CN116270541A - 抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒及制备方法和肺部吸入制剂 - Google Patents

Abstract

本申请属于抗细菌感染技术领域，尤其涉及抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒及制备方法和肺部吸入制剂；本申请提供的抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒通过对阳纳米粒子能够穿过粘液层，渗透进入生物被膜内部，并提高外膜通透性，从而解决现有技术中阳离子纳米粒子等抗菌药物难以抵达铜绿假单胞菌感染位置、抗菌效果较低的技术问题。

Description

抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒及制备方法和肺部吸入制剂

技术领域

本申请属于抗细菌感染技术领域，尤其涉及抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒及制备方法和肺部吸入制剂。

背景技术

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)常见于免疫功能低下患者特别是囊性纤维化(CF)患者肺部，其引起的感染具有难根除、易复发、较高的死亡率的特点，已经对公众健康造成巨大威胁。

目前临床上通常采用抗生素治疗铜绿假单胞菌感染，在体内和体外对铜绿假单胞菌能有效发挥作用包括青霉素类等抗生素，然而随着抗生素的广泛应用导致了铜绿假单胞菌耐药性的出现，可以使用第二种或多种抗生素药物联合治疗，然而抗生素联合治疗随着治疗时间的延长，还是会出现细菌耐药率的升高和清除率的下降，因此有必要提供一种新的治疗铜绿假单胞菌感染的手段。

阳离子纳米粒子虽然对铜绿假单胞菌感染具有较高杀菌效果，但铜绿假单胞菌感染往往伴随黏液分泌异常增加等临床症状，黏液层成为阻碍阳离子纳米粒子到达感染部位的屏障，并且铜绿假单胞菌通过形成生物被膜也降低了阳离子纳米粒子治疗铜绿假单胞菌感染的效果，铜绿假单胞菌外膜作为选择性屏障防止抗菌药物渗透。

发明内容

有鉴于此，本申请提供了抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒及制备方法和肺部吸入制剂，用于解决现有技术中阳离子纳米粒子等抗菌药物难以抵达铜绿假单胞菌感染位置、抗菌效果较低的技术问题。

本申请第一方面提供了抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒，纳米粒包括复合纳米粒和抗菌药物；

所述复合纳米粒包括二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸、聚己内酯-聚乙二醇和聚己内酯化ε-聚赖氨酸；

所述聚己内酯-聚乙二醇和聚己内酯化ε-聚赖氨酸负载抗菌药物构建阳离子抗菌纳米粒；

所述二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸包覆所述阳离子抗菌纳米粒。

优选的，所述抗菌药物包括阿奇霉素。

需要说明的是，阿奇霉素可以抑制群体感应系统下调铜绿假单胞菌的毒力因子表达发挥抗毒力作用，预防细菌根除后的感染复发，具有抗生物被膜和抑制毒力双重作用。

优选的，所述抗菌药物还包括但不限于环丙沙星、妥布霉素、链霉素、红霉素或其组合。

本申请第二方面提供了抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒的制备方法，制备方法包括步骤：

步骤S1、将聚己内酯化ε-聚赖氨酸、聚己内酯-聚乙二醇以及抗菌药物溶解在有机溶剂中，加入蒸馏水搅拌过夜；

步骤S2、搅拌过夜后加入二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸搅拌，得到抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒。

优选的，步骤S1中，所述聚己内酯化ε-聚赖氨酸的制备方法包括：将聚己内酯-羧基、N-(3-(二甲氨基)-丙基)-N-乙基碳二酰亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺超声分散在溶剂中，氮气气氛下搅拌过夜。然后加入ε-聚赖氨酸搅拌过夜。产物于水中透析，冷冻干燥得到聚己内酯化ε-聚赖氨酸。

优选的，步骤S2中，所述二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸的制备方法包括：将ε-聚赖氨酸溶解磷酸盐缓冲盐中，加入聚乙二醇-活性酯在氮气流下搅拌过夜，加入二甲基马来酸酐，调整pH值大于7.0，搅拌过夜后于水中透析，冻干得到二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸。

优选的，步骤S1中，抗菌药物包括但不限于阿奇霉素、环丙沙星、妥布霉素、链霉素、红霉素或其组合，聚己内酯-聚乙二醇和聚己内酯化ε-聚赖氨酸的质量比为1:1-16:1。

优选的，步骤S1中，所述溶剂为四氢呋喃。

本申请第三方面提供了肺部吸入制剂，所述肺部吸入制剂包括上述抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒和药用辅料。

需要说明的是，本申请提供的肺部吸入制剂包括聚乙二醇化ε-聚赖氨酸、聚己内酯-聚乙二醇、聚己内酯化ε-聚赖氨酸以及抗菌药物等组成成分，其中，ε-聚赖氨酸能够作为药物的载体在肺部铜绿假单胞菌细菌感染中应用。

优选的，所述肺部吸入制剂包括但不限于吸入气雾剂、干粉吸入剂、吸入喷雾剂或吸入溶液。

综上所述，本申请提供了抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒及制备方法和肺部吸入制剂，抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒包括复合纳米粒和抗生素，复合纳米粒包括二甲马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸、聚己内酯-聚乙二醇、聚己内酯化ε-聚赖氨酸和抗菌药物构建阳离子抗菌纳米粒，二甲马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸对阳离子纳米粒子改性，有利于降低纳米粒子与黏液蛋白相互作用，使纳米粒顺利穿透粘液层，到达铜绿假单胞菌生物被膜层，纳米粒到达铜绿假单胞菌生物被膜层后脱去二甲马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸，使其顺利渗透进入生物被膜内部，提高抗生物被膜作用，聚己内酯化ε-聚赖氨酸靶向铜绿假单胞菌后释放抗菌药物发挥杀菌作用，并提高外膜通透性，从而解决现有技术中阳离子纳米粒子等抗菌药物难以抵达铜绿假单胞菌感染位置、抗菌效果较低的技术问题。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实验例1中测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒人工痰液和生物被膜渗透性实验结果示意图；

图2为本申请实验例2中测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒pH和脂肪酶响应性实验结果示意图；

图3为本申请实验例3中测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒细菌靶向性、内外膜渗透性影响、抗菌活性和抗生素耐药性影响实验结果示意图；

图4为本申请实验例4中测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒抗生物被膜情况实验结果示意图；

图5为本申请实验例5中测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒抗毒力因子实验结果示意图；

图6为本申请实验例6中测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒体内分布实验结果示意图；

图7为本申请实验例7中测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒体内抗菌效果实验结果示意图；

图8为本申请实验例8中测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒安全性评价实验结果示意图；

图9为本申请实验例9中制备得到的抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒表征；

图1中，(a和b)SA-AZINPs或DA-AZI NPs穿透人工痰液示意图(a)和穿透率(b)。(c)在人工痰液中孵育1h后SA-AZINPs或DA-AZI NPs的聚集率，(d-f)SA-AZI NPs或DA-AZINPs与人工痰液孵育的激光共聚焦图像(d)，以及人工痰液中纳米粒的总荧光强度(e)和标准化荧光分布(f)，(h和g)SA-AZI NPs或DA-AZI NPs与生物被膜孵育的激光共聚焦图像(g)，以及洗涤前后生物被膜内检测到的纳米粒荧光强度(h)，比例尺：30μm；

图2中，(a和b)SA-AZI NPs和DA-AZI NPs在pH 7.4或pH 6.5条件下孵育2h后的马尔文粒径直径和透射电镜图像(a)和ζ电位(b)，比例尺为：200nm，(c和d)DA-AZI NPs在PBS(pH 7.4)中与含或不含脂肪酶孵育8h后的马尔文粒径(c)和透射电镜图像(d)，比例尺：200nm，(e)SA-AZI或DA-AZI NPs在不同条件下的累积释放；

图3中，(a)GFP-P.aeruginosa的激光共聚焦图像，用尼罗河红标记的SA-AZI NPs或DA-AZINPs在pH值6.5条件下孵育铜绿假单胞菌，比例尺：20μm，(b)DA-AZI NPs与GFP-P.aeruginosa之间的相互作用，(c和d)不同处理后P.aeruginosa的外膜通透性(c)和内膜通透性(d)，(e和f)P.aeruginosa经不同处理后的MIC(e)和MBC(f)，(g)在亚MIC浓度游离AZI或DA-AZI NPs存在的情况下，细菌连续传代过程中的耐药发展情况；

图4中，(a和b)游离AZI、SA-AZI NPs和DA-AZI NPs处理生物被膜24h后的琼脂平板图像(a)和CFU(b)，(c)SYTO9/PI染料染色后生物被膜的激光共聚焦图像，比例尺：30μm。(d)不同处理后生物被膜的扫描电镜图像，比例尺：5μm；

图5中，(a-e)P.aeruginosa经不同处理后产生的绿脓菌素(a)、铁载体(b)、蛋白酶(c)、弹性蛋白酶(d)和鼠李糖脂(e)的含量，(f)不同处理后的细菌与RAW 264.7细胞共同培养后的细胞活力，(g)亚抑制浓度的AZI、SA-AZI NPs或DA-AZI NPs处理细菌2h后的激光共聚焦图像，比例尺：30μm，(h-i)不同处理后生物被膜形成的浓度(h)和时间依赖(i)；

图6中，(a和b)吸入游离DiR染料或DiR标记的DA-AZI NPs后主要器官的体外荧光成像(a)和定量分析(b)，(c和d)感染小鼠肺部吸入DiR标记的SA-AZI NPs或DA-AZINPs2 h后免疫荧光成像(c)和共定位分析(d)，比例尺：60μm；

图7中，(a-e)BALF中IL-6(a)、IL-10(b)、TNF-α(c)、MIP-2(d)和血清中PCT(e)等炎症相关细胞因子的含量。(g-f)BALF中炎症细胞的显微镜图像(f)和不同处理后中性粒细胞与巨噬细胞比例的定量分析(g)，比例尺:100μm，(h)BALF不同处理后中性粒细胞的流式细胞术分析，(i)实验期间小鼠的体重曲线，(j)不同处理后小鼠的细菌负荷(n＝6)，(k)H&E染色肺切片的组织学评价，标尺：200μm；

图8中，(a-e)不同处理后小鼠血液生化指标的变化，(f)不同处理后小鼠主要器官的H&E染色；

图9中，(a)PCL-ε-PLL的核磁氢谱，(b)PEG-PLL-DA的核磁氢谱，(c)PEG-PLL-SA的核磁氢谱，(d-e)PCL-ε-PLL对BEAS-2B细胞(d)和RAW264.7细胞毒性考察(e)，(f-g)PCL-PEG和PCL-PLL不同比例制备得到的阳离子纳米粒的抗菌效果(f)和AZI载药量(g)，(h)PCL-ε-PLL和PEG-PLL-DA不同比例混合制得的纳米粒ζ电位，(i)载不同抗生素纳米粒抑制生物被膜形成效果。

具体实施方式

本申请提供了抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒及制备方法和肺部吸入制剂，用于解决现有技术中阳离子纳米粒子等抗菌药物难以抵达铜绿假单胞菌感染位置、抗菌效果较低的技术问题。

下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

实施例中，术语为如下所示：

1.P.aeruginosa：铜绿假单胞菌

2.EPS：胞外多聚物

3.AZI：阿奇霉素

4.LPS：脂多糖

5.DA：二甲基马来酸酐

6.PCL-PLL：聚己内酯化ε-聚赖氨酸

7.PCL-PEG：聚己内酯-聚乙二醇

8.PEG-PLL-DA：二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸

9.DA-AZINPs：二甲基马来酸酐修饰的载阿奇霉素抗菌纳米粒

10.DA-CIPNPs：二甲基马来酸酐修饰的载环丙沙星抗菌纳米粒

11.DA-SMNPs：二甲基马来酸酐修饰的载链霉素抗菌纳米粒

12.DA-TOB NPs:二甲基马来酸酐修饰的载妥布霉素抗菌纳米粒

13.DA-EMNPs:二甲基马来酸酐修饰的载红霉素抗菌纳米粒

14.SA-AZINPs：琥珀酸酐修饰的载阿奇霉素抗菌纳米粒

15.PLL-AZI NPs：阳离子抗菌纳米粒

16.ζ电位：Zeta电位

17.CF：囊性纤维化患者

18.SA：琥珀酸酐

19.PBS：磷酸盐缓冲盐

20.QS:群体感应系统

10.Beas-2B cell:人支气管上皮细胞

11.RAW264.7 cell：小鼠单核巨噬细胞白血病细胞

12.GFP-P.aeruginosa：绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌

13.SYTO9/PI：死活菌染料

14.Papp值：表观渗透系数

15.DMEM：高糖培养基

16.MIC：最低抑菌浓度，在微生物鉴定的稀释法中以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度

17.MBC：最低杀菌浓度(MBC)，能够杀灭培养基内细菌(即杀死99.9％

供试微生物)的最低浓度。

18.DiR：一种亲脂性、近红外荧光染料

19.BALF：肺泡灌洗液

20.H&E切片：苏木精-伊红切片

21.Wright Giemsa：瑞姬染液，用于区分免疫细胞

22.IL-6：白细胞介素-6

23.MIP-2：趋化因子-2

24.IL-10：白细胞介素-10

25.TNF-α：肿瘤坏死因子-α

26.PCT：降钙素原

27.AST：谷草转氨酶

28.ALT：丙氨酸氨基转移酶

29.BUN：尿素氮

30.LDH：乳酸脱氢酶

31.CRE：血肌酐

实施例1

鉴于现有技术中阳离子纳米粒子等抗菌药物难以抵达铜绿假单胞菌感染位置、抗菌效果较低的缺陷，本申请实施例1提供了一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒，纳米粒包括复合纳米粒和抗菌药物；复合纳米粒包括二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸、聚己内酯-聚乙二醇和聚己内酯化ε-聚赖氨酸；聚己内酯-聚乙二醇和聚己内酯化ε-聚赖氨酸负载抗菌药物构建阳离子抗菌纳米粒；二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸包覆所述阳离子抗菌纳米粒。

铜绿假单胞菌感染患者往往伴随着纤毛受损、黏液分泌异常增加、纤毛运输减少和气道表面液体减少的临床特征，气道积聚的黏液层是阻碍抗菌药物到达感染部位的第一道屏障，有效的克服感染患者气道中异常的黏液屏障是使得药物足量到达感染部位是改善抗菌效果的关键点，本申请提供的抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒减弱了黏液层与阳离子纳米粒相互作用，从而容易穿过黏液层；铜绿假单胞菌的生物被膜是细菌产生大量胞外多聚物(EPS)将其包绕形成的膜样微生物集合体，致密的生物被膜通过限制抗菌药物的渗透、切断营养物质的供应下调细菌代谢，大幅度增加内部细菌突变频率和基因平行转移等提高细菌的耐药性，本申请提供的抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒通过在穿过黏液层，到达铜绿假单胞菌的生物被膜位置时，聚乙二醇化的ε-聚赖氨酸亲水性优异从而增加渗透进入生物被膜的能力，并响应铜绿假单胞菌被膜层的低pH微环境脱去二甲马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸负电荷外层，实现电荷翻转暴露出负载抗菌药物的聚己内酯化ε-聚赖氨酸，小尺寸的负载抗菌药物的聚己内酯化ε-聚赖氨酸可以有效渗透进入生物被膜内部，靶向铜绿假单胞菌并原位释放抗菌药物发挥杀菌作用；铜绿假单胞菌外膜是磷脂和脂多糖(LPS)的不对称双分子层，内含形成β-桶状蛋白通道的孔蛋白，形成了亲水性和疏水性药物的渗透屏障，此外，脂多糖碳水化合物的低流动性和类脂A具有复杂的空间结构，作为选择性屏障防止抗菌药物渗透。外膜上会存在两种膜孔蛋白，抗菌药物通过相对比较大的膜孔蛋白将抗菌药物转运进入具体，但由于先天性缺乏或者基因突变导致菌体外膜缺乏转运抗菌药物的外膜蛋白例如OprF、OprD、OprH。P.aeruginosa极低的外膜渗透性限值了大多数抗生素的渗透，具有较高的固有耐药性，本申请提供的抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒可以提高外膜通透性协同抗菌药物发挥抗菌作用；从而解决现有技术中阳离子纳米粒子等抗菌药物难以抵达铜绿假单胞菌感染位置、抗菌效果较低的技术问题；本申请实施例1提供的抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒可用于体内、体外抗铜绿假单胞菌感染的治疗。

作为优选，抗菌药物优选阿奇霉素，抗菌药物阿奇霉素可以抑制群体感应系统下调铜绿假单胞菌的毒力因子表达发挥抗毒力作用，预防细菌根除后的感染复发，因此，当本申请提供的抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒负载抗菌药物阿奇霉素时，具有抗生物被膜和抑制毒力双重作用。

作为优选，本申请提供的抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒还可以负载其他抗菌药物，功效上相互协同发挥抗菌和抗生物被膜效果，拓宽纳米粒应用范围；其中，抗菌药物包括但不限于环丙沙星、妥布霉素、链霉素、红霉素或其组合。

实施例2

本申请实施例2提供了实施例1所述抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒的制备方法，制备方法包括步骤：制备聚己内酯化ε-聚赖氨酸、制备二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸以及制备抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒。

其中，制备聚己内酯化ε-聚赖氨酸包括将聚己内酯-羧基、N-(3-(二甲氨基)-丙基)-N-乙基碳二酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺超声分散在四氢呋喃中，氮气气氛下搅拌过夜，然后加入ε-聚赖氨酸搅拌过夜，产物于水中透析，冷冻干燥得到聚己内酯化ε-聚赖氨酸(PCL-ε-PLL)；

制备二甲基马来酸酐修饰聚乙二醇化ε-聚赖氨酸包括将ε-聚赖氨酸溶解磷酸盐缓冲盐中，加入聚乙二醇-活性酯在氮气流下搅拌过夜，加入二甲基马来酸酐，调整pH＞7.0，搅拌过夜后于水中透析，冻干得到二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸(PEG-PLL-DA)；

制备抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒包括将聚己内酯化ε-聚赖氨酸、聚己内酯-聚乙二醇以及抗菌药物溶解在四氢呋喃中，加入蒸馏水搅拌过夜，加入二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸搅拌，得到抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒(DA-AZI NPs)。

结晶紫染色法测定生物被膜形成，将细菌悬液接种于存在载不同抗菌药物纳米粒的96孔板中，孵育24h后，用PBS冲洗去除浮游细胞，用0.1％结晶紫染色，最后加入95％乙醇，在OD₅₇₀下测定吸光度此外，通过在预定时间内测量不同样品(1/8MIC)存在下的生物被膜形成，评估对生物被膜形成的抑制作用。

制备产物的表征如图9所示，核磁氢谱表明PCL-PLL、PEG-PLL-DA、PEG-PLL-SA的成功合成(图9a-c)，PCL-ε-PLL在浓度为1600μg/mL时对Beas-2B cell和RAW264.7 cell均无毒性作用(图9d,e)，相对于其他阳离子材料细胞毒性更小，PCL-PEG和PEG-PLL的质量比在1:1-16:1之间形成的纳米粒具有较高的抗菌能力，在4:1-16:1之间具有较高的抗菌药物载药量(图9f,g)，因此确定最佳比例为4:1进行后续评价。PEG-PLL-DA具有有效的电荷屏蔽作用(图9h)。DA-AZINPs相较于其他抗生素纳米粒具有最强的抑制生物被膜形成作用(图9i)。DA-AZI NPs是直径为131±4.2nm的球体(图2a)，在pH＝7.4时具有轻微带负电的表面，DA-AZI NPs的尺寸和电荷足以顺利穿透黏液。

实施例3

本申请实施例3提供了一种肺部吸入制剂，肺部吸入制剂包括实施例1所述抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒和药物上可接受的辅料。

本申请实施例3提供的肺部吸入制剂中抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒的生物相容性好，可降解、对肺部无毒副作用，从而可用于肺部铜绿假单胞菌抗菌治疗。

实施例4

本申请实施例4提供了一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒(SA-AZI NPs)，该纳米粒包覆聚己内酯化ε-聚赖氨酸的负电荷外层为琥珀酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸，作为实施例1所述抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒(DA-AZI NPs)的对比例。

其中，琥珀酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸的制备方法与实施例2中制备方法的区别在于制备抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒的过程中，加入琥珀酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸。

实验例1

本申请实验例1提供用于测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒(SA-AZI NPs)和抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒(DA-AZI NPs)在人工痰液和生物被膜渗透性实验。

实验过程为：尼罗红标记的纳米粒在人工痰液中孵育1h后收集上清液，测定上清液和初始纳米粒溶液的荧光强度，计算纳米粒的聚集率，使用了Transwell系统测量人工痰液中纳米粒的Papp值，将人工痰液置于带有聚碳酸酯膜的Transwell上，同时在接收池中加入PBS，将纳米粒添加到人工痰液表面，在37℃的摇床中孵育，在预定的时间点，样品从接收池中取出，检测荧光强度并计算Papp值，使用激光共聚焦显微镜记录纳米粒在人工痰液中的穿透过程；

和人工痰液类似，建立GFP-P.aeruginosa流动生物被膜模型，使用激光共聚焦显微镜记录纳米粒在生物被膜中的渗透过程。

实验结果表明：相比于对照组纳米粒，DA-AZI NPs在人工痰液中聚集率均较低，为26.2％(图1c)。它们的Papp值约为PLL-AZINPs的4.5倍(图1a,1b)，表明DA-AZI NPs具有更强的穿透粘液的能力。聚乙二醇使NPs具有隐身性能，有利于黏液的渗透(图1d)。DA-AZINPs在40min内就能穿透人工痰液并均匀分布，而PLL-AZINPs在60min内穿透能力较差，并伴有聚集的发生(图1e,f)。DA-AZI NPs比SA-AZINPs在生物被膜中穿透速度更快、范围更广(图1g)。PBS洗涤后，在生物被膜中观察到的DA-AZINPs荧光没有明显变化(图1g)。这些结果表明，DA-AZI NPs可以有效地跨越黏液和生物被膜两道屏障实现生物被膜内部长时间并靶向铜绿假单胞菌。

实验例2

本申请实验例2提供了抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒体外药物释放量测试。

实验过程为：使用粒径仪测量DA-AZINPs不同pH和有无脂肪酶的PBS中孵育后的粒径和ζ电位，用透射电子显微镜观察纳米颗粒的形貌，在不同pH值和有无脂肪酶的缓冲液中测定纳米颗粒的体外药物释放量。

实验结果为：在pH为6.5的酸性微环境中DA-AZI NPs的粒径变小(图2a)，ζ电位从-3.29mV变为11.2mV(图2b)。在富含脂肪酶的介质中，阳离子纳米粒的大小显著增加，达到224.7±32nm(图2c)，伴有碎片(图2d)。当pH值为7.4时，DA-AZI NPs在生理条件下药物泄漏有限，在脂肪酶的存在下DA-AZI NPs在24h内释放超过70％的AZI，在孵育48h后释放高达80.2％(图2e)。

实验例3

本申请实验例3提供了测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒细菌靶向性、内外膜渗透性影响、抗菌活性和抗生素耐药性影响实验。

实验过程为：使用尼罗红标记纳米粒，PBS洗涤3次去除培养基后与纳米粒在pH6.5下孵育15min。然后，将细菌悬浮液洗去，使用激光共聚焦进行成像。

使用NPN探针测得外膜渗透性。将细菌悬液与NPN探针预孵育5min，然后加入游离AZI或pH为6.5的纳米粒溶液，用微量滴定板分析仪测定NPN荧光以测得外膜渗透性。

根据细胞内ATP的释放量测定细菌内膜通透性。调整细菌OD₆₀₀＝0.4，与游离AZI或纳米粒孵育后收集样本并使用ATP检测试剂盒进行检测。

采用肉汤微量稀释法和稀释平板计数法测定MIC和MBC。将细菌接种在96孔板中。然后，将含有两倍连续稀释样品的LB肉汤放入板的每个孔中。37℃孵育24h后，测得OD₆₀₀确定MIC。随后，将无明显细菌生长的悬浮液涂布LB琼脂板上，菌落形成的最低浓度为MBC。

在亚致死剂量处理下进行抗生素耐药试验。P.aeruginosa在含有1/2MIC浓度的游离AZI或纳米粒的LB肉汤中每隔24h传代一次。记录每次传代后细菌的MIC值以评估抗生素耐药性的发展。

实验结果为：DA-AZINPs与P.aeruginosa具有强烈的相互作用(图3a,b)，说明纳米粒可以靶向并黏附于细菌外膜。DA-AZI NPs表现出与PLL-AZI NPs相似的渗透性，使NPN能够穿透外膜，产生强烈的荧光(图3c)。DA-AZI NPs对细菌的内膜也造成了明显的损伤，导致ATP的通透性较高(图3d)。除阳性对照外，其余各组均未观察到对真核细胞具有损伤作用(图3h)，说明DA-AZI NPs可选择性渗透细菌内外膜而不损伤细胞。DA-AZI NPs抗菌活性较强，其MIC和MBC分别比AZI低2倍和4倍(图3e,f)。这与DA-AZI NPs治疗后细菌膜通透性增加，对抗生素的吸收增强有关。

实验例4

本申请实验例4提供了测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒抗铜绿假单胞菌生物被膜情况实验。

实验过程为：将细菌悬液接种于96孔板中，37℃培养24h。随后用PBS洗板去除浮游细菌，然后在pH 6.5下与游离AZI或纳米粒孵育生物被膜，之后超声涡旋分散生物被膜，用稀释平板计数法测定生物被膜中细菌的存活数量。

在CLSM实验中，使用流动培养基培养生物被膜，用浓度为256μg/mL的游离AZI或NPs处理24h，之后用SYTO9/PI染色15min，使用激光共聚焦显微镜进行观察。

利用扫描电镜进一步观察生物被膜的形态，将无菌显微镜载玻片置于12孔板中，每孔板接种细菌悬液在载玻片上形成生物被膜。AZI或纳米粒(256μg/mL)处理后，用2.5％戊二醛固定过夜，然后用乙醇溶液依次脱水。最后，用流动的二氧化碳对载玻片进行干燥，喷金，使用扫描电镜进行观察。

使用BEAS-2B细胞上测试了DA-AZINPs的细胞毒性。采用兔红细胞进行溶血实验将红细胞悬液与等体积的SA-AZINPs或DA-AZINPs在37℃孵育1、2、3、4h。阴性和阳性对照分别为PBS和0.5％Triton X-100。4℃1000g离心5min，576nm处测上清液吸光度，计算溶血率。

实验结果为：与浮游细菌相比，DA-AZINPs对细菌清除率最高(图4a,b)。DA-AZINPs对铜绿假单胞菌生物被膜显示出显著的根除效果，绝大多数细菌在孵育24小时后失活(图4c)。DA-AZI NPs处理后，部分细菌出现收缩，出现膜变形和断裂的现象(图4d)。在用于根除生物被膜的浓度下，DA-AZI NPs没有细胞毒性和溶血活性(图4e,f)。

实验例5

本申请实验例5提供了测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒抗毒力因子作用实验。

实验过程为：细菌在pH 6.5下与游离AZI或纳米粒孵育24h后，收集上清液检测毒力因子。

绿脓菌素和铁载体测定：将培养上清液用Tris–HCl稀释3倍，并测定OD₄₀₅处的吸光度。上清液与500μL氯仿混合，然后加入300μL 5mM HCl。在OD₅₂₀处测定吸光度。

蛋白酶和弹性蛋白酶活性测定：偶氮酪蛋白和刚果红(ECR)分别用作底物来评估蛋白酶和弹性蛋白酶活性。对于蛋白酶，将培养上清液与等体积的1％偶氮酪蛋白在37℃下孵育1h，加入7％冰高氯酸。离心后，向上清液中加入10M氢氧化钠，并在OD₄₃₀下测定吸光度。对于弹性蛋白酶，将培养上清液与ECR缓冲液在37℃下孵育3h。然后去除不溶性ECR，在OD₄₉₅处下测定吸光度。

鼠李糖脂测定：用乙醚提取上清液两次。将乙醚馏分蒸干，用蒸馏水重悬。加入1.6％甲醇和70％硫酸，80℃下孵育30分钟，在OD₄₂₁下测定吸光度。

使用RAW264.7细胞测量不同处理后P.aeruginosa培养基的毒性。将在96孔板中培养的RAW264.7细胞加入不同处理培养基孵育1h。随后，在每个孔中加入DMEM，孵育24小时测定细胞活力。

对BEAS-2B细胞进行细菌粘附试验。BEAS-2B细胞加入24孔共聚焦板中，孵育24h。Hoechst染色30min，用GFP-P.aeruginosa感染荧光标记的细胞。最后，用PBS洗干净，于激光共聚焦显微镜下观察。

结晶紫染色法测定生物被膜形成。将细菌悬液接种于存在游离AZI或纳米粒的96孔板中。37℃孵育24h后，用PBS冲洗去除浮游细胞，用0.1％结晶紫染色30min。最后加入200μL 95％乙醇，在OD₅₇₀下测定吸光度此外，通过在预定时间内测量不同样品(1/4MIC)存在下的生物被膜形成，评估对生物被膜形成的时间依赖性抑制作用。

实验结果为：除鼠李糖脂外，所有毒力因子与游离AZI或纳米粒在亚抑制浓度下孵育后均降低，且DA-AZINPs处理后毒力因子水平最低(图5a-e)。DA-AZI NPs处理组细胞活力保持在80％以上，说明DA-AZINPs在一定程度上可以保护宿主细胞免受毒力因子的损伤(图5f)。DA-AZINPs对P.aeruginosa黏附的抑制作用较其他组强(图5g)，这表明DA-AZI NPs可以有效抑制P.aeruginosa感染复发。DA-AZINPs对生物被膜的形成均表现出浓度和时间依赖性的抑制活性，抑制率最高，在1/4MIC条件下可抑制约90％的生物被膜形成(图5h,i)。

实验例6

本申请实验例6提供了测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒体内分布实验。

实验过程为：使用琼脂珠包埋方法建立小鼠P.aeruginosa慢性肺部感染模型，每只小鼠感染菌量为1×10⁷CFU。建立慢性肺部感染模型后，将DiR标记的DA-AZI NPs和游离DiR染料雾化至感染小鼠。在给药后0、12、24h测量主要脏器的荧光信号。

为了比较纳米粒在感染肺部的分布，给药后2小时，处死小鼠。取肺，PBS冲洗，-80℃立即保存。冷冻组织切片，使用DAPI染色。用激光共聚焦显微镜对切片进行成像。

实验结果为：与游离DiR染料相比，DA-AZI NPs表现出长时间的肺滞留和较低的全身暴露(图6a,b)。免疫荧光成像(图6c)显示，DA-AZI NPs组铜绿假单胞菌与纳米粒具有更强的共定位关系，皮尔森系数证实了这一点(图6d)，说明DA-AZI NPs比SA-AZINPs更能到达感染部位并在感染部位积累。

实验例7

本申请实验例7提供了测试抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒体内抗菌效果实验。

实验过程为：小鼠感染5天后，将游离AZI、SA-AZI和DA-AZI NPs以15mg/kg(等量AZI)的剂量雾化吸入感染小鼠体内，每日1次，连续2天，停药后观察小鼠1天。感染8天后，取一部分小鼠收集BALF。之后，收集感染的肺匀浆并涂板。感染小鼠肺部细菌负荷以肺匀浆和BALF中细菌总数表示。剩余的BALF离心用于分析细胞因子和炎症细胞。使用ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6、MIP-2、IL-10和TNF-α。用CD11b和Ly6G抗体标记中性粒细胞，使用流式细胞术和Wright-Giemsa染液检测炎性细胞。同时采用ELISA试剂盒检测血清中PCT的含量。治疗后进行肺组织学检查，处死未灌洗小鼠取肺，进行H&E染色。

实验结果为：与对照组相比，DA-AZI NPs处理的小鼠中观察到的促炎细胞因子包括IL-6、TNF-α和MIP-2水平最低(图7a-c)。然而，不同处理对抗炎细胞因子IL-10的产生没有影响(图7d)。此外，DA-AZI NPs治疗后，血清中反映全身感染和炎症程度的(PCT含量也显著降低(图7e)。DA-AZI NPs组炎性细胞总数减少，中性粒细胞/巨噬细胞比值降低(图7f,g)。流式细胞术分析也显示DA-AZINPs治疗后中性粒细胞浸润减少到12.0％(图7h)。接种细菌后小鼠体重显著下降，但各组体重均有恢复，说明小鼠产生了铜绿假单胞菌慢性肺部感染(图7i)。DA-AZI NPs组处理后的小鼠肺中观察到细菌负荷下降最多，超过2个数量级(图7j)。对照小鼠肺组织分析显示肺病变严重，有明显炎症浸润，肺泡间隔明显增厚。DA-AZINPs处理小鼠的肺结构保持相对正常，没有明显的炎症浸润和肺泡损伤迹象，提示根除生物被膜膜后肺损伤恢复(图7k)。

实验例8

本申请实验例8提供了测试抗铜绿假单胞菌感染的安全性评价实验。

实验过程为：将实施案例7中的小鼠主要器官切片，进行组织学检查。采血使用ELISA试剂盒分析血生化指标，包括AST、ALT、BUN、LDH和CRE。

实验结果为：小鼠血液生化指标均在正常范围内，说明DA-AZINPs对肝肾功能无不良影响(图8a-e)。组织学检查显示，心、肝、脾、肾等主要器官组织结构保持正常，无明显病变，证明DA-AZI NPs在体内具有良好的生物相容性(图8f)。

以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

Claims (8)

1.一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒，其特征在于，所示纳米粒包括复合纳米粒和抗菌药物；

所述复合纳米粒包括二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸、聚己内酯-聚乙二醇和聚己内酯化ε-聚赖氨酸；

所述聚己内酯-聚乙二醇和聚己内酯化ε-聚赖氨酸负载抗菌药物构建阳离子抗菌纳米粒；

所述二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸包覆所述阳离子抗菌纳米粒。

2.根据权利要求1所述的一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒，其特征在于，所述抗菌药物包括但不限于阿奇霉素、环丙沙星、妥布霉素、链霉素、红霉素或其组合。

3.权利要求1-2任一项所述一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒的制备方法，其特征在于，制备方法包括步骤：

步骤S1、将聚己内酯化ε-聚赖氨酸、聚己内酯-聚乙二醇以及抗菌药物溶解在有机溶剂中，加入蒸馏水搅拌过夜；

步骤S2、搅拌过夜后加入二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸搅拌，得到抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒。

4.根据权利要求3所述的一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述聚己内酯化ε-聚赖氨酸的制备方法包括：将聚己内酯-羧基、N-(3-(二甲氨基)-丙基)-N-乙基碳二酰亚胺以及N-羟基琥珀酰亚胺超声分散在溶剂中，氮气气氛下搅拌过夜，加入ε-聚赖氨酸搅拌过夜，产物于水中透析，冷冻干燥得到聚己内酯化ε-聚赖氨酸。

5.根据权利要求4所述的一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸的制备方法包括：将ε-聚赖氨酸溶解磷酸盐缓冲盐中，加入聚乙二醇-活性酯在氮气流下搅拌过夜，加入二甲基马来酸酐，调整pH大于7.0，反应过夜后于水中透析，冻干得到二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇化ε-聚赖氨酸。

6.根据权利要求4所述的一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述抗菌药物包括但不限于阿奇霉素、环丙沙星、妥布霉素、链霉素、红霉素或其组合，聚己内酯-聚乙二醇和聚己内酯化ε-聚赖氨酸的质量比为1:1-16:1。

7.一种肺部吸入制剂，其特征在于，所述肺部吸入制剂包括权利要求1-2任一项所述的一种抗铜绿假单胞菌感染的纳米粒和药用辅料。

8.根据权利要求7所述的一种肺部吸入制剂，其特征在于，所述肺部吸入制剂包括但不限于吸入气雾剂、干粉吸入剂、吸入喷雾剂或吸入溶液。

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