CN116287233A - 基因标志物在非小细胞肺癌预后评估中的应用、检测装置以及计算机可读介质 - Google Patents

基因标志物在非小细胞肺癌预后评估中的应用、检测装置以及计算机可读介质 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于非小细胞肺癌局部复发风险评估的标志物，属于肿瘤医学技术领域。本发明利用单因素和多因素Cox回归分析对非小细胞肺癌受试者的临床和基因组测序数据进行分析筛选，获得与受试者无局部复发生存期相关的重要特征，并将EGFR突变状态、CDKN2A突变状态、肿瘤组织最小突变丰度与最大突变丰度比值、及序列血浆ctDNA状态用于构建非小细胞肺癌局部复发风险评估的Cox回归分析预测模型。所述预测模型可作为早中期非小细胞肺癌受试者术后局部复发风险的预测工具，对指导临床治疗策略及后续的个性化随访方案具有重要价值。

Description

基因标志物在非小细胞肺癌预后评估中的应用、检测装置以 及计算机可读介质
技术领域
本发明涉及用于非小细胞肺癌术后局部复发风险评估的标志物，属于肿瘤医学技术领域。
背景技术
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理亚型，约占85％，主要包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌[2]。近年来，非小细胞肺癌的治疗取得了很大的进展，随着EGFR-TKIs、ALK-TKIs等靶向药物和免疫检查点抑制剂在NSCLC中的使用，NSCLC已成为精确医学治疗领域发展最快的肿瘤类型[3-6]。根治性手术切除是早中期肺癌受试者的主要治疗手段[7,8]，但早中期NSCLC的5年生存率约为38％-74％，这意味着26％-62％的术后NSCLC受试者将在5年内发生局部复发或远处转移[9]。为了克服术后肿瘤复发的风险，已有的临床试验表明以顺铂为基础的化疗可使II期和IIIA期受试者生存获益[10,11]。有研究表明，术后放射治疗(PORT)降低了受试者局部复发的风险，并可使N2受试者生存获益。然而，PORT在肺癌术后治疗中的地位仍然存在争议，且不建议N0和N1受试者接受PORT治疗[12-14]。因此，临床上亟需明确与早中期NSCLC受试者术后局部复发相关的预测因素，以便能够选择适合辅助放疗的受试者。
NSCLC具有高度临床和病理异质性，仅基于临床及病理特征，如临床分期、组织学病理类型、分化程度等并不能准确评估NSCLC受试者的局部复发风险。近年来，随着分子检测技术的进步，临床对肺癌生物学的理解逐渐加深，多种可能在NSCLC中具有预测复发风险作用的分子标志物逐渐涌现。既往研究发现，KRAS G12C突变与I-III期肺腺癌根治术后较高的复发风险相关[15]；MUC4突变与I期NSCLC受试者术后早期复发显著相关[16]。此外，循环肿瘤DNA(ctDNA)是一种具备广泛应用前景的非侵入性生物标志物，基于ctDNA的MRD(微小残留病灶)检测在多种实体瘤中都能较好的预测受试者的复发风险。相关研究表明，术后ctDNA阳性是I-III期NSCLC受试者无复发生存期(Recurrence free survival，RFS)缩短的独立危险因素，ctDNA状态在多因素Cox分析中对RFS预测的相对贡献度高于TNM分期等临床变量的总和[17]。然而，尚未有研究报道与早中期受试者术后局部复发风险相关的分子标志物。
参考文献
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发明内容
本发明所要解决的是对于NSCLC局部复发风险缺少较好的标志物的问题，提出了具有较好预测效果的NSCLC术后局部复发风险分子标志物。
本发明共纳入118例接受手术切除的NSCLC受试者，对受试者的肿瘤组织和动态监测血浆样本进行靶向NGS检测。通过对受试者的临床特征数据、基因特征数据和ctDNA特征数据进行分析，筛选得到与受试者术后无局部复发生存期(LRFS)显著相关的变量，并基于这些变量构建能够有效预测NSCLC受试者术后局部复发风险的模型。
本发明将受试者的临床特征、基因组特征(肿瘤组织中频率大于5％的基因变异以及肿瘤组织中最小突变丰度与最大突变丰度比值)和多个时间点的ctDNA状态纳入单因素Cox回归分析，发现性别、吸烟与否、淋巴结状态、肿瘤组织EGFR突变状态、ERBB2变异状态、CDKN2A突变状态、TP53突变状态、最小突变丰度与最大突变丰度比值，以及序列血浆ctDNA状态跟局部复发风险相关(p<0.050)。
本发明基于单因素Cox回归分析筛选到的重要特征变量构建特征数不同的概率预测模型，选择性能较优的概率预测模型建立NSCLC受试者术后局部复发风险预测列线图模型，该模型简单直观，性能优异。
检测基因标志物的试剂在制备非小细胞肺癌预后评估试剂中的应用，所述的非小细胞肺癌预后是指非小细胞肺癌术后局部复发风险；
所述的基因标志物包括EGFR基因、CDKN2A基因、肿瘤组织中最小基因突变丰度与最大基因突变丰度比值和血浆ctDNA突变状态中的一种或者几种的组合。
检测EGFR基因的试剂是对EGFR基因的突变进行检测的试剂；检测CDKN2A基因的试剂是对CDKN2A基因的突变进行检测的试剂。
一种非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估装置，包括：
测序模块，用于对组织样本和血浆ctDNA样本进行测序，获得测序信息；
比对模块，用于根据测序模块获得的测序信息比对于参考基因组，获得组织样本是否发生突变以及血浆ctDNA中是否发生基因突变；
计算模块，用于计算出组织样本中的最小基因突变丰度与最大基因突变丰度的比值；
判定模块，用于根据比对模块和计算模块获得的结果，根据如下公式计算风险评分并进行判定：
风险评分＝A×EGFR基因突变状态+B×CDKN2A基因突变状态+C×丰度比值+D×血浆ctDNA突变状态；A、B、C、D为系数；
当风险评分大于设定阈值时认为存在风险。
当EGFR基因不存在突变时，取值0，否则取值1；
当CDKN2A基因存在突变时，取值1，否则取值0；
丰度比值≤0.10，取值1，否则取值0；
血浆ctDNA存在突变时，取值1，否则取值0。
还包括：血浆cfDNA样本来源时间判定模块，用于对进行血浆cfDNA样本的采集时间进行获取，若采集于术后任一时间，则进入比对模块处理。
一种计算机可读取介质，其记载有可以运行以下非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估步骤的计算机程序：
步骤S1，对组织样本进行测序，并对比至参考基因组，获取EGFR基因和CDKN2A基因突变状态；
步骤S2，对受试者血浆cfDNA进行测序，并对比至参考基因组，获取血浆cfDNA突变状态；
步骤S3，计算出组织样本中的最小基因突变丰度与最大基因突变丰度的比值；
步骤S4，根据下式进行计算：
风险评分＝A×EGFR基因突变状态+B×CDKN2A基因突变状态+C×丰度比值+D×血浆ctDNA突变状态；A、B、C、D为系数；
当风险评分大于设定阈值时认为存在风险。
A＝20-25，B＝15-20，C＝8-12，D＝43-47。
风险评分≤78，复发概率≤60％；风险评分为79～82，复发概率>60％；风险评分为83～86，复发概率>70％；风险评分>87，复发概率为>80％。
所述的步骤S2中，是在受试者术后任一时间或者术前对血浆cfDNA进行测序。
一种非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估装置，包括：
测序模块，用于对组织样本进行测序，获得测序信息；
比对模块，用于根据测序模块获得的测序信息比对于参考基因组，获得EGFR基因是否发生突变、CDKN2A基因是否发生突变；
判定模块，用于根据比对模块获得的结果，若EGFR基因不存在突变或者CDKN2A基因存在突变时，认为存在风险。
一种非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估装置，包括：
测序模块，用于对血浆ctDNA样本进行测序进行测序，获得测序信息；
比对模块，用于根据测序模块获得的测序信息比对于参考基因组，获得血浆ctDNA中是否发生基因突变；
判定模块，用于根据比对模块获得的结果，若血浆cfDNA存在基因突变，认为存在风险。
一种非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估装置，包括：
测序模块，用于对组织样本进行测序，获得测序信息；
比对模块，用于根据测序模块获得的测序信息比对于参考基因组，获得EGFR基因是否发生突变、CDKN2A基因是否发生突变以及血浆ctDNA中是否发生基因突变；
计算模块，用于计算出组织样本中的最小基因突变丰度与最大基因突变丰度的比值；
判定模块，用于根据计算模块获得的结果，若丰度比值≤0.10，认为存在风险。
一种计算机可读取介质，其记载有可以运行以下非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估步骤的计算机程序：
步骤S1，对组织样本进行测序，并对比至参考基因组，获取基因突变信息；
步骤S2，若EGFR基因不存在突变或者CDKN2A基因存在突变时，认为存在风险。
一种计算机可读取介质，其记载有可以运行以下非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估步骤的计算机程序：
步骤S1，对受试者血浆cfDNA进行测序，并对比至参考基因组，获取血浆cfDNA突变状态；
步骤S2，若血浆cfDNA存在基因突变，认为存在风险。
所述的受试者血浆cfDNA采集于术后任一时间或者术前。
一种计算机可读取介质，其记载有可以运行以下非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估步骤的计算机程序：
步骤S1，对组织样本进行测序，并对比至参考基因组，获取基因突变信息；
步骤S2，计算出组织样本中的最小基因突变丰度与最大基因突变丰度的比值，若丰度比值≤0.10，认为存在风险。
附图说明
图1是118例非小细胞肺癌受试者肿瘤组织样本的基因变异图谱。
图2是TP53基因的生存曲线图。
图3是不同阈值下肿瘤组织中最小突变丰度与最大突变丰度比值对无局部复发生存时间影响的森林图。
图4是以0.10作为最小突变丰度与最大突变丰度比值的阈值，比对不同分组患者的无局部复发生存时间生存曲线。
图5是基于EGFR突变状态、CDKN2A突变状态、最小突变丰度与最大突变丰度比值、及序列血浆ctDNA状态所构建的Cox回归模型的可视化列线图。
图6是非小细胞肺癌术后局部复发风险预测模型的ROC曲线。
具体实施方式
本发明共纳入118例接受手术切除的非小细胞肺癌(NSCLC)受试者，对受试者的肿瘤组织和动态监测血浆样本进行靶向NGS检测。通过对受试者的临床特征数据、基因特征数据和ctDNA特征数据进行单因素和多因素Cox回归分析，4个分子特征被证明是NSCLC受试者无局部复发生存期(LRFS)的独立预测生物标志物。基于单因素Cox回归分析筛选到的重要特征变量构建特征数不同的概率预测模型，选择性能较优的概率预测模型建立NSCLC受试者术后局部复发风险预测列线图模型，并进行模型性能验证。
术语：
本发明中所述的“基因变异”包含以下几种情况：
基因突变：包括错义突变、无义突变、剪切突变、移码突变、非移码突变、大片段插入缺失突变和启动子突变等。
基因拷贝数变异：染色体局部区域发生扩增或缺失，导致了编码蛋白过表达或表达减少的染色体局部区域基因拷贝数变异(CNV)，如ERBB2基因扩增。
基因融合：属于结构变异的一种，由于染色体易位、缺失或倒置，导致两个基因部分基因序列相互融合。
本发明中所述的“序列血浆ctDNA阳性”是指受试者术后多点采血样本中，任一术后血浆ctDNA样本中检测到匹配肿瘤组织样本的突变。
本发明中“局部复发”是指肺癌肿瘤经手术切除后在相同位置上重新生长的相同性质的肿瘤。
本发明中“无局部复发生存期(LRFS)”是计算从NSCLC受试者根治性手术切除到局部复发的时间。
受试者基本信息和样本情况
受试者基本信息：本发明共纳入118例NSCLC受试者，包括79例肺腺癌、34例肺鳞癌、2例肺腺鳞癌和3例肺大细胞神经内分泌癌。受试者年龄范围为18岁至88岁，男性受试者占63.6％，55.9％的受试者有吸烟史，Ⅱ～Ⅲ期占82.2％。所有受试者均接受根治性手术治疗，其中74.5％的受试者进行了术后辅助治疗。截止末次随访，共22例(18.6％)的受试者发生局部复发，中位无局部复发生存期(LRFS)尚未达到。
受试者样本情况：本发明纳入受试者手术组织和术前血作为基线样本；术后1个月内、辅助治疗后及术后6-36个月(每3个月一次)的外周血作为动态监测样本。组织样本采用南京世和基因生物技术股份有限公司自主研发的
Figure SMS_1
panel进行靶向NGS检测(表1)，血浆样本采用南京世和基因生物技术股份有限公司自主研发的
Figure SMS_2
panel进行超高灵敏度检测(表2)。
表1
Figure SMS_3
panel基因列表
Figure SMS_4
Figure SMS_5
Figure SMS_6
表2
Figure SMS_7
panel基因列表
AKT1 AKT2 AKT3 ALK APC AR TSC2
ARAF ARID1A ARID2 ASXL1 ATM ATR TYMS
ATRX AXL BCL2L11 BRAF BRCA1 BRIP1 U2AF1
BTK CD274 CD74 CDA CDH1 CDK4 UGT1A1
CDK6 CDK8 CDKN1B CDKN2A CDKN2B CHEK2 VEGFA
CREBBP CTNNB1 CYLD CYP2B6 CYP2C19 CYP2D6 WRN
CYP3A4 CYP3A5 DDR2 DHFR DNMT3A DPYD XRCC1
EGFR ERBB2 ERBB3 ERBB4 ERCC1 ERCC2 STK11
ERCC4 FAT1 FBXW7 FGFR1 FGFR3 FLT4 TET2
FRG1 GATA4 GNAS GRIN2A GSTM1 GSTP1 TGFBR2
GSTT1 HDAC9 HGF HRAS IDH1 IDH2 TP53
JAK1 JAK2 KDR KEAP1 KIT KMT2A TPMT
KMT2C KMT2D KRAS LRP1B LZTR1 MAP2K1 TSC1
MAP2K2 MED12 MET MLH1 MTHFR MTOR SMAD4
MYC NBN NF1 NF2 NFE2L2 NOTCH1 SMARCA4
NQO1 NRAS NTRK1 NTRK3 PBRM1 PDCD1 SMARCB1
PDCD1LG2 PDGFRA PDGFRB PIK3CA PIK3CD PIK3R1 SOX2
PTEN PTPN11 QKI RAF1 RB1 RECQL4 STAG2
RELN RET RHOA RICTOR ROS1 SBDS STAT3
SDC4 SETD2 SF3B1 SLC34A2 SMAD2 SMAD3
鉴定与NSCLC无局部复发生存期相关的临床特征
首先，我们通过单因素Cox分析，评估了NSCLC受试者年龄、性别和病理TNM分期等不同的临床特征与LRFS之间的关系。如表3所示，男性受试者往往具有更高的局部复发风险(p＝0.023)，吸烟受试者的局部复发风险较非吸烟者显著更高(p＝0.027)。此外，淋巴结状态呈阳性的受试者较阴性受试者局部复发风险具有更高的趋势(p＝0.061)，该特征也是目前临床上较为公认的早中期NSCLC受试者术后复发高危临床因素。
表3单因素Cox分析筛选NSCLC无局部复发生存期相关临床特征
Figure SMS_8
Figure SMS_9
鉴定与NSCLC无局部复发生存期相关的基因组特征
118例NSCLC受试者可获得肿瘤组织样本，我们对肿瘤组织样本的基因图谱进行了绘制和分析(见图1)，同时进一步探究基于组织测序的基因变异和肿瘤异质性等基因组特征对受试者LRFS的影响。
基因变异对LRFS的影响：118例组织样本中合计检测到374个基因变异，包括58个拷贝数变异、9个基因融合和307个非同义突变，平均每人2.6(307/118)个突变。常见高频变异基因与既往报道较为一致，包括TP53(66.9％)、EGFR(39.0％)、CDKN2A(14.4％)、KRAS(12.7％)、KEAP1(11.0％)、PIK3CA(10.2％)和LRP1B(9.3％)等。本发明通过单因素Cox分析筛选体细胞变异频率大于5％的16个基因与LRFS的相关性，筛选结果见表4，未发生EGFR突变，以及携带TP53突变、ERBB2变异(包括扩增和突变)和CDKN2A突变的受试者局部复发风险更高(p<0.050)。
表4单因素Cox分析筛选NSCLC无局部复发生存期相关基因变异
Figure SMS_10
Figure SMS_11
*表示变异类型包括基因突变和拷贝数变异
肿瘤异质性对LRFS的影响：NSCLC是一种高度异质性疾病。本发明通过计算肿瘤组织中最小突变丰度与最大突变丰度比值(MinVAF/MaxVAF)来评估受试者的肿瘤异质性，最小突变丰度与最大突变丰度比值越小，肿瘤异质性越大。我们通过设置不同阈值来研究肿瘤组织中最小突变丰度与最大突变丰度比值与受试者LRFS的相关性，结果以森林图形式展示，见图3。结果显示，肿瘤组织中最小突变丰度与最大突变丰度比值>0.10的受试者局部复发风险显著更低(p＝0.001)，生存曲线见图4。
鉴定与NSCLC无局部复发生存期相关的ctDNA特征
118例NSCLC受试者可获得术前血浆样本，114例受试者可获得术后1个月内血浆样本，95例受试者可获得根治性治疗后血浆样本(未辅助治疗受试者为术后1个月内血浆，行辅助治疗受试者为治疗完成后4个月内的血浆)，通过单因素Cox方法分析单个时间点ctDNA状态与LRFS的相关性。如表5所示，术前、术后1个月内和根治性治疗后ctDNA阳性的受试者局部复发风险均显著更高(p<0.001)。此外，ctDNA动态变化也可预测受试者LRFS，54例序列血浆ctDNA阳性(在术后监测期间任何时间点检测到ctDNA阳性)受试者的LRFS显著低于序列血浆阴性(术后ctDNA始终为阴性)受试者(n＝64)，且序列血浆ctDNA状态较单个时间点对LRFS的区分性更优，HR最大达33.59，p<0.001。
表5单因素Cox分析筛选NSCLC无局部复发生存期相关ctDNA特征
不同时间点ctDNA状态 HR(95％CI) p值
术前ctDNA状态：阳性vs.阴性 4.53(1.34-15.35) 0.008
术后1个月ctDNA状态：阳性vs.阴性 3.12(1.33-7.33) 0.006
根治性治疗后ctDNA状态：阳性vs.阴性 8.11(3.31-19.82) <0.001
序列血浆ctDNA状态：阳性vs.阴性 33.59(4.51-250.04) <0.001
Cox回归模型的构建和验证
基于上述单因素Cox回归分析筛选得到的9个LRFS影响因素(包括受试者性别、吸烟与否、淋巴结状态，肿瘤组织EGFR突变状态、ERBB2变异状态、CDKN2A突变状态、TP53突变状态、最小突变丰度与最大突变丰度比值，以及序列血浆ctDNA状态)，我们尝试各种组合构建LRFS预测模型来评估NSCLC受试者的术后局部复发风险，并通过计算各组合的AIC值来评价各模型性能，AIC值越小，模型性能越好。如表7所示，基于EGFR突变状态、CDKN2A突变状态、最小突变丰度与最大突变丰度比值、序列血浆ctDNA状态构建的模型AIC值最小。因此，本发明基于这4个特征构建了预测非小细胞肺癌术后12个月局部复发风险的预测模型，并通过列线图进行公式可视化展示，见图5。绘制从变量到“点轴”的垂直线来确定每个因素的得分(最小突变丰度与最大突变丰度比值：大于0.10得0分，反之得22分；EGFR基因：突变得0分，拷贝数变异/融合/野生型得17分；CDKN2A基因：突变得10分，野生型得0分；序列血浆ctDNA：阳性得45分，阴性得0分)，通过将分值相加并在风险评分轴上定位，获得术后12个月局部复发概率。风险评分≤78，复发概率≤60％；风险评分为79～82，复发概率>60％；风险评分为83～86，复发概率>70％；风险评分>87，复发概率为>80％。
表6基于各种组合的LRFS预测模型效果比较
Figure SMS_12
Figure SMS_13
最后，应用c-index值和ROC曲线评估该列线图模型的预测能力。本发明构建模型的c-index值为0.866；并采用该模型对术后12个月、18个月、24个月的局部复发进行预测，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.921、0.894、0.894，均大于0.89，且预测术后12个月的局部复发情况最优(见图6)。以上结果表明本发明建立的非小细胞肺癌局部复发风险预测模型预测局部复发性能高，在指导非小细胞肺癌随访管理计划的制定具有一定的临床应用价值。

Claims (8)

1.检测基因标志物的试剂在制备非小细胞肺癌预后评估试剂中的应用，其特征在于，所述的非小细胞肺癌预后是指非小细胞肺癌术后局部复发风险；
所述的基因标志物包括EGFR基因、CDKN2A基因、肿瘤组织中最小基因突变丰度与最大基因突变丰度比值和血浆ctDNA突变状态中的一种或者几种的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测EGFR基因的试剂是对EGFR基因的突变进行检测的试剂；检测CDKN2A基因的试剂是对CDKN2A基因的突变进行检测的试剂。
3.一种非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估装置，其特征在于，包括：
测序模块，用于对组织样本和血浆ctDNA样本进行测序，获得测序信息；
比对模块，用于根据测序模块获得的测序信息比对于参考基因组，获得组织样本是否发生突变以及血浆ctDNA中是否发生基因突变；
计算模块，用于计算出组织样本中的最小基因突变丰度与最大基因突变丰度的比值；
判定模块，用于根据比对模块和计算模块获得的结果，根据如下公式计算风险评分并进行判定：
风险评分＝A×EGFR基因突变状态+B×CDKN2A基因突变状态+C×丰度比值+D×血浆ctDNA突变状态；A、B、C、D为系数；
当风险评分大于设定阈值时认为存在风险。
4.根据权利要求3所述的评估装置，其特征在于，当EGFR基因不存在突变时，取值0，否则取值1；
当CDKN2A基因存在突变时，取值1，否则取值0；
丰度比值≤0.10，取值1，否则取值0；
血浆ctDNA存在突变时，取值1，否则取值0。
5.根据权利要求4所述的评估装置，其特征在于，还包括：血浆cfDNA样本来源时间判定模块，用于对进行血浆cfDNA样本的采集时间进行获取，若采集于术后任一时间，则进入比对模块处理。
6.一种计算机可读取介质，其特征在于，其记载有可以运行以下非小细胞肺癌术后局部复发风险的评估步骤的计算机程序：
步骤S1，对组织样本进行测序，并对比至参考基因组，获取EGFR基因和CDKN2A基因突变状态；
步骤S2，对受试者血浆cfDNA进行测序，并对比至参考基因组，获取血浆cfDNA突变状态；
步骤S3，计算出组织样本中的最小基因突变丰度与最大基因突变丰度的比值；
步骤S4，根据下式进行计算：
风险评分＝A×EGFR基因突变状态+B×CDKN2A基因突变状态+C×丰度比值+D×血浆ctDNA突变状态；A、B、C、D为系数。
7.根据权利要求6所述的计算机可读取介质，其特征在于，当风险评分大于设定阈值时认为存在风险。
8.根据权利要求6所述的计算机可读取介质，其特征在于，所述的步骤S2中，是在受试者术后任一时间或者术前对血浆cfDNA进行测序。
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