CN116270969A - 产气荚膜梭菌溶血素o在制备激活nlrp3炎症小体的特异性激活剂中的应用 - Google Patents

产气荚膜梭菌溶血素o在制备激活nlrp3炎症小体的特异性激活剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用，属于生物医药技术领域。PFO是一种NLRP3炎症小体特异性激活剂，通过与细胞膜上的胆固醇结合进入胞内，影响细胞内线粒体与溶酶体的结构功能等，从而激活NLRP3炎症小体。本发明为深入了解PFO特异性激活NLRP3炎症小体的机理，以及未来在靶向治疗PFO毒素感染的医药研究中提供新思路。

Description

产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激 活剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用。
背景技术
炎症小体是一种多蛋白免疫复合物，能够识别病原相关分子模式(PAMPs)和宿主产生的危险信号分子(DAMPs)，从而激活下游前体细胞因子，使机体产生相应的免疫反应。其中属于NLR蛋白家族的NLRP3炎症小体是最常见的炎症小体之一，NLRP3蛋白作为受体蛋白(receptor)可以感应包括病原体、毒力因子(尼日利亚菌素)、核酸、ATP、无机颗粒(二氧化硅和石棉)、微结晶体(胆固醇结晶和尿酸钠结晶)在内的多种刺激信号，在天然免疫中发挥着十分重要的作用。许多慢性炎症疾病，例如二型糖尿病，粥样动脉硬化和肿瘤等都与NLRP3炎症小体的激活紧密相连。
产气荚膜梭菌是一种人类气性坏疽的主要病原菌，可导致细胞坏死或组织水肿等病症。前期研究表明，产气荚膜梭菌能够产生并分泌20余种复杂的外毒素，这些毒素通常需要与宿主细胞的受体结合，激活细胞内部的信号通路从而导致细胞死亡。产气荚膜梭菌溶血素O(Perfringolysin O，PFO)是一种由产气荚膜梭菌产生的胆固醇依赖性成孔溶细胞素，属于胆固醇依赖性溶血素(CDC)家族。PFO能够在细胞膜上形成孔道，引起细胞膜电位的大幅度变化，与胞浆分子的流失，造成细胞死亡，最终导致组织坏死。虽然目前已经有不少关于PFO在临床气性坏疽疾病的报道，但仍缺乏PFO对NLRP3炎症小体激活机理的相关研究。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用，PFO是一种NLRP3炎症小体特异性激活剂，通过与细胞膜上的胆固醇结合进入胞内，影响细胞内线粒体与溶酶体的结构功能等，从而激活NLRP3炎症小体。本发明为深入了解PFO特异性激活NLRP3炎症小体的机理，以及未来在靶向治疗PFO毒素感染的医药研究中提供新思路。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用。
优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O在体内和/或体外激活NLRP3炎症小体。
优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O进入细胞内激活NLRP3炎症小体。
优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O与细胞膜上的胆固醇结合，在细胞膜上形成孔道，进入细胞内并激活NLRP3炎症小体，导致细胞焦亡。
优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后对线粒体和溶酶体产生影响。
优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后破坏线粒体，使线粒体释放ROS，激活NLRP3炎症小体。
优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后破坏溶酶体，导致溶酶体破裂进而激活NLRP3炎症小体。
优选的，所述产气荚膜梭菌溶血素O引起细胞内K+的浓度变化，激活NLRP3炎症小体。
有益效果：
PFO是一种NLRP3炎症小体特异性激活剂，通过与细胞膜上的胆固醇结合进入胞内，影响细胞内线粒体与溶酶体的结构功能等，从而激活NLRP3炎症小体。本发明为深入了解PFO特异性激活NLRP3炎症小体的机理，以及未来在靶向治疗PFO毒素感染的医药研究中提供新思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1中A为敲除NLRP3基因的小鼠与野生型小鼠的巨噬细胞在同等条件下加入LPS+PFO处理后，caspase-1与p20蛋白的表达电泳图；图1中B为分别在LPS+PFO与LPS+Nigericin诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体活化条件下，NLRP3炎症小体抑制剂MCC950对Caspase-1、Pro-IL-1β、GSDMD以及其活性亚基p20、p17、p30的蛋白表达的作用；图1中C为在此条件下，定量检测的IL-1β蛋白表达量；图1中D为在此条件下，检测的LDH释放；
图2为加入胆固醇抑制剂MCD或在此条件下利用转染试剂DOTAP对PFO进行转染，PFO对NLRP3炎症小体激活产生的作用；图2中A为在此条件下，检测Caspase-1、Pro-IL-1β以及其活性亚基p20、p17蛋白的表达量图；图2中B为在此条件下，定量检测的IL-1β蛋白表达量；图2中C为在此条件下，检测的LDH释放；
图3为在加入抑制巨噬细胞内吞的Cytochalasin D试剂后，PFO对NLRP3炎症小体激活产生的作用；图3中A为在此条件下，检测Caspase-1、Pro-IL-1β以及其活性亚基p20、p17蛋白的表达量图；图3中B为在此条件下，定量检测的IL-1β蛋白表达量；图3中C为在此条件下，检测的LDH释放百分比；
图4为分别用胆固醇抑制剂MCD与抑制巨噬细胞内吞的Cytochalasin D试剂处理细胞后，PFO与线粒体和溶酶体的相互作用；
图5为加入非定向ROS清除剂NAC与线粒体ROS定向清除剂Mito-tempo后，PFO对胞内总ROS与线粒体ROS的激活作用；
图6为加入线粒体ROS定向清除剂Mito-tempo处理细胞后，PFO对巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的作用；图6中A为在此条件下，线粒体膜电位测量图；
图6中B为在此条件下，检测Caspase-1、Pro-IL-1β、GSDMD以及其活性亚基p20、p17、p30的蛋白表达量；图6中C为在此条件下，定量检测的IL-1β蛋白表达量；图6中D为在此条件下，检测的LDH释放量；
图7为加入溶酶稳定剂CA-074、BafilomycinA、NH4Cl后，PFO对NLRP3炎症小体激活产生的作用；图7中A为由AO吖啶橙荧光强度评判的溶酶体膜破裂程度图；图7中B为在此条件下，检测Caspase-1、Pro-IL-1β以及其活性亚基p20、p17蛋白的表达量图；图7中C为在此条件下，定量检测的IL-1β蛋白表达量；图7中D为在此条件下，检测的LDH释放量；
图8为加入不同浓度梯度的KCl对PFO诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体激活产生的作用；图8中A为在此条件下，测量的胞内K+浓度；图8中B为在此条件下，检测Caspase-1、Pro-IL-1β以及其活性亚基p20、p17蛋白的表达量图；
图8中C为在此条件下，定量检测的IL-1β蛋白表达量；图8中D为在此条件下，检测的LDH释放量；
图9中A为用溶酶体保护剂BafilomycinA、NH4Cl、CA-074处理细胞后，检测的mtROS含量图；图9中B为用线粒体ROS定向清除剂Mito-tempo、KCl、Glyburide试剂处理细胞后，检测的mtROS含量图；图9中C为用线粒体ROS定向清除剂Mito-tempo、KCl、Glyburide试剂处理细胞后，Green-AO Fluorescence值的检测图。
具体实施方式
本发明提供了产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用。
在本发明中，所述PFO优选在体内和/或体外激活NLRP3炎症小体。在本发明中，所述PFO优选进入细胞内激活NLRP3炎症小体。在本发明中，所述PFO优选与细胞膜上的胆固醇结合，在细胞膜上形成孔道，进入细胞内并激活NLRP3炎症小体，导致细胞焦亡。在本发明中，所述PFO不会影响NLRP3炎症小体及其下游细胞因子前体有关蛋白质的DNA转录等过程。在本发明中，所述PFO是通过进入细胞质侵染细胞，从而激活NLRP3炎症小体的；在使用胆固醇抑制剂MCD处理细胞时，NLRP3炎症小体未被激活且细胞死亡率显著降低。而在使用抑制巨噬细胞内吞的试剂Cytochalasin D处理细胞后，NLRP3炎症小体亦未被激活，但细胞死亡率仍处于较高水平。结合两组实验可说明PFO需进入胞内才能激活NLRP3炎症小体，且除活化的NLRP3炎症小体外，PFO在细胞膜上形成孔道也可导致细胞死亡。
在本发明中，所述PFO优选侵染细胞后对线粒体和溶酶体产生影响。在本发明中，所述PFO优选侵染细胞后破坏线粒体，使线粒体释放ROS，激活NLRP3炎症小体。在本发明中，所述PFO优选侵染细胞后破坏溶酶体，导致溶酶体破裂进而激活NLRP3炎症小体。在本发明中，所述PFO侵染细胞后会对线粒体和溶酶体产生影响，在使用胆固醇抑制剂MCD与抑制巨噬细胞内吞的试剂Cytochalasin D处理细胞后，在线粒体和溶酶体中均未检测出PFO。在本发明中，所述PFO会引起胞内ROS的含量增加。其中，线粒体ROS含量也同时增加，且线粒体受到破坏。在加入线粒体ROS定向清除剂Mito-tempo后，线粒体破坏程度减少，且NLRP3炎症小体激活程度减弱，细胞存活率增加。在本发明中，所述PFO对溶酶体的影响，加入溶酶稳定剂CA-074、BafilomycinA、NH4Cl后，溶酶体膜破裂程度降低，NLRP3炎症小体激活程度减弱，且细胞存活率增加。
在本发明中，所述PFO优选引起细胞内K+的浓度变化，激活NLRP3炎症小体，胞外高浓度K+会抑制PFO对NLRP3炎症小体激活，且随着K+浓度的增加，抑制作用增强。在本发明中，所述PFO在侵染细胞后，线粒体、溶酶体的破坏与K+外流的上下游关系，由上到下依次为K+离子外流、线粒体、溶酶体。当使用CA-074处理细胞时，发现线粒体ROS并未有明显下降，当使Mito-tempo处理细胞后，吖啶橙染料检测溶酶体膜通透性有明显下降，说明PFO破坏线粒体产生ROS可能在破坏溶酶体的上游。当使用KCl和Glyburide抑制K+外流时，线粒体ROS有所下降，溶酶体膜通透性有明显下降，说明K+外流可能发生在线粒体和溶酶体破坏的最上游。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
材料与方法：
(1)小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)培养
①L929细胞(武汉普诺赛公司，货号CL-0137)复苏于细胞培养皿中，待细胞长满后传代，随后等待7天收集培养上清液，过滤除菌，保存于-80℃待用。
②取6-8周野生型C57BL/6J小鼠，颈椎脱臼处死小鼠，取后肢腿骨。在超净台内，将后肢腿骨关节连接处分离，离心得到红色骨髓细胞，用含有20％L929培养上清、10％FBS、1％非必需氨基酸、1％双抗的DMEM培养基重悬细胞，铺于细胞培养皿中，在培养第3天和第5天添加20％培养液，第六天可以使用。
(2)NLRP3炎症小体的激活
将BMDM细胞按照5×105个细胞/孔接种于24孔板中，过夜培养。第二天用100ng/ml脂多糖处理4h，之后加入不同浓度的ADH-503处理细胞1h，随后用0.73μg/ml PFO毒素刺激细胞1h，再进行后续实验。
(3)蛋白免疫印迹实验
①用裂解液裂解细胞(含有100mM DTT)和蛋白上样缓冲液(含有2％SDS)混合后收集，100℃金属浴煮10min，通过10％SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，100V跑2h。
②用湿转法将蛋白质转移至PVDF膜上，100V转膜2h。
③用5％的脱脂牛奶室温下封闭膜1h。
④1:1000稀释一抗，4℃摇床孵育过夜。
⑤TBST洗膜三次，每次10min，1:2000稀释相对应的二抗，室温摇床孵育1h。
⑥TBST洗膜3次，每次10min，用ECL化学发光显色液进行显色，用化学发光凝胶成像仪进行成像。
(4)ELISA(Mouse IL-1betaUncoated ELISA，Invitrogen 88-7013)
①提前一天包被抗体，每孔加入100μl capture antibody放入摇床4℃过夜。
②洗涤液洗涤3次，每次1min，拍干。
③每孔加入200μl ELISA稀释液室温封闭1h。
④洗涤液洗涤1次。
⑤收集细胞上清液。
⑥准备8个不同浓度的IL-1β标准品(用ELISA稀释液梯度稀释)。
⑦每孔分别加入100μl的样品和标准品，室温摇床孵育2h。
⑧洗涤液洗涤5次，每次1min，拍干。
⑨每孔加入100μl detection antibody，室温孵育1h。
⑩洗涤液洗涤5次，每次1min，拍干。
Figure BDA0004097540230000061
每孔加入100μl辣根过氧化物酶，室温摇床孵育30min。
Figure BDA0004097540230000062
洗涤液洗涤7次，每次2min，拍干。
Figure BDA0004097540230000063
每孔加入100μl TMB显色液，室温孵育15min。
Figure BDA0004097540230000064
每孔加入100μl终止液，随后在450nM波长下读取OD值，数据分析。
(5)qRT-PCR
①每孔1×106个细胞接种于12孔板中，刺激完细胞后，每孔加入500μl trizol裂解细胞，收集到1.5ml ep管中。
②每孔加入100μl氯仿，剧烈震荡15s，室温放置15min。
③12000g 4℃离心20min。
④吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇(大约50％trizol体积)，颠倒数次混匀，室温沉淀10min。
⑤12000g 4℃离心10min，在管底可见RNA沉淀，弃上清。
⑥加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，混匀，7500g4℃离心5min，弃上清。
⑦重复上个步骤两遍，小心吸尽上清，室温放置约10min至RNA略干。
⑧用DEPC水溶解RNA，-80℃冰箱保存。
⑨按照翌圣生物公司的反转录试剂盒(11141ES60)合成cDNA，并按照qRT-PCR反应体系进行扩增。
(6)ASC寡聚化实验
①将BMDM细胞铺板于12孔板中，过夜培养，第二天按照步骤2处理细胞。弃上清，每孔用300μl Triton lysis buffer(包含蛋白酶抑制剂)裂解，取10ul留用，其余裂解物收集到1.5ml ep管中。
②将细胞裂解液离心6000g 4℃15min。
③弃上清，用1×预冷PBS洗2遍沉淀，然后重悬于200μl的1×PBS中。
④加入辛二酸二琥珀酰亚胺(DSS，购于MCE公司，货号：HY-W019543)，终浓度为2mM。
⑤37℃孵育30min，每10min轻涡旋一次。
⑥6000g离心10min，弃上清。
⑦将沉淀重悬于1×的SDS-PAGE loading Tritonbuffer中(40μl)，100℃煮沸10min进行Western-blotting实验。
(7)免疫共沉淀实验
①将磁珠充分混悬，取50μl磁珠，置于1.5ml ep管中，加入400μl洗涤缓冲液，充分混悬,置于磁力架，磁性分离，弃上清，重复洗涤步骤2次。
②BMDM细胞处理完后，用Ripabuffer裂解细胞(包含蛋白酶抑制剂)，收集细胞裂解液，4℃,14000g,10min，收集上清液，置冰上。
③将抗体和细胞裂解液按比例混合，置于翻转混合仪中，4℃过夜进行抗原-抗体结合。
④将步骤①中预处理好的抗体与③中的抗原抗体复合物混合，置于翻转混合仪4℃过夜孵育进行抗原-抗体-磁珠结合。
⑤磁性分离，收集磁珠弃上清。使用400μl结合/洗涤缓冲液充分重悬磁珠，重复洗涤4次，最后一次洗涤结束磁性分离，收集磁珠弃上清。
⑥向磁珠中加入25-50μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均匀，100℃加热10min。分离磁珠，收集上清，进行SDS-PAGE实验。
(8)提取细胞线粒体(碧云天细胞线粒体分离试剂盒，货号：C3601)
①用PBS洗一遍，用细胞刮板刮取在12孔板中的细胞到离心管中，100-200g，4℃离心收集细胞。
②用冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，4℃离心5min沉淀细胞，弃上清。
③加入1-2.5ml临用前添加了PMSF的线粒体分离试剂至2000-5000万细胞中，轻轻悬浮细胞，冰浴放置10-15min。
④把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆10-30下左右。
⑤把细胞匀浆在600g，4℃离心10min。
⑥小心把上清液转移到另一离心管中，在11000g，4℃离心10min。
⑦小心去除上清液，沉淀即为分离得到的细胞线粒体。
(9)提取细胞溶酶体(贝博生物溶酶体提取试剂盒，货号：BB-3603)
①取1-2×107个细胞，在4℃，500×Ag条件下离心5min，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
②用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
③加入400μl冷的试剂A，置冰上静置10min。
④用Dounce匀浆器匀浆30-40下。
⑤匀浆液在4℃，1000g条件下离心5min。弃沉淀，收集上清。
⑥将上清在4℃，3000g条件下离心10min。弃沉淀，收集上清。
⑦将上清在4℃，5000g条件下离心10min。弃沉淀，收集上清。
⑧将上清在4℃，20000g条件下离心20min。弃上清，收集沉淀。
⑨在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
⑩在4℃，20000g条件下离心20min。弃上清，收集沉淀。
Figure BDA0004097540230000081
沉淀用溶酶体保存液C重悬，即得到溶酶体样品。
2.结果分析
如图1所示，敲除NLRP3基因的小鼠与野生型小鼠的巨噬细胞在同等条件下加入LPS+PFO处理后，NLRP3基因敲除的巨噬细胞中p20蛋白没有表达；NLRP3炎症小体抑制剂MCC950抑制PFO与Nigericin诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体活化，表现为在此条件下Caspase-1p20、IL-1βp17、GSDMD p30的蛋白表达量与对照组相比显著下降、IL-1β蛋白的胞外释放量下降，同时LDH释放量降低；
如图2所示，加入胆固醇抑制剂MCD后，PFO对NLRP3炎症小体激活产生抑制作用，表现为在此条件下Caspase-1p20、IL-1βp17蛋白表达量与对照组相比显著下降、IL-1β蛋白的胞外释放量下降，以及在此条件下LDH释放量降低；但加入胆固醇抑制剂MCD预处理后，利用DOTAP转染试剂将PFO转染进细胞后，NLRP3炎症小体被重新激活，表现为在此条件下Caspase-1p20、IL-1βp17蛋白表达量上升、IL-1β蛋白的胞外释放量增加，以及在此条件下LDH释放量升高；
如图3所示，加入抑制巨噬细胞内吞的Cytochalasin D试剂后，PFO对NLRP3炎症小体激活产生抑制作用，表现为在此条件下Caspase-1p20、IL-1βp17蛋白表达量与对照组相比显著下降、IL-1β蛋白的胞外释放量下降，以及在此条件下LDH释放量降低；
如图4所示，在PFO诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体活化条件下，提取细胞线粒体和溶酶体后利用Western-blotting检测出PFO蛋白；当分别用胆固醇抑制剂MCD与抑制巨噬细胞内吞的Cytochalasin D试剂处理细胞后，提取细胞线粒体和溶酶体后利用Western-blotting在线粒体和溶酶体中均未检测出PFO；
如图5所示，加入非定向ROS清除剂NAC与线粒体ROS定向清除剂Mito-tempo后，PFO诱导的巨噬细胞总ROS和线粒体ROS含量分别与对照组相比显著减少；
如图6所示，加入线粒体ROS定向清除剂Mito-tempo后，PFO诱导的巨噬细胞线粒体膜电位与对照组相比显著恢复，在此条件下Caspase-1p20、IL-1βp17蛋白表达量与对照组相比显著下降、IL-1β蛋白的胞外释放量下降，以及在此条件下LDH释放量降低；
如图7所示，加入溶酶稳定剂CA-074、BafilomycinA、NH4Cl后，PFO对NLRP3炎症小体激活产生抑制作用，表现为在此条件下Caspase-1p20、IL-1βp17蛋白表达量与对照组相比显著下降、IL-1β蛋白的胞外释放量下降，以及在此条件下LDH释放量降低；同时由AO吖啶橙荧光强度评判的溶酶体膜破裂程度降低；
如图8所示，PFO显著降低细胞内K+浓度；加入不同浓度梯度的KCl对PFO诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体活化产生抑制作用，表现为在此条件下Caspase-1p20、IL-1βp17蛋白表达量与对照组相比显著下降、IL-1β蛋白的胞外释放量下降，以及在此条件下LDH释放量降低；
如图9所示，用溶酶体保护剂BafilomycinA、NH4Cl、CA-074处理细胞后，PFO诱导的巨噬细胞mtROS含量未出现明显下降；用Mito-tempo、KCl与Glyburide试剂处理细胞均抑制细胞内mtROS含量；用线粒体ROS定向清除剂Mito-tempo、KCl与Glyburide处理细胞后，Green-AO Fluorescence值均明显下降。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.产气荚膜梭菌溶血素O在制备激活NLRP3炎症小体的特异性激活剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O在体内和/或体外激活NLRP3炎症小体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O进入细胞内激活NLRP3炎症小体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O与细胞膜上的胆固醇结合，在细胞膜上形成孔道，进入细胞内并激活NLRP3炎症小体，导致细胞焦亡。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后对线粒体和溶酶体产生影响。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后破坏线粒体，使线粒体释放ROS，激活NLRP3炎症小体。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O侵染细胞后破坏溶酶体，导致溶酶体破裂进而激活NLRP3炎症小体。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产气荚膜梭菌溶血素O引起细胞内K+的浓度变化，激活NLRP3炎症小体。
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