CN116322738A

CN116322738A - 血管加压素-2受体拮抗肽及其用途

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Publication number: CN116322738A
Application number: CN202180052406.2A
Authority: CN
Inventors: N·吉勒斯; J·西欧莱克; L·德罗克托夫; B·梅勒; H·诺扎克
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2023-06-23
Also published as: WO2021260068A1; JP2023533222A; EP3929209A1; AU2021295295A1; EP4171607A1; BR112022026084A2; US20230234994A1; CA3182365A1

Abstract

本发明涉及一种肽，其包含与以下SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸同一性的序列：RPSX₁CNLPVKPGPCX₂GFFSAFYYSQKX₃NKCHSFTYGGCAGNANRFSTX₄EK CRRTCX₅X₆，其中，‑X1表示氨基酸残基F或G，‑X2表示任何氨基酸残基，除了碱性氨基酸残基，‑X3表示氨基酸残基T或D，‑X4表示氨基酸残基I、L或E，‑(i)X5表示V并且X6表示G或(ii)X5表示G并且X6表示V，和‑位于位置39处的氨基酸是A。本发明还涉及其各种诊断性和治疗性用途。

Description

血管加压素-2受体拮抗肽及其用途

技术领域

本发明关于与涉及血管加压素-2受体的疾病的治疗相关的医疗领域。

背景技术

2型血管加压素受体(V2R)是由位于染色体Xq28上的AVPR2基因编码的G-蛋白-偶联受体。V2R与V1a、V1b和催产素受体一样属于血管加压素激素敏感受体家族。V2R和许多GPCR一样，通过G蛋白依赖性和G蛋白非依赖性机制诱导多效性作用。

V2R在肾元远端中显著表达。一旦在收集管中被激活，V2R/Gas途径刺激细胞内cAMP产生，这激活蛋白激酶A以磷酸化水通道蛋白-2，从而使其经由细胞内钙依赖性胞吐机制从细胞内囊泡转位到顶端膜。此外，由于基底外侧膜的水通道蛋白3和水通道蛋白4，水可以通过顶端膜处的水通道蛋白2从尿液到达主细胞，然后到达血液。循环不良的V2R与由于活性复合物AVP-V2R-β-抑制蛋白导致的长期激活有关。第三种V2途径通过金属蛋白酶介导的胰岛素样生长因子受体激活导致ERK1/2的激活。

V2R的功能丧失和功能获得变异都与人类疾病有关。精氨酸-血管加压素(AVP)分泌不足与人血浆钠水平低于135mmol/l的低钠血症相关。它与许多疾病有关，包括慢性心力衰竭、肝衰竭和慢性肾病，其中它已显示与死亡风险增加有关。肺癌或前列腺癌中的异位AVP分泌也可以导致循环AVP水平过高，从而可以导致低钠血症。此外，V2R也是常染色体显性型多囊肾病(ADPKD)的治疗靶点。开发了许多针对V2R相关疾病(包括ADPKD)的治疗策略，但只有阻断V2R在人类中证明了其功效(Nagao等人,2012,Exp Anim,第61卷:477-488)。

在肾外，内皮细胞表达V2R，在该细胞中V2R参与控制冯维勒布兰德因子(VonWillebrand factor)表达。在内耳中，V2R参与淋巴囊容量调控，并且被认为在梅尼埃病(Meniere disease)中发挥作用(Eckhard等人,2012,Mol Aspects Med,第33卷：612-637)。在骨骼中，V2R可有助于止血(Tamma等人,2013,Proc Natl Acad Sci USA,第110(46)卷：18644-18649)。神经肽、如AVP可以在神经内分泌肿瘤中过表达。此外，V2R异位存在于人的肺、乳腺、胰腺、结肠直肠和胃肠道肿瘤中(Pifano等人,2017,Front Oncol,第7卷–Article11:1-11)。

然后，V2R活性不足与许多疾病相关，尤其是在人类中。然而，尽管V2R具有重要的生理和病理重要性，但这种受体的治疗库很差。本领域仅主要使用一种名为托伐普坦的拮抗剂分子，其是一种属于伐普坦类家族的苯并氮杂卓(benzazepine)来源的分子，作为对V2R的拮抗剂，具有高亲和力，但与其他三种血管加压素敏感受体相比具有中等选择性。托伐普坦目前用于治疗低钠血症和ADPKD，但由于其肝毒性而存在许多问题。

AVP的过量分泌是例如低钠血症的疾病的关键病因，并解释了为什么V2R拮抗剂在以正常容量性(euvolemic)或高容量性(hypervolemic)低钠血症为特征的以下病理疾病中如此有效：例如SIADH(抗利尿激素分泌失调综合征(Syndrome of InappropriateAntiDiuretic Hormone secretion))、肝硬化和充血性心力衰竭(G I F；Ghali等人，Cardiology,2008,1 1 1,147-157)。

先天性肾源性尿崩症与V2R失活突变有关。这导致多尿症伴严重脱水，特别是在儿童中。V2R拮抗剂(伐普坦类)表现为药物伴侣，它们能够穿透细胞并可以挽救突变受体(Morello等人，J.Clin.Investigation,2000,105,887-895)。

通过与抑制蛋白相互作用，V2R刺激导致涉及cAMP和MAP激酶的信号传导途径的激活，因此有利于增殖响应。例如，在大鼠体内注射AVP诱导了肾小管上皮细胞增殖，所述细胞可以被V2R拮抗剂抑制(Alonso等人，Endocrinology,2009,150,239-250)。此外，利尿剂、例如V2R拮抗剂能够抑制肾癌细胞(Bolignano等人，Urol.Oncol.,2010,28,642-647)和肺癌细胞(Pequeux等人,Endocr.Relat.Cancer,2004,11,871-885)的增殖。这些结果表明，V2R拮抗剂是针对不同类型癌症的良好治疗性候选物。

冯维勒布兰德因子(VWF)参与初期止血。已证明，AVP还有V2R特异性激动剂dDAVP

经由其与V2R相互作用提高了VWF和因子VIII水平(Kaufmann等人，J.Clin.Invest.,2000,106,107-116)。凝血过量可以导致血栓形成(凝块)，其可以通过使用V2R拮抗剂治愈，从而限制凝血因子的分泌。

V2R拮抗剂托伐普坦还用于治疗肝硬化。之前的荟萃分析显示，由于其众所周知的肝毒性，用伐普坦类治疗增加了肝硬化患者中总不良事件的风险。(伐普坦类对肝硬化患者中的临床结果的影响：随机对照试验的荟萃分析，2019年，药理学前沿(Impact of Vaptanson Clinical Outcomes in Cirrhosis Patients:AMeta-Analysis of RandomizedControlled Trials,2019,Frontiers in Pharmacology))。

V2R拮抗剂托伐普坦已进一步用于治疗心力衰竭。这项大规模分析证实了托伐普坦在真实临床环境中的有效性和安全性。(托伐普坦在心力衰竭患者中的耐受性―Samsca上市后心力衰竭监测(SMILE)研究的最终结果，2019年，循环杂志(Tolerability ofTolvaptan in Patients With Heart Failure―Final Results of the Samsca Post-Marketing Surveillance in Heart Failure(SMILE)Study,2019,CirculationJournal))。

虽然伐普坦类已经清楚地证明了V2R拮抗剂对各种病状的治疗效果，但其治疗用途受到一些主要缺陷的限制：

-伐普坦类及其代谢物具有肝毒性。由于这个原因，它们的使用必需对患者进行严格监测，并且其长期施用是有限的。其中一些只能静脉内注射，限制了其用于住院患者。

-伐普坦类仅对V2R具有一些选择性，其V2/Vla选择性指数从112(托伐普坦)到0.15(考尼伐坦)变化。

-伐普坦类是用于MAP激酶激活的拮抗剂。因此，它们无法完全阻断特定的V2R-相关信号传导途径。伐普坦类在生理缓冲液中溶解性差，且生物利用度有限(Bernier等人.JASN,2006,17,591)。

本领域已知的最具选择性的V2R拮抗剂是最初从曼巴蛇毒中分离出来的肽，被命名为mambaquaretin(MQ1)。MQ1是一种长度为57个氨基酸残基的肽，其由采用Kunitz肽结构的三个二硫键成网状(Ciolek等人,2017,Proc Natl Acad Sic USA,第114(27)卷:7154-7159)。MQ1肽对人V2R表现出高亲和力，而对156种其他GPCR(包括V1aR、V1bR和OTR)在μM浓度下无亲和力。MQ1肽是与Gas蛋白、与β-抑制蛋白的相互作用和MAP激酶激活相关的三种途径的完全竞争性拮抗剂(Ciolek等人,2017,Proc Natl Acad Sic USA,第114(27)卷:7154-7159)。当施用时，MQ1肽诱导纯促排水效应，即诱导水分损失而不损失电解质。MQ1在囊性肾脏疾病中的功效被证实(Ciolek等人,2017,Proc Natl Acad Sic USA,第114(27)卷:7154-7159)。

目前仍然需要V2R拮抗剂，其与已知的V2R拮抗剂相比是替代的或改进的，尤其是用于医疗目的。

发明内容

本发明涉及一种肽，其包含与以下SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸同一性的序列：

RPSX₁CNLPVKPGPCX₂GFFSAFYYSQKX₃NKCHSFTYGGCAGNANRFST X₄EKCRRTCX₅X₆

其中，

-X1表示氨基酸残基F或G，

-X2表示任何氨基酸残基，除了碱性氨基酸残基，

-X3表示氨基酸残基T或D，

-X4表示氨基酸残基I、L或E，

-(i)X5表示V并且X6表示G或(ii)X5表示G并且X6表示V，和

-位于位置39处的氨基酸是A。

在所述肽的一些实施方式中，X1表示基酸残基G。

在所述肽的一些实施方式中，X2表示选自由A、D、E、F、G、I、L、N、M、Q、S、T、V和Y组成的组的氨基酸残基。

在所述肽的一些实施方式中，X3表示氨基酸残基D。

在所述肽的一些实施方式中，X4表示氨基酸残基E或L。

在一些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述肽与选自包括以下的组的肽具有80％或更大的氨基酸同一性：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。在一些实施方式中，所述肽包含选自包括以下的组的氨基酸序列：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。在一些实施方式中，所述肽由选自包括以下的组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

所述肽可用可检测分子标记。

本发明还涉及编码上述肽的核酸，所述核酸可包含在表达载体中。

本发明还涉及包含如上所定义的肽和生理上可接受的载体的药物组合物。

本发明还涉及如上所述的肽作为药剂的用途。本发明还涉及所述肽用于治疗选自由以下组成的组的疾病的用途：以正常容量性或低容量性(hypovolemic)低钠血症为特征的病理疾病、抗利尿不适当肾原性综合征、先天性肾源性尿崩症、多囊肾病、癌症、血栓形成、梅尼埃病、难治性肝病和心力衰竭。

本发明还涉及如上所述的经标记的肽用于检测表达血管加压素-2受体的细胞的体外用途。

本发明还涉及用于检测血管加压素-2受体细胞表达的调控异常的体外方法，其包括以下步骤：

a)提供待测试的细胞，

b)使步骤a)提供的细胞与根据权利要求11所述的经标记的肽接触，

c)测量血管加压素-2受体细胞表达的表达水平值，

d)比较步骤c)获得的表达水平值与参考表达水平值，

e)确定血管加压素g-2受体细胞表达的调控异常发生。

本发明还涉及包含如上所述的经标记的肽的诊断性试剂。

附图说明

图1分别示出SEQ ID NO.7的已知MQ1 V2R拮抗肽(也可称为“U-Da2a)和SEQ IDNO.6的根据本发明的V2R拮抗剂(称为MQ-LEAD)的免疫原性的计算机预测。

两种肽的序列已输入到NETMHCNETMHCPAN 3.2软件(www.IEDB.org)中，通过选择在欧洲和北美人群中最常见的HLA-DR分子。

NETMHC软件允许预测序列与HLA II类分子的可能关联。选定的II类HLA分子在欧洲和北美人群中是最常见的。预测评分是在第一个氨基酸上报告的9个氨基酸的每条序列的百分位数。评分越低，预期序列与HLA II类分子的关联越强。

在图1中，每个编号的列对应于57个氨基酸残基长的肽中的每一者的氨基酸残基。上图：已知的MQ1 V2R拮抗肽。下图：SEQ ID NO.6)的MQ-LEAD肽。在名为“DRBx_nnnn”的行中，DRBx是HLA-DRB基因座的名称，并且nnnn是等位基因的数目。

免疫原性评分：(i)评分低于10％(黑色)，(ii)10至20％(深灰色)和(iii)20％至30％(浅灰色)。下图中粗体和加下划线的位置由与MQ1肽相比的MQ-LEAD肽中的氨基酸残基的差异组成。

图2示出与已知MQ1肽的V2R结合特性相比，根据本发明的V2R拮抗肽与V2R的结合。横坐标：经测试的V2R拮抗肽或MQ1肽的摩尔浓度的对数。纵坐标：结合的3H-AVP，对照的％

图3示出V2R拮抗肽对利尿的作用。经测试的V2R拮抗肽在大鼠(SprageDelay)中以每天3nmol/kg i.p.注射(箭头)，并且追踪随时间推移的利尿。

图3A.横坐标：时间段，以小时表示。纵坐标：利尿，以ml/h/kg表示。测试条件；(i)MQ1肽[黑圆圈“●”，虚线]，(ii)MQ-LEAD[黑方块“□”，实线]和(iii)MQ K39A[黑三角

实线]。

图3B.横坐标：从左到右：(i)MQ-LEAD[黑色条形]，(ii)MQ1肽[虚线条形]和(iii)MQ K39A[空白条形]。

图4示出实验研究设计的示意图。

图5示出在第0-2-3-4天，在第0天植入DDAVP的雄性大鼠中的3个剂量的MQ-LEAD、1个剂量的托伐普坦及它们的媒介物对钠血症的作用。

横坐标：时间段，以天表示。纵坐标：血液Na+浓度，以mM表示。测试条件：(i)空心圆圈“○”：托伐普坦的媒介物，无菌水中的1％ HPMC，(ii)黑方块“■”：V2R拮抗肽MQ-LEAD的媒介物，生理盐水，(iii)空心方块“□”：托伐普坦，(iv)倒三角

：20μg/kg的MQ-LEAD，(v)菱形“◆”：60μg/kg的MQ-LEAD，和(vi)黑方块“■”：200μg/kg的MQ-LEAD。

图6示出V2R拮抗肽对cAMP产生的抑制。横坐标：肽浓度，以-Log(M)表示。纵坐标：抑制cAMP产生，以对照的百分比表示。(i)圆形“●”：MQ1肽；(ii)方形“■”：MQ K39A肽；(iii)三角形

：MQ-LEAD肽。

具体实施方式

定义

术语“对象”是指需要对其进行治疗或正在参与临床试验、流行病学研究或用作对照的任何单一对象，包括人类和哺乳动物兽医患者，例如牛、马、狗和猫。在某些优选的实施方式中，对象是人类。

如本文所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”癌症表示施用根据本发明的组合疗法给患有癌症的对象。

术语“药学上可接受的”表示在制备通常安全、无毒且在生物学上或在其他方面都不是不可取的药物组合物时有用的东西，并包括兽医以及人类药学用途可接受的东西。

在本发明范围内，两条核酸或肽/蛋白质的序列之间的“同一性百分比”表示在最佳比对后获得的待比较的两条序列之间的同一核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的且两条序列之间的差异沿其长度随机分布。序列的比较传统上是通过比较对它们进行优化对齐后的序列来进行，所述比较能够通过段或通过使用“比对窗口”进行。除了手工比较外，还可以通过Smith和Waterman(1981)的局部同源算法、通过Neddleman和Wunsch(1970)的局部同源算法、通过Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法或通过使用这些算法的计算机软件(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或通过比较软件BLAST NR或BLAST P)来进行。

两条序列之间的同一性百分比是通过比较两条优化对齐的序列来确定的，其中待比较的序列可以与用于两条序列之间的优化比对的参考序列相比具有添加或缺失。同一性百分比通过以下来计算：确定两条序列之间、优选两条完整序列之间核苷酸或氨基酸残基是同一的位置数，将同一位置数除以比对窗口中的总位置数，并将结果乘以100，以获得两条序列之间的同一性百分比。

如本文所用，“V2R拮抗剂活性”涉及物质的以下活性(例如肽的活性)：(i)结合至V2R，最优选人V2R，其结合亲和力值小于100nM；和(ii)抑制cAMP产生，其IC50值小于1000nM。

详细公开

本发明涉及可主要用于医疗和诊断目的的血管加压素-2受体拮抗剂家族。

本发明人已经确定了共享特定的结构特征的肽家族，其在体外和体内都表现为高效的血管加压素-2拮抗剂。这些肽来源于在以No.WO 2014/041526公开的PCT申请中所述的已知MQ1肽(也称为“U-Da2a”)。

本发明人发现，多个MQ1-来源的肽具有在氨基酸位置39处存在赖氨酸(K)残基的共同特征，在纳摩尔水平上抑制人血管加压素-2受体(也在本文中称为“V2R”)的活性。值得注意的是，所公开的所述肽家族比已知的MQ1肽具有显著更高的V2R抑制能力。这些肽对V2R的亲和力比已知的MQ1肽高几倍，例如与已知的MQ1肽相比，对V2R的亲和力高8倍。

本文公开的这些肽表现为血管加压素-2受体的强拮抗剂化合物，然后将在本文中统称为“V2R拮抗肽”。

如实施例中所示，本文公开的V2R拮抗肽以比已知的MQ1肽低得多的浓度强烈抑制在血管加压素激活下V2R表达细胞产生cAMP。

在体内，本发明的V2R拮抗肽实际上诱导了促排水效应。值得注意的是，本文公开的V2R拮抗剂多肽用于治疗低钠血症的效力约为托伐普坦(治疗上最常使用的V2R拮抗剂化合物)的500倍，即其效力约为迄今为止在这种生理环境中实际使用的主要V2R拮抗剂化合物的500倍。

V2R拮抗肽

RPSX₁CNLPVKPGPCX₂GFFSAFYYSQKX₃NKCHSFTYGGCAGNANRFST X₄EKCRRTCX₅X₆

其中，

-X1表示氨基酸残基F或G，

-X2表示任何氨基酸残基，除了碱性氨基酸残基，

-X3表示氨基酸残基T或D，

-X4表示氨基酸残基I、L或E，

-(i)X5表示V并且X6表示G或(ii)X5表示G并且X6表示V，和

-位于位置39处的氨基酸是A。

如本文所用，“X_n”和“Xn”可以不加区别地用于表示相同可变氨基酸残基。

如本文所用，氨基酸残基可选自由以下组成的组：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)，以及氨基酸类似物，包括D-氨基酸、β丙氨酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸、氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、胱氨酸、胱硫醚、羊毛硫氨酸、黎豆氨酸、二氨基庚二酸、正亮氨酸、别异亮氨酸、异丝氨酸、N-乙基甘氨酸、N-丙基甘氨酸、N-异丙基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-乙基丙氨酸和异丝氨酸。

然而，氨基酸残基最优选选自由20种常见氨基酸残基组成的组。

本发明的肽中的所有氨基酸可以是D-或L-形式两者，尽管天然存在的L-形式是优选的。

在不希望受到任何特定理论束缚的情况下，本发明人认为在本文公开的肽的高V2R拮抗剂特性与SEQ ID NO.1的氨基酸位置39处的丙氨酸残基(A)的存在之间存在直接关系。

如本文的实施例所示，本文公开的V2R拮抗肽也预计被赋予降低的免疫原性。这些肽的免疫原性降低使得它们有资格用于治疗与V2R功能障碍相关的各种病理疾病，尤其是需要它们反复施用给对象的那些病理疾病，例如举例来说，抗利尿激素分泌失调综合征或先天性肾源性尿崩症。

此外，在不希望受到任何特定理论束缚的情况下，本发明人认为，根据本发明的V2R拮抗肽对V2R具有高选择性，正如对已知的MQ1多肽所显示的那样。事实上，V2R拮抗肽对V2R的高选择性表示在用于治疗目的施用时预期会有低的不良效应，相反，例如，广泛使用的V2R拮抗剂托伐普坦由于其对V2R的中等选择性而报告了许多不良作用。

本发明人认为，本文公开的V2R拮抗肽的亲和力不受氨基酸残基X2的同一性的显著影响，除非氨基酸残基X2由碱性氨基酸残基组成。相比之下，碱性氨基酸残基作为氨基酸残基X2的存在负面影响了肽对V2R的亲和力，导致其与V2R的结合能力发生改变。

如本文所用，包括对于氨基酸残基X2，碱性氨基酸残基由氨基酸残基组成，其是常规的也可以是非常规的氨基酸残基，即其在pH 7.0下带正电荷。碱性常规氨基酸残基选自由K(赖氨酸)、R(精氨酸)和H(组氨酸)组成的组。

因此，在优选的实施方式中，X2表示除了K、R和H之外的任何氨基酸残基。

在优选的实施方式中，X2表示选自由以下组成的组的氨基酸残基：A、D、E、F、G、I、L、N、M、Q、S、T、V和Y。

在其他优选的实施方式中，X2表示选自由以下组成的组的氨基酸残基：N、A、E、F和I。

在另一个优选的实施方式中，X2表示氨基酸残基N或A。

类似地，位于本文公开的V2R拮抗肽的C-末端处两个中性氨基酸X5和X6的同一性不应显著影响所述肽与V2R的结合能力。

在最优选的实施方式中，本发明涉及与SEQ ID NO.1的肽具有80％氨基酸同一性或更大且与SEQ ID NO.1的肽相比不包含氨基酸残基缺失且不包含氨基酸残基添加的肽。因此，最优选地，根据本发明的V2R拮抗肽具有57个氨基酸的长度，其氨基酸序列与SEQ IDNO.1相比没有包含氨基酸缺失和没有包含氨基酸添加。

具有与SEQ ID NO.1有80％氨基酸同一性的氨基酸序列的肽最优选由与SEQ IDNO.1的肽仅区别在于存在与SEQ ID NO.1相比的一个或多个氨基酸残基替代的肽组成，因此肽具有57个氨基酸残基的长度且包含与SEQ ID NO.1相比的一个或多个氨基酸取代。

其序列与SEQ ID NO.1具有80％氨基酸同一性的肽可包含与SEQ ID NO.1相比的至多11个氨基酸替代。本发明涵盖了具有与SEQ ID NO.1相比一个氨基酸残基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个替代的肽。

本发明因此涵盖了包含与SEQ ID NO.1具有80％或更大的氨基酸同一性且包含一个或多个修饰至蛋白的一个或多个氨基酸残基、肽键、N-和/或C-末端的V2R拮抗肽，只要维持V2R拮抗剂活性。通过本领域技术人员已知的常规方法引入肽的这些修饰以非限制性的方式包括：用非蛋白原性氨基酸(D氨基酸或氨基酸类似物)替代天然氨基酸；肽键的修饰，特别是用逆式或逆反式键或不同于肽键的键；环化，和添加化学基团至蛋白的侧链或一个或多个末端，特别用于偶联感兴趣的剂至本文所述的V2R肽拮抗剂。这些修饰可用于标记V2R拮抗肽，或替选地进一步提高其对V2R的亲和力、其生物利用度和/或其稳定性。

在一些实施方式中，在如本文公开的V2R拮抗肽中；由内切蛋白酶靶向的一个或多个氨基酸残基被它们相应的非天然D-形式替代。例如，作为胰蛋白酶靶标的一个或多个精氨酸和/或赖氨酸残基可以被其相应的非天然形式替代。

在一些实施方式中，在如本文公开的V2R拮抗肽中，一个或多个二硫桥被非天然链接替代。优选地，所述非天然链接抗还原，例如噻唑烷接头。这些接头增加了本发明的蛋白质对生物流体中存在的还原剂的抗性。

最优选地，根据本发明的V2R拮抗肽(涵盖包含与SEQ ID NO.1相比的一个或多个氨基酸替代的肽)包含位于对应于SEQ ID NO.1的位置5和55的氨基酸位置处的半胱氨酸残基。

最优选地，根据本发明的V2R拮抗肽(涵盖包含与SEQ ID NO.1相比的一个或多个氨基酸替代的肽)包含位于对应于SEQ ID NO.1的位置14和38的氨基酸位置处的半胱氨酸残基。

最优选地，根据本发明的V2R拮抗肽(涵盖包含与SEQ ID NO.1相比的一个或多个氨基酸取代的肽)包含位于对应于SEQ ID NO.1的位置30和51的氨基酸位置处的半胱氨酸残基。

在如本文公开的肽的一些实施方式中，X1表示氨基酸残基G(甘氨酸)。

在如本文公开的肽的一些实施方式中，X2表示氨基酸残基A(丙氨酸)。

在如本文公开的肽的一些实施方式中，X3表示氨基酸D(天冬氨酸)。

在如本文公开的肽的一些实施方式中，X4表示氨基酸残基E(谷氨酸)或L(亮氨酸)。

本发明还涉及包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列的肽，其中X1至X6中的每一者彼此独立地具有针对SEQ ID NO.1所述的含义。本发明还涉及由SEQ ID NO.1的氨基酸序列组成的肽，其中X1至X6中的每一者彼此独立地具有针对SEQ ID NO.1所述的含义。

本发明还涉及与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸同一性的肽，其中X1表示F、X2表示N、X3表示T、X4表示I并且X5和X6具有与针对SEQ ID NO.1的相同含义。最优选地，X5表示V且X6表示G。本发明还涉及与SEQ ID NO.2的肽具有80％氨基酸同一性的肽，其涵盖了由SEQ ID NO.2组成的肽。

本发明还涉及与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸同一性的肽，其中X1表示F、X2表示N、X3表示T、X4表示L且X5和X6具有与针对SEQ ID NO.1的相同含义。最优选地，X5表示V且X6表示G。本发明还涉及与SEQ ID NO.3的肽具有80％或更大的氨基酸同一性的肽。本发明还涉及由SEQ ID NO.3的氨基酸序列组成的肽。

本发明还涉及与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸同一性的肽，其中X1表示F、X2表示A、X3表示T、X4表示L并且X5和X6具有与针对SEQ ID NO.1的相同含义。最优选地，X5表示V且X6表示G。本发明还涉及与SEQ ID NO.4的肽具有80％或更大的氨基酸同一性的肽。本发明还涉及由SEQ ID NO.4的氨基酸序列组成的肽。

本发明还涉及与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸同一性的肽，其中X1表示G、X2表示N、X3表示D且X4表示I且X5和X6具有与针对SEQ ID NO.1的相同含义。最优选地，X5表示V且X6表示G。本发明还涉及与SEQ ID NO.5的肽具有80％或更大的氨基酸同一性的肽。本发明还涉及由SEQ ID NO.5的氨基酸序列组成的肽。

本发明还涉及与SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸同一性的肽，其中X1表示G、X2表示N、X3表示D、X4表示E且X5和X6具有与针对SEQ ID NO.1的相同含义。最优选地，X5表示V且X6表示G。本发明还涉及与SEQ ID NO.6的肽具有80％或更大的氨基酸同一性的肽。本发明还涉及由SEQ ID NO.6的氨基酸序列组成的肽。

本发明还涉及下式(I)的化合物：

[Nt-EXT]n-L1x-[V2R-AP]-L2y-[Ct-EXT]m(I)，

其中：

-[Nt-EXT]表示共价连接至如本文公开的V2R拮抗肽的N-末端的化学部分。

-[V2R-AP]表示根据本发明的V2R拮抗肽，

-[Ct-EXT]表示共价连接至如本文公开的V2R拮抗肽的C-末端的化学部分，和

-n和m中的每一者独立地表示等于0或1的整数，

-L1和L2中的每一者是接头部分，其在存在时可分别避免抑制(i)[Nt-EXT]和[V2R-AP]之间和(ii)[Ct-EXT]和[V2R-AP]之间的相互作用，更重要的是，L1和L2中的每一者在存在时可用于预防[Nt-EXT]和[Ct-EXT]中的任一者影响V2R拮抗肽[V2R-AP]结合至V2R。

-x和y中的每一者独立地表示等于0或1的整数。

在一些优选的实施方式中，[Nt-EXT]和/或[Ct-EXT]在存在时独立地表示非-蛋白化学部分，例如用于标记V2R拮抗肽的非-蛋白可检测分子，如放射性化学部分或含荧光团的化学部分，或稳定部分(例如ZZ、DsBa和DsBb)。在这些实施方式中的一些中，[Nt-EXT]和/或[Ct-EXT]是一种增加如本文所述的V2R拮抗肽的生物利用度并且特别是减少其尿排泄(urinary elimination)的剂，例如聚乙二醇分子。在一些优选的实施方式中，[Nt-EXT]和/或[Ct-EXT]在存在时可独立表示聚亚烷基二醇，尤其是聚乙二醇。这些优选的实施方式涵盖了式H-(O-CH₂-CH₂)n-O-的聚乙二醇，其中n是范围为5至20的整数，有利的是10至15，例如n由表示12的整数组成。

在一些其他优选的实施方式中，[Nt-EXT]和/或[Ct-EXT]在存在时独立地表示蛋白质部分，其涵盖蛋白/肽部分，包括允许纯化、检测、固定和/或细胞靶向本发明的蛋白质的那些，和/或增加V2R拮抗肽的对V2R的亲和力、生物利用度、在表达系统中的产生和/或稳定性。这些蛋白部分可选自：(i)标记部分，例如荧光蛋白(GFP及其衍生物、BFP和YFP)，(ii)报告子部分，例如酶标记(荧光素酶、碱性磷酸酶、谷胱甘肽转移酶(GST)、β-半乳糖苷酶)，(ii)结合部分，例如表位标签(聚His6、FLAG、HA、myc)、DNA-结合结构域、激素-结合结构域、用于固定在支持物上的聚-赖氨酸标签，和(iii)用于定位式(I)的化合物的靶向部分至特定细胞类型或细胞分区。此外，式(I)的化合物有利地包含接头(L1、L2)，其连接[Nt-EXT]和/或[Ct-EXT]中的每一者至[V2R-AP]，所述接头足够长以避免抑制序列[V2R-AP]与[Nt-EXT]和/或[Ct-EXT]中的每一者之间的相互作用(在存在时)。接头L1和/或L2还可包含对蛋白酶的识别位点，例如用于从根据本发明的经纯化的嵌合蛋白去除亲和力标签和稳定部分。

在一些实施方式中，接头部分L1和/或L2可包含例如针对蛋白酶的识别位点，用于从根据本发明的式(I)的化合物中去除亲和力标签和稳定部分。

此外，如本文所述的V2R拮抗肽或一些实施方式的式(I)的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的方法有利地被修饰，以改变其生理特性并且特别是为了改善其在生物体中的半衰期时间(糖基化：HAUBNE R.等人，J.Nucl.Med.,2001,42,326-36；与PEG缀合：KIMTH.等人，Biomaterials,2002,23,2311-7)、其溶解度(与白蛋白杂交：KOEHLER MF.等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,2002,12,2883-6)、其对蛋白酶的抗性(非天然氨基酸(D构象，例如))，和/或其肠道吸收(Lien等人，TIB,2003,21,556-)。

V2R拮抗肽的合成

如本文所述的V2R拮抗肽可通过已知的克隆技术或通过化学合成来产生。

例如，编码V2R拮抗肽的DNA通过使用克隆技术来制备，并插入可自主复制的载体中以制备重组DNA。将重组DNA引入适当的寄主，例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、放线菌(Actinomyces)、酵母、丝状真菌、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞，以获得转化体。从转化体的培养产物，可以获得如本文公开的V2R拮抗肽。替选地，制备编码V2R拮抗肽的DNA，并将其用于使用小麦胚芽和大肠埃希氏菌的细胞提取物的脱细胞蛋白合成系统，以合成根据本发明的肽。

本发明涵盖了呈可表达形式的编码如本文所述的V2R拮抗肽的核酸或包含所述核酸的重组载体的用途。呈可表达形式的编码V2R拮抗肽的核酸是指在细胞系统或无细胞系统中表达后产生功能肽的核酸分子。

实际上，在其中式(I)的化合物由蛋白质组成的实施方式中，也可以根据与上文相同的方法将所述式(I)的化合物产生为重组蛋白。

此外，使用如本文公开的V2R拮抗肽的常规化学合成方法，例如“固相法”或“液相法”，通过脱水/缩合依次连接和延长氨基酸。本文实施例中描述了用化学合成来合成V2R拮抗肽的方法。

药物组合物

本发明还涉及本文所述的V2R拮抗肽或在一些实施方式中的式(I)的化合物(包括所述V2R拮抗肽)用于医疗用途并且尤其用于治疗涉及V2R途径的病理疾病的用途。

本发明还涵盖了呈可表达形式的编码如本文所述的V2R拮抗肽或替选地式(I)化合物的一些蛋白实施方式的核酸、或包含所述核酸的重组载体的用途。呈可表达形式的编码此类蛋白的核酸是指在细胞系统或无细胞系统中表达后产生功能蛋白、即由V2R拮抗剂组成的蛋白的核酸分子。

因此，根据本发明，所述蛋白、所述核酸和/或所述重组载体可被包含在还包含药学上可接受的载体的药物组合物中。

根据本发明的药物组合物可被配制为用于通过多种途径施用，包括但不限于，经肠(如，口服)、肠胃外、静脉内、肌内、动脉内、皮下、透皮、皮内、经直肠、阴道内、腹膜内、局部、经粘膜、经鼻、经颊、舌下；和/或吸入；和/或作为口腔喷雾剂、鼻腔喷雾剂和/或气雾剂。

在一些实施方式中，根据本发明的药物组合物可以是由本领域水平所涵盖的任何合适的形式，例如呈可注射的溶液或混悬液、片剂、包衣片剂、胶囊剂、糖浆剂、栓剂、乳霜剂、软膏剂、洗剂等的形式。

包含V2R拮抗肽或式(I)的选定化合物的药物组合物可以以粉末状形式冻干剂呈现，其中活性成分与糖、例如甘露糖醇结合。对于其使用，此类药物组合物通常应用适当体积的水或氯化钠溶液进行复溶。然后，所产生的液体药物组合物可以通过适当的施用途径施用。

在药物组合物中，将V2R拮抗肽或式(I)的选定化合物与一种或多种药学上可接受的载体和任选的持续释放基质(例如可生物降解聚合物)组合，以形成治疗组合物。

在某些实施方式中，药物组合物还可包含一种或多种盐、一种或多种缓冲剂和/或一种或多种防腐剂。

药学上可接受的载体是技术人员已知的并常规使用的那些。

在本发明的范围内，“药学上可接受的载体”是指参与携带或运输预防或治疗活性剂的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。

在某些实施方式中，适合的药学上可接受的载体可选自包括以下的组：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；乙二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；等。

根据本发明的药物组合物包含治疗有效量的本文所述的V2R拮抗肽，或选定实施方式的式(I)化合物，或编码其的核酸或重组载体，例如足以对施用其的个体产生医疗益处的量。药物有效剂量取决于所使用的组合物的种类、施用途径、施用是单剂量或多剂量、所治疗的哺乳动物的类型(人类或非人类哺乳动物)、个体身体特征的参数，包括年龄、身体状况、大小、体重、同时用药以及医学领域的技术人员将认识到的其他因素。因此，在本发明的范围内，待施用的活性成分的有效量、尤其是V2R拮抗肽或式(I)的选定化合物的量可以由医生或本领域技术熟练的获授权人确定，并且可以在治疗的时间过程中适当地调整。

V2R拮抗肽或式(I)的选定化合物可以每次施用步骤范围为0.1至300纳摩尔的选定V2R拮抗肽/kg体重的量施用，这取决于上述个体参数。本发明人认为，以低于0.1纳摩尔/kg体重的量施用如本文公开的V2R拮抗肽将不是治疗上有效的。本发明人还认为，以高于300纳摩尔/kg体重的量施用如本文公开的V2R拮抗肽可导致不良作用，并且可能在对象中发生一些毒性作用。

确实，所公开的V2R拮抗肽中的每一者的确切分子量(Mw)始终是可确定的。

假设根据本发明的V2R拮抗肽的Mw为6500，施用其0.1纳摩尔/kg给体重为80kg的对象由施用52ng的所述肽至所述对象组成。仍然假设根据本发明的V2R拮抗肽的Mw为6500，施用其300纳摩尔/kg给体重为80kg的对象由施用0.156mg的所述肽给所述对象组成。

为了清楚起见，在其中选定活性成分包含根据本发明的V2R拮抗肽的一些实施方式中，施用给有需要的对象的活性成分的量基于其中包含的V2R拮抗肽的Mw值计算，而不是根据活性成分本身的Mw值。举例来说，在其中选定活性成分是本文所公开的式(I)化合物的一些实施方式中，施用给有需要的对象的活性成分的量基于其中包含的[V2R-AP]部分的Mw值计算，而不是根据活性成分本身的Mw值。

如本文所用，选定V2R拮抗肽的0.1nmol/kg或更大的量涵盖所述选定V2R拮抗肽的0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20nmol/kg或更大的量。

如本文所用，300nmol/kg或更小的选定V2R拮抗肽的量涵盖所述选定V2R拮抗肽的290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、150nmol/kg或更小的量。

医疗用途

本发明涉及本文所述的V2R拮抗肽或本文所述的式(I)的选定化合物用于制备药剂的用途。本发明还涉及本文所述的V2R拮抗肽、或本文所述的式(I)的选定化合物作为药剂的用途。

本发明还涉及用于治疗患有涉及V2R途径的病理疾病的对象的方法，其包括施用本文所述的V2R拮抗肽、或本文所述的式(I)的选定化合物、或编码其的核酸或重组载体至所述对象的步骤。

本发明还涉及本文所述的V2R拮抗肽、或本文所述的式(I)的选定化合物、或编码其的核酸或重组载体在制备用于治疗患有涉及V2R途径的病理疾病的对象的药剂中的用途。

本发明还涉及本文所述的V2R拮抗肽、或本文所述的式(I)的选定化合物、或编码其的核酸或重组载体用于治疗患有涉及V2R途径的病理疾病的对象的用途。

在一些实施方式中，活性成分、即如本文公开的V2R拮抗肽或式(I)的选定化合物可以以单次团注施用，以随时间施用的若干个分批剂量施用，或者剂量可以根据治疗情况的紧急程度所指示按比例减少或增加。为了便于施用和剂量的均匀性，以剂量单位形式配制治疗剂可以是特别有利的。如本文所用，剂量单位形式是指物理上离散的单位，适合作为用于待治疗的哺乳动物对象的单一剂量，每个单位含有经计算以与所需的药物载体相结合产生所想要的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格可以由以下决定并直接依赖于以下：(a)活性成分的独特特性和待实现的特定治疗效果，和(b)复合此类活性成分用于治疗个体敏感性的本领域所固有的局限性。

因此，本领域技术人员将理解基于本文提供的公开内容，剂量和给药方案根据治疗领域中众所周知的方法进行调整。即，可以很容易地确定最大可耐受剂量，并且还可以确定对对象提供可检测的治疗益处的有效量，向对象提供可检测的治疗益处而施用每种剂的时间要求也是如此。

确定用于施用化疗剂的适当剂量和方案在相关领域中是众所周知的，并且一旦提供了本文公开的教导，将被理解为由本领域技术人员所涵盖。

涉及V2R途径的病状包括且不限于：(i)以正容量性或低容量性低钠血症为特征的病理疾病，例如充血性心力衰竭(CHF)、肝硬化、抗利尿激素分泌失调综合征(SIADH)和脑水肿，(ii)抗利尿不适当肾原性综合征(NSIAD)，(iii)先天性肾源性尿崩症(cNDI)，(iv)多囊肾病，(v)癌症，包括肾癌和肺癌，(vi)血栓形成，(vii)梅尼埃病，(viii)难治性肝病，和(ix)心力衰竭。

诊断性

根据另外的方面，本发明涉及V2R拮抗肽或替选地式(I)的选定化合物作为可以应用于光学成像、磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描术(PET)以检测生理或病理条件下或响应于内源性或外源性刺激、用于诊断或研究目的的V2R细胞表达的诊断试剂或成像试剂的用途。它也可以用作药物筛选工具，用于筛选V2R配体，包括V2R激动剂和拮抗剂。

在优选的实施方式中，V2R拮抗肽通过偶联至可检测分子来标记。

然后，本发明还涉及如本文所述的经标记的V2R拮抗肽。

可以使用能够单独或与其他组合物或化合物一起提供可检测信号的常规可检测分子(标签)。合适的检测方法包括，例如通过免疫荧光显微术(包括共聚焦显微术)或通过流式细胞术(FACscan)检测直接或间接用荧光标签标记的剂；通过放射自显影法检测放射性标记剂；电子显微术；免疫染色；亚细胞分级分离等。在一些实施方式中，将放射性元素(例如放射性氨基酸)直接掺入肽链；在其他实施方式中，荧光标签可经由生物素/亲合素相互作用与肽缔合、与荧光素缀合肽缔合等。

在本发明的实施方式中，检测程序包括可见地检查标记剂的颜色变化，或检查经标记的V2R肽拮抗剂的物理化学变化。物理化学变化可伴随氧化反应或其他化学反应发生。它们可以用眼睛、使用分光光度计等来检测。

因此，用于标记本文所述的V2R拮抗肽的有用可检测分子优选为产生可检测和/或可量化信号的标记剂，特别是放射性、磁性或发光(辐射发光、化学发光、生物发光、荧光或磷光)剂。可以使用本领域技术人员所熟知的标准缀合技术，经由共价键或非共价键直接或间接地标记所标记的蛋白质。标记剂的实例包括放射性同位素例如锝-99(⁹⁹Tc)、氟-18(¹⁸F)、氚(³H)和碘-125(¹²⁵I)；发光剂例如AlexaFluor、FITC和青色素3；顺磁性造影剂、例如钆化合物和超顺磁造影剂、例如氧化铁纳米颗粒。

为清楚起见，偶联至可检测分子的如本文公开的V2R拮抗肽可以由实施方式的式(I)的化合物组成，其中存在[Nt-EXT]或[Ct-EXT]中的至少一者(即整数m或n中的至少一者表示1)，并且包括所述可检测分子或由所述可检测分子组成。

在一些优选的实施方式中，在标记剂中，V2R拮抗肽共价连接至放射剂或荧光剂。

标记剂(例如荧光剂或放射剂)与V2R拮抗肽的共价偶联可通过以下实现：(i)在蛋白的化学合成期间在蛋白质的N-末端或C-末端处掺入标记剂，或(ii)在重组蛋白或合成蛋白中掺入反应性基团(游离半胱氨酸.生物素基，叠氮基部分)，然后使用该基团共价连接标记剂。

优选地，标记剂共价连接至蛋白质的N-或C-末端，因为V2R拮抗肽的N-末端和C-末端均不参与其与V2R的结合。

本发明涉及本文所述的经标记的V2R拮抗肽用于在体外或体内检测表达V2R的细胞的用途。本发明还涉及本文所述的经标记的V2R拮抗肽在体外或体内用于测量表达V2R的细胞的V2R表达水平的用途。

a)提供待测试的细胞，

b)使步骤a)提供的细胞与根据本发明的经标记V2R拮抗肽接触，

c)测量由步骤b)结束时提供的细胞的血管加压素-2受体的表达水平值，

d)比较步骤c)获得的表达水平值与参考表达水平值，

e)确定血管加压素g-2受体细胞表达的调控异常发生。

在一些实施方式中，在步骤d)使用的参考表达水平值由未患有V2R细胞表达调控异常的对象(即未患有涉及V2R途径的病症或疾病的对象)的细胞中预期的平均V2R表达水平值组成。

在一些其他实施方式中，在步骤d)使用的参考表达水平值由患有V2R细胞表达的调控异常的对象(即患有涉及V2R途径的病症或疾病的对象)的细胞中已知或以其他方式确定或可确定的V2R表达值组成。

如本领域中熟知，AVP及其受体的异位表达已在多种癌症中报道(North等人,1999,Peptides,第20卷:837-842；Sinha等人,2019,Oncogene,第30(6)卷:1231-1245)，其中V2R激动剂在乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和肺癌中具有潜在的抗增殖作用(Garona等人,2015,Int J Oncol,第46卷:2335-2345；Ripoll等人,2013,Breast Cancer Res Treat,第142卷:9-18；Iannucci等人,2011,Future Med Chem,第3卷:1987-1993；Garona等人,2018,Cancer Res Treat,第51(2)卷:438-450；Pifano等人,2017,Front Oncol,7:11；Garona等人,2020,Vitamins and Hormones,第113卷:259-289)，和V2R拮抗剂在人肾癌中有抗增殖作用(Sinha等人,2019,Oncogene,第30(6)卷:1231-1245)。在本上下文中，根据本发明的V2R拮抗肽容易构成用于使过表达V2R的癌细胞成像的感兴趣的探针。

本发明的另一主题涉及如本文所述的V2R拮抗肽在体外诊断方法中的用途。

本发明的另一主题还是本文所述的V2R拮抗肽或本文所述的式(I)选定化合物用于诊断涉及V2R表达水平提高或降低的病状的体外或体内用途。

本发明的另一主题是本文所述的V2R拮抗肽或式(I)选定化合物用于诊断涉及V2R表达水平提高或降低的病状的体外或体内用途。

对于某些诊断性应用，经标记的V2R拮抗肽用于在体外或体内可视化患者组织中的V2R表达，并与来自健康个体的相同类型的组织比较评价其表达水平。V2R过表达指示例如癌症的病理疾病，而V2R低表达指示例如先天性肾源性尿崩症(cNDI)的病理疾病。一旦已经确定诊断剂，可以为经诊断的患者确定有效治疗，包括使用V2R拮抗剂，例如用于治疗癌症或cNDI。

本发明的一个主题还是V2R拮抗肽作为用于研究V2R的研究工具的用途。

本发明的另一主题是用于体外或体内检测V2R的方法，其包括以下步骤：

a)使待分析的细胞与经标记V2R拮抗肽接触，和

b)检测经标记的细胞。

细胞的标记特别是荧光标记或磁标记，通过本领域技术人员已知的任何技术(荧光显微术、流式细胞术、磁共振成像)检测。

在哺乳动物对V2R受体的体内检测(细胞成像)、特别是实时检测包括对所述哺乳动物施用所述标记的V2R拮抗肽的预先步骤(肠胃外注射、口服施用)。

本发明的另一主题是本文所公开的V2R拮抗肽用于筛选V2R配体的用途。

本发明的一个主题还是用于筛选V2R配体的方法，其包括：

a)用本发明的测试分子和经标记的V2R拮抗肽孵育V2R，和

b)测量分别在存在和不存在测试分子时获得的信号，其中与不存在测试分子的对照相比，存在该分子时信号较低，表明测试分子为V2R配体。

所识别配体对V2R的激动剂、拮抗剂作用然后在表达V2R的细胞中使用在本领域中众所周知的药理学测定，例如在本申请的实施例中公开的那些测试。

本发明还提供了试剂盒，其包括：(a)第一容器，其含有以下中的一种或多种：如本文所述的V2R拮抗肽、编码其的核酸或重组载体、经修饰的宿主细胞、药物组合物、诊断试剂或成像试剂，呈溶液或冻干形式；(b)任选地，第二容器，其含有用于冻干制剂的稀释剂或复溶溶液；(c)任选地，第三容器，其含有能够表达V2R的经分离的V2R受体或宿主细胞(呈溶液或冻干形式)，和任选地用于一种或多种溶液用途和/或一种或多种冻干制剂的复溶和/或用途的说明书。

本发明通过本文的实施例进一步说明，但不以任何方式限于本文的实施例。

实施例

实施例1：V2R拮抗肽的活性

A.材料和方法

肽的化学合成.

多肽合成在Gyros Protein Technologies,Inc Prelude合成仪上以12.5μmol规模进行，按照描述进行去保护、纯化和折叠(Ciolek等人,2017,Proc Natl Acad Sci USA,第114卷:7154-7159)。

在整个实验中都使用纯度高于95％的肽批次。在自动合成MQ1和脱保护N-端胺官能团之后，将6-叠氮己酸偶联在树脂上。将2当量的6-叠氮己酸与偶联剂HCTU(1.9当量)在2当量的二异丙基乙胺存在下偶联两次持续60分钟。6-叠氮己酸-MQ1从树脂中分离，纯化并如对MQ1 V2R肽拮抗剂那样进行氧化。将10当量的DFO-DBCO(对异硫氰基苄基去铁草胺-二芳基双环辛炔，溶解于200μl DMF中)或Cy5.5-DBCO(溶解于200μl HEPES缓冲液中)或AFDye-488-DBCO(溶解于200μl HEPES缓冲液中)与溶解于HEPES缓冲液(200μl,pH 7.4)中的0.3μmol的6-叠氮己酸-MQ1混合，并在室温下放置过夜并通过HPLC纯化。

B.结果

已经测试了多种MQ1-来源的肽对人血管加压素-2受体(V2R)的结合亲和力。

将结果汇总于下文表1中。

表1

如果表1中公开的序列与序列表中描述的那些之间存在差异，则正确的序列是表1中列出的那些。

表1所描绘的结果表明，与已知的MQ1 V2R拮抗肽相比，表现为IC₅₀比值为0.5或更小的经测试最有效的肽是其中位于已知MQ1 V2R拮抗肽中的氨基酸位置39处的赖氨酸残基被丙氨酸残基替代(氨基酸变化通常表示为“K39A”)的所有肽。最有效的V2R拮抗肽如下：

-SEQ ID NO.2的氨基酸序列的“K39A”肽，

-SEQ ID NO.3的氨基酸序列的“K39A+I48L”肽，

-SEQ ID NO.4的氨基酸序列的“N15A+K39A+I48L”肽，

-SEQ ID NO.5的氨基酸序列的“F4G+K39A+T27D”肽。

-SEQ ID NO.6的氨基酸序列的“F4G+K39A+T27D I48E”肽，在本文中还称为“MQ-LEAD”，和

实施例2：V2R拮抗肽的免疫原性和选择性

A.材料和方法

A.1.免疫原性

治疗性蛋白的免疫原性仍然是其开发失败的主要风险，因此是制药行业非常重要的问题。免疫原性是分子诱导免疫响应的能力。从该响应产生的抗体(抗药物抗体或ADA)可以抑制蛋白的治疗活性或甚至诱导过敏症状。由于免疫响应是物种依赖性的，动物、例如小鼠和大鼠是非常差的免疫原性预测模型并且当注射到人体内时不允许待评价的分子的免疫原性。免疫原性的临床前评价是基于调控人体免疫响应的机制。

ADA对治疗性蛋白质的响应主要涉及三种不同的细胞类型i)产生抗体的B细胞，ii)CD4 T细胞，其为B细胞分泌抗体提供必要的协助，和iii)树突状细胞，其通过将蛋白质作为肽呈现给T细胞而引起其激活。当将蛋白质注射到体内时，该蛋白质被树突细胞吸收并分解成肽。产生的一些肽具有适当的锚残基以结合至HLA II类分子，并被呈递到T细胞。被T细胞识别的肽称为T表位。因为HLA II类分子是多态性的，所以T表位因分子而异并因此根据HLA II类分子在个体之间有所不同。

鉴于T淋巴细胞在ADA响应中的作用，治疗性蛋白的免疫原性高度依赖于其激活T淋巴细胞的能力，从而在其序列中含有T表位。T表位含量的评价可以使用预测软件完成，其中最有效的是NETMHC。通过NETMHC软件测试U-Da2a和MQ-LEAD中潜在T表位的存在。

A.2.选择性

蛋白酶测定一般方案如下：

1递送2X酶

2递送缓冲液至无酶孔中

3通过使用Acoustic技术(Echo550；纳升范围)递送MQ-WT(U-Da2a)于水中

4孵育5-15分钟

5递送2X底物以引发应用

6旋转和振荡，在室温下在EnVision中开始测量；5分钟间隔持续25次(2小时)

7取测量的线性部分的斜率*(信号/时间)来分析数据

8用Excel计算斜率，并用Prism软件进行曲线拟合

具体规格在本发明的末尾的表2中公开

缓冲液：

A 25mM Tris pH 8.0,100mM NaCl,0.01％ Brij35,

B'25mM MES pH 6,50mM NaCl,0.005％ Brij35,5mM DTT

B 75mM Tris pH 7.0,0.005％ Brij35,3mM DTT

B+EDTA 75mM Tris pH 7.0,1mM EDTA,0.005％ Brij35,3mM DTT

C 100mM Tris-HCl,pH 8.0,50mM NaCl,10mM CaCl2,0.025％ CHAPS,1.5mM DTT

D 25mM乙酸钠pH 5.5,0.1M NaCl,5mM DTT

E 25mM乙酸钠pH 3.5,5mM DTT

F 25mM Tris pH 9,150mM NaCl

L 400mM乙酸钠pH 5.5,4mM EDTA,8mM DTT

X(弗林蛋白酶)100mM Tris-HCl,pH 7.5,1mM CaCl2,0.5％ TX-100,1mM DTT

S 0.1M乙酸钠pH 3.5,0.1M NaCl

TCN 25mM Tris pH 7.5,10mM CaCl2,150mM NaCl

TCNB 25mM Tris pH 7.5,10mM CaCl2,150mM NaCl,0.05％ Brij35

Z 25mM Tris pH 9,2.5uM ZnCl2,0.005％ Brij

KLK 7缓冲液50mM Tris,150mM NaCl,pH 8.5

ACE2缓冲液75mM Tris,pH 8.5,1M NaCl

脑啡肽酶缓冲液50mM Tris,pH 9.0

CTSD缓冲液100mM乙酸钠pH 3.5,200mM NaCl,0.02％ Brij35

CTSE缓冲液100mM乙酸钠pH3.5,500mM NaCl,0.005％ Triton X-100

弹性蛋白酶缓冲液50mM Tris,pH 7.5,1M NaCl,0.05％Brij35

1X半胱天冬酶缓冲液1 50mM HEPES pH7.4,100mM NaCl,0.01％CHAPS,0.1mMEDTA,10mM DTT

1X半胱天冬酶缓冲液2 50mM HEPES pH7.4,1M柠檬酸钠，100mM NaCl,0.01％CHAPS,0.1mM EDTA,10mM DTT

MMP缓冲液：50mM HEPES(pH7.5),10mM CaCl2,0.01％ Brij-35，储存在4℃下。在使用之前添加于缓冲液中的0.1mg/ml BSA。

B.结果

B.1.免疫原性

已经计算了SEQ ID NO.7的已知MQ1肽和SEQ ID NO.6的MQ LEAD肽的预期免疫原性。

对比结果描绘于图1中。

如其在图1中所示，已知的MQ1肽中存在的免疫原性区域在MQ LEAD V2R拮抗肽中并不明显。

在MQ1(U-Da2a)上时，鉴定出15个潜在表位，包括具有高评分(百分位数低于10％)的6个表位，在MQ-LEAD的序列中鉴定出仅3个潜在T表位。这3个潜在T表位的评分也很低(百分位数为20％至30％)。

然后，MQ-LEAD肽将呈现比已知的MQ1肽低得多的免疫原性风险。

B.2.选择性

已知的MQ1肽对血管加压素-2受体的选择性已通过测定其与大量分子的结合来测试。

结果描绘于本发明的末尾的表3中。

表3的结果示出MQ1肽对血管加压素-2受体的选择性。

实施例3：V2R拮抗肽的药理学

A.材料和方法–V2R结合测定

来自表达血管加压素受体的细胞的膜购自PERKINELMER(法国科塔布夫)。用³H-AVP(PERKINELMER,法国科塔布夫)在96-孔板中进行结合实验。反应混合物含有50mM Tris-HCl,pH 7.4、10mM MgCl₂和1g/L BSA，最终体积为100μL。将板在室温下孵育3小时。经由通过预浸泡于细胞收集器(PERKINELMER,法国科塔布夫)上的0.5％聚乙烯亚胺中的GF/C过滤器过滤来终止结合反应，并将板干燥。将Ultimagold O(25μl；PERKINELMER)添加至每个孔，并将样品使用TopCount计数器(PERKINELMER,法国科塔布夫)计数(计算收率为55％)。在1μM AVP存在下测量非特异性结合。使用Kaleidagraph(Synergy软件，Reading,PA,USA)，将单位点抑制质量作用曲线拟合至抑制结合数据。将IC₅₀值使用Cheng-Prusoff等式(Cheng等人，Biochem.Pharmacol.,1973,22,3099-3108)转化为K_i用于竞争实验。

B.结果

根据本发明的V2R拮抗肽结合至V2R

结果描绘于图2中。

图2的结果显示，与已知的MQ1(U-Da2a)肽相比，根据本发明的MQ-LEAD肽对血管加压素-2受体的亲和力增加了5倍。使用V2R拮抗肽MQ K39A获得甚至更好的结果。

这些结果显示了V2R拮抗肽MQ-LEAD和MQ K39A表现为强V2R拮抗肽。

实施例4：根据本发明的V2R拮抗剂的体内活性

A.材料和方法

A.1.利尿的体内测定

6至12周龄的Sprague Dawley大鼠在代谢笼(Techniplast France,法国里昂)中适应两天，自由进食和饮水，之后用各种MQ以溶解于0.9％NaCl中的3nmol/kg进行i.p.注射(1ml固定体积)(法国协议号2015082111349702v1)。在不同时间收集尿液，以20,800g离心30分钟。尿液渗透压用渗透计(Knauer,德国柏林)测定。

A.2.对低钠血症实验模型的体内测定

大鼠低钠血症模型.无特异性病原体的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(体重为445至525克)从Janvier实验室(Le Genest St.Isle,53941,法国圣贝特文塞德克斯)获得，并使其适应动物实验房条件持续1周。建立了源自之前论文的实验方案(Miyazaki T,Yamamura Y,Onogawa T,Nakamura S,Kinoshita S,Nakayama S等人，Therapeuticeffects of tolvaptan,a potent,selective nonpeptide vasopressin V2 receptorantagonist,in rats with acute and chronic severehyponatremia.Endocrinology.2005；146:3037–43.)，以开发大鼠低钠血症模型，获法国教育和研究部(French Ministry of Education and Research)批准(No.18604-2019010915104191)。通过将5mg药物溶解至生理盐水中制备2.2mg/mL的去氨加压素(dDAVP)原液。使用预填充有dDAVP溶液的皮下ALZET渗透微型泵(2002型,DURECTCorporation,Cupertino,CA95014,USA)(泵速为0.47±0.02μL/小时，并且平均填充体积为233.6±4.7μL)，施用dDAVP。在初始实验中测定dDAVP的剂量(10ng/小时)。从第0天至第3天，每天以0.02mg/kg剂量皮下施用丁丙诺啡(Centravet,03120法国拉帕利斯)一次，以抑制术后疼痛。在ALZET泵植入后前3天(上午9点和下午4点)和在第4天上午9点，每天进行两次水灌胃(30mL/kg)。每天获取体重，以调整待施用的水的体积。大鼠可自由获得标准大鼠食物，以及其笼子里的水。溶解于生理盐水中的MQ1在第2-3-4天上午10点以10或100μg/kg(s.c.途径，0.8mL/kg)施用。在第0、2、3和4天上午9点，400μL血液从异氟醚麻醉大鼠的尾静脉中收集，含肝素酸锂(Sanofi-Aventis,法国让蒂伊)。将样品离心(4℃,2000g,5min)。钠定量由法国图卢兹ENVT中心实验室(Central laboratory of the ENVT,法国图卢兹)在VITROS 250/350/950/5,1FS,4600和集成系统VITROS 5600(Ortho-ClinicalDiagnostics,英国白金汉郡)上进行。P<0.05，ANOVA多因素，然后是Tukey检验)。

B.结果

B.1.根据本发明的两种V2R拮抗肽对利尿的作用

结果描绘于图3(图3A和3B)中。图3的结果显示了本发明的MQ-LEAD和MQ K39A肽均增加了利尿。

B.2.根据本发明的V2R拮抗肽对低钠血症的作用.

本研究的目的是测试来源于mambaquaretine(MQ-LEAD)的肽(一种V2受体的有效且选择性拮抗剂)对正常成年CD株雄性大鼠(Sprague Dawley)中的DDAVP-诱导的低钠血症的作用。

MQ-LEAD肽已在大鼠低钠血症模型中得以验证。体内测定的时间表描绘于图4中。

结果描绘于图5中。

图5中描绘的结果显示了在D4，托伐普坦(10mg/kg，口服途径)的作用显著不同于媒介物治疗组的值。托伐普坦治疗组中钠的平均值(137.6±3.3mM)。在D4，3个剂量的MQ-LEAD(20、60和200μg/kg，s.c.)的血浆钠浓度显著高于媒介物治疗组的相应值。与托伐普坦剂量(10mg/kg,p.o.)的直接比较表明，MQ-LEAD的效力可以是托伐普坦的500倍。在D3和D4，20和60μg/kg的MQ-LEAD之后的钠值虽然有所增加，但与基础值(D0)相比没有统计学差异。

实施例5：本发明的V2R拮抗肽对cAMP产生的抑制

A.材料和方法

A.1.检查了MQ-WT、MQ-18(K39A)和MQ-232(MQ-LEAD)在稳定表达人精氨酸血管加压素的U2OS AVPR2A Nomad细胞系中的拮抗剂作用。

U2OS AVPR2 Nomad细胞系含有稳定表达无标签的人精氨酸血管加压素受体2A(AVPR2A)的U2OS细胞。该细胞系被设计以测定化合物或分析其调节精氨酸血管加压素受体2A(AVPR2A)的能力。当激动剂与AVPR2结合时，Gs蛋白被激活，这继而触发cAMP介导的细胞响应。这种细胞响应可以通过量化荧光强度及其细胞分布的增加来测量。

A.2.受体2A(V2R).使用1nM人Arg8-血管加压素作为激动剂，使用基于荧光的测定，在八个浓度(一式三份，1μM至1nM)下测定测试项。

-第1天.解冻Nomad AVPR2 U2OS细胞系(2x106个细胞/T25)。

-第2天.将细胞维持在加湿5％ CO2气氛下在37℃的补充有10％ FBS的DMEM-F12中。

-第3天.将细胞以20.000个细胞/孔(+/-2000个细胞)的浓度涂铺在96孔板中。将细胞在24h期间在37℃下在加湿5％ CO2气氛下维持在补充有10％ FBS的DMEM-F12培养基中。

-第4天.将细胞与不同浓度的测试化合物(1000、333.33、111.11、37.04、12.37、4.12、1.37和0.46nM)和1nM的溶解于Opti-MEM中的Arg8-血管加压素一起孵育24小时。将含媒介物(水)的Opti-MEM添加至未刺激对照孔，将1nM的Arg8-血管加压素添加至阳性对照孔并将1nM的含100nM考尼伐坦的Arg8-血管加压素添加至拮抗对照。该实验至少一式三份地进行。

-第5天.将Nomad生物传感器的激活在细胞的甲醛固定(3.7wt.％，20分钟)之后定量。使用DAPI(2μg/ml)对细胞核进行染色，并使用Thermofisher的Cell Insight High-Content Bioimager测量荧光。为了检测DAPI，使用的滤波器分别为380/10和460/10nm用于激发和发射，和以检测Nomad生物传感器，滤波器分别为548/20和645/75nm。图像是在20X物镜下获得的，每个孔拍摄9张照片。通过划定细胞核的目标区(用DAPI染色)进行细胞定量，并在定量后，对每个一式三份试验取平均值。颗粒定量也使用Thermofisher CellomicsScan Viewer 6.1.1进行。来自Cell Software的Spot检测器应用程序划定了2个目标区、细胞核和细胞质。该软件应用程序定量了每个细胞核的颗粒数，并计算了颗粒数/每个孔的细胞质的平均值。之后对一式三份试验进行平均。使用Excel 2003和Sigmaplot 9.0两者进行数据管理。

B.结果

如图5中所示，本发明的V2R拮抗肽(即K39A肽和MQ-LEAD肽)当与亲本MQ1肽(MQ-WT肽)相比时是更有效的cAMP产生抑制剂。V2R拮抗肽以剂量依赖性方式抑制在用Arg 8血管加压素激活的条件下的cAMP产生。

本发明的V2R拮抗肽的cAMP产生抑制特性进一步在下表3中说明。

表3：抑制cAMP产生

	IC50,nM	Kinac*,nM
			MQ1(“MQ-WT”)	192	81
U-Da2a K39A	46.1	23
			MQ LEAD	9.27	4.6

*Kinac：失活常数：测量经测试的肽阻止受体激活的能力，即阻止Arg8血管加压素激活cAMP产生。

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序列表

<110> CEA

<120> 血管加压素-2受体拮抗肽及其用途

<130> PR89992

<150> EP20305696

<151> 2020-06-24

<160> 25

<170> BiSSAP 1.3.2

<210> 1

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> X1, X2, X3, X4, X5和X6如所定义的.

<220>

<223> X1, X2, X3, X4, X5和X6如所定义的.

<220>

<221>

<222> 4

<223> X1表示氨基酸残基F或G

<220>

<221>

<222> 15

<223> X2表示任何氨基酸残基,除了碱性氨基酸

<220>

<221>

<222> 27

<223> X3表示氨基酸残基T或D

<220>

<221>

<222> 48

<223> X4表示氨基酸残基I,L或E

<220>

<221>

<222> 56..57

<223> (i) X5表示V并且X6表示G或(ii) X5表示G并且X6表示V

<400> 1

Arg Pro Ser Xaa Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Xaa Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Xaa Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Xaa

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Xaa Xaa

50 55

<210> 2

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> K39A

<220>

<223> K39A

<400> 2

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 3

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> K39A+I48L

<220>

<223> K39A+I48L

<400> 3

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 4

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> N15A+K39A+I48L

<220>

<223> N15A+K39A+I48L

<400> 4

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Ala Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 5

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> F4G K39A T27D

<220>

<223> F4G K39A T27D

<400> 5

Arg Pro Ser Gly Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Asp Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 6

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> MQ-LEAD F4G+K39A+T27D+I48E

<220>

<223> MQ-LEAD F4G+K39A+T27D+I48E

<400> 6

Arg Pro Ser Gly Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Asp Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Ala Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Glu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 7

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> WT MQ1

<220>

<223> WT MQ1

<400> 7

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 8

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> K10A

<220>

<223> K10A

<400> 8

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Ala Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 9

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> K10E

<220>

<223> K10E

<400> 9

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Glu Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 10

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> F17A

<220>

<223> F17A

<400> 10

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Ala Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 11

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> F18A

<220>

<223> F18A

<400> 11

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Ala Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Arg Phe Ser Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 12

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> N41A

<220>

<223> N41A

<400> 12

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Ala Ala Asn Arg Phe Ser Thr Ile

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 13

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> R44A

<220>

<223> R44A

<400> 13

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Ala Phe Ser Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 14

<211> 57

<212> PRT

<213>人工序列

<223> R44E

<220>

<223> R44E

<400> 14

Arg Pro Ser Phe Cys Asn Leu Pro Val Lys Pro Gly Pro Cys Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Ser Ala Phe Tyr Tyr Ser Gln Lys Thr Asn Lys Cys His Ser

20 25 30

Phe Thr Tyr Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Glu Phe Ser Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Cys Arg Arg Thr Cys Val Gly

50 55

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213>人工序列

<223>酶底物

<220>

<221>链

<222> 1

<223> (7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221>链

<222> 9

<223> 2, 4-二硝基苯基

<400> 15

Arg Pro Pro Gly Phe Ser Ala Phe Lys

1 5

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213>人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221>链

<222> 1

<223> (7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221>链

<222> 7

<223> 2, 4-二硝基苯基

<400> 16

Tyr Val Ala Asp Ala Pro Lys

1 5

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 1

<223> (7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> NON_STD

<222> 7

<223> X是N-3-(2,4-二硝基苯基)-L-α，β-二氨基丙酰基]

<400> 17

Pro Leu Ala Gln Ala Val Xaa Arg Ser Ser Ser Arg

1 5 10

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 1

<223> (7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 11

<223> 2, 4-二硝基苯基

<400> 18

Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg Lys Arg Arg

1 5 10

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> 乙酰乙酰化

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 4

<223> 7-氨基-4-甲基香豆素

<400> 19

Leu Glu His Asp

1

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> 乙酰乙酰化

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 4

<223> 7-氨基-4-甲基香豆素

<400> 20

Asp Glu Val Asp

1

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> 乙酰乙酰化

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 4

<223> 7-氨基-4-甲基香豆素

<400> 21

Trp Glu His Asp

1

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 1

<223> (7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> NON_STD

<222> 5

<223> 连接到2, 4-二硝基苯基的N-3-(2,4-二硝基苯基)-L-α，β-二氨基丙酰基]

<400> 22

Pro Leu Gly Leu Xaa Ala Arg

1 5

<210> 23

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> NON_STD

<222> 1

<223> 琥珀酰

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 4

<223> 7-氨基-4-甲基香豆素

<400> 23

Ala Ala Pro Phe

1

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> NON_STD

<222> 1

<223> 甲氧基琥珀酰

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 4

<223> 7-氨基-4-甲基香豆素

<400> 24

Ala Ala Pro Val

1

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<223> 酶底物

<220>

<221> 链

<222> 1

<223> （7-甲氧基香豆素-4-基）乙酰基

<220>

<223> 酶底物

<220>

<221> NON_STD

<222> 7

<223> X是戊氨酸

<220>

<221> 链

<222> 10

<223> 2, 4-二硝基苯基

<400> 25

Arg Pro Lys Pro Val Glu Xaa Trp Arg Lys

1 5 10

Claims

1.一种肽，其包含与以下SEQ ID NO.1的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸同一性的序列：

其中，

-X1表示氨基酸残基F或G，

-X2表示任何氨基酸残基，除了碱性氨基酸残基，

-X3表示氨基酸残基T或D，

-X4表示氨基酸残基I、L或E，

-(i)X5表示V并且X6表示G或(ii)X5表示G并且X6表示V，和

-位于位置39处的氨基酸是A。

2.根据权利要求1所述的肽，其中X1表示所述氨基酸残基G。

3.根据权利要求1所述的肽，其中X2表示选自由A、D、E、F、G、I、L、N、M、Q、S、T、V和Y组成的组的氨基酸残基。

4.根据权利要求1所述的肽，其中X3表示所述氨基酸残基D。

5.根据权利要求1所述的肽，其中X4表示所述氨基酸残基E或L。

6.根据权利要求1所述的肽，其包含SEQ ID NO.1的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述的肽，其包含选自由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的组的氨基酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽，其是用可检测分子标记的。

9.一种核酸，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的肽。

10.根据权利要求9所述的核酸，其被包含在表达载体中。

11.一种药物组合物，其包含如权利要求1至7中任一项所述的肽和生理上可接受的载体。

12.根据权利要求1至7中任一项所述的肽作为药剂的用途。

13.根据权利要求1至7中任一项所述的肽用于治疗选自由以下组成的组的疾病的用途：以正常容量性或低容量性低钠血症为特征的病理疾病、抗利尿不适当肾原性综合征、先天性肾源性尿崩症、多囊肾病、癌症、血栓形成、梅尼埃病、难治性肝病和心力衰竭。

14.根据权利要求8所述的经标记的肽用于检测表达血管加压素-2受体的细胞的体外用途。

15.一种用于检测血管加压素-2受体细胞表达的调控异常的体外方法，其包括以下步骤：

a)提供待测试的细胞，

b)使步骤a)提供的细胞与根据权利要求8所述的经标记的肽接触，

c)测量血管加压素-2受体细胞表达的表达水平值，

d)比较步骤c)获得的所述表达水平值与参考表达水平值，

e)确定血管加压素g-2受体细胞表达的调控异常发生。

16.根据权利要求1至8中任一项所述的肽在体外诊断方法中的用途。