CN116271240A - 一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，属于生物工程技术领域。该方法首次将生物3D打印技术和干细胞原位诱导技术结合用于血管构建，创造性地提出了滋养血管仿生。利用生物3D打印快速制备血管支持定制口径和长度，具有接近生理密度的血管细胞数量，内部细胞拥有良好的生长环境，细胞外基质种类丰富，力学性能优异。原位诱导技术获得大量血管平滑肌细胞；施加力学刺激，细胞外基质进一步重塑，获得接近天然血管力学性能；经过体外内皮化，获得了全生物性的小口径组织工程血管。通过该方法构建得到的全生物性小口径组织工程血管，在临床上可用于外周血管替代、动静脉造瘘、冠脉搭桥的全生物性小口径组织工程血管。

Description

一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法。
背景技术
心血管疾病(CVD)的发病率和死亡率逐年攀升，已经超过癌症成为全球死亡的头号杀手。据统计，每年约1800万患者死于心血管疾病，给社会带来了沉重负担。对于大多数病人，需要进行血管移植以建立旁路或置换堵塞及损伤的血管，而此时，组织工程血管的出现正为移植物短缺提供了良好的解决方案。经过数十年的发展，合成材料制备的人工血管已经成功用于大血管的替代。然而，对于小口径血管(<6mm)，急性血栓、吻合口内膜增生、动脉瘤、远期钙化等并发症限制了其进一步应用。构建生物性的小口径组织工程血管成为领域内的主要研究方向。
天然动脉的精细结构保证了其功能的发挥，包括内膜层，血管内皮细胞发挥抗凝及血管调节功能；中膜层，平滑肌细胞响应生化信号调节血管张力，胶原纤维和弹性纤维提供抗拉伸和扩张的机械支撑；外膜层，传入神经和滋养血管及祖细胞，调节及维持血管功能。基于此，生物性组织工程血管的构建应该包含主要的血管细胞和多种成分的细胞外基质。生物3D打印技术被认为是一项颇有前景的组织工程技术，允许个性化设计打印结构，快速规模化制备生物组织，并且能更好地控制细胞在结构内的空间分布和支架的微结构。传统的血管制造方法包括血管铸模、细胞膜片制备、支架材料种植细胞后分泌外基质、支架材料皮下包埋及生物3D打印血管等，部分研究已经开展临床试验。不过，这些方法均存在一定缺陷。如支架材料种植，材料生物相容性差、细胞接种数量有限、细胞分散不均匀导致生成移植物时间延长且批次间差异大，支架材料残留导致体内异物反应。支架材料皮下包埋生成的移植物为疏松结缔组织，力学张力明显不足。
仿生组织的构建除了制造技术外，另一个核心问题就在于种子细胞。人体实质器官中，细胞密度达到3×108/cm3，以往体外二维培养细胞的方式很难提供如此数量的细胞。不仅如此，近年来，不断有新的证据表明，传统方式培养的细胞在表型和功能上与体内细胞相距甚远，模拟体内环境的三维培养、多细胞球培养、类器官培养逐渐成为主流。
在器官构建中，人们认识到了血管化的重要性，对于组织工程血管，血管化也同样不可或缺。缺乏血管的工程组织，其厚度往往被限制在200μm以内。对于人体内中小动脉，其外膜都含有丰富的滋养血管网络，为内部细胞输送必需的营养和氧气。在组织工程血管的构建中，提高细胞密度的同时也应该将滋养血管考虑其中，以此保证细胞的存活，基于细胞数量和细胞外基质的厚度及强度来赋予血管优异的力学性能。然而，目前血管的研究中均未提及这一要素。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种构建方法，该方法利用天然细胞外基质成分及光敏生物材料搭配干细胞和微血管片段制备生物墨水进行3D打印，为获得打印含细胞“活”组织的组织工程血管构建开辟了新途径。
本发明的第二目的在于提供一种利用细胞因子促进细胞增殖与分化，进而提升打印血管的机械性能，解决生物打印组织强度差的技术问题。
本发明的第三目的在于提供一种利用体外培养的方式，将微血管片段结合用于作为打印血管外膜部分的主要材料，进而构建出真正的“活”组织。
本发明通过以下技术方案实现：
一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，包括如下步骤：
S1、组织工程血管的构建：采用含有光敏生物材料的生物墨水，将经消化离心处理的干细胞和微血管制备成细胞悬液；
利用软件进行工程血管建模；
将细胞悬液填充到生物3D打印机中进行打印，经蓝光交联成型，获得组织工程血管；
所述生物墨水是由光敏生物材料溶液和细胞外基质蛋白溶液制备得到；
S2、原位诱导分化：将步骤S1打印获得的组织工程血管转移至培养皿中进行细胞扩增培养、诱导分化处理，获得多层平滑肌环绕的组织工程血管；
所述诱导分化处理采用添加细胞因子进行处理；
S3、搏动培养：将步骤S2中获得的多层平滑肌环绕的组织工程血管固定到生物反应器内处理获得具有液体灌流功能和机械张力的组织工程血管；
S4、内皮种植：在经过步骤S3处理的组织工程血管的管腔中，加入内皮细胞溶液旋转360度分散均匀后静置培养，利用血流冲刷速度使内皮细胞稳定粘附，并顺血流方向排列。
上述该全生物性小口径组织工程血管的构建方法中，首先合成生物墨水，其中包括主要支撑成分光敏明胶，可以快速成型稳定打印结构并为细胞提供三维环境；胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白提供活性位点，促进干细胞的增殖分化。接着对生物墨水进行表征，包括光交联时间、孔隙率、流变性能、弹性模量、细胞毒性。最后进行打印参数优化，软件设计打印结构，选择悬浮凝胶作为支撑，调整料筒温度、打印速度、打印气压以获得高保真度和高细胞活力。
上述将多能干细胞消化成单细胞后，用生物墨水制备成细胞悬液进行打印，体外扩增后直接进行原位诱导。不同于传统二维诱导，这里的干细胞被定植于三维微环境中，诱导过程更为复杂也更接近在体真实环境。通过培养基中的不同细胞因子刺激，细胞与外基质的相互作用，细胞间的相互作用，来促进干细胞增殖分化为特定细胞。考虑到环境的改变，我们增加了细胞因子的浓度以及作用时间。为了保证内部细胞的存活，我们在细胞悬液中加入微血管片段以实现打印组织的预血管化。另外，采用动态培养以促进血管网形成及内部营养物质交换。
经过两周的诱导，干细胞分化成血管平滑肌细胞并保留部分祖细胞。为进一步促进细胞分泌外基质及细胞外基质重塑，将工程血管固定于生物反应器内，通过逐步增大的脉动压力刺激，提升血管机械性能。进一步测试工程血管的缝合强度、爆裂强度、拉伸性能、药物刺激反应等，与天然动静脉作比较。
内皮种植：对于小口径组织工程血管，由于血流量小、流速缓慢，血栓发生率极高。而体外内皮化是最仿生也是最有效的解决方案。这里，我们选用同一来源的多能干细胞，诱导为血管内皮细胞，进行细胞种植。在血管管腔中加入内皮细胞，自动旋转360度使细胞分散均匀，后逐步增加血流冲刷速度，以使内皮细胞稳定粘附和顺血流方向排列。
作为优选地，所述干细胞来源于不同hiPSC细胞系，不同ESC细胞系及不同来源MSC中的任意一种；
所述微血管片段来源于脂肪垫、祖细胞衍生的血管网及干细胞衍生的血管类器官中的任意一种。
作为优选地，所述光敏生物材料包括光敏明胶和/或光敏胶原；
所述光敏生物材料溶液包括光敏明胶溶液和/或光敏胶原溶液。
作为优选地，所述光敏明胶溶液是由mTeSR1完全培养基加热至50-60℃，不断搅拌至光敏明胶完全溶解后，配置成20％溶液，之后加入0.5％LAP光交联剂、20μM Y27632因子混合获得；
所述光敏胶原溶液是由0.2N乙酸溶液，在4℃下溶解光敏胶原获得。
作为优选地，所述细胞因子包括糖原合酶激酶-3抑制剂(CHIR99021)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、激活素A(ActivinA)、血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、转化生长因子β(TGF-β)和血管内皮生长因子(VEGF165)中任意一种。
作为优选地，所述细胞外基质蛋白溶液是由2X PBS溶液溶解细胞外基质蛋白后，获得浓度为375-400g/mL溶液；
所述细胞外基质蛋白包括层粘连蛋白和纤连蛋白。
作为优选地，所述内皮细胞为原代内皮细胞、祖细胞衍生内皮细胞及干细胞衍生内皮细胞中的任意一种；
所述内皮细胞溶液中的内皮细胞含量为1×107/mL-2×107/mL。
作为优选地，所述静置培养24h；
所述血流冲刷速度为5-100mL/min。
一种全生物性小口径组织工程血管，由所述的全生物性小口径组织工程血管的构建方法获得。
一种全生物性小口径组织工程血管在临床上可用于外周血管替代、动静脉造瘘器械、冠脉搭桥器械中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
本发明提供了一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，该方法是针对目前小口径组织工程血管巨大需求和构建难题，首次将生物3D打印技术和干细胞原位诱导技术相结合用于血管构建，并创造性地提出了滋养血管仿生。利用生物3D打印技术快速制备的血管支持个性化定制口径和长度，具有接近生理密度的血管细胞数量并且内部细胞拥有良好的生长环境，细胞外基质种类丰富并且力学性能优异。通过原位诱导技术，获得大量血管平滑肌细胞；施加力学刺激后，细胞外基质进一步重塑，获得接近天然血管的力学性能；最后，经过体外内皮化，获得了全生物性的小口径组织工程血管。本发明解决了小口径组织工程血管的构建难题，也可以为更为复杂的组织器官构建提供借鉴意义。
通过该方法构建得到的全生物性小口径组织工程血管，在临床上可用于外周血管替代、动静脉造瘘、冠脉搭桥的全生物性小口径组织工程血管。
附图说明
图1为实验例1三维培养组细胞在第0天，第7天和第14天的培养光镜图示意图(标尺100μm)；
图2为实验例1原位诱导平滑肌细胞在第0天，第7天和第14天的培养光镜图示意图(标尺100μm)；
图3为实验例1二维诱导平滑肌细胞的免疫荧光染色示意图(标尺50μm)；
图4为实验例1三维培养平滑肌细胞的免疫荧光染色示意图(标尺50μm)；
图5为实验例1原位诱导平滑肌细胞的免疫荧光染色示意图(标尺50μm)；
图6为实验例1平滑肌细胞的RT-qPCR结果示意图；
图7为实验例1细胞补片免疫荧光染色示意图；
图8为实验例2中3D生物打印建模血管结构横截面示意图；
图9为实验例2中3D生物打印建模血管结构立体图
图10为实验例2中3D打印血管的外观形态示意图；
图11为实验例2中打印细胞2天后原位诱导的光镜图
图12为实验例2中打印细胞14天后原位诱导的光镜图
图13为实验例2中血管D14 HE染色示意图；
图14为实验例2中搏动培养过程示意图；
图15为实验例4iPSC-EC免疫荧光染色示意图；
图16为实验例4内皮细胞种植后不同时间段扫描电镜结果示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，包括如下步骤：
1、生物3D打印：
1)合成生物墨水，用mTeSR1完全培养基加热至60℃溶解光敏明胶，期间不断搅拌至彻底溶解，配置成20％溶液，其中加入0.5％光交联剂LAP，20uM Y27632因子。
用0.2N乙酸溶液4℃溶解光敏胶原，期间置于低温摇床不断震荡，配置成1％溶液。
用2X PBS溶液室温溶解层粘连蛋白和纤连蛋白，浓度调整为375ug/mL。接着将纤连蛋白溶液和胶原蛋白溶液1:1混合，期间一直置于冰上。
最后，将上一步的混合溶液与明胶溶液于37℃1:1混合，期间剧烈震荡，其中加入总体积0.5％的1mol NaOH溶液调节pH，得到生物墨水。
分装后，于-20℃储存备用。
2)Materialise Magic软件进行血管建模，设计内径2-6mm，长度1-4cm。
3)生物墨水复温至37℃，消化干细胞后用生物墨水制备成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×107/mL，其中加入血管片段10000个/mL或诱导内皮细胞2×106/mL。
后将细胞悬液转移至5ml料筒内，于4℃冰箱预冷5min。
接着将料筒填充至envisionTEC生物打印机进行打印。
4)打印参数设置：选用27G 1英寸针头，明胶悬浮浴，打印结构层高200-300um，挤出压力0.5-1bar，料筒温度25℃，打印速度15-30mm/s。
5)405nm蓝光在六个方向各照射20s，后洗去悬浮胶，将打印血管转移至培养皿中进行培养。
2、原位诱导分化：步骤1)中的打印血管转移至培养皿中，加入干细胞培养基扩增3d。后加入含12uM CHIR99021,30ng/ml BMP4的N2B27培养基(DMEM/F12:Neurobasal 1:1，1X N2添加剂，1X少维A B27添加剂，0.012mMβ巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，P/S)诱导3d至中胚层。接着加入含2ng/mL ActivinA、20ng/ml PDGF-BB的N2B27培养基进行平滑肌细胞诱导，隔天换液，共诱导4d。最后加入含10％胎牛血清，1ng/mL TGF-β的SmGM培养基扩增7d。期间培养皿放置于摇床上以40rpm转速不断振荡，得到多层平滑肌环绕的组织工程血管。
3、搏动培养：经过两周的诱导，干细胞分化成血管平滑肌细胞并保留部分祖细胞。为进一步促进细胞分泌外基质及细胞外基质重塑，将工程血管固定于生物反应器内，外附电纺膜提供初始力学支撑，通过逐步增大的脉动压力刺激，提升血管机械性能。
流量设置为100-200mL/min，搏动频率为60-200bmp，径向应变为0.5％-3％。期间培养基更换为DMEM加入20％胎牛血清，1％ NEAA，2mM L-谷氨酰胺，0.012mMβ巯基乙醇，1ng/mL TGF-β和P/S。
培养四周后，得到细胞外基质重塑后的组织工程血管。
4、内皮种植：对于小口径组织工程血管，由于血流量小、流速缓慢，血栓发生率极高。而体外内皮化是最仿生也是最有效的解决方案。
选用同一来源的多能干细胞，诱导为血管内皮细胞，进行细胞种植。
在血管管腔中加入1×107/mL的内皮细胞，自动旋转360度使细胞分散均匀，静置培养24h。后连接至生物反应器，通过蠕动泵进行冲刷，流速从5mL/min逐渐增加至100mL/min，以使内皮细胞稳定粘附和顺血流方向排列。
实验例1：生物3D打印结合原位诱导hiPSC-SMC构建细胞补片。
根据步骤1合成生物墨水，制备成单细胞悬液，后打印成20X20X1mm细胞补片。
根据步骤2进行原位诱导14天。
根据步骤3进行拉伸培养7天。
如图1所示，图中标号为1、2、3的为三维培养组细胞在第0天，第7天和第14天的培养光镜图，结果显示：培养至14天，三维培养组细胞呈分散状态。
如图2所示，图中标号为1、2、3的为原位诱导平滑肌细胞在第0天，第7天和第14天的培养光镜图。结果显示，原位诱导组细胞密集排列，细胞间无间隙。
上述结果表明：此方法可以获得高密度的平滑肌细胞用于构建组织工程血管。
如图3所示，为二维诱导平滑肌细胞的免疫荧光染色示意图；
如图4所示，为三维培养平滑肌细胞的免疫荧光染色示意图；
如图5所示，为原位诱导平滑肌细胞的免疫荧光染色示意图。
附图结果显示：经免疫荧光染色鉴定，原位诱导后干细胞分化为平滑肌细胞，和二维诱导、三维培养一样，均表达平滑肌细胞特异性标志物CNN1和α-SMA。
如图6所示，为平滑肌细胞的RT-qPCR结果图。RT-qPCR检测原位诱导获得平滑肌细胞的基因表达情况，从结果可以看出，平滑肌细胞不表达干细胞多能性转录因子OCT3/4，相较之二维诱导的平滑肌样细胞，表达更多的平滑肌标志物MYH11和α-SMA，并且可以合成及分泌胶原蛋白(COL1)和弹性蛋白(ELN)，更有利于后续组织工程血管的细胞外基质重塑。
如图7所示，为细胞补片免疫荧光染色图。原位诱导后可以获得厚度达200um的致密平滑肌细胞层。
图中(a)为低倍镜视野，标尺为200μm。图中(b)(c)(d)为局部放大视野的单通道和叠加图像，标尺均为100μm。
实验例2：生物3D打印结合原位诱导hiPSC-SMC构建小口径组织工程血管。
根据步骤1合成生物墨水，制备成单细胞悬液，后3D打印成内径4mm，外径5mm，长20mm的小口径组织工程血管。
根据步骤2进行原位诱导14天。
根据步骤3搏动培养4周。
如图8所示，为3D生物打印建模血管结构横截面示意图。
如图9所示，为3D生物打印建模血管结构立体图。
该。血管结构设计为中膜和外膜双层打印，口径4mm，长度2-6cm。
如图10所示，为3D打印血管的外观形态示意图，有较好的保真度，标尺为1cm。
如图11所示，为打印细胞2天后原位诱导的光镜图。图中(a)标尺为500μm，(b)标尺为200μm。
如图12所示，为打印细胞14天后原位诱导的光镜图。图中(a)标尺为500μm，(b)标尺为200μm。
从上述图11和12可以看出，打印后干细胞初始呈单细胞散在分布，诱导分化后，细胞呈梭状平滑肌样，紧密排列。
如图13所示，为血管D14 HE染色。打印血管后诱导分化14D进行HE染色，可以看出原位诱导出致密的平滑肌层，细胞排列整齐，厚度达100-200um。相较于对照组，在外膜加入滋养血管后，血管壁内部细胞存活率增加。
如图14所示，为搏动培养过程示意图。图中(a)(b)中显示打印血管周围环绕多层电纺膜增加其力学性能，(c)中显示后转移至血管孵育器中进行长时间搏动培养，以促进细胞外基质重塑。
实验例3：生物3D打印结合原位诱导hESC-SMC构建小口径组织工程血管。
根据步骤1合成生物墨水，制备成单细胞悬液，后3D打印成内径4mm，外径5mm，长20mm的小口径组织工程血管。
根据步骤2进行原位诱导14天。
根据步骤3搏动培养4周。
实验例4：生物3D打印结合原位诱导构建小口径组织工程血管的脱细胞和内皮化。
根据步骤1合成生物墨水，制备成单细胞悬液，后3D打印成内径4mm，外径5mm，长20mm的小口径组织工程血管。
根据步骤2进行原位诱导14天。
根据步骤3搏动培养4周。
常规SDS法脱细胞。
最后根据步骤4进行内皮细胞种植，内皮细胞分别为脐静脉内皮细胞，iPSC-EC，ESC-EC。
如图15所示，为iPSC-EC免疫荧光染色图。其中(a)(b)(c)为单通道染色光镜图。(d)为叠加图像。
图示表明，iPSC成功诱导分化为血管内皮细胞，经免疫荧光染色鉴定，诱导细胞高表达内皮特异性标志物vwF和CD144。
如图16所示，内皮细胞种植后不同时间段扫描电镜结果，标尺均为20μm。血管内皮细胞种植到血管内膜表面，24h后细胞已开始铺展，经过流动冲刷培养，细胞进一步展开，至72h，内皮细胞间呈紧密连接，且顺血流方向排布，最终形成内皮屏障。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、组织工程血管的构建：采用含有光敏生物材料的生物墨水，将经消化离心处理的干细胞和微血管制备成细胞悬液；
利用软件进行工程血管建模；
将细胞悬液填充到生物3D打印机中进行打印，经蓝光交联成型，获得组织工程血管；
所述生物墨水是由光敏生物材料溶液和细胞外基质蛋白溶液制备得到；
S2、原位诱导分化：将步骤S1打印获得的组织工程血管转移至培养皿中进行细胞扩增培养、诱导分化处理，获得多层平滑肌环绕的组织工程血管；
所述诱导分化处理采用添加细胞因子进行处理；
S3、搏动培养：将步骤S2中获得的多层平滑肌环绕的组织工程血管固定到生物反应器内处理获得具有液体灌流功能和机械张力的组织工程血管；
S4、内皮种植：在经过步骤S3处理的组织工程血管的管腔中，加入内皮细胞溶液旋转360度分散均匀后静置培养，利用血流冲刷速度使内皮细胞稳定粘附，并顺血流方向排列。
2.根据权利要求1所述的一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于，所述干细胞来源于不同hiPSC细胞系，不同ESC细胞系及不同来源MSC中的任意一种；
所述微血管片段来源于脂肪垫、祖细胞衍生的血管网及干细胞衍生的血管类器官中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于，所述光敏生物材料包括光敏明胶和/或光敏胶原；
所述光敏生物材料溶液包括光敏明胶溶液和/或光敏胶原溶液。
4.根据权利要求3所述的一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于，所述光敏明胶溶液是由mTeSR1完全培养基加热至50-60℃，不断搅拌至光敏明胶完全溶解后，配置成20％溶液，之后加入0.5％LAP光交联剂、20μM Y27632因子混合获得；
所述光敏胶原溶液是由0.2N乙酸溶液，在4℃下溶解光敏胶原获得。
5.根据权利要求1所述的一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于，所述细胞因子包括糖原合酶激酶-3抑制剂、骨形态发生蛋白4、激活素A、血小板衍生生长因子BB、转化生长因子β和血管内皮生长因子中任意一种。
6.根据权利要求1所述的一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于，所述细胞外基质蛋白溶液是由2X PBS溶液溶解细胞外基质蛋白后，获得浓度为375-400g/mL溶液；
所述细胞外基质蛋白包括层粘连蛋白和纤连蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于，所述内皮细胞为原代内皮细胞、祖细胞衍生内皮细胞及干细胞衍生内皮细胞中的任意一种；
所述内皮细胞溶液中的内皮细胞含量为1×107/mL-2×107/mL。
8.根据权利要求1所述的一种全生物性小口径组织工程血管的构建方法，其特征在于，所述静置培养24h；
所述血流冲刷速度为5-100mL/min。
9.一种全生物性小口径组织工程血管，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的全生物性小口径组织工程血管的构建方法获得。
10.一种如权利要求9所述的全生物性小口径组织工程血管在临床上可用于外周血管替代、动静脉造瘘器械、冠脉搭桥器械中的应用。
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