体与其配体中的一者或多者之间的相互作用。在某些实施方案中，抗CD47抗体可使CD47受体与其配体之间的相互作用降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约99.9％。在某些实施方案中，抗CD47抗体可阻断CD47受体的下游免疫抑制信号传导。在某些实施方案中，使用抗CD47抗体的治疗在受试者中表现出抗肿瘤功效，从而减少肿瘤生长并且/或者延长受试者的生存期。在某些实施方案中，抗CD47抗体增加免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的免疫应答和/或抗肿瘤作用。在某些实施方案中，与参考抗CD47抗体(例如，莫洛利单抗类似物)相比，抗CD47抗体表现出对正常细胞(例如，红细胞)的结合和/或毒性降低，从而表现出脱靶效应降低。在某些实施方案中，与参考抗CD47抗体(例如，莫洛利单抗类似物)相比，抗CD47抗体表现出优越的抗肿瘤功效。莫洛利单抗，也称为Hu5F9-G4，是Liu等人(2015)“具有抗癌治疗潜力的人源化抗CD47抗体的临床前开发(Pre-ClinicalDevelopment of a Humanized Anti-CD47 Antibody with Anti-Cancer TherapeuticPotential)”，PLOS ONE[公共科学图书馆：综合]10(9)：e0137345中公开的处于临床阶段的抗CD47抗体。
在某些实施方案中，抗体以约1×10-7M或更低的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-8M或更低的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约5×10-9M或更低的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-9M或更低的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-10M或更低的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-11M至约1×10-7M之间的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-10M至约1×10-8M之间的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-10M至约5×10-8M之间的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-10M至约1×10-9M之间的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约2×10-10M至约5×10-9M之间的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-9M至约5×10-8M之间的KD结合CD47。在某些实施方案中，抗体以约1×10-10M至约5×10-9M之间的KD结合CD47。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含：a)重链可变区，该重链可变区包含：(1)重链可变区CDR-H1，该CDR-H1包含SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51和61中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)重链可变区CDR-H2，该CDR-H2包含SEQ ID NO：2、12、22、32、42、52和62中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和(3)重链可变区CDR-H3，该CDR-H3包含SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53和63中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和b)轻链可变区，该轻链可变区包含：(1)轻链可变区CDR-L1，该CDR-L1包含SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54和64中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；(2)轻链可变区CDR-L2，该CDR-L2包含SEQ IDNO：5、15、25、35、45、55和65中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和(3)轻链可变区CDR-L3，该CDR-L3包含SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56和66中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
在某些实施方案中，抗CD47抗体与参考抗CD47抗体交叉竞争，该参考抗CD47抗体包含：a)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR-L3；b)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR-L3；c)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ IDNO：26所示的氨基酸序列的CDR-L3；d)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQID NO：31所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR-L3；e)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQID NO：42所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的CDR-L3；f)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的CDR-L3；或g)重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQID NO：62所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57和67组成的组的氨基酸序列，并且该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58和68组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，并且该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，并且该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，并且该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，并且该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，并且该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，并且该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中该CDR-H1结构域、该CDR-H2结构域和该CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，该参考重链可变区包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，并且该CDR-L1结构域、该CDR-L2结构域和该CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，该参考轻链可变区包含SEQ ID NO：68所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEO ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQID NO：23所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ IDNO：34所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQID NO：46所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQID NO：52所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的CDR-L3。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，该VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的CDR-L3。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57和67组成的组的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，该轻链可变区包含与选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58和68组成的组的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57和67组成的组的氨基酸序列，该轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58和68组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ IDNO：17所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：38所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，该轻链可变区包含SEQ IDNO：68所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，包含在重链可变区中的氨基酸序列中的任一者可包含至多约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或约10个氨基酸取代、缺失和/或添加。在某些实施方案中，氨基酸取代是保守取代。
在某些实施方案中，抗体包含人框架。在某些实施方案中，抗体是人抗体。在某些实施方案中，抗体分离自人源噬菌体展示文库。
在某些实施方案中，抗CD47抗体不包含Fc区。在某些实施方案中，抗CD47抗体还包含Fc区。在某些实施方案中，Fc区包括人Fc区。在某些实施方案中，Fc区包括选自由以下项组成的组的Fc区：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区。在某些实施方案中，Fc区包括选自由以下项组成的组的Fc区：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区。在某些实施方案中，Fc区包括IgG1 Fc区。在某些实施方案中，IgG1 Fc区包含一种或多种调整抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施方案中，IgG1 Fc区包含一种或多种降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施方案中，IgG1 Fc区包含一种或多种增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施方案中，Fc区包括IgG4 Fc区。在某些实施方案中，IgG4 Fc区包含S228P的突变。在某些实施方案中，Fc区包含C末端赖氨酸。在某些实施方案中，Fc区包含C末端赖氨酸的缺失。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ IDNO：69和70所示的氨基酸序列(M1#21)。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ ID NO：69和72所示的氨基酸序列(M1#21P)。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ ID NO：71和70所示的氨基酸序列(M1#21K)。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ IDNO：71和72所示的氨基酸序列(M1#21KP)。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ IDNO：59和60所示的氨基酸序列(M1#55)。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ ID NO：59和74所示的氨基酸序列(M1#55P)。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ ID NO：73和60所示的氨基酸序列(M1#55K)。在某些实施方案中，抗CD47抗体包含重链和轻链，该重链和轻链分别包含SEQ IDNO：73和74所示的氨基酸序列(M1#55KP)。
在某些实施方案中，抗CD47抗体包含全长免疫球蛋白、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、VHH、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、VHH-Fv融合体、双抗体、三抗体、四抗体或它们的任何组合。
在某些实施方案中，抗体包含在为抗体衍生物的较大分子中。在某些实施方案中，抗体衍生物是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其中该多特异性抗体包含特异性结合第二抗原的第二抗体部分。在某些实施方案中，第二抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施方案中，肿瘤相关抗原选自由以下项组成的组：Her-2，B7H3，EGFR，PD-L1，MSLN，c-Met，B细胞成熟抗原(BCMA)，碳酸酐酶IX(CA1X)，癌胚抗原(CEA)，CD5，CD7，CD1 0，CD1 9，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，CD38，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD123，CD133，CD138，CD276(B7H3)，上皮糖蛋白(EGP2)，滋养层细胞表面抗原2(TROP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-a，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis A(CA 1.9.9)，Lewis Y(LeY)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，L1细胞粘附分子(L1 CAM)，粘蛋白16(Muc-16)，粘蛋白1(Muc-1)，NG2D配体，癌胚抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，密封蛋白18.2(CLDN18.2)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，肾母细胞瘤蛋白(WT-1)，1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)，PVR，PVRL2及它们的任何组合。在某些实施方案中，第二抗原是免疫检查点调节剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂选自由以下项组成的组：TIGIT、PD1、CTLA4、LAG-3、2B4、BTLA及它们的任何组合。在某些实施方案中，抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合抑制免疫检查点调节剂。在某些实施方案中，第二抗原是免疫共刺激分子或T细胞受体/CD3复合物的亚基。在某些实施方案中，免疫共刺激分子选自由以下项组成的组：CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40及它们的任何组合。在某些实施方案中，抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合激活免疫共刺激分子。在某些实施方案中，T细胞受体/CD3复合物的亚基选自由以下项组成的组：CD3γ、CD3δ、CD3ε及它们的任何组合。在某些实施方案中，抗体衍生物或多特异性抗体与第二抗原的结合激活T细胞受体/CD3复合物。
在某些实施方案中，抗CD47抗体通过接头与第二抗原结合部分连接。在某些实施方案中，接头是肽接头。在某些实施方案中，肽接头包含约4个至约30个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头包含约4个至约15个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头包含选自由SEQ IDNO：75-102组成的组的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗CD47抗体缀合至治疗剂或标记。在某些实施方案中，标记选自由以下项组成的组：放射性同位素、荧光染料和酶。在某些实施方案中，治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
2.2抗体亲和力
在某些实施方案中，本文公开的抗体或抗体衍生物对其靶抗原具有高结合亲和力。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-7M或更低的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-8M或更低的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约5×10-9M或更低的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-9M或更低的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-10M或更低的KD结合靶标。
在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-11M至约1×10-7M之间的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-10M至约1×10-7M之间的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-10M至约1×10-8M之间的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-11M至约1×10-9M之间的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约2×10-10M至约5×10-9M之间的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物以约1×10-9M至约5×10-8M之间的KD结合靶标。在某些实施方案中，抗体以约1×10-10M至约1×10-9M之间的KD结合靶标。
抗体或抗体衍生物的KD可通过本领域已知的方法确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试、EIA测试、Octet测试、
Figure BDA0004143687210000351
测试和肽扫描。
在某些实施方案中，KD可使用
Figure BDA0004143687210000352
表面等离子体共振测定法测量。例如但不限于，在25℃下，在固定的抗原CMS芯片上以约10个响应单位(RU)使用/>
Figure BDA0004143687210000353
-2000或/>
Figure BDA0004143687210000354
3000(Biacore公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(NJ))进行测定。在某些实施方案中，根据供应商说明书，将羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CMS，Biacore公司)用N-乙基-N′-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活。将抗原用pH4.8的10mM乙酸钠稀释至5μg/mL(约0.2μM)，之后以5μL/分钟的流速注入，以获得大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注入抗原之后，注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)以大约25μL/min的流速注入含0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。结合速率(kon)和解离速率(koff)是使用简单的一对一朗缪尔结合模型(/>
Figure BDA0004143687210000355
评估软件版本3.2)通过同时拟合结合与解离传感图来计算的。平衡解离常数(KD)可计算为比率koff/kon。参见例如，Chen等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]293：865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定法测定的结合速率(on-rate)超过106M-1 s-1，则该结合速率可使用荧光猝灭技术来确定，该技术在浓度增加的抗原存在的情况下，在25℃下测量20nM抗抗原抗体(Fab形式)的PBS(pH7.2)溶液的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如光谱仪，诸如截流配置的分光光度计(阿维夫仪器(Aviv Instruments))或具有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic公司)测量的。
2.3抗体片段
在某些实施方案中，本公开的抗体包含抗原结合片段或抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、VHH、Fv和scFv片段，以及本文所述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat.Med.[自然-医学]9：129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthtin，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies[单克隆抗体的药理学]，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，(纽约施普林格出版社(Springer-Verlag，New York)，第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体(salvage receptor)结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是双抗体。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.[自然-医学]9：129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90：6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.[自然一医学]9：129-134(2003)。
在某些实施方案中，本公开的抗体可包含单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(马萨诸塞州沃尔瑟姆Domantis公司(Domantis，Inc.，Waltham，MA)；参见例如，美国专利号6,248,516 B1)。在某些实施方案中，单结构域抗体是骆驼科动物单结构域抗体。在某些实施方案中，单结构域抗体是VHH。在某些实施方案中，单结构域抗体是嵌合抗体。在某些实施方案中，单结构域抗体是人源化抗体。
抗体片段可通过各种技术制备，这些技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)的产生，如本文所述。
2.4嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如，美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81：6851-6855(1984)。在某些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠的可变区)和人恒定区。在某些实施方案中，嵌合抗体是其中类别或亚类与亲本抗体的类别或亚类相比已经改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是人源化抗体。通常，将非人抗体进行人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)源自非人抗体，而一个或多个框架区(FR)(或其任何部分)源自人抗体序列。人源化抗体还可任选地包含人恒定区的至少一部分。在某些实施方案中，人源化抗体中的某些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所源自的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法描述于例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.[生物科学前沿]13：1619-1633(2008)；并且还描述于例如，Riechmann等人，Nature[自然]332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86：10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods[方法]36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan，Mol.Immunol.[分子免疫学]28：489-498(1991)(描述“表面重修”)；Dall’Acqua等人，Methods[方法]36：43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人，Methods[方法]36：61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer[英国癌症杂志]83：252-260(2000)(描述FR改组的“指导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，Sims等人，J.Immunol.[免疫学杂志]151：2296(1993))；源自特定轻链可变区亚组或重链可变区亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：4285(1992)；和Presta等人，J.Immunol.[免疫学杂志]151：2623(1993)；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.[生物科学前沿]13：1619-1633(2008))；和筛选FR文库得到的框架区(参见例如，Baca等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272：10678-10684(1997)和Rosok等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271：22611-22618(1996))。
2.5人抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是人抗体(例如，人结构域抗体或人DAb)。可使用本领域已知的各种技术产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.[当代药理学观点]5：368-74(2001)，Lonberg，Curr.Opin.Immunol.[当代免疫学观点]20：450-459(2008)，和Chen，Mol.Immunol.[分子免疫学]47(4)：912-21(2010)。能够产生完全人单结构域抗体(或DAb)的转基因小鼠或大鼠是本领域已知的。参见例如，US20090307787A1、美国专利号8,754,287、US20150289489A1、US20100122358A1和WO2004049794。
可通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体(例如，人DAb)，该转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其取代了内源性免疫球蛋白基因座，或其存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物中获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.[自然-生物技术]23：1117-1125(2005)。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0004143687210000383
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M/>
Figure BDA0004143687210000381
技术的美国专利号7,041,870和描述/>
Figure BDA0004143687210000382
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900)。可例如通过与不同的人恒定区结合进一步修饰来自此类动物产生的完整抗体的人可变区。
也可通过基于杂交瘤的方法制备人抗体(例如，人DAb)。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠人异源骨髓瘤细胞系(参见例如，Kozbor，J.Immunol.[免疫学杂志]133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications[单克隆抗体生产技术和应用]，第51-63页，纽约马塞尔德克尔公司(MarcelDekker，Inc.，New York)，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.[免疫学杂志]147：86(1991))。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]103：3557-3562(2006)。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系中产生单克隆人IgM抗体)和Ni，Xiandai Mianyixue[现代免疫学]26(4)：265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)还描述于Vollmers和Brandlein，Histology andHistopathology[组织学和组织病理学]20(3)：927-937(2005)和Vollmers和Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology[实验和临床药理学的方法和发现]27(3)：185-91(2005)。
还可通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列产生人抗体(例如，人DAb)。然后可将此类可变结构域序列与期望的人恒定域结合。从抗体文库选择人抗体的技术描述如下。
2.6文库来源的抗体
可通过筛选具有期望活性的抗体的组合文库分离本公开的抗体。例如，本领域已知多种用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库中具有期望的结合特性的抗体的方法。此类方法描述于例如，Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]178：1-37(O′Brien等人编辑，新泽西州托托瓦哈门那出版社(Human Press，Totowa，NJ)，2001)，并且还描述于例如，McCafferty等人，Nature[自然]348：552-554；Clackson等人，Nature[自然]352：624-628(1991)，Marks等人，J.Mol.Biol.Biol.[分子生物学杂志]222：581-597(1992)；Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]248：161-175(Lo编辑，新泽西州托托瓦哈门那出版社(Human Press，Totowa，NJ)，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]101(34)：12467-12472(2004)；和Lee等人，J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]284(1-2)：119-132(2004)。构建单结构域抗体文库的方法已有描述，例如，参见美国专利号7371849。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因库，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.[免疫学年度综述]12：433-455(1994)中所述。噬菌体通常将抗体片段展示为scFv片段或Fab片段。免疫来源的文库无需构建杂交瘤即可提供针对免疫原的高亲和力抗体。另选地，可在无需任何免疫的情况下克隆原初文库(例如，从人中获得)以提供针对广泛范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源，如Griffiths等人，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]12：725-734(1993)所述。最后，也可通过从干细胞克隆未重排的V基因片段，并使用含有用于编码高度可变CDR3区并在体外完成重排的随机序列的PCR引物，合成制备原初文库，如Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227：381-388(1992)所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
2.7抗体变体
本公开还提供了所公开抗体的氨基酸序列变体。例如，可期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。可通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括但不限于抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终的(即，经过修饰的)抗体具有期望的特性(例如，抗原结合)。
2.7.1取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。取代诱变的目的位点包括HVR(或CDR)和FR。保守取代示于表2中“优选取代”的标题下。表2中“示例性取代”的标题下提供了更实质的变化，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可将氨基酸取代引入目的抗体，并筛选出具有期望的活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC)的产物。
表2.氨基酸取代
原始残基 示例性取代 优选取代
Ala(A) Val、Leu、Ile Val
Arg(R) Lys、Gln、Asn Lys
Asn(N) Gln、His、Asp、Lys、Arg Gln
Asp(D) Glu、Asn Glu
Cys(C) Ser、Ala Ser
Gln(Q) Asn、Glu Asn
Glu(E) Asp、Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn、Gln、Lys、Arg Arg
Ile(I) Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys(K) Arg、Gln、Asn Arg
Met(M) Leu、Phe、Ile Leu
Phe(F) Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val、Ser Ser
Trp(W) Tyr、Phe Tyr
Tyr(Y) Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val(V) Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸 Leu
氨基酸可根据共同的侧链特性进行分组：(1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。在某些实施方案中，非保守取代将需要将这些类别中的一个类别的成员交换为另一个类别的成员。
在某些实施方案中，一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如，改善)并且/或者将基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(诸如本文披露的技术)方便地产生。简言之，对一个或多个HVR(或CDR)残基进行突变，并将变体抗体在噬菌体上展示并筛选出具有特定生物学活性(例如，结合亲和力)的变体抗体。
可在HVR(或CDR)中进行改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可在HVR(或CDR)“热点”(即，由在体细胞成熟过程期间发生高频突变的密码子编码的残基)(参见例如，Chowdhury，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]207：179-196(2008))和/或SDR(a-CDR)中进行，并测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建次级文库以及从次级文库中重新选择而进行的亲和力成熟已经描述于例如，Hoogenboom等人，Methods inMolecular Biology[分子生物学方法]178：1-37(O′Brien等人编辑，新泽西州托托瓦哈门那出版社(Human Press，Totowa，NJ)，(2001))中。在亲和力成熟的某些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建次级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR(或CDR)定向方法，其中使若干HVR(或CDR)残基(例如一次4-6个残基)随机化。可例如使用丙氨酸扫描诱变或模型化来特异性地鉴定抗原结合中涉及的HVR(或CDR)残基。特别是CDR-H3和CDR-L3经常被靶向。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可在一个或多个HVR(或CDR)内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可在HVR(或CDR)中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可在HVR(或CDR)“热点”或CDR之外。在上文提供的变体VHH序列的某些实施方案中，每个HVR(或CDR)要么未改变，要么包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
如Cunningham和Wells(1989)Science[科学]244：1081-1085所述，鉴定可靶向诱变的抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在这种方法中，鉴定靶残基或靶残基组(例如，带电荷的残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)置换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在氨基酸位置引入另外的取代，证明对初始取代的功能敏感性。另选地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可作为取代候选物被靶向或消除。可筛选变体以确定它们是否包含期望的特性。
氨基酸序列插入包括氨基末端和/或羧基末端融合，长度在一个残基至含有一百个或更多残基的多肽的范围内，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的示例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，用于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
2.7.2糖基化变体
在某些实施方案中，改变抗体以增加或减少构建体糖基化的程度。向抗体中添加或缺失糖基化位点可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区(例如，scFv-Fc)时，与其相连的糖可发生改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的双触角寡糖，其通常通过N键连接至Fc区CH2结构域的Asn297。参见例如，Wright等人，TIBTECH[生物技术趋势]15：26-32(1997)。寡糖可包括多种糖，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中连接至GlcNAc的岩藻糖。在某些实施方案中，可对抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
在某些实施方案中，抗体具有糖结构，该糖结构缺少(直接或间接)连接至Fc区的岩藻糖。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过计算糖链内Asn297处的岩藻糖相对于连接至Asn 297的所有糖结构(例如，复合、杂合和高甘露糖结构)的总和的平均量来确定岩藻糖的量，如通过MALDI-TOF质谱法(如例如WO 2008/077546中所述)测量的。Asn297是指位于Fc区中约位置297处(Fc区残基的EU编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中微小的序列变化，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即位于位置294和300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如，美国专利公开号US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(协和发酵工业株式会社(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd))。与“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体相关的出版物示例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.[生物技术和生物工程]87：614(2004)。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系的示例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊]249：533-545(1986)；美国专利申请号US 2003/0157108A1，Presta，L；和WO 2004/056312A1，Adams等人)，以及敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除的CHO细胞(参见例如，Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.[生物技术和生物工程]87：614(2004)；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.[生物技术和生物工程]94(4)：680-688(2006)；和WO2003/085107)。
在某些实施方案中，抗体具有平分型寡糖(bisected oligosaccharide)，例如其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc平分。此类抗体变体可具有减少的岩藻糖基化和/或提高的ADCC功能。此类抗体变体的示例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)中。还提供了在连接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有提高的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Pael等人)；WO 1998/58964(Raju，S.)；和WO 1999/22764(Raju，S.)中。
2.7.3 Fc区变体
在某些实施方案中，目前公开的抗体或抗体衍生物的Fc区可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，取代)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。在某些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入抗体部分的Fc区(例如，scFv-Fc或VHH-Fc)，从而产生Fc区变体。
在某些实施方案中，该Fc区具有部分但非全部效应子功能，此类功能使其成为应用的理想候选物，在这些应用中，抗体在体内的半衰期很重要，但某些效应子功能(诸如补体和ADCC)是非必要或有害的。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确定CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留了FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.[免疫学年度综述]9：457-492(1991)第464页的表2中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性示例描述于美国专利号5，500,362中(参见例如，Hellstrom，I.等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]83：7059-7063(1986))和Hellstrom，I等人，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82：1499-1502(1985)；5，821，337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]166：1351-1361(1987))。另选地，可采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(加利福尼亚州山景城细胞技术公司(CellTechnology，Inc.MountainView，CA))；以及CytoTox
Figure BDA0004143687210000451
非放射性细胞毒性测定(威斯康星州麦迪逊普洛麦格公司(Promega，Madison，WI)))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。另选地或另外地，可在体内，例如在动物模型中，评估目的分子的ADCC活性，诸如Clynes等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]95：652-656(1998)中所公开的。还可进行C1q结合测定以确定抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如，在WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods[免疫学方法杂志]202：163(1996)；Cragg，M.S.等人，Blood[血液]101：1045-1052(2003)；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie等人，Blood[血液]103：2738-2743(2004))。也可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如：Petkova，S.B.等人，Int′l.Immunol.[国际免疫学]18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的抗体包括其中Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个残基被取代的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有取代的Fc突变体，包括其中残基265和297被丙氨酸取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了与FcR结合增强或减弱的某些抗体变体。(参见例如，美国专利6,737,056；WO 2004/056312和Shields等人，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]9(2)：6591-6604(2001))
在某些实施方案中，Fc区包含根据残基的EU编号的一个或多个突变。在某些实施方案中，Fc区是IgG1 Fc区。在某些实施方案中，IgG1 Fc区包含L234A突变和/或L235A突变。在某些实施方案中，Fc区是IgG2 Fc区或IgG4 Fc区。在某些实施方案中，Fc区是包含F234A和/或L235A突变的IgG4 Fc区。
在某些实施方案中，Fc区是IgGl Fc区。在某些实施方案中，IgGl Fc区包含一种或多种调整抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施方案中，IgG1 Fc区包含一种或多种降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施方案中，IgG1 Fc区包含一种或多种增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的突变。在某些实施方案中，IgG1 Fc区包含L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L的突变。在某些实施方案中，IgG1 Fc区包含S239D、A330L和I332E的突变。在某些实施方案中，IgG1Fc区包含L235V、F243L、R292P和Y300L的突变。在某些实施方案中，IgGl Fc区在Fc区的位置298、333和/或334处包含取代。
在某些实施方案中，Fc区包括IgG4 Fc区。在某些实施方案中，IgG4Fc区包含S228P突变。
在某些实施方案中，Fc区包含C末端赖氨酸。在某些实施方案中，Fc区包含C末端赖氨酸的缺失。
在某些实施方案中，对Fc区进行改变，导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)发生改变(即，提高或降低)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人，J.Immunol.[免疫学杂志]164：4178-4184(2000)中所述的。
在某些实施方案中，抗体(例如，scFv-Fc或VHH-Fc)变体包含变体Fc区，该变体Fc区包含一个或多个改变半衰期和/或改变与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的氨基酸取代。具有延长的半衰期和与新生儿Fc受体(FcRn)的改善的结合的抗体，该FcRn负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.[免疫学杂志]117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.[免疫学杂志]24：249(1994))描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)。这些抗体包含其中具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，这些取代改变了Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在Fc区残基中的一个或多个残基处具有取代(例如，Fc区残基434的取代)的Fc变体(美国专利号7,371,826)。
还参见Duncan和Winter，Nature[自然]322：738-40(1988)；美国专利号5,648，260；美国专利号5,624，821；以及关于Fc区变体的其他示例的WO 94/29351。
2.7.4半胱氨酸工程化抗体变体
在某些实施方案中，可期望产生半胱氨酸工程化抗体部分，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在某些实施方案中，取代的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸取代这些残基，反应性硫醇基团由此定位在抗体的可及位点，并可用于将抗体缀合至其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)，以产生免疫缀合物，如本文进一步所述的。在某些实施方案中，以下残基中的任一个或多个残基可被半胱氨酸取代：重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体部分可如例如美国专利号7,521,541中所述产生。
2.8抗体衍生物
在某些实施方案中，本文所述的抗体可进一步修饰为包含本领域已知且容易获得的另外的蛋白质或非蛋白质部分的抗体衍生物。适于抗体衍生化的非蛋白质部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)，以及葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中可能具有优势。该聚合物可具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。连接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果连接的聚合物多于一个，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素来确定，这些因素包括但不限于待改善抗体的特定性质或功能，抗体衍生物是否将在限定条件下用于诊断等。
在某些实施方案中，抗体可进一步修饰为包含一种或多种具有生物学活性的蛋白质、多肽或其片段的抗体衍生物。如本文可互换使用的，“生物活性的”或“具有生物学活性的”意指在体内显示出生物学活性以执行特定功能。例如，它可意指与特定生物分子(诸如蛋白质、DNA等)结合，然后促进或抑制该生物分子的活性。在某些实施方案中，生物活性蛋白或其片段包括：作为用于预防或治疗疾病或病况的活性药物物质施用于患者的蛋白和多肽；以及用于诊断目的的蛋白和多肽(诸如诊断测试或体外测定中使用的酶)；以及为预防疾病而施用于患者的蛋白质和多肽(诸如疫苗)。
2.9产生方法
可使用本领域任何可获得的或已知的技术产生本文公开的抗体和抗体衍生物。例如但不限于，可使用重组方法和组合物产生抗体和抗体衍生物，例如，如美国专利号4,816,567中所述的。产生抗体和抗体衍生物的详细过程描述于以下实施例中。
目前公开的主题还提供编码本文公开的抗体或抗体衍生物的分离的核酸。例如，分离的核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列，例如抗体的轻链和/或重链。
在某些实施方案中，核酸可存在于一种或多种载体(例如，表达载体)中。如本文所用，术语“载体”是指能够转运已经与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体(表达载体)能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体常常为质粒(载体)形式。但是，所公开的主题旨在包括具有等效功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
可在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中构建本文公开的抗体或抗体衍生物的不同部分。产生多顺反子表达盒的元件的示例包括但不限于多种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(IRES，例如FGF-l IRES，、FGF-2IRES、VEGF IRES、IGF-IIIRES、NF-κBIRES、RUNX1 IRES、p53IRES、甲型肝炎IRES、丙型肝炎IRES、瘟病毒IRES、口蹄疫病毒IRES、小核糖核酸病毒IRES、脊髓灰质炎病毒IRES和脑心肌炎病毒IRES)和可切割接头(例如2A肽，例如P2A、T2A、E2A和F2A肽)。逆转录病毒载体和合适的包装细胞系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知多种产生双嗜性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等人(1985)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]5：431-437)；PA317(Miller等人(1986)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]6：2895-2902)；和CRIP(Danos等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85：6460-6464)。非双嗜性颗粒也是合适的，例如具有VSVG、RD114或GALV包膜的假型颗粒和本领域已知的任何其他非双嗜性颗粒。
在某些实施方案中，可将编码本公开的抗体或抗体衍生物的核酸和/或包括该核酸的一种或多种载体引入宿主细胞。在某些实施方案中，可通过本领域已知的任何方法将核酸引入细胞，这些方法包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。在某些实施方案中，宿主细胞可包括例如，已经用以下物质转化的宿主细胞：载体，该载体包含编码包含单结构域抗体和/或单结构域抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在某些实施方案中，宿主细胞可包括例如，已经用以下物质转化的宿主细胞：(1)包含核酸的载体，该核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，该第一载体包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，该第二载体包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在某些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，YO、NSO、Sp20细胞)。
在某些实施方案中，制备本文公开的抗体或抗体衍生物的方法可包括在适于表达该抗体或抗体衍生物的条件下培养其中已引入编码该抗体或抗体衍生物的核酸的宿主细胞，以及任选地从该宿主细胞和/或宿主细胞培养基中回收该抗体或抗体衍生物。在某些实施方案中，通过层析技术从宿主细胞中回收抗体或抗体衍生物。
为了重组产生本公开的抗体或抗体衍生物，可分离编码例如如上所述的抗体或抗体衍生物的核酸，并将其插入一种或多种载体中，以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规过程(例如，通过使用能够特异性结合编码抗体或抗体衍生物的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离此类核酸，并对其进行测序。用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，抗体或抗体衍生物可在细菌中产生。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。(还参见Charlton，Methods inMolecular Biology[分子生物学方法]，第248卷(B.K.C.Lo编辑，新泽西州托托瓦哈门那出版社(Human Press，Totowa，NJ)，2003)第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体或抗体衍生物可以可溶性级分从细菌细胞糊状物中分离，并可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母菌)也是用于抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已进行“人源化”，从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体或抗体衍生物的真菌和酵母菌株。参见Gemgross，Nat.Biotech.[自然-生物技术]22：1409-1414(2004)和Li等人，Nat.Biotech.[自然-生物技术]24：210-215(2006))。用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也可源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的示例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，它们可与昆虫细胞结合使用，特别用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。在某些实施方案中，植物细胞培养物可用作宿主细胞。参见例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
在某些实施方案中，脊椎动物细胞也可用作宿主。例如但不限于，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的非限制性示例是SY40(COS-7)转化的猴肾细胞CV1系；人胚胎肾细胞系(293或293细胞，如例如Graham等人，J GenViral.[基因病毒杂志]36：59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如例如Mather，Biol.Reprod.[生殖生物学]23：243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep 02)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]383：44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFK CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]77：42I6(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如YO、NSO和Sp2/0。关于适于抗体或抗体衍生物产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki和Wu，Methodsin MolecularBiology[分子生物学方法]，第248卷(B.K.C.Lo编辑，新泽西州托托瓦哈门那出版社(Human Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
在某些实施方案中，用于制备双特异性和/或多特异性抗体的技术包括但不限于：重组表达具有相同特异性的两个免疫球蛋白重链轻链对，其中重链或轻链中的一条或两条融合至具有不同特异性的抗原结合部分(例如，VHH或scFv)；重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链轻链对(参见Milstein和Cuello，Nature[自然]305：537(1983)，PCT专利申请号WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]10：3655(l991))；和“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利号5,731,168)。双特异性抗体也可通过以下方法来制备：用于产生抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A 1)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等人，Science[科学]，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J Immunol.[免疫学杂志]148(5)：1547-1553(1992))；使用用于制备双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90：6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如，Gruber等人，J.Immunol.[免疫学杂志]152：5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如例如Tutt等人，J Immunol.[免疫学杂志]147：60(1991)。
本公开的双特异性和多特异性分子也可使用化学技术(参见例如，Kranz(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]78：5807)、“多瘤”技术(参见例如，美国专利4,474，893)或重组DNA技术制备。目前公开的主题的双特异性和多特异性分子也可使用本领域已知的和如本文所述的方法，通过缀合组成部分结合特异性(例如，第一表位和第二表位结合特异性)制备。例如但不限于，双特异性和多特异性分子的各结合特异性可通过重组融合蛋白技术一起产生，或者可单独产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可使用多种偶联剂或交联剂进行共价结合。交联剂的非限制性示例包括蛋白质A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky(1984)J.Exp.Med.[实验医学杂志]160：1686；Liu(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82：8648)。其他方法包括Paulus(BehringIns.Mitt.[贝林研究所通报](1985)，第78期第118-132页)；Brennan((1985)Science[科学]229：81-83)；Glennie((1987)JImmunol.[免疫学杂志]139：2367-2375)所述的方法。当结合特异性是抗体(例如，两种人源化抗体)时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键合来缀合。在某些实施方案中，在缀合之前，铰链区可被修饰以包含奇数个(例如，一个)巯基残基。
在某些实施方案中，双特异性抗体的两种结合特异性可在同一载体中编码，并在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性和多特异性分子是MAb×MAb，MAb×Fab，Fab×F(ab′)2或配体×Fab融合蛋白时，此方法特别有用。在某些实施方案中，本公开的双特异性抗体可以是单链分子，诸如单链双特异性抗体，包含一个单链抗体和结合决定簇的单链双特异性分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子和多特异性分子也可以是单链分子或可包含至少两个单链分子。制备双特异性分子和多特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；以及美国专利号5,482,858中。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点(例如，表位结合位点)的工程化抗体(包括“章鱼抗体”)(参见例如，US 2006/0025576A1)。
在某些实施方案中，动物系统可用于产生本公开的抗体或抗体衍生物。用于制备杂交瘤的一种动物系统是鼠系统。
在小鼠中的杂交瘤产生是非常完善的过程。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合过程也是已知的(参见例如，Harlow和Lane(1988)，Antibodies，A Laboratory Manual[抗体实验室手册]，纽约州冷泉港冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor New York))。
2.10测定
可通过本领域已知的和本文提供的多种测定对本文提供的本公开的抗体和抗体衍生物进行鉴定、筛选，或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。
在某些实施方案中，可通过已知方法(诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或蛋白质印迹测定)来测试本公开的抗体或抗体衍生物的抗原结合活性。这些测定中的每一种测定通常通过采用对特定目的蛋白-抗体复合物具有特异性的经标记的试剂(例如，抗体)来检测该目的复合物的存在。例如，可使用例如识别并特异性结合抗体或抗体衍生物的酶联抗体或抗体片段来检测抗体或抗体衍生物。另选地，可使用多种其他免疫测定中的任一种测定来检测抗体或抗体衍生物。例如，可将抗体或抗体衍生物进行放射性标记并用于放射性免疫测定(RIA)(参见例如，Weintraub，B.，Principles ofRadioimmunoassays[放射性免疫测定的原则]，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques[关于放射性配体测定技术的第七次培训课程]，TheEndocrine Society[内分泌学会]，1986年3月，其通过引用方式并入本文)。可通过如使用盖革(Geiger)计数器或闪烁计数器或通过放射自显影等手段对放射性同位素进行检测。
在某些实施方案中，竞争测定可用于鉴定与本公开的抗体竞争结合CD47的抗体或抗体衍生物。在某些实施方案中，这种竞争性抗体结合与本文公开的抗体所结合表位相同的表位(例如，线性表位或构象表位)。Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols[表位定位方案]”，Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]，第66卷(新泽西州托托瓦哈门那出版社(Humana Press，Totowa，NJ))中提供了定位抗体所结合的表位的详细示例性方法。
在竞争测定的非限制性示例中，固定的CD47可在溶液中温育，该溶液包含结合CD47的第一标记抗体或抗体衍生物和测试其与第一抗体竞争结合CD47的能力的第二未标记抗体。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的CD47在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与CD47结合的条件下温育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定的CD47相关的标记的量。如果在测试样品中与固定的CD47相关的标记的量相比于对照样品大大减少，则表明第二抗体正与第一抗体竞争结合CD47。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual[抗体实验室手册]第14章纽约州冷泉港冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
本公开提供了用于鉴定具有生物活性的抗CD47抗体或其抗体衍生物的测定。生物活性可包括例如，激活免疫细胞或免疫激活报告分子，例如，NFAT报告分子或NF-κB报告分子。还提供了在体内和/或体外具有这种生物学活性的抗体。
2.11免疫缀合物
目前公开的主题还提供了免疫缀合物，该免疫缀合物包含缀合至一种或多种检测探针和/或细胞毒性剂(诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或它们的片段))或放射性同位素的本文公开的抗体或抗体衍生物。例如，所公开的主题的抗体或抗原结合部分可功能性地连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)至一个或多个其他结合分子(诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)。
在某些实施方案中，免疫缀合物是抗体药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至一种或多种药物，包括但不限于美登木素生物碱(参见美国专利号5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235)；澳瑞他汀(auristatin)，诸如单甲基澳瑞他汀药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利号5,635,483和5,780,588，以及7,498,298)；尾海兔素；卡奇霉素或其衍生物(参见美国专利号5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等人，Cancer Res.[癌症研究]53：3336-3342(1993)；和Lode等人，Cancer Res.[癌症研究]58：2925-2928(1998))；蒽环霉素，诸如道诺霉素或阿霉素(参见Kratz等人，Current Med.Chem.[现代药物化学]13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic&Med.Chem.Letters[生物有机化学与医药化学通讯]16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.[生物缀合化学]16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters[生物有机化学与医药化学通讯]12：1529-1532(2002)；King等人，J Med.Chem.[医药化学杂志]45：4336-4343(2002)；和美国专利号6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；紫杉烷，诸如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、替司他赛(tesetaxel)和奥他赛(ortataxel)；单端孢霉烯(trichothecene)；和CC1065。
在某些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至酶活性毒素或其片段的本文所述的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲毒蛋白、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酿霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯(tricothecene)。
在某些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至放射性原子以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于产生放射性缀合物。非限制性示例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。将放射性缀合物用于检测时，它可包括用于闪烁显像研究的放射性原子，例如tc99m或1123，或包括用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)的自旋标记，例如碘123、碘131、铟11、氟19、碳13、氮15、氧17、钆、锰或铁。
可使用多种双功能蛋白偶联剂(例如，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二亚氨酸酯HCl)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲代亚苯基2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯))制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可如Vitetta等人，Science[科学]238：1098(1987)中所述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳4标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺-五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定型接头、肽酶敏感型接头、光不稳定型接头、二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Res.[癌症研究]52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用交联剂制备的此类缀合物，这些交联剂包括但不限于可商购获得的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)(例如，来自美国伊利诺伊州罗克福德的皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology，Inc.，Rockford，IL.，U.S.A))。
2.12抗原识别受体
目前公开的主题还提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的抗原识别受体。抗原识别受体是能够响应于其与抗原的结合而激活、刺激或抑制免疫应答细胞(例如，T细胞)的受体。抗原识别受体的非限制性示例包括天然和重组T细胞受体(“TCR”)、嵌合共刺激受体(CCR)、嵌合抗原受体(“CAR”)或抑制性CAR(iCAR)。抗原识别受体的设计和使用方法是本领域公知的，并描述于文献中，例如国际公开WO 2018/027155、WO 2019/099483、WO 2019/157454、WO 2019/133969、WO 2019/099993、WO 2015/142314、WO 2018/027197和WO2014055668。
在某些实施方案中，目前公开的主题提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的嵌合抗原受体(CAR)。CAR是工程化的受体，其可将目的特异性嫁接到或赋予给免疫效应细胞。在某些实施方案中，CAR可用于将单克隆抗体的特异性嫁接到T细胞；其编码序列的转移由载体促进。在某些实施方案中，CAR是“第一代”CAR，其通常由胞外抗原结合结构域(例如，scFv或VHH)、跨膜结构域和胞质/胞内信号传导结构域组成，该胞外抗原结合结构域(例如，scFv或VHH)与该跨膜结构域融合，该跨膜结构域与该胞质/胞内信号传导结构域融合。“第一代”CAR可提供从头抗原识别，并通过在单个融合分子中的它们的CD3z链信号传导结构域引起免疫应答细胞(例如，CD4+和CD8+T细胞)的激活，而不依赖于HLA介导的抗原呈递。在某些实施方案中，CAR是“第二代”CAR，其还包含从各种共刺激分子(例如，CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD27、CD40/My88和NKGD2)至CAR的胞质尾部的胞内信号传导结构域，以向免疫应答细胞提供另外的信号，由此“第二代”CAR包括提供共刺激(例如，CD28或4-1BB)和激活(CD3z)两者的CAR。在某些实施方案中，CAR是“第三代”CAR，其包含多个共刺激结构域(例如，CD28和4-1BB)和激活(CD3z)。在某些实施方案中，CAR是第二代CAR。在某些实施方案中，CAR包含结合抗原的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中该胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，CAR还包含在胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间的铰链/间隔区。在某些实施方案中，胞外抗原结合结构域包含本文公开的抗体或抗体片段。在某些实施方案中，抗体或抗体片段包括VHH或scFv。
在某些实施方案中，目前公开的主题提供了包含本文公开的抗体或抗体片段的重组TCR。天然TCR是包含二硫键连接的异二聚体蛋白的蛋白复合物，该异二聚体蛋白由表达为含CD3链分子的复合物的一部分的两条可变链组成。天然TCR存在于T细胞表面，并负责识别作为与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合的肽的抗原。在某些实施方案中，天然TCR包含α链和β链(分别由TRA和TRB基因编码)。在某些实施方案中，TCR包含γ链和δ链(分别由TRG和TRD基因编码)。α链、β链、γ链和δ链中的每一条链包含两个胞外结构域：可变(V)区和恒定(C)区。恒定区邻近细胞膜，随后为跨膜区和短胞质尾部。可变区与肽/MHC复合物结合。每个可变区具有三个互补决定区(CDR)。在某些实施方案中，TCR包含具有CD3δ、CD3γ、CD3ε和CD3ζ的受体复合物。当TCR复合物与其抗原和MHC(肽/MHC)结合时，表达TCR复合物的T细胞被激活。
在某些实施方案中，重组TCR是非天然存在的TCR。在某些实施方案中，该重组TCR包含重组α链和/或重组b链，其中该重组α链和/或该重组b链的部分或整个可变区被本文公开的抗体或抗体片段替换。在某些实施方案中，抗体或抗体片段包括VHH、VH、VL或scFv。在某些实施方案中，抗体或抗体片段包括VHH。在某些实施方案中，重组TCR以MHC/HLA非依赖性方式结合目的抗原。在某些非限制性实施方案中，抗原的结合能够激活包含重组TCR的免疫应答细胞。
目前公开的主题提供了包含(a)本文公开的抗原识别受体(例如，CAR或TCR)的免疫应答细胞。在某些实施方案中，抗原识别受体能够激活免疫应答细胞。目前公开的主题的免疫应答细胞可以是淋巴系的细胞。包括B细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞的淋巴系提供了抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物质的检测、宿主的外来细胞的检测等。淋巴系的免疫应答细胞的非限制性示例包括T细胞、自然杀伤(NK)细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可从中分化淋巴样细胞的多能干细胞)。T细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，并且主要负责细胞介导的免疫。T细胞参与适应性免疫系统。目前公开的主题的T细胞可以是任何类型的T细胞，包括但不限于辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞(包括中央记忆T细胞、干细胞样记忆T细胞(或干细胞样记忆型T细胞)和两种类型的效应记忆T细胞：例如，TEM细胞和TEMRA细胞)、调节性T细胞(也称为抑制性T细胞)、自然杀伤T细胞、黏膜相关恒定T细胞和gdT细胞。细胞毒性T细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的T淋巴细胞的子集。患者自身的T细胞可通过引入抗原识别受体(例如，CAR或TCR)进行遗传修饰以靶向特定抗原。在某些实施方案中，免疫应答细胞是T细胞。T细胞可以是CD4+T细胞或CD8+T细胞。在某些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在某些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。自然杀伤(NK)细胞可以是淋巴细胞，其是细胞介导的免疫的一部分，并在先天免疫应答过程中起作用。NK细胞不需要预先激活即可对靶细胞发挥其细胞毒性作用。目前公开的主题的人淋巴细胞的类型包括但不限于外周供体淋巴细胞，例如在Sadelain，M.等人2003Nat Rev Cancer[自然-癌症综述]3：35-45(公开了经遗传修饰以表达CAR的外周供体淋巴细胞)；Morgan，R.A.等人2006Science[科学]314：126-129(公开了经遗传修饰以表达包含a和b异二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞)；Panelli，M.C.等人2000J Immunol[免疫学杂志]164：495-504；Panelli，M.C.等人2000JImmunol[免疫学杂志]164：4382-4392(公开了源自肿瘤活检中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物)；和Dupont，J.等人2005Cancer Res[癌症研究]65：5417-5427；Papanicolaou，G.A.等人2003 Blood[血液]102：2498-2505(公开了采用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突细胞在体外选择性地扩增抗原特异性外周血白细胞)中所公开的外周供体淋巴细胞。在某些实施方案中，免疫应答细胞(例如，T细胞)可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)或体外衍生自工程化祖细胞或干细胞。
3.使用方法
目前公开的主题还提供了使用所公开的抗体和抗体衍生物的方法。在某些实施方案中，该方法涉及目前公开的抗体或抗体衍生物的治疗用途。在某些实施方案中，该方法涉及目前公开的抗体或抗体衍生物的诊断用途。
3.1治疗方法
本公开提供了本文公开的抗体或抗体衍生物用于治疗疾病和病症或用于增加免疫应答的方法和用途。在某些实施方案中，可将抗体、抗体衍生物和/或包含其的药物组合物施用于受试者(例如，哺乳动物，诸如人)以治疗疾病和病症或增加免疫应答。在某些实施方案中，这些疾病和病症涉及免疫检查点抑制和/或异常的CD47活性。在某些实施方案中，可通过本文公开的抗体或抗体衍生物治疗的疾病和病症包括但不限于瘤形成(例如，癌症)。
在某些实施方案中，本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段)，其用于制备药物。在某些实施方案中，本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段)，其用于制备用于治疗癌症的药物。在某些实施方案中，本公开提供了本文所述的抗体或抗体衍生物(或其片段)，其用于治疗受试者的癌症。在某些实施方案中，本公开提供了包含本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)的药物组合物，其用于治疗受试者的癌症。在某些实施方案中，癌症可以是血液癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃肿瘤、成胶质细胞瘤、喉癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和多种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌还包括肿瘤学领域中的任何已知的癌，包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌及它们的肝转移、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝细胞瘤、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺瘤、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆小管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、睾丸瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、乳腺肿瘤(诸如导管腺癌和小叶腺癌)、子宫颈鳞状上皮和腺癌、子宫上皮癌和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移行性鳞状细胞癌、B和T细胞淋巴瘤(结节性和弥散性)、浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。
在某些实施方案中，癌症可以是黑色素瘤、NSCLC、头颈癌、尿路上皮癌、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌(TNBC))、胃癌、胆管癌、经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、非霍奇金淋巴瘤原发性纵隔B细胞淋巴瘤(NHL PMBCL)、间皮瘤、卵巢癌、肺癌(例如，小细胞肺癌)、食管癌、鼻咽癌(NPC)、胆道癌、结肠直肠癌、宫颈癌或甲状腺癌。
在某些实施方案中，待治疗的受试者是哺乳动物(例如，人、非人灵长类动物、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫等)。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者疑似患有癌症或有患癌症的风险、或被诊断患有癌症或具有异常CD47表达或活性的任何其他疾病。
癌症或表现出异常CD47活性的任何其他疾病的许多诊断方法和这些疾病的临床描述是本领域已知的。此类方法包括但不限于，例如免疫组织化学、PCR、荧光原位杂交(FISH)。关于异常CD47活性或表达的诊断方法的其他细节描述于例如Gupta等人(2009)ModPathol.[现代病理学]22(1)：128-133；Lopez-Rios等人(2013)J Clin Pathol.[临床病理学杂志]66(5)：381-385；Ellison等人(2013)J Clin Pathol[临床病理学杂志]66(2)：79-89；和Guha等人(2013)PLoS ONE[公共科学图书馆：综合]8(6)：e67782。
可通过任何合适的途径施用，包括例如静脉内、肌内或皮下途径。在一些实施方案中，本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与第二、第三或第四药剂(包括例如抗肿瘤药、生长抑制剂、细胞毒性剂或化学治疗剂)组合施用，以治疗涉及异常CD47活性的疾病或病症。此类药剂包括例如多西他赛、吉非替尼、FOLFIRI(伊立替康、5-氟尿嘧啶和亚叶酸)、伊立替康、顺铂、卡铂、紫杉醇、贝伐单抗(抗VEGF抗体)、FOLFOX-4、输注氟尿嘧啶、亚叶酸和奥沙利铂、阿法替尼、吉西他滨、卡培他滨、培美曲塞、替万替尼、依维莫司、CpG-ODN、雷帕霉素、来那度胺、维罗非尼、内皮抑素、拉帕替尼、PX-866、Imprime PGG和伊洛替尼。在一些实施方案中，抗体或抗体衍生物(或其片段)缀合至另外的药剂。
在某些实施方案中，本文提供的抗体或抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与一种或多种另外的疗法(诸如放射疗法、手术、化学疗法、和/或靶向疗法)组合施用。在某些实施方案中，本文提供的抗体、抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与放射疗法组合施用。在某些实施方案中，本文提供的抗体、抗体衍生物(或其片段)和/或组合物与放射疗法的组合用于治疗本文公开的赘生物或癌症。
根据要治疗的适应症和本领域技术人员熟悉的与给药相关的因素，本文提供的抗体或抗体衍生物将以在最小化毒性和副作用的同时有效治疗该适应症的剂量施用。对于癌症的治疗，典型的剂量可以是例如在0.001μg至1000μg的范围内；然而，低于或高于该示例性范围的剂量在本发明的范围内。日剂量可以是总体重的约0.1μg/kg至约100mg/kg、总体重的约0.1μg/kg至约100μg/kg或总体重的约1μg/kg至约100μg/kg。如上文提到的，可通过定期评估治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于经若干天或更长时间的重复施用，根据病况，重复进行治疗直至发生期望的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且在本发明的范围内。期望的剂量可通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物、或通过连续输注施用组合物来递送。
包含本文公开的抗体或抗体衍生物的药物组合物可每天施用一次、两次、三次或四次。组合物也可以低于每日施用的频率进行施用，例如，每周六次、每周五次、每周四次、每周三次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次。组合物也可诸如在植入物中以缓释配制品施用，该植入物逐渐释放该组合物以在一段时间内使用，并且允许该组合物以较低频率施用，诸如每月一次、每2-6个月一次、每年一次或甚至单次施用。缓释装置(诸如圆粒剂型(pellet)、纳米颗粒、微粒、纳米球、微球等)可通过注射或手术植入各种位置进行施用。
可通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸缩小、进展时间、生存持续时间、无进展生存期、总缓解率、应答持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估癌症治疗。可采用确定疗法功效的方法，包括例如通过放射成像测量反应。
在某些实施方案中，将治疗功效测量为肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，使用等式100-(T/C×100)进行计算，其中T是治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积，并且C是未治疗的肿瘤的平均相对肿瘤体积。在某些实施方案中，％TGI是约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％或高于95％。
3.2诊断和成像方法
经标记的抗体或抗体衍生物可用于诊断目的，以检测、诊断或监测与CD47的表达、异常表达和/或活性相关的疾病和/或病症。例如，本文提供的抗体和抗体衍生物可用于原位、体内、离体和体外诊断测定或成像测定。检测CD47多肽表达的方法包括(a)使用一种或多种抗体或抗体衍生物测定多肽在个体的细胞(例如，组织)或体液中的表达，以及(b)比较基因表达水平与标准基因表达水平，其中与标准表达水平相比，测定的基因表达水平的增加或减少指示异常表达。
本文提供的另外的实施方案包括诊断与动物(例如，哺乳动物，诸如人)中CD47的表达或异常表达相关的疾病或病症的方法。这些方法包括检测哺乳动物中的CD47分子。在某些实施方案中，诊断包括：(a)向哺乳动物施用有效量的经标记的抗体或抗体衍生物；(b)在施用后等待一段时间，以允许该经标记的抗体或抗体衍生物优先集中在受试者体内表达CD47分子的部位(并使未结合的经标记的分子清除至背景水平)；(c)确定背景水平；以及(d)检测受试者中该经标记的分子，使得检测到高于该背景水平的经标记的分子指示受试者患有与CD47表达或异常表达相关的特定疾病或病症。背景水平可通过不同方法确定，这些方法包括将检测到的经标记的分子的量与先前针对特定系统确定的标准值进行比较。
本文提供的抗体和抗体衍生物可用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法测定生物样品中的蛋白质水平(例如，参见Jalkanen等人，J.Cell.Biol.[细胞生物学杂志]101：976-985(1985)；Jalkanen等人，J.Cell.Biol.[细胞生物学杂志]105：3087-3096(1987))。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，包括酶标记，诸如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，诸如碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115mIn、113mIn、112In、111In)和锝(99Tc、99mTc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru；鲁米诺；以及荧光标记，诸如荧光素和罗丹明，和生物素。
本领域已知的技术可应用于本文提供的经标记的抗体(或其片段)。这些技术包括但不限于使用双功能缀合剂(参见例如，美国专利号5,756,065；5,714,631；5,696,239；5,652,361；5,505,931；5,489,425；5,435,990；5,428,139；5,342,604；5,274,119；4,994,560；和5,808,003)。
另选地或另外地，可例如通过使用对应于编码CD47的核酸或其互补序列的基于核酸的探针的荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的WO98/45479)、DNA印迹法、RNA印迹法或聚合酶链反应(PCR)技术(诸如实时定量PCR(RT-PCR))，测量细胞中编码CD47多肽的核酸或mRNA的水平。还可例如使用基于抗体的测定，通过测量生物流体(诸如血清)中的脱落抗原来研究CD47过表达，(还参见例如，1990年6月12日公布的美国专利号4,933,294；1991年4月18日公布的WO91/05264；1995年3月28日公布的美国专利号5,401,638；以及Sias等人，J.Immunol.Methods[免疫法杂志]132：73-80(1990))。除了上述测定之外，本领域技术人员可获得各种体内和离体测定。例如，可将哺乳动物体内的细胞暴露于抗体，该抗体任选地用可检测标记(例如，放射性同位素)进行标记，并且可例如通过外部扫描放射性或者通过分析取自先前暴露于该抗体的哺乳动物的样品(例如，活检或其他生物样品)来评估抗体与体细胞的结合。
4.药物配制品
目前公开的主题还提供了包含本文公开的抗体或抗体衍生物以及药学上可接受的载剂的药物配制品。在某些实施方案中，药物组合物可包括目前公开的主题的多种(例如，两种或更多种)抗体和/或抗体衍生物的组合。
在某些实施方案中，可通过将具有期望纯度的抗体或抗体衍生物与一种或多种任选的药学上可接受的载剂组合来制备公开的药物配制品(“Remington′s PharmaceuticalSciences”(雷明顿药物科学)第16版，Osol，A.编辑(1980))，其形式为冻干配制品或水溶液。例如但不限于，冻干抗体配制品描述于美国专利号6,267,958。在某些实施方案中，抗体配制品水溶液可包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的抗体配制品水溶液，后者的配制品包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。在某些实施方案中，抗体或抗体衍生物可具有大于约80％、大于约90％、大于约91％、大于约92％、大于约93％、大于约94％、大于95％、大于约96％、大于约97％、大于约98％、大于约99％、大于约99.1％、大于约99.2％、大于约99.3％、大于约99.4％、大于约99.5％、大于约99.6％、大于约99.7％、大于约99.8％或大于约99.9％的纯度。
药学上可接受的载剂通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、烷基对羟基苯甲酸酯(诸如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药学上可接受的载剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0004143687210000651
百特国际有限公司(Baxter International Inc.))。某些示例性的sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968。在某些实施方案中，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
载剂可适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物(例如，抗CD47抗体)包被在材料中，以保护该化合物免受酸和可使化合物失活的其他自然条件的影响。
本公开的药物组合物也可以组合疗法施用，即与其他药剂组合施用。在某些实施方案中，本文公开的药物组合物还可包含多于一种治疗适应症所必需的活性成分，例如，具有不会对彼此的互补活性产生不利影响的活性成分。在某些实施方案中，药物配制品可包含用于治疗由第一治疗剂治疗的相同疾病的第二活性成分。此类活性成分合适地以对于预期目的有效的量组合存在。例如但不限于，本公开的配制品还可包含多于一种治疗特定适应症所必需的活性成分，优选具有不会对彼此的互补活性产生不利影响的活性成分。例如，可期望进一步提供可用于治疗相同疾病的第二治疗剂。此类活性成分合适地以对于预期目的有效的量组合存在。
本公开的组合物可通过本领域已知的多种方法施用。施用途径和/或方式因期望的结果而异。活性化合物可用保护化合物免于快速释放的载剂来制备，诸如控释配制品，包括植入物、透皮贴剂以及微囊化递送系统。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类配制品的许多方法描述于例如，“Sustained and Control1ed Release Drug Delivery Systems”(缓释和控释药物递送系统)，J.R.Robinson编辑，纽约马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.，NewYork)，1978。在某些实施方案中，药物组合物是根据美国食品药品监督管理局(U.S.Foodand Drug Administration)的“良好生产规范”(Good Manufacturing Practice(GMP))生产的。
也可制备含有本文公开的抗体或抗体衍生物的缓释制剂。缓释制剂的合适示例包括含有抗体或抗体衍生物的固体疏水聚合物的半透性基质，这些基质为成型制品形式，例如薄膜或微胶囊形式。在某些实施方案中，活性成分可包封于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，包封于胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包封于粗乳液中。此类技术公开于“Remington′s Pharmaceutical Sciences”(雷明顿药物科学)第16版，Osol，A.编辑(1980)。
为了通过某些施用途径施用本公开的抗体或抗体衍生物，可能有必要用防止化合物失活的材料包被该化合物或将该材料与该化合物共同施用。例如，可在合适的载剂(例如，脂质体)或稀释剂中将化合物施用于受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体(Strejan等人(1984)JNeuroimmunol.[神经免疫学杂志]7：27)。
药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。使用此类介质和试剂用于药物活性物质是本领域中已知的。
除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则可考虑将其用于本公开的药物组合物中。还可将补充性活性化合物掺入组合物中。
治疗组合物通常必须是无菌的、基本等渗的，并且在制备和储存条件下是稳定的。该组合物可被配制为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其他有序结构。该载剂可以是含有以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及它们适合的混合物。可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)，通过在分散体的情况下保持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂来保持恰当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
可通过根据需要将所需量的本文公开的一种或多种抗体或抗体衍生物与上文列举的成分的一种成分或成分的组合掺入合适的溶剂中，然后进行灭菌微滤(例如通过无菌滤膜过滤)来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和来自上文列举的成分的所需其他成分的无菌溶媒中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何另外的期望成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥(冻干)。
还可用本领域已知的医学装置来施用治疗组合物。例如，本公开的治疗组合物可用无针头皮下注射装置施用，诸如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中公开的装置。可用于本公开的植入物和模块的示例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以受控的速率分配药物的可植入微输液泵；美国专利号4,486,194，其公开了一种用于通过皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了一种用于以精确的输注速率递送药物的药物输液泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开了具有多室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。已知许多其他此类植入物、递送系统和模块。
对于治疗组合物，本公开的配制品包括适于口服、经鼻、局部(包括经颊和经舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用的配制品。这些配制品可方便地以单位剂量形式存在并且可通过药学领域公知的任何方法制备。可与载剂材料组合以产生单一剂型的抗体或抗体衍生物的量根据治疗的受试者和特定的施用方式而变化。可与载剂材料组合以产生单一剂型的抗体或抗体衍生物的量通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以百分数计，该量的范围是约0.01％至约99％的活性成分、约0.1％至约70％的活性成分，或约1％至约30％的活性成分。
用于局部或经皮施用本公开的组合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液、贴剂和吸入剂。可将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载剂和可能需要的任何防腐剂、缓冲液或推进剂混合。
短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”是指除了肠内施用和局部施用之外的、通常通过注射的施用方式，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
这些药物组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上述灭菌程序，以及通过加入各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物的存在。还可期望将等渗剂，诸如糖、氯化钠等加入组合物中。此外，通过加入延迟吸收的药剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)可实现可注射药物形式的延长吸收。
在某些实施方案中，将本公开的抗体或抗体衍生物作为药物施用于人和动物时，它们可单独或与药学上可接受的载剂组合以药物组合物的形式施用，该药物组合物包含例如约0.01％至约99.5％(或约0.1％至90％)的抗体或抗体衍生物。
5.制品
目前公开的主题还提供了制品(例如，试剂盒)，该制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。
在某些实施方案中，制品/试剂盒包括容器以及在该容器上或与该容器相关的标签或包装插页。合适容器的非限制性示例包括瓶、小瓶、注射器、静脉注射液袋等。容器可由各种材料诸如玻璃或塑料形成。容器可容纳(本身或与另一种组合物组合)有效治疗、预防和/或诊断病况的组合物，并且可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射液袋或具有可由皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。
在某些实施方案中，组合物中的至少一种活性剂是本公开的抗体或抗体衍生物。标签或包装插页可指示该组合物用于治疗选择的病况。
在某些实施方案中，制品/试剂盒可包括(a)第一容器，该第一容器中装有组合物，其中该组合物包含本公开的抗体或抗体衍生物；和(b)第二容器，该第二容器中装有组合物，其中该组合物包含另外的细胞毒性剂或治疗剂。在某些实施方案中，制品/试剂盒还可包括指示组合物可用于治疗特定病况的包装插页。
另选地或另外地，制品/试剂盒还可包括另外的容器(例如，第二或第三容器)，该另外的容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如但不限于抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品/试剂盒可包括从商业和用户角度看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
序列表
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以下实施例仅是对目前公开的主题的说明，不应视为以任何方式进行限制。
实施例
实施例1：具有降低的脱靶结合的抗CD47抗体的鉴定
从内部合成的原初人Fab噬菌体文库中分离抗CD47克隆，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACS)针对CD47 N末端ECD进行筛选。使用从八个健康供体分离的PBMC样品产生原初人Fab噬菌体文库。然后通过使用标准装配PCR技术将所得克隆的VL和VH的核苷酸序列与人IgG4的恒定区融合，使用所得克隆产生全长抗体。从原初Fab噬菌体文库中鉴定了两个前导克隆(lead clone)M1和M2。
然后通过在4℃下将表达CD47的细胞(Raji细胞，B细胞淋巴瘤)与在FACS缓冲液(含有2％FBS的1×PBS)中连续稀释的抗CD47单克隆抗体一起温育半小时，测试抗CD47抗体的全细胞结合能力。用FACS缓冲液洗涤细胞，并用山羊抗人IgG(H+L)FITC抗体或山羊抗小鼠IgG(H+L)FITC抗体在4℃下再检测结合半小时。使用Cytomics FC 500(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))进行流式细胞术分析。抗CD47参考抗体(基于Liu等人(2015)，PLOS ONE[公共科学图书馆：综合]10(9)：e0137345中公开的序列信息内部合成的莫洛利单抗(magrolimab)类似物)用作阳性对照。IgG同种型对照(抗PD1抗体)和IgG同种型对照(抗PD1抗体)用作阴性对照。如图1所示，通过流式细胞术检测抗体克隆M1和M2与表达CD47的Raji细胞的结合。
然后根据标准方案，对抗体克隆M1进行基于体外噬菌体展示的亲和力成熟，以增强对CD47抗原的亲和力。简言之，对一个或多个CDR残基进行突变，并将变体抗体展示在噬菌体上，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和荧光激活细胞分选(FACS)筛选出对CD47蛋白具有更好的结合能力的变体抗体。
使用上述方法测试M1变体对Jurkat细胞的全细胞结合能力。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)用作阳性对照。贝伐单抗(抗VEGF-A抗体)用作阴性对照。如图2A所示，克隆M1及其变体(M1#11、M1#21、M1#25、M1#33、M1#46和M1#55)能结合Jurkat细胞(天然表达CD47的人白血病细胞系)。
尽管CD47由许多类型的肿瘤组织表达以逃避免疫系统，但它也在红细胞(RBC)上表达。筛选出与正常组织(诸如RBC)的结合降低的抗CD47抗体。使用上述方法测试M1变体对RBC的全细胞结合能力。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)用作阳性对照。贝伐单抗(抗VEGF-A抗体)用作阴性对照。如图2B所示，在药理学上可接受的浓度水平下，克隆M1及其变体(M1#11、M1#21、M1#25、M1#33、M1#46和M1#55)与莫洛利单抗类似物相比均表现出与RBC的结合降低。这些结果表明，克隆M1及其变体可靶向表达CD47的肿瘤组织，并与莫洛利单抗类似物相比，具有降低的与RBC的脱靶结合。
另外，还测试了在恒定区中具有修饰的M1变体。例如，M1#21K与M1#21相比加入了C末端赖氨酸，并且M1#21KP在M1#21K的轻链恒定区中含有一个氨基酸取代。使用上述方法测试这些恒定区变体对Jurkat细胞和RBC的全细胞结合能力。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)用作阳性对照。曲妥珠单抗(抗HER2抗体)用作阴性对照。如图3A所示，恒定区变体(M1#21K和M1#21KP)能以与M1#21相同的方式结合Jurkat细胞(天然表达CD47的人白血病细胞系)。如图3B所示，与M1#21相似，与莫洛利单抗类似物相比，恒定区变体(M1#21K和M1#21KP)均表现出与RBC的结合降低。这些结果表明，克隆M1及其变体可靶向表达CD47的肿瘤组织，并与莫洛利单抗类似物相比，具有降低的与RBC的脱靶结合。这些结果还表明，与莫洛利单抗类似物相比，恒定区中的修饰不改变M1变体靶向表达CD47的肿瘤组织的能力或其与RBC的降低的脱靶结合。
实施例2：抗CD47抗体对人SIRPα与CD47结合的抑制
为了测试抗CD47抗体对抑制CD47介导的信号途径的作用，测试了抗体阻断CD47与SIRPα(CD47的配体)结合的能力。将表达CD47的细胞(Jurkat)(1E5个细胞/孔)洗涤，并重新悬浮于FACS缓冲液(含有2％FBS的1×PBS)中。将不同浓度的测试抗体和固定浓度的生物素-人SIRPα-Fc混合，并与细胞在4℃下共温育30分钟。洗去未结合的抗体和生物素-人SIRPα-Fc，然后在4℃下将细胞用链霉亲和素-PE染色30分钟。使用Cytomics FC 500(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter Inc.))进行流式细胞术分析。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)和IgG同种型对照(抗PD1抗体)分别用作阳性和阴性对照。
如图4所示，与莫洛利单抗类似物相比，克隆M1及其变体显示出类似的阻断CD47与SIRPα结合的能力。结果表明，克隆M1及其变体作为针对CD47的拮抗抗体功能正常。
实施例3：抗CD47抗体对红细胞的降低的脱靶效应
尽管CD47由许多类型的肿瘤组织表达以逃避免疫系统，但它也在红细胞(RBC)上表达。为了评价抗CD47抗体对RBC的脱靶效应，检测了它们对诱导血凝反应的作用。将人RBC用0.9％NaCl缓冲液洗涤两次，在0.9％NaCl缓冲液中稀释至10％，然后在37℃下与连续稀释的抗体在圆底96孔板中温育2小时或过夜。凝集的RBC将均匀地覆盖孔底部，相比之下，非凝集的细胞将在孔底部形成红点。抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)用作阳性对照。同种型对照(抗PD1 IgG4)用作阴性对照。
如图5所示，抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)以剂量依赖性方式诱导RBC凝集。相比之下，克隆M1及其变体不诱导任何RBC凝集，与IgG同种型对照(抗PD1抗体)相似。
此外，先前的研究表明抗CD47抗体可通过诱导巨噬细胞介导的对肿瘤细胞的吞噬发挥抗肿瘤作用。为了评价抗CD47抗体对RBC的脱靶效应，检测了它们对巨噬细胞介导的对RBC和肿瘤细胞的吞噬的作用。将Raw264.7细胞(永生化巨噬细胞)和从人外周血单核细胞(PBMC)分离的巨噬细胞接种在48孔板中并贴壁培养过夜。人白血病细胞系Jurkat由于其CD47的高表达而用作靶细胞。
将Jurkat细胞或RBC在37℃下用CFSE标记10分钟，用完全RPMI-1640培养基洗涤，然后与连续稀释的克隆M1及其变体、抗CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)或同种型对照抗体(抗PD1抗体，阴性对照)一起在37℃下温育30分钟。然后将抗体-靶细胞混合物与Raw264.7细胞或PBMC衍生的巨噬细胞以1∶1的比例(针对Jurkat细胞)或10∶1的比例(针对RBC)温育2小时。随后，除去未吞噬的靶细胞。刮取剩余的吞噬细胞，用PE-Cyanine 7缀合的F4/80抗体或CD14抗体(eBioscience)染色，并通过流式细胞术分析。吞噬能力计算为总F4/80+细胞中F4/80+CFSE+细胞的百分比或总CD14+细胞中CD14+CFSE+细胞的百分比。
莫洛利单抗类似物、克隆M1及其变体均诱导Raw264.7细胞(图6A)和PBMC衍生的巨噬细胞(图6C)介导的针对Jurkat的吞噬。然而，与莫洛利单抗类似物相反，克隆M1及其变体不诱导Raw264.7细胞(图6B)或PBMC衍生的巨噬细胞(图6D)介导的针对RBC的吞噬。这些结果表明，与莫洛利单抗类似物相比，克隆M1及其变体表现出对正常组织的脱靶效应降低，但保持了它们诱导巨噬细胞介导的针对肿瘤细胞的吞噬的抗肿瘤效应。
实施例4：抗CD47抗体在WiDr(人结肠癌)异种移植瘤小鼠模型中的抗肿瘤功效
由于NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠表达的SIRPα可强力结合人CD47并模拟人SIRPα与人CD47的结合，因此所有体内研究中均使用NOD/SCID小鼠。体内实验按照规定的指南进行。
使用NOD/SCID小鼠评价抗CD47抗体在WiDr(人结肠癌)异种移植瘤小鼠模型中的体内抗肿瘤功效。小鼠皮下移植3×106个WiDr人结肠癌细胞。肿瘤接种后七天，将小鼠用溶媒对照(安慰剂)、CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)和M1变体M1#21进行腹膜内处理，每周两次，持续3周，剂量为3mg/kg和10mg/kg。每周两次观察肿瘤的形成。肿瘤体积计算为TV(肿瘤体积)＝(长度×宽度2)/2。
肿瘤生长曲线如图7所示。数据表明，莫洛利单抗类似物和M1#21在两种不同的剂量方案下均表现出对NCI-H82癌细胞的显著肿瘤生长抑制，而M1#21在两种剂量方案中的每一种下均表现出与莫洛利单抗类似物相比更好的肿瘤生长抑制。
实施例5：抗CD47抗体在NCI-H82(人小细胞肺癌)异种移植瘤小鼠模型中的抗肿瘤功效
还使用NOD/SCID小鼠评价抗CD47抗体在NCI-H82(人小细胞肺癌)异种移植瘤小鼠模型中的体内抗肿瘤功效。小鼠皮下移植3×106个表达人CD47的小细胞肺癌细胞NCI-H82。肿瘤接种后七天，在第0天、第3天、第7天和第14天将小鼠用溶媒对照(安慰剂)、CD47参考抗体(莫洛利单抗类似物)、克隆M1及其变体(M1#21和M1#55)进行腹膜内处理。每周两次观察并测量肿瘤。肿瘤体积计算为TV(肿瘤体积)＝(长度×宽度2)/2。
肿瘤生长曲线如图8所示。数据表明，莫洛利单抗类似物、克隆M1及其变体M1#21和M1#55均表现出对NCI-H82癌细胞的显著肿瘤生长抑制，而M1#21和M1#55均表现出与莫洛利单抗类似物相比增强的肿瘤生长抑制。
除了所述和要求保护的各种实施方案之外，所公开主题还针对具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施方案。这样，本文所呈现的特定特征可在所公开主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开主题包括本文公开的特征的任何合适的组合。出于例示和说明的目的，已经呈现了所公开主题的具体实施方案的以上说明。以上说明并不旨在是穷尽的或将所公开主题限制于所公开的那些实施方案。
对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离所公开主题的精神或范围的情况下，可对所公开主题的组成和方法进行多种修改和变化。因此，预期的是所公开主题包括在所附权利要求书及其等同物范围之内的修改和变化。
本文引用了多种出版物、专利和专利申请，其内容通过引用方式整体并入本文。
序列表
<110> 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司
上海复宏汉霖生物制药有限公司
上海复宏汉霖生物医药有限公司
<120> 抗CD47抗体及使用方法
<160> 104
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(5)
<223> 克隆M1 VH CDR1
<400> 1
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(16)
<223> 克隆M1 VH CDR2
<400> 2
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1 VH CDR3
<400> 3
Phe Thr Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(13)
<223> 克隆M1 VL CDR1
<400> 4
Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile Gly Ser His Lys Val Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 克隆M1 VL CDR2
<400> 5
Gly Asn Asp Gln Arg Arg Ser
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1 VL CDR3
<400> 6
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val
1 5 10
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(119)
<223> 克隆M1 VH
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Thr Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(116)
<223> 克隆M1 VL
<400> 8
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro
115
<210> 9
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(446)
<223> 克隆M1 HC
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Thr Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(219)
<223> 克隆M1 LC
<400> 10
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser
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<220>
<221> DOMAIN
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<212> PRT
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<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
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<212> PRT
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<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(13)
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<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
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<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
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1 5 10 15
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Phe His Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Arg Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
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100 105 110
Leu Gly Gln Pro
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
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1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe His Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
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Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Arg Gly Val Pro Asp
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Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
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Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
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Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
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Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
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Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
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<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(16)
<223> 克隆M1#25 VH CDR2
<400> 22
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<213> 人工序列
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<221> DOMAIN
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<221> DOMAIN
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<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(119)
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<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Val Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
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<213> 人工序列
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<221> CHAIN
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20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
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50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
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100 105 110
Leu Gly Gln Pro
115
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<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(445)
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<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Val Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Thr Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 30
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(219)
<223> 克隆M1#25 LC
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Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
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Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Ala Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
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210 215
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(5)
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(16)
<223> 克隆M1#33 VH CDR2
<400> 32
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1#33 VH CDR3
<400> 33
Phe Ile Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(13)
<223> 克隆M1#33 VL CDR1
<400> 34
Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile Gly Ser His Lys Val Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 克隆M1#33 VL CDR2
<400> 35
Asp Asn Asp Gln Arg Arg Ser
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1#33 VL CDR3
<400> 36
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val
1 5 10
<210> 37
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(119)
<223> 克隆M1#33 VH
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Ile Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(116)
<223> 克隆M1#33 VL
<400> 38
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Asp Asn Asp Gln Arg Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro
115
<210> 39
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(445)
<223> 克隆M1#33 HC
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Ile Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
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385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 40
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(219)
<223> 克隆M1#33 LC
<400> 40
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Asp Asn Asp Gln Arg Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(5)
<223> 克隆M1#46 VH CDR1
<400> 41
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(16)
<223> 克隆M1#46 VH CDR2
<400> 42
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1#46 VH CDR3
<400> 43
Phe Ser Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(13)
<223> 克隆M1#46 VL CDR1
<400> 44
Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile Gly Ser His Lys Val Lys
1 5 10
<210> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 克隆M1#46 VL CDR2
<400> 45
Gly Asn Asp Gln Arg Arg Ser
1 5
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1#46 VL CDR3
<400> 46
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(119)
<223> 克隆M1#46 VH
<400> 47
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Ser Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(116)
<223> 克隆M1#46 VL
<400> 48
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro
115
<210> 49
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(445)
<223> 克隆M1#46 HC
<400> 49
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Ser Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 50
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(219)
<223> 克隆M1#46 LC
<400> 50
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(5)
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<400> 51
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(16)
<223> 克隆M1#55 VH CDR2
<400> 52
Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1#55 VH CDR3
<400> 53
Phe Lys Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(13)
<223> 克隆M1#55 VL CDR1
<400> 54
Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile Gly Ser His Lys Val Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 克隆M1#55 VL CDR2
<400> 55
Gly Asn Asp Gln Arg Arg Glu
1 5
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1#55 VL CDR3
<400> 56
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val
1 5 10
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(119)
<223> 克隆M1#55 VH
<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Lys Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 58
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(116)
<223> 克隆M1#55 VL
<400> 58
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Glu Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro
115
<210> 59
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(445)
<223> 克隆M1#55 HC
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Lys Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 60
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(219)
<223> 克隆M1#55 LC
<400> 60
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Glu Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(5)
<223> 克隆M1#21 VH CDR1
<400> 61
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(16)
<223> 克隆M1#21 VH CDR2
<400> 62
Glu Ile Asn Gln Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1#21 VH CDR3
<400> 63
Phe Thr Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210> 64
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(13)
<223> 克隆M1#21 VL CDR1
<400> 64
Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile Gly Ser His Lys Val Lys
1 5 10
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 克隆M1#21 VL CDR2
<400> 65
Gly Asn Asp Gln Arg Phe Ser
1 5
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(11)
<223> 克隆M1#21 VL CDR3
<400> 66
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val
1 5 10
<210> 67
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(119)
<223> 克隆M1#21 VH
<400> 67
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Gln Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Thr Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 68
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(116)
<223> 克隆M1#21 VL
<400> 68
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro
115
<210> 69
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(445)
<223> 克隆M1#21 HC
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Gln Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Thr Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 70
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(219)
<223> 克隆M1#21 LC
<400> 70
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Leu Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 71
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(446)
<223> 克隆M1#21 HC-2
<400> 71
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Gln Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Thr Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 72
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(219)
<223> 克隆M1#21 LC-2
<400> 72
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 73
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(446)
<223> 克隆M1#55 HC-2
<400> 73
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Phe Lys Gly Arg Pro Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 74
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CHAIN
<222> (1)..(219)
<223> 克隆M1#55 LC-2
<400> 74
Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Thr
1 5 10 15
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Glu Ser Asn Ile
20 25 30
Gly Ser His Lys Val Lys Trp Tyr Gln Gln Phe Ala Gly Ala Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile His Gly Asn Asp Gln Arg Arg Glu Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp
85 90 95
Asp Ser Leu Tyr Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
100 105 110
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
130 135 140
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
145 150 155 160
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
180 185 190
Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
195 200 205
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(12)
<223> 75示例性接头
<400> 75
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(15)
<223> 76示例性接头
<400> 76
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(5)
<223> 77示例性接头
<400> 77
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> 78示例性接头
<400> 78
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(8)
<223> 79示例性接头
<400> 79
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 80
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(12)
<223> 80示例性接头
<400> 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(6)
<223> 81示例性接头
<400> 81
Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(9)
<223> 82示例性接头
<400> 82
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 83示例性接头
<400> 83
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 84
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(21)
<223> 84示例性接头
<400> 84
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly
20
<210> 85
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(5)
<223> 85示例性接头
<400> 85
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(15)
<223> 86示例性接头
<400> 86
Pro Ala Pro Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro Pro Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 87示例性接头
<400> 87
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 88示例性接头
<400> 88
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
1 5
<210> 89
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CONFLICT
<222> (1)..(4)
<223> 89示例性接头
<400> 89
Ala Ser Thr Lys
1
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(12)
<223> 90示例性接头
<400> 90
Ala Ser Thr Lys Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(7)
<223> 91示例性接头
<400> 91
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5
<210> 92
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(12)
<223> 92示例性接头
<400> 92
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5 10
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> 93示例性接头
<400> 93
Gly Arg Pro Gly Ser Gly Arg Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(20)
<223> 94示例性接头
<400> 94
Gly Arg Pro Gly Ser Gly Arg Pro Gly Ser Gly Arg Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Arg Pro Gly Ser
20
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> 95示例性接头
<400> 95
Gly Arg Gly Gly Ser Gly Arg Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 96
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(20)
<223> 96示例性接头
<400> 96
Gly Arg Gly Gly Ser Gly Arg Gly Gly Ser Gly Arg Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Arg Gly Gly Ser
20
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> 97示例性接头
<400> 97
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 98
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(20)
<223> 98示例性接头
<400> 98
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Ser
20
<210> 99
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> 99示例性接头
<400> 99
Gly Glu Pro Gly Ser Gly Glu Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 100
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> CONFLICT
<222> (1)..(20)
<223> 100示例性接头
<400> 100
Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser Gly Glu Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Glu Gly Gly Ser
20
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(10)
<223> 101示例性接头
<400> 101
Gly Asp Pro Gly Ser Gly Asp Pro Gly Ser
1 5 10
<210> 102
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(20)
<223> 102示例性接头
<400> 102
Gly Asp Pro Gly Ser Gly Asp Pro Gly Ser Gly Asp Pro Gly Ser Gly
1 5 10 15
Asp Pro Gly Ser
20
<210> 103
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(312)
<223> CD47多肽
<400> 103
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe
145 150 155 160
Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val
180 185 190
Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr
195 200 205
Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His
210 215 220
Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu
245 250 255
Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile
260 265 270
Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr
275 280 285
Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys
290 295 300
Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Glu
305 310
<210> 104
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(121)
<223> CD47 N末端ECD
<400> 104
Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn
1 5 10 15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
20 25 30
Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
35 40 45
Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro
115 120

Claims (69)

1.一种结合CD47的抗体，所述抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区包含：
(1)重链可变区CDR-H1，所述CDR-H1包含SEQ ID NO：1、11、21、31、41、51和61中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(2)重链可变区CDR-H2，所述CDR-H2包含SEQ ID NO：2、12、22、32、42、52和62中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和
(3)重链可变区CDR-H3，所述CDR-H3包含SEQ ID NO：3、13、23、33、43、53和63中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区包含：
(1)轻链可变区CDR-L1，所述CDR-L1包含SEQ ID NO：4、14、24、34、44、54和64中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；
(2)轻链可变区CDR-L2，所述CDR-L2包含SEQ ID NO：5、15、25、35、45、55和65中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体；和
(3)轻链可变区CDR-L3，所述CDR-L3包含SEQ ID NO：6、16、26、36、46、56和66中任一者的氨基酸序列，或其包含至多约3个氨基酸取代的变体。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体以1×10-8M或更低的KD结合CD47。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体以5×10-9M或更低的KD结合CD47。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中所述抗体以约1×10-11M至约1×10-8M之间的KD结合CD47。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体以约1×10-10M至约1×10-8M之间的KD结合CD47。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中所述抗体与参考抗CD47抗体交叉竞争，所述参考抗CD47抗体包含：
a)重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR-L3；
b)重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ IDNO：14所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR-L3：
c)重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ IDNO：24所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的CDR-L3；
d)重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ IDNO：34所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR-L3；
e)重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ IDNO：44所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的CDR-L3；
f)重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ IDNO：54所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的CDR-L3；或
g)重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：62所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ IDNO：64所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的CDR-L3。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
a)重链可变区，所述重链可变区包含CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，其中所述CDR-H1结构域、所述CDR-H2结构域和所述CDR-H3结构域分别含有包含在参考重链可变区中的CDR-H1结构域、CDR-H2结构域和CDR-H3结构域，所述参考重链可变区包含选自由SEQ ID NO：7、17、27、37、47、57和67组成的组的氨基酸序列；和
b)轻链可变区，所述轻链可变区包含CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，其中所述CDR-L1结构域、所述CDR-L2结构域和所述CDR-L3结构域分别含有包含在参考轻链可变区中的CDR-L1结构域、CDR-L2结构域和CDR-L3结构域，所述参考轻链可变区包含选自由SEQ ID NO：8、18、28、38、48、58和68组成的组的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的CDR-L3。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ IDNO：12所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的CDR-L3。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ IDNO：22所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列的CDR-L3。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ IDNO：32所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：34所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：36所示的氨基酸序列的CDR-L3。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ IDNO：42所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：43所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列的CDR-L3。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ IDNO：52所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：56所示的氨基酸序列的CDR-L3。
14.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：重链可变结构域(VH)序列，所述VH序列含有(1)包含SEQ ID NO：61所示的氨基酸序列的CDR-H1，(2)包含SEQ IDNO：62所示的氨基酸序列的CDR-H2，和(3)包含SEQ ID NO：63所示的氨基酸序列的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)序列，所述VL序列含有(1)包含SEQ ID NO：64所示的氨基酸序列的CDR-L1，(2)包含SEQ ID NO：65所示的氨基酸序列的CDR-L2，和(3)包含SEQ ID NO：66所示的氨基酸序列的CDR-L3。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：18所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：28所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：38所示的氨基酸序列。
19.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：48所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：58所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：67所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ IDNO：68所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含人框架。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括全长免疫球蛋白、单链Fv(scFv)片段、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、Fv-Fc融合体、scFv-Fc融合体、scFv-Fv融合体、双抗体、三抗体、四抗体或它们的任何组合。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含Fc区。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包括人Fc区。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包括选自由以下项组成的组的Fc区：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包括选自由以下项组成的组的Fc区：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包括IgG1 Fc区。
30.根据权利要求1-28中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包括IgG4 Fc区。
31.根据权利要求30所述的抗体，其中所述IgG4 Fc区包含S228P的突变。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包含C末端赖氨酸。
33.根据权利要求1-31中任一项所述的抗体，其中所述Fc区包含C末端赖氨酸的缺失。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含在多特异性抗体，例如双特异性抗体中，其中所述多特异性抗体包含特异性结合第二抗原的第二抗体部分。
35.根据权利要求34所述的抗体，其中所述第二抗原是肿瘤相关抗原。
36.根据权利要求35所述的抗体，其中所述肿瘤相关抗原选自由以下项组成的组：Her-2，EGFR，PDL1，MSLN，c-Met，B细胞成熟抗原(BCMA)，碳酸酐酶IX(CA1X)，癌胚抗原(CEA)，CD5，CD7，CDl0，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD34，CD38，CD41，CD44，CD49f，CD56，CD74，CD123，CD133，CD138，CD276(B7H3)，上皮糖蛋白(EGP2)，滋养层细胞表面抗原2(TROP-2)，上皮糖蛋白-40(EGP-40)，上皮细胞粘附分子(EpCAM)，受体酪氨酸蛋白激酶erb-B2、3、4，叶酸结合蛋白(FBP)，胎儿乙酰胆碱受体(AChR)，叶酸受体-a，神经节苷脂G2(GD2)，神经节苷脂G3(GD3)，人端粒酶逆转录酶(hTERT)，激酶插入结构域受体(KDR)，Lewis A(CA1.9.9)，Lewis Y(LeY)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，L1细胞粘附分子(L1CAM)，粘蛋白16(Muc-16)，粘蛋白1(Muc-1)，NG2D配体，癌胚抗原(h5T4)，前列腺干细胞抗原(PSCA)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)，密封蛋白18.2(CLDN18.2)，血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)，肾母细胞瘤蛋白(WT-1)，1型酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)，PVR，PVRL2及它们的任何组合。
37.根据权利要求36所述的抗体，其中所述第二抗原是免疫检查点调节剂。
38.根据权利要求37所述的抗体，其中所述免疫检查点调节剂选自由以下项组成的组：TIGIT、PD1、CTLA4、LAG-3、2B4、BTLA及它们的任何组合。
39.根据权利要求36所述的抗体，其中所述第二抗原是免疫共刺激分子或T细胞受体/CD3复合物的亚基。
40.根据权利要求39所述的抗体，其中所述免疫共刺激分子选自由以下项组成的组：CD28、ICOS、CD27、4-1BB、OX40和CD40及它们的任何组合。
41.根据权利要求39所述的抗体，其中所述T细胞受体/CD3复合物的亚基选自由以下项组成的组：CD3γ、CD3δ、CD3ε及它们的任何组合。
42.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与治疗剂或标记连接的根据权利要求1-41中任一项所述的抗体。
43.根据权利要求42所述的免疫缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
44.根据权利要求42所述的免疫缀合物，其中所述标记选自由以下项组成的组：放射性同位素、荧光染料和酶。
45.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR含有包含根据权利要求1-41中任一项所述的抗体的胞外抗原结合结构域。
46.根据权利要求45所述的CAR，其中所述抗体是scFv。
47.一种免疫应答细胞，所述免疫应答细胞包含根据权利要求45或46所述的CAR。
48.根据权利要求47所述的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞选自由以下项组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和骨髓细胞。
49.根据权利要求48所述的免疫应答细胞，其中所述免疫应答细胞是T细胞。
50.一种药物组合物，所述药物组合物包含a)根据权利要求1-41中任一项所述的抗体、根据权利要求42-44中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求47-49中任一项所述的免疫应答细胞，和b)药学上可接受的载剂。
51.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-41中任一项所述的抗体。
52.一种载体，所述载体包含根据权利要求51所述的核酸。
53.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求51所述的核酸或根据权利要求52所述的载体。
54.一种制备根据权利要求1-41中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括在根据权利要求53所述的宿主细胞中表达所述抗体，以及从所述宿主细胞中分离所述抗体。
55.一种减轻受试者的肿瘤负荷的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-41中任一项所述的抗体、根据权利要求42-44中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求50所述的药物组合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述方法减少肿瘤细胞的数量。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述方法减小肿瘤大小。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述方法根除所述受试者的肿瘤。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下项组成的组：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及它们的组合。
60.一种治疗和/或预防赘生物的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-41中任一项所述的抗体、根据权利要求42-44中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求50所述的药物组合物。
61.一种延长患有赘生物的受试者的生存期的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-41中任一项所述的抗体、根据权利要求42-44中任一项所述的免疫缀合物或根据权利要求50所述的药物组合物。
62.根据权利要求60或61所述的方法，其中所述赘生物选自由以下项组成的组：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及它们的组合。
63.根据权利要求1-41中任一项所述的抗体，所述抗体用作药物。
64.根据权利要求1-41中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗癌症。
65.根据权利要求50所述的药物组合物，所述药物组合物用作药物。
66.根据权利要求50所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗癌症。
67.根据权利要求64所述的抗体或根据权利要求66所述的药物组合物，其中所述癌症选自由以下项组成的组：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及它们的组合。
68.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-41中任一项所述的抗体、根据权利要求42-44中任一项所述的免疫缀合物、根据权利要求50所述的药物组合物、根据权利要求51所述的核酸、根据权利要求52所述的载体或根据权利要求47-49所述的免疫应答细胞。
69.根据权利要求68所述的试剂盒，所述试剂盒还包含用于治疗和/或预防赘生物的书面说明书。
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