CN116298260A - 非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡。该试纸卡包括背衬以及在背衬上的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫。所述层析膜上的检测线喷涂有非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物。该抗原表位多肽组合物为为序列表中序列1所示的多肽、以及序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。所述质控线喷涂山羊抗猪IgG。所得的试纸卡具有极高的灵敏度，同时本发明所述试纸卡具有极高的特异性及准确性，结果肉眼可判读，较为直观，可快速特异性地检测出血清中非洲猪瘟病毒的特异性抗体，具有良好的实用价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)的病原体是非洲猪瘟病毒(ASFV)，ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)。ASFV是囊膜病毒，正二十面体结构，由5层同心圆结构组成，粒子直径平均为200nm左右，病毒基因组为双链DNA分子，长170-193kb，编码超过150个多肽，其中至少有50个组成了病毒颗粒的不同结构域。80nm的病毒核心包含病毒基因组和核蛋白p10和pA104R，病毒核心由p35、p15、p150、p37、p34和p14蛋白组成的病毒衣壳包裹；围绕着病毒衣壳的是两层脂质分子，内层囊膜由p54、p17、pE248R和p12组成，衣壳结构含有p72、pE120R和pB438L；病毒通过质膜出芽，从宿主细胞释放，在此过程中获得的外层囊膜包含蛋白p24、CD2v、p30和p12。
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达100％。鉴于该病的严重危害性，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前针对ASF没有可用的疫苗，事实上也从未成功研制出过有效的ASF商品化疫苗。对该病的控制严格依赖于动物检疫、生物安全措施和扑杀。研发疫苗面临的技术挑战包括以下几个方面：作为已知最大的DNA病毒之一，ASFV基因尚未鉴定和确定功能；没有可用于疫苗生产的病毒增殖细胞系；具有多个不同表型特征的ASFV基因型，候选疫苗的研发中基本没有交叉保护；研制的疫苗既要可用于家猪注射免疫，同时也可以在丛林传播循环的情况下能够对野猪及潜在的其他野生动物进行口服免疫。动物感染非洲猪瘟病毒后，机体免疫系统对病毒进行免疫防御从而产生特异性抗体，在感染后的2周内，会先后产生IgM和IgG抗体，IgM是免疫系统中最先出现的抗体，检测出IgM提示感染新近发生，一般用于感染的早期诊断，IgG是既往感染的指标，同时进行非洲猪瘟病毒特异性IgM和IgG总抗体有利于提高对非洲猪瘟病毒感染检出的敏感性，此外，还可以用于乳汁、唾液中IgA抗体的检测，因此对有效控制非洲猪瘟病毒具有重要的临床意义。
非洲猪瘟病毒抗体的检测方法有很多，世界动物卫生组织(WOAH)推荐的诊断技术分为病原学检测和血清学试验。ELISA是WOAH规定的国际贸易检验方法。病毒的分离鉴定与核酸检测，可作为潜伏期、疾病初期及症状明显期的检测手段，主要包括病毒分离试验、红细胞吸附试验、PCR检测、实时荧光定量PCR试验等。血清学试验用于检测非洲猪瘟病毒的抗原和抗体，主要包括荧光抗体技术、ELISA及免疫层析试验等。目前，由于检测需使用活毒，费时费力，病原学检测、荧光抗体技术、免疫学印迹等试验对于技术及设备要求较高，不适于临床推广，ELISA需要专门的实验室才能操作，也限制其在基层中的推广使用。
胶体金免疫层析技术是一种紧靠肉眼观察即可实现的快速检测技术，操作便捷，反应时间短，不需要任何仪器设备，结果清晰容易辨读，是符合现场检测(POCT)的一种快速检测技术。另一方面，由于目前尚缺少针对非洲猪瘟的商品化疫苗，因此检测出非洲猪瘟病毒抗体，则可以认为猪体内存在非洲猪瘟病毒感染。针对目前非洲猪瘟目前存在隐匿传播的流行趋势，因此对非洲猪瘟病毒特异性抗体检测提出了高敏感性、高特异性的高要求，同时还需要操作便捷，结果判读简单的检测方法，以便可在基层进行推广使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，该试纸卡利用非洲猪瘟病毒P54蛋白(序列4GenBank No.MH717102)上抗原表位多肽作为检测抗体的特异性抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的抗体检测试纸卡，用于检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体。
为了达到上述目的，本发明首先筛选得到了性能优异的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，本发明提供的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2、序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的三种时，任意三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1；
本发明还要求保护非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。
本发明的检测非洲猪瘟病毒抗体的免疫层析试纸卡，包括背衬以及在背衬上的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫。所述标记物垫上标记有葡萄球菌A蛋白(SPA)的标记物，，所述层析膜上设置有检测线和质控线，所述检测线(T线)喷涂有上述非洲猪瘟病毒抗原多肽组合物。
所述层析膜上的质控线(C线)喷涂山羊抗猪IgG；所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽为化学人工合成得到。
其中，层析膜优选为硝酸纤维素膜(NC膜)。所述的吸水垫的制作材料为吸水滤纸；所述的标记物垫为玻璃纤维素膜。
所述试纸卡的背衬为聚乙烯背衬。
所述胶体金免疫层析试纸卡可以用于特异性检测非洲猪瘟病毒抗体，其待测样品包括但不限于猪全血、猪血清、猪血浆、唾液拭子、乳汁等。
所述试纸卡检测的抗体类别包括但不限于IgG、IgA和IgM等，因此该试纸卡检测的敏感性更高。
本发明试纸卡的定性检测方法及结果判定：
采用本发明试纸卡和本发明样品稀释液检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：待测样品类型包括猪全血、血清、猪血浆、唾液、乳汁等样品。取2滴待测样品(约60μL)加入6滴样品稀释液进行稀释(即进行1:4倍稀释)，作为检测样本。
(2)撕开试纸卡的铝箔袋，取出试纸卡，将其放置在洁净的操作台上。
(3)用巴氏管吸取检测样本，滴加3滴于样品垫上方，垂直缓慢滴加。
(4)滴加完成后，等待10-15分钟，判定结果。
(5)结果判定：若检测线和质控线均显紫红色，为非洲猪瘟病毒抗体阳性；若检测线不显色而质控线显紫红色，为非洲猪瘟病毒抗体阴性；若质控线不显色，则试纸无效。
本发明的上述试纸卡，可用于检测非洲猪瘟病毒抗体，以判断被检动物是否存在感染后产生的非洲猪瘟病毒抗体。
本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对非洲猪瘟病毒的抗原表位进行精确分析，从P54蛋白(序列4)上的主要抗原表位上筛选出适合胶体金免疫层析检测用的肽段。该肽段集中了P54蛋白的抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。
同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于本发明试纸卡检测抗原的制备。
另外，由于试纸卡中使用的多肽抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提高了检测非洲猪瘟病毒抗体的效率，以判断被检动物是否感染非洲猪瘟病毒。
总之，本试纸卡采用化学合成结构蛋白P54蛋白主要抗原位点的抗原肽作为检测抗原，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测非洲猪瘟病毒病毒感染后产生的抗体，以判断被检动物是否感染非洲猪瘟病毒。实验结果表明，本发明的试纸卡重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足基层人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
本发明的非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡，可同时检测IgM、IgG和IgA总抗体，敏感性和特异性更高，可大大减少漏检率。
本发明所涉及的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸卡用于检测动物是否感染非洲猪瘟病毒，有利于我国非洲猪瘟病毒防控体系的建立。
附图说明
图1为特异性检测非洲猪瘟病毒抗体的胶体金免疫层析试纸卡。其中，1为样品垫，2为标记物垫(喷涂了胶体金标记的SPA的金标垫)，3为检测线，4为质控线，5为层析膜(硝酸纤维素膜)，6为吸水垫，7为背衬。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡检测抗原的制备
本试验采用生物信息学方法对GenBank公布的Pig/HLJ/2018毒株序列(MK333180.1)的P54蛋白(序列4)的主要抗原表位进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出多肽抗原，序列分别为序列表中序列1、序列2、序列3所示，制成纯度约80％的多肽抗原，能够覆盖非洲猪瘟病毒的P54蛋白主要中和抗原表位，提高抗体阳性的检出率。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的三条多肽，作为本发明试纸卡的检测抗原。
本发明的检测抗原非洲猪瘟多肽抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂做为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：
一、多肽抗原固相合成
1、合成试剂的准备
检测抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
SEQ ID NO:1如下所示：
FFQPVYPRHY GECLSPVTTP 20SEQ ID NO:2如下所示：
SRKKKAAAIE EEDIQFINPY QDQQWVEVTP QPGTSKPAGA TTASVGKPVT GRPATNRPAT60NKPVTDNPVT DRL 73SEQ ID NO:3如下所示:
GPAAAPAAAS APAHPAEPYT TVTTQNTASQ TMSAIENLRQ RNTYTHKDL 49
依据多肽抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至相应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100％的NMP、3％的AIM(已酰咪唑)、35％的PIP(哌啶)、100％的MeOH(甲醇)等放置到相对应的试剂瓶中。
2、合成仪状态的检测
检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常(433A正常表压10.2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求(具体检测要求见下表1)。
表1多肽合成仪流速检测标准表
| 试剂 | 瓶号 | Module | 标准范围 |
| 35％Piperidine | 1 | A | 1.0～1.2ml |
| 3％AIM | 4 | D | 1.0～1.2ml |
| 100％MeOH | 9 | I | 3.5～4.0ml |
| DIC | 8 | I | 0.45～0.55g |
| 100％NMP | 10 | A | 2.6～2.8ml |
3、多肽抗原合成开始
在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0Sol DIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry是否为Std Fmoc 1.0Sol DIC 90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。
Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。
4、多肽抗原合成进行
Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶(PIP)进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“－NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HOBT)至反应器内。
如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤(合成仪按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用量及运行情况。
表2多肽抗原合成循环步骤
5、多肽抗原合成结束
多肽抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂(肽现在还连接在树脂上)基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。
二、多肽抗原的裂解及鉴定
1、多肽抗原的裂解
经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。步骤如下：
从冰箱内取出合成的多肽树酯(指肽还连接在树脂上)，放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)、10ml的三丙基硅烷(TIS)和磁搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120min除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到多肽抗原。
2、多肽抗原的鉴定
多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法(MODAL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。
3、多肽抗原纯化
将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤(用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。
4、多肽抗原冷冻干燥
为了便于长期保存和运输，需要将多肽抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冷冻好的多肽抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的多肽抗原。包装后贴上标签，标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。
实施例2、非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡的制备
1、样品垫的制备：样品垫的材质为玻璃纤维膜，每张玻璃纤维膜采用5mL处理液(含有3％蔗糖、0.5％BSA、0.1％Triton X100,0.5％海藻糖)浸泡，37℃过夜烘干备用。
2、胶体金标记葡萄球菌A蛋白(SPA)的制备
(1)取1mL的50nm胶体金颗粒，先加入5μL的1M碳酸钾溶液(K2CO3)，采用微量漩涡振荡器快速混匀3分钟后，加入25μg葡萄球菌A蛋白(SPA，浓度为5mg/mL)，快速混匀，然后在3D旋转仪上室温孵育1小时。
(2)加入200μL含有10mg/mL牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，并在D旋转仪上室温孵育1小时进行封闭。
(3)将步骤(2)封闭后得到胶体金标记葡萄球菌A悬浮液于4℃12000r/min离心20分钟后，小心弃去上清液，沉淀物即为制备的胶体金标记葡萄球菌A蛋白(SPA)颗粒，用金标重悬液(含有3％蔗糖、0.5％酪蛋白、0.5％BSA、0.1％Triton X100,0.5％海藻糖)重悬后，4℃保存备用。
3、金标垫(标记物垫)的制备
(1)预处理：金标垫的材质为玻璃纤维膜，每张玻璃纤维膜采用5mL处理液(含有3％蔗糖、0.5％BSA、0.1％Triton X100,0.5％海藻糖)浸泡，37℃过夜烘干备用。
(2)喷金：取180μL胶体金标记SPA溶液(浓度为0.14mg/mL)，按照6μL/cm的速度喷膜，37℃下放置2小时干燥，备用。
4、硝酸纤维素膜划线
(1)检测线(T线)喷洒：将非洲猪瘟病毒多肽抗原用0.01mol/M PBS稀释成总抗原浓度为1.5mg/mL((设置七组处理，ZM202201划线多肽为序列1所示的多肽，ZM202202划线多肽为序列2所示的多肽，ZM202203划线多肽为序列3所示的多肽，ZM202204划线多肽为序列1所示的多肽和序列2所示的多肽(二者质量比为1:1)，ZM202205划线多肽为序列2所示的多肽和序列3所示的多肽(二者质量比为1:1)，ZM202206划线多肽为序列1所示的多肽和序列3所示的多肽(二者质量比为1:1)，ZM202207划线多肽为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽(三者质量比为1:1))，用划膜仪以1μL/cm的速度均匀划在硝酸纤维素膜的T线位置。
(2)质控线(C线)喷洒：将山羊抗猪IgG(Sigma SAB 4600047，2mg/mL)，0.01mol/MPBS稀释成1mg/mL，用划膜仪，以1μl/cm的速度均匀划在硝酸纤维素膜的C线位置，然后放于37℃过夜烘干备用。
5、试纸条的组装：采用如下方法组装试纸条：在正常湿度和温度下的洁净操作台上，将处理好的样品垫(1)、喷涂了标记物垫-胶体金标记的SPA的金标垫(2)、喷涂了检测线(3)和质控线(4)的层析膜-硝酸纤维素膜(5)、吸水垫(6)(材质为吸水滤纸)依次以2-4mm重叠黏贴在背衬(7)上，见图1。
6、裁切及试纸卡的组装：将组装好的试纸条，用切条机切成4mm胶体金试纸条。挑取完好整齐的试纸条，放入卡壳中，压盖完成后连同干燥剂放入铝箔袋中密封保存。
7、样品稀释液的配制：样品稀释液为含有0.5％Tween20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。
实施例3、敏感性试验
一、非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡的使用方法
(1)样品处理：待测样品类型包括猪全血、血清、唾液、乳汁等样品。取2滴待测样品(约60μL)加入6滴样品稀释液进行稀释(即进行1:4倍稀释)，作为检测样本。
(2)撕开试纸卡的铝箔袋，取出试纸卡，将其放置在洁净的操作台上。
(3)用巴氏管吸取检测样本，滴加3滴于样品垫上方，垂直缓慢滴加。
(4)滴加完成后，等待10-15分钟，判定结果。
(5)结果判定：若检测线和质控线均显紫红色，为非洲猪瘟病毒抗体阳性；若检测线不显色而质控线显紫红色，为非洲猪瘟病毒抗体阴性；若质控线不显色，则试纸无效。
二、敏感性试验
1、灵敏度试验
使用按照实施例2的方法制备的3批次非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批次ZM202201～ZM202207)，分别依照上述非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡使用方法对非洲猪瘟标准阳性血清(购自中国兽医药品监察所，采用非洲猪瘟病毒抗体检测金标准方法检测其间接免疫荧光试验检测效价为1:4000，CVCC编号为Z286)进行检测。首先将非洲猪瘟标准阳性血清采用样品稀释液(为含有0.5％Tween20的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液)进行1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600倍稀释，用本发明试纸卡进行检测。结果显示：本发明的3批次试纸卡对非洲猪瘟标准阳性血清的稀释度为1:12800时检测结果仍为阳性，即本发明的试纸卡对非洲猪瘟的最低检测限可达到1:12800，高于间接免疫荧光试验的敏感性。
2、敏感性试验
使用按照实施例2的方法制备的3批次非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批次ZM202201～ZM202207)，依照上述非洲总猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸卡使用方法对55份非洲猪瘟感染猪血清(经韩国金诺非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒检测结果为非洲猪瘟病毒抗体阳性)进行检测，结果显示(表3)，本发明的试纸卡共检测出55份，表明本试纸卡对55份已知阳性血清的敏感性为100.0％。
表3敏感性试验检测结果
3、特异性试验
使用按照实施例2的方法制备的3批次非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批次ZM202201～ZM202207)，依照上述非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡使用方法对20份健康猪血清、2份猪口蹄疫病毒O型(FMD-O)阳性血清、2份猪口蹄疫病毒A型(FMD-A)阳性血清、2份猪圆环病毒阳性血清(PCV2)、2份猪繁殖与呼吸综合征阳性血清(PRRS)，分别进行检测。
试纸卡的特异性检测结果如下表(表4)显示，对20份健康猪血清的检测结果显示，7批试纸卡的特异性均为100.0％。对2份猪口蹄疫病毒O型(FMD-O)阳性血清、2份猪口蹄疫病毒A型(FMD-A)阳性血清、2份猪圆环病毒阳性血清(PCV2)、2份猪繁殖与呼吸综合征阳性血清(PRRS)的检测结果均显示为阴性，因此7批试纸卡对这8份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％。
表4特异性试验检测结果
实施例4、与进口试剂盒的符合率试验
ELISA方法是世界动物卫生组织(WOAH)推荐的非洲猪瘟病毒抗体诊断技术。本试验使用按照实施例2的方法制备的7批非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡，与韩国金诺非洲猪瘟抗体检测试剂盒分别检测35份待检猪血清。
符合率试验结果显示(表5)，非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批号为ZM202201)对35份待检猪血清的敏感性为48.6％，进口试剂盒的敏感性为77.1％，两种方法检测结果一致的为21份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为60.0％。
非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批号为ZM202202)对35份待检猪血清的敏感性为42.9％，进口试剂盒的敏感性为77.1％，两种方法检测结果一致的为19份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为54.2％。
非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批号为ZM202203)对35份待检猪血清的敏感性为42.9％，进口试剂盒的敏感性为77.1％，两种方法检测结果一致的为21份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为60.0％。
非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批号为ZM202204)对35份待检猪血清的敏感性为68.6％，进口试剂盒的敏感性为77.1％，两种方法检测结果一致的为26份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为74.3％。
非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批号为ZM202205)对35份待检猪血清的敏感性为60.0％，进口试剂盒的敏感性为77.1％，两种方法检测结果一致的为27份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为77.1％。
非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批号为ZM202206)对35份待检猪血清的敏感性为62.9％，进口试剂盒的敏感性为77.1％，两种方法检测结果一致的为26份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为74.3％。
非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡(批号为ZM202207)对35份待检猪血清的敏感性为82.9％，进口试剂盒的敏感性为77.1％，两种方法检测结果一致的为33份。因此，本发明试剂盒与进口试剂盒的符合率为94.3％，检测结果准确性高，可用于非洲猪瘟抗体检测。
表5符合率试验结果
Claims (9)
1.一种非洲猪瘟病毒总抗体检测胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于，包括背衬以及在背衬上的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫；其特征在于，所述标记物垫包埋有胶体金标记的葡萄球菌A蛋白，所述层析膜上设置有检测线和质控线，所述检测线喷涂有非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。
2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于：当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、以及序列2所示的多肽和序列3所示的多肽中的一种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的三种时，三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1。
3.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于：所述层析膜上的质控线喷涂有山羊抗猪IgG；所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽为化学人工合成得到。
4.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于：所述背衬为聚乙烯背衬。
5.根据权利要求1-5任意一项所述的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于，还包括装载卡壳。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的胶体金免疫层析试纸卡，其特征在于，所述的背衬为聚乙烯材料背衬；
所述的吸水垫的制作材料为吸水滤纸；所述的标记物垫为玻璃纤维素膜；
所述的层析膜为硝酸纤维素膜。
7.权利要求1-6任意一项所述胶体金免疫层析试纸卡在制备特异性检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，特异性检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂盒的待测样品包括但不限于猪全血、猪血清、猪血浆、唾液拭子、乳汁等。
9.根据权利要求的应用，其特征在于，所述试剂盒检测的非洲猪瘟病毒抗体类别包括但不限于IgG、IgA和IgM等，因此该试纸卡检测的敏感性更高。
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