CN116287253A - 一种肺癌分子标志物及其应用 - Google Patents

一种肺癌分子标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116287253A
CN116287253A CN202310147710.6A CN202310147710A CN116287253A CN 116287253 A CN116287253 A CN 116287253A CN 202310147710 A CN202310147710 A CN 202310147710A CN 116287253 A CN116287253 A CN 116287253A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lung cancer
wasf1
expression
atg
metastasis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310147710.6A
Other languages
English (en)
Inventor
周经姣
杨文�
田禹
晏晴
王毅
王仲怡
吴争
刘雁萍
刘雨蝶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Original Assignee
Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University of Science and Engineering WUSE filed Critical Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority to CN202310147710.6A priority Critical patent/CN116287253A/zh
Publication of CN116287253A publication Critical patent/CN116287253A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明公开了一种肺癌分子标志物WASF1及其应用，属于生物医药技术领域。本发明研究发现WASF1在肺癌组织中高表达，WASF1表达量与肺癌临床分期和远端转移存在显著正相关，WASF1表达水平可应用于诊断肺癌的发展进程和不良预后。本发明研究发现WASF1能促进肺癌细胞增殖、侵袭和转移，发现并验证了WASF1的调控机制，验证WASF1作为药物治疗靶点，可应用于筛选抑制WASF1表达的药物制备抗肺癌药物。同时体内和体外实验发现ATG下调WASF1表达，抑制肺癌增殖、浸润和转移，因此，ATG可作为一种抑制WASF1表达的药物，应用于制备治疗肺癌的药物组合物。

Description

一种肺癌分子标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肺癌分子标志物WASF1及其在肺癌诊断和肺癌药物中的应用。
背景技术
据世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)发布的2020年全球癌症负担数据，2020年全世界新增肺癌病例220万，新增肺癌死亡病例180万(远超其他癌症)。肺癌起病隐匿，早期症状不明显，难以诊断，但发展迅速，80％患者确诊时已经处于晚期或发生转移，5年生存率不足20％。
当前肺癌治疗方法包括手术、化疗、放疗、免疫治疗、分子靶向治疗等。手术治疗是治疗肺癌的重要手段，但并不能有效解决晚期患者肿瘤转移的问题。化学治疗往往引起严重临床副作用，如消化系统不良反应、骨髓抑制、泌尿系统毒性反应、肝功能损害等。放射治疗对机体正常组织造成损伤，如造血系统综合征等(闫兰芳,武云.局部晚期非小细胞肺癌治疗现状及展望[J].癌症进展,2021,19(19):1957-1960-1973)。免疫治疗是近年来兴起的治疗方案，如靶向PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂可改善肺癌患者的生存预后，但只有20％-40％患者出现反应，获得疾病长期缓解的患者更少(Reck M,Remon J,HellmannMD.First-Line Immunotherapy for Non-Small-Cell Lung Cancer[J].J ClinOncol.2022,40(6):586-597)。
分子靶向治疗是一种新型的生物治疗模式，它针对可能导致细胞癌变的驱动基因等，在分子水平上阻断肿瘤信号通路，抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，但小分子靶向药物在进行癌症临床治疗中面临很多挑战。一方面，靶向抗癌药物的治疗效率低，仅对有限数量的患者有效，例如，与铂类化疗药物相比，EGFR抑制剂(如吉非替尼和厄洛替尼)可改善肺癌患者的疾病无进展生存时间(progression free survival，PFS)、客观反应率(objective response rate，ORR)、中位生存期和生活质量，但只有不到20％的患者对抑制剂治疗有反应(Thai AA,Solomon BJ,Sequist LV,et al.Lung cancer[J].Lancet.2021；398(10299):535-554.)；另一方面是耐药问题，目前临床上使用EGFR抑制剂有效延长了EGFR突变肺癌患者的PFS，但多数患者在治疗后6～13个月后出现耐药问题，表现为肿瘤进展，该现象被称为“继发性耐药”(Cooper AJ,Sequist LV,Lin JJ.Third-generation EGFRand ALK inhibitors:mechanisms of resistance and management[J].Nat Rev ClinOncol.2022；19(8):499-514.)。
综上所述，肺癌免疫治疗和小分子靶向治疗虽然取得了一些进展，但治疗患者出现长期缓解的比例不高，并且有些患者会产生耐药性。因此，迫切需要开发新的肿瘤分子标志物和分子靶向药物应用于肺癌患者的临床诊断和治疗。WASF1基因(又称WAVE1)是一种蛋白质编码基因，该基因编码的蛋白是Wiskott-Aldrich综合征蛋白(WASP)家族的成员。WASF1基因编码的蛋白由559个氨基酸组成，是一种肌动蛋白的调节因子。然而，截至目前为止，WASF1在肺癌等恶性肿瘤细胞中的表达及作用尚无研究报道。
发明内容
本发明的目的是针对目前肺癌诊断和治疗中，缺乏新型的诊断标志物和药物治疗靶点、缺乏新型的分子靶向药物，现有药物不能有效抑制肺癌进展和转移等问题，提供一种肺癌的新型分子标志物WASF1及其在肿瘤诊断以及抗肿瘤进展和转移药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的：
本发明提供了检测分子标志物的试剂在制备肺癌的诊断或预后评估试剂盒中的应用，所述分子标志物为WASF1；WASF1的NCBI Gene ID为8936。发明人通过分析健康组织和肺癌组织大样本转录组数据与临床分期信息，研究发现WASF1在肺癌组织中表达量显著增高，肺癌组织样本中WASF1的表达量与肺癌的分期呈正相关，在stageⅣ中表达量达到最高；相比未远处转移患者，肺癌发生远处转移患者的肿瘤组织中WASF1的表达水平显著升高，WASF1表达水平可应用于肺癌的诊断和预测。并且WASF1高水平表达与肺癌的不良预后存在显著正相关性，因此WASF1可作为肺癌预后风险因素，具有高预测准确度。本发明研究还发现WASF1能够促进肺癌细胞增殖、侵袭和转移，并验证了WASF1表达的调控机制，WASF1作为新的药物治疗靶点，可应用于筛选抑制WASF1表达的药物、制备治疗肺癌药物组合物；同时，通过体内和体外实验证实ATG下调WASF1的表达，抑制肺癌的增殖、浸润和转移，发现ATG作为一种抑制WASF1表达的药物，可应用于制备治疗肺癌的药物组合物。
进一步，所述在肺癌组织中WASF1表达上调。所述WASF1的表达在肺癌的不同分期程度、转移肺癌中增高。WASF1的表达水平与肺癌的分期呈正相关，在stageⅣ中表达量达到最高；与未远处转移患者比较，远处转移肺癌患者的肿瘤组织中WASF1的表达水平显著升高。所述WASF1在不良预后的肺癌患者中的表达升高，WASF1高水平表达与肺癌的不良预后显著正相关。
进一步，所述试剂包括检测WASF1表达水平的特异性引物，其序列为：
WASF1:
F:5'-GACCGATTGTCTGTTAGTGTCAC-3'(SEQ ID No.1)，
R:5'-GTCGAAAAGCTGCTGATCTTGA-3'(SEQ ID No.2)；
18srRNA:
F:5'-GTTCCGACCATAAACGATGCC-3'(SEQ ID No.3)，
R:5'-TGGTGGTGCCCTTCCGTCAAT-3'(SEQ ID No.4)。
进一步，本发明提供了一种肺癌的诊断或预后评估试剂盒，包括用于检测肿瘤样本中WASF1的表达水平的试剂。
进一步，所述试剂包括检测WASF1表达水平的特异性引物，其序列为：
WASF1:
F:5'-GACCGATTGTCTGTTAGTGTCAC-3'(SEQ ID No.1)，
R:5'-GTCGAAAAGCTGCTGATCTTGA-3'(SEQ ID No.2)；
18srRNA:
F:5'-GTTCCGACCATAAACGATGCC-3'(SEQ ID No.3)，
R:5'-TGGTGGTGCCCTTCCGTCAAT-3'(SEQ ID No.4)。
进一步，本发明提供WASF1的抑制剂在制备治疗肺癌的药物组合物中的应用。
进一步，所述肺癌药物靶点为WASF1，通过筛选抑制WASF1表达的药物可应用于制备治疗肺癌药物组合物。
进一步，所述WASF1的抑制剂为牛蒡子苷元(Arctigenin，ATG)。发明人研究发现，ATG在体外抑制肺癌细胞增殖、侵袭和转移，在小鼠肺癌模型中显著抑制肿瘤的生长、侵袭和转移，延长小鼠生命周期；ATG是一种抑制WASF1表达的药物，可作为肺癌治疗的组合物。
进一步，靶向WASF1转录因子结合位点可用于发展治疗肺癌的药物，WASF1转录因子结合位点序列为：TGCCTGGCAA，TACTGGGAAA，GTCCTGGAAC。检测WASF1启动子表达水平的特异性引物的序列为：
Primer pairs 1
F:5'-GCTGGGATTAAGGCATGTGC-3'，R:5'-TGGGGATGGGATGGGGTAAT-3'。
Primer pairs 2
F:5'-TGGTTGGTTGACCCTTGTGG-3'，R:5'-CGAACCCAACCGAGGAAGTT-3'。
Primer pairs 3
F:5'-TGAGACAAGGTTTCCCCGTG-3'，R:5'-TTTCTGAGTTCGAGGCCAGC-3'。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明发现肺癌患者样本中WASF1的表达量与肺癌的分期呈正相关，在stageⅣ中表达量达到最高；与未远处转移患者相比，肺癌远处转移患者的肿瘤组织中WASF1表达水平显著升高；因此检测WASF1表达水平可应用于预测肺癌的发展进程和转移。
(2)本发明发现高表达水平的WASF1与肺癌的不良预后呈显著正相关，WASF1可作为肺癌预后风险因素，为肺癌患者提供一种预后评估方案。
(3)本发明研究发现WASF1能促进肺癌细胞的增殖、转移和侵袭，发现并验证了调控WASF1表达的关键位点和序列，为肿瘤靶向治疗提供新的靶点；WASF1作为新的药物治疗靶点，可应用于筛选抑制WASF1表达的药物制备治疗肺癌药物组合物。
(4)本发明通过体内和体外实验发现，中药提取物牛蒡子苷元(Arctigenin，ATG)下调WASF1基因的表达，抑制肺癌的增殖、浸润和转移，证实ATG作为一种抑制WASF1表达的药物，可应用于制备治疗肺癌的药物组合物。
附图说明
图1为肺癌患者肿瘤组织和健康对照样本中WASF1表达水平分析结果；
图2为WASF1表达水平与肺癌的分期(stageⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)相关性分析结果；
图3为WASF1表达水平与肺癌的转移(M0、M1)相关性分析结果；
图4为WASF1在肺癌患者中预后分析结果；
图5为肺癌细胞LLC经ATG处理后WASF1基因的表达水平测试结果
图6为肺癌细胞LLC经不同浓度ATG处理后的增殖情况；
图7为ATG处理肺癌细胞LLC细胞72h后细胞形态变化；
图8为肺癌细胞LLC经ATG处理后的迁移情况；
图9为肺癌细胞LLC经ATG处理后的侵袭情况；
图10为ATG给药组和阴性对照组小鼠体内肿瘤生长情况；
图11为ATG给药组和阴性对照组小鼠体内肿瘤对骨组织的浸润情况；
图12为ATG给药组和阴性对照组小鼠体内肿瘤组织中WASF1的表达情况；
图13为ATG给药组和阴性对照组肿瘤模型小鼠的生存曲线；
图14为WASF1启动子序列的富集效率的测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
需要说明的是，下述实施例中：
1.采用的LLC细胞购于上海中科院细胞库，所列出的LLC细胞系均按照现有技术进行培养，所有细胞系均通过中国典型培养物保藏中心(武汉)短串联重复分析鉴定，并使用PCR检测试剂盒验证排除支原体污染，在-80℃中冷冻保存经复苏后用于后续实验。
2.实施例中采用的试剂：CCK-8细胞增殖试剂盒购买自碧云天生物技术有限公司，超纯RNA提取试剂盒购自康为世纪生物技术有限公司，逆转录试剂盒、2×Universal SYBRGreen Fast qPCR Mix试剂盒、ChIP试剂盒、STAT3等抗体购买自爱博泰克生物科技有限公司等。
3.生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在说明书附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism 8.0或SPSS 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05显示具有统计学差异，p＜0.01显示具有显著地统计学差异。***代表P<0.001；**代表P<0.01；*代表P<0.05；ns代表不具有显著差异。
实施例1WASF1在诊断肺癌的进展、浸润、转移以及评估生存预后中的应用
一、在肺癌组织样本中WASF1表达量分析
TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/)获取肺癌的RNA-Seq测序数据和临床数据，包含59例健康肺组织样本和483例肺癌患者肺组织样本的RNA-seq数据。通过RStudio读取RNA-seq数据，过滤去除原始数据中表达量为”0”的基因，通过“edger”分析包采取对数表达比率的加权截断均值(trimmed mean of M values，TMM)归一化方法，对Tumor VS Normal数据进行差异表达分析。为降低假阳性(false discover rate，FDR),p-value用Benjamini–Hochberg(BH)方法校正。分析健康和肺癌患者肺组织样本中基因的表达量，比较WASF1水平在两组间的表达差异。
图1为WASF1在临床肺癌患者肿瘤组织及健康对照中WASF1表达水平统计。通过对肺癌组织及健康组织WASF1表达情况进行分析可知，肺癌组织中WASF1相对表达量显著高于健康组织，*p<0.05。
二、WASF1表达水平与肺癌分期以及转移的相关性
通过RStudio获取肺癌患者肺组织样本中WASF1基因表达量以及临床信息。根据肺癌发展进程(stageⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)进行分组、比较不同Stage组间WASF1表达水平。并将未发生远处转移的肺癌患者与远处转移(M0、M1)肺癌患者进行分组，其中M0是无远处转移(390例)，M1是发生远处转移(49例)；分析两组间WASF1基因表达差异。
图2为WASF1表达水平与肺癌的分期(stageⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)相关性分析结果。通过对肺癌患者各期WASF1的表达水平进行分析可知，WASF1表达水平随着肺癌的进展而上调，在stageⅣ中表达量达到最高。*p<0.05。
图3为WASF1表达水平与肺癌的转移(M0、M1)相关性分析结果，通过对比肺癌发生转移和未转移患者肿瘤组织中WASF1的表达水平，发现肺癌发生转移的肿瘤组织中WASF1表达量中位值约为5，未发生转移的患者肿瘤组织中WASF1表达量中位值约为2，*p<0.05。这说明肺癌转移患者肿瘤组织中WASF1的表达高于未发生转移的肺癌患者，证实WASF1表达水平与肺癌的浸润程度和转移呈高度正相关性。
三、WASF1表达水平用于肺癌患者预后生存时间的预测
获取肺癌患者肿瘤组织中WASF1表达量、临床信息和肺癌患者的生存预后数据。根据WASF1表达量中位数将肺癌患者分为高表达组和低表达组，使用“survival包”计算五年生存率，绘制Kaplan Meier曲线。
图4为WASF1在肺癌患者中预后分析结果。通过比较肺癌组织WASF1高表达和低表达患者的预后生存时间，发现肿瘤组织低表达WASF1的患者其总生存率和生存时间显著高于肿瘤组织中高表达WASF1的患者，**p<0.01，n＝468。结果表明WASF1高表达水平与肺癌的不良预后相关，显示WASF1可作为肺癌预后的风险因素，可预测肺癌患者预后生存时间。
实施例2WASF1抑制剂减少肺癌的增殖、浸润和转移
一、ATG抑制WASF1表达可减少肺癌细胞增殖、侵袭和迁移
1.ATG处理肿瘤细胞，RT-qPCR检测肿瘤细胞WASF1表达水平：
取对数生长期的肺癌细胞接种于6孔培养板，在37℃、5％CO2的培养箱中培养贴壁后加入50μM牛蒡子苷元(Arctigenin，ATG)，对照组(Vehicle)加入等量PBS，培养48小时。TRIzol裂解肺癌细胞，加入氯仿抽提RNA，异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤RNA数次，后用无核酶水溶解。
将定量的RNA进行反转录成cDNA，根据ABScriptⅡRT Mix for qPCR with gDNARemover试剂说明书进行优化和改进，首先按照表1体系进行基因组清除，在37℃，5min，85℃，5min后按照表2的体系配制合成第一条cDNA链，按照25℃，5min，42℃15min，85℃，5sec条件下反应后保存-20℃冰箱。
表1RNA中去除基因组DNA体系表
Figure SMS_1
表2cDNA合成第一链体系表
Figure SMS_2
检测WASF1的转录水平；18SrRNA作为对照。所述引物序列为：
WASF1:
F:5'-GACCGATTGTCTGTTAGTGTCAC-3'(SEQ ID No.1)，
R:5'-GTCGAAAAGCTGCTGATCTTGA-3'(SEQ ID No.2)；
18srRNA:
F:5'-GTTCCGACCATAAACGATGCC-3'(SEQ ID No.3)，
R:5'-TGGTGGTGCCCTTCCGTCAAT-3'(SEQ ID No.4)。
将cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR实验，按照2×Universal SYBR GreenFast qPCR Mix说明书进行优化和改进，按表3冰上配制20μL RT-qPCR体系，按表4程序进行扩增：
表3RT-qPCR配制体系
Figure SMS_3
表4RT-qPCR反应程序
Figure SMS_4
图5为肺癌细胞LLC经ATG处理后WASF1基因的表达水平测试结果，结果显示，ATG能够抑制肺癌细胞LLC中WASF1的基因转录表达，是干扰WASF1表达的潜在药物，***p<0.001，n＝3。
2.Cell Counting Kit 8检测肺癌细胞的增殖：
在96孔板中接种肺癌细胞，培养箱中培养至贴壁后，加入不同浓度ATG处理(20μM、40μM、80μM、100μM)，对照组中加入PBS。培养24h、48h、72h后，向每孔培养基中加入含有10％CCK8溶液的培养基，37℃避光孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度值。
抑制率＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％；细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％；As实验孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液)；Ac对照孔吸光度(含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物)；Ab空白孔吸光度(含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物)。
图6为肺癌细胞LLC经不同浓度ATG处理后的增殖情况，结果显示，ATG以浓度依赖和时间依赖的方式显著抑制肺癌细胞LLC细胞的增殖，*p<0.05，**p<0.01，n＝3。因此，抑制WASF1表达的药物可以用于制备抑制肺癌的药物。
图7为ATG处理肺癌细胞LLC细胞72h后细胞形态变化。分别用阴性对照和50μM ATG处理LLC细胞72h，10×显微镜观察LLC细胞的形态变化，结果显示，肿瘤细胞形态改变，数量减少，ATG抑制LLC细胞增殖。
3.划痕实验检测肺癌细胞的迁移：
肺癌细胞约接种于6孔板孔中，静置于37℃培养箱培养24h，用枪头垂直于细胞平面，在细胞上划痕。加入50μM ATG孵育细胞，同时加入等量PBS为对照，分别在0h与48h拍照观察细胞迁移程度，获得的图片用Image J软件进行处理后用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。迁移率＝[(0h划痕宽度-培养后划痕宽度)/0h划痕宽度]×100％
图8为肺癌细胞LLC经ATG处理后的迁移情况，结果显示，与阴性对照相比，抑制WASF1的药物ATG显著抑制LLC的迁移，****p<0.0001，n＝3；说明抑制WASF1的药物ATG能够在体外抑制肺癌细胞LLC的迁移。
4.Transwell实验检测肺癌细胞的侵袭能力：
无血清DMEM孵育Transwell小室后消化细胞，计数后制备1×105cell/mL浓度的细胞悬液。在Transwell小室中加入200μL的细胞悬液，下室加入600μL含15％ FBS的培养基，同时在下室中加入50μM ATG，对照组中加入PBS，静置于37℃培养箱培养48h。4％多聚甲醛固定细胞，结晶紫工作液避光染色15-30分钟。10×显微镜下随即五个视野观察分析侵袭和迁移的细胞数量，采集代表性图像，统计穿过小室的细胞数目，并进行统计学分析。
图9为肺癌细胞LLC经ATG处理后的侵袭情况，可以看出，以阴性对照组为参照，相对侵袭率为1，ATG组细胞相对侵袭率小于0.5，**p<0.01，n＝3，ATG处理的LLC细胞的侵袭率显著下调，说明ATG能够抑制体外肺癌细胞LLC的侵袭。
二、ATG抑制WASF1表达，小鼠肺癌组织增殖减少、浸润下降
1.小鼠肿瘤模型构建、ATG药物治疗以及活体成像：
将肺癌细胞接种于六孔板，加入GFP-luci-puro三标病毒浓缩液，获得luci-GFP-puro标记肺癌细胞。选取3-5周龄小鼠(购自武汉鼠贝利)构建肺癌骨转移模型。麻醉小鼠后，用500ul注射器取80ul(8x105个细胞)luci-GFP-puro标记的肺癌细胞悬液，注射于小鼠胫骨中，对照组注射等量PBS。成瘤后，将小鼠随机分为2组(阴性对照组和ATG给药组)，每组10只。组1小鼠给予等量PBS治疗；组2小鼠腹腔注射ATG(25mg/kg)进行治疗，连续给药3周。小鼠治疗期间腹腔注射D-luciferin，麻醉后放入成像机器进行活体成像，检测胫骨荧光强度，追踪监测肿瘤生长。
图10为ATG给药组和阴性对照组肺癌转移小鼠体内肿瘤生长情况，可以看出，与阴性对照组相比，ATG给药组明显减缓肿瘤的生长速度(n＝10)，说明抑制ATG在体内抑制肺癌转移小鼠肿瘤的增殖。
2.小鼠X-ray成像检测肿瘤的浸润：
分别于接种后第7，14，21天进行小鼠双侧后肢X线摄片，将小鼠麻醉后，取仰卧位，用小动物活体成像设备进行X-ray成像：电压50kV，电流45mA，曝光2ms。观察小鼠胫骨部位结构的改变，评估骨组织破坏程度。
图11为ATG给药组和阴性对照组肺癌转移小鼠体内肿瘤对骨组织的浸润情况，可以看出，阴性对照组中小鼠的胫骨出现明显的溶骨性破坏，ATG给药组中小鼠的胫骨结构比较完整(n＝10)，说明ATG能够抑制体内肺癌细胞对骨的浸润，明显抑制骨溶解。
3.RT-qPCR检测肿瘤组织WASF1表达水平：
图12为ATG给药组和阴性对照组肺癌转移小鼠体内肿瘤组织中WASF1的表达情况，可以看出，与阴性对照组相比，ATG给药组明显下调肺癌转移小鼠肿瘤组织中WASF1的表达，**p<0.01，n＝10，说明ATG在体内肺癌转移小鼠中明显抑制WASF1基因的转录。
4.小鼠生存曲线：
详细记录肺癌骨转移小鼠阴性对照组和ATG给药组在治疗期间的体重，测量小鼠肿瘤大小，并且在治疗结束观察记录小鼠生存时间。在GraphPad Prism 8中绘制小鼠的生存曲线。
图13为ATG给药组和阴性对照组小鼠的生存曲线，可以看出，ATG给药组明显延长了肺癌转移小鼠的生命周期，提高肺癌转移小鼠的生存率。
三、调控WASF1表达的转录因子和结合位点的分析和验证
1.JASPAR网站预测调控WASF1表达的转录因子及其结合位点：
通过GENEBANK数据库得到Wasf1基因的启动子序列，即基因的上游2kb序列。通过JASPAR数据库(https://jaspar.genereg.net/)的Vertebrata模块获得转录因子STAT3的基序序列，预测获得STAT3与WASF1基因启动子的结合位点，如表5所示。
表5转录因子STAT3与Wasf1预测结合位点
Figure SMS_5
2.染色质免疫沉淀反应：
根据染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒说明书进行优化和改进。使用终浓度为0.75％的甲醛溶液固定肺癌细胞，使染色质与蛋白成分交联。收集细胞后离心，裂解细胞后，超声将染色质片段化。
在各个目的蛋白样品管中加入STAT3抗体对应抗体，在各个阴性参照管中加入正常同型IgG，每个沉淀反应所需对应抗体量为5μg。在4℃的转子上孵育至少3小时，取5％样品作为Input对照，不进行免疫沉淀反应。吸取全部反应液加入到对应标记的磁珠管中，在4℃的转子上孵育2小时。将离心管放在磁性分离架上，将蛋白A/G磁珠吸附至管壁，缓冲液清洗磁珠。
通过ChIP洗脱缓冲液洗，将染色质从抗体-蛋白A/G磁珠上洗脱，解交联。将样品溶液加入吸附柱中，漂洗，离心过柱，向吸附膜中间位置悬空滴加洗脱缓冲液TB洗脱DNA溶液以得到纯化的DNA。
3.qPCR验证WASF1的启动子序列的富集效率：
使用Primer3Plus在线网站根据得到的结合位点序列设计qPCR引物。序列如下：
Primer pairs 1
F:5'-GCTGGGATTAAGGCATGTGC-3'，R:5'-TGGGGATGGGATGGGGTAAT-3'。
Primer pairs 2
F:5'-TGGTTGGTTGACCCTTGTGG-3'，R:5'-CGAACCCAACCGAGGAAGTT-3'。
Primer pairs 3
F:5'-TGAGACAAGGTTTCCCCGTG-3'，R:5'-TTTCTGAGTTCGAGGCCAGC-3'。
qPCR实验按照2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix说明书进行操作。ChIP-qPCR富集效率利用下列公式计算：Percentage of Input＝5％×2C[T]Input Sample–C[T]IP Sample
图14为WASF1启动子序列的富集效率的测试结果，可以看出，STAT3下拉的DNA序列中，WASF1的启动子序列富集效率高达0.6％，*p<0.05，***p<0.001，n＝3。证明转录因子STAT3能够调控WASF1基因的转录表达。
综合上述结果说明，WASF1在肺癌的发生发展中表达量上调，WASF1高表达与肺癌的临床分期、转移、不良预后呈显著正相关，WASF1表达水平可应用于预测肺癌的发展进程和预后生存时间。在此基础上，本发明研究发现WASF1促进肺癌细胞的增殖、侵袭和转移，还发现并验证了调控WASF1表达的转录因子及其结合位点。WASF1作为新的药物治疗靶点，可应用于筛选抑制WASF1表达的药物制备治疗肺癌药物。同时通过体内和体外实验发现，ATG下调WASF1的表达，抑制肺癌的增殖、侵袭和转移。ATG可作为一种抑制WASF1表达的药物，应用于制备治疗肺癌的药物组合物。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (7)

1.检测分子标志物的试剂在制备肺癌的诊断或预后评估试剂盒中的应用，所述分子标志物为WASF1。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述WASF1在肺癌组织中的表达上调，WASF1表达与肺癌临床分期、肺癌转移和不良预后显著正相关。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测WASF1表达水平的特异性引物，其序列为：
F:5'-GACCGATTGTCTGTTAGTGTCAC-3'，
R:5'-GTCGAAAAGCTGCTGATCTTGA-3'；
18SrRNA引物序列为:
F:5'-GTTCCGACCATAAACGATGCC-3'，
R:5'-TGGTGGTGCCCTTCCGTCAAT-3'。
4.一种肺癌的诊断或预后评估试剂盒，其特征在于，包括用于检测生物样本中WASF1表达水平的试剂。
5.如权利要求4所述的肺癌诊断或预后评估试剂盒，其特征在于，所述试剂包括检测WASF1表达水平的特异性引物，其序列为：
F:5'-GACCGATTGTCTGTTAGTGTCAC-3'，
R:5'-GTCGAAAAGCTGCTGATCTTGA-3'；
18SrRNA引物序列为:
F:5'-GTTCCGACCATAAACGATGCC-3'，
R:5'-TGGTGGTGCCCTTCCGTCAAT-3'。
6.WASF1的抑制剂在制备治疗肺癌的药物组合物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述WASF1的抑制剂为牛蒡子苷元。
CN202310147710.6A 2023-02-22 2023-02-22 一种肺癌分子标志物及其应用 Pending CN116287253A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310147710.6A CN116287253A (zh) 2023-02-22 2023-02-22 一种肺癌分子标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310147710.6A CN116287253A (zh) 2023-02-22 2023-02-22 一种肺癌分子标志物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116287253A true CN116287253A (zh) 2023-06-23

Family

ID=86812415

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310147710.6A Pending CN116287253A (zh) 2023-02-22 2023-02-22 一种肺癌分子标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116287253A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1852974A (zh) * 2003-06-09 2006-10-25 密歇根大学董事会 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法
CN101283106A (zh) * 2005-07-27 2008-10-08 肿瘤疗法科学股份有限公司 小细胞肺癌的诊断方法
CN102526731A (zh) * 2010-12-27 2012-07-04 鲁南制药集团股份有限公司 一种含有牛蒡苷元的药物组合物
CN103417554A (zh) * 2012-05-22 2013-12-04 中国科学院上海药物研究所 一种抗肿瘤的药物组合物及其应用
CN108660212A (zh) * 2018-05-25 2018-10-16 武汉科技大学 Wdr1基因在制备非小细胞肺癌治疗和检测产品中的应用
CN113293208A (zh) * 2020-02-21 2021-08-24 中国农业大学 与肺癌增殖和转移相关的分子标志物及其应用
WO2022053065A1 (zh) * 2020-09-14 2022-03-17 信达生物制药(苏州)有限公司 用于预测或评估肺癌患者的生物标志物、检测方法及应用
CN114522168A (zh) * 2022-03-09 2022-05-24 山东第一医科大学附属肿瘤医院(山东省肿瘤防治研究院、山东省肿瘤医院) 一种含治疗胃癌的药物组合物、应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1852974A (zh) * 2003-06-09 2006-10-25 密歇根大学董事会 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法
CN101283106A (zh) * 2005-07-27 2008-10-08 肿瘤疗法科学股份有限公司 小细胞肺癌的诊断方法
US20090317392A1 (en) * 2005-07-27 2009-12-24 Yusuke Nakamura Method of diagnosing small cell lung cancer
CN102526731A (zh) * 2010-12-27 2012-07-04 鲁南制药集团股份有限公司 一种含有牛蒡苷元的药物组合物
CN103417554A (zh) * 2012-05-22 2013-12-04 中国科学院上海药物研究所 一种抗肿瘤的药物组合物及其应用
CN108660212A (zh) * 2018-05-25 2018-10-16 武汉科技大学 Wdr1基因在制备非小细胞肺癌治疗和检测产品中的应用
CN113293208A (zh) * 2020-02-21 2021-08-24 中国农业大学 与肺癌增殖和转移相关的分子标志物及其应用
WO2022053065A1 (zh) * 2020-09-14 2022-03-17 信达生物制药(苏州)有限公司 用于预测或评估肺癌患者的生物标志物、检测方法及应用
CN114522168A (zh) * 2022-03-09 2022-05-24 山东第一医科大学附属肿瘤医院(山东省肿瘤防治研究院、山东省肿瘤医院) 一种含治疗胃癌的药物组合物、应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王潞: "牛蒡子苷及牛蒡苷子苷元的药理作用研究进展", 《中草药》, vol. 39, no. 3, 12 March 2008 (2008-03-12), pages 467 - 470 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111778338B (zh) 一种环状rna生物标志物的应用
Han et al. Low-expression of TMEM100 is associated with poor prognosis in non-small-cell lung cancer
CN111304326B (zh) 检测及靶向lncRNA生物标志物的试剂及其在肝细胞癌中的应用
CN107519193B (zh) 食管鳞癌早期分子诊断标志物及其应用
CN109055564B (zh) 用于慢性淋巴细胞白血病诊断及预后评估的CircRNA标志物
CN114427003B (zh) Nhp2在预测癌症放疗敏感性和预后中的应用
CN116287253A (zh) 一种肺癌分子标志物及其应用
CN111979315A (zh) 环状tp63作为肺鳞癌诊断或治疗靶点的应用
CN111733248B (zh) Loc158435作为诊治喉鳞癌的生物标志物的应用
CN110468134B (zh) 一种与NSCLC相关的tRF及其应用
CN109929844B (zh) 一种胶质瘤预后标志物cpvl抑制剂及其应用
CN111733247A (zh) 长链非编码rna在癌症诊治中的应用
CN112553342B (zh) 一种肺腺癌诊断的生物标志物及其应用
CN110093419B (zh) 环状rna的应用、试剂盒和药物组合物及其应用
CN113699233B (zh) Troap在制备肾细胞癌预后产品及治疗药物中的用途
AU2021100731A4 (en) A Use of PIWI interacting RNA piR-hsa-211106
CN111733249B (zh) 喉癌发生发展相关分子标志物
CN111733246B (zh) 用于癌症早期诊断和治疗的分子
CN111635946B (zh) 一种诊治胶质瘤的分子生物标志物及其应用
EP4006166A2 (en) Tumour marker aquaporin 2 protein and application thereof
US20230250425A1 (en) USE OF PIWI-INTERACTING RNA piR-hsa-211106
CN110541034B (zh) Linc01992在乳腺癌诊疗中的应用
CN107385082B (zh) Mst1p9基因及其表达产物在肾癌中的应用
CN113564255A (zh) 一种lncRNA NEAT1_1的应用
CN117230199A (zh) Mis18a基因在制备肺癌诊断、治疗或预后评估产品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination