CN116254256A - 一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,将源自新型冠状病毒受体结合域的RBD作为靶向递送载体,将源自新型冠状病毒及其变异毒株的各毒株共有RNAi序列siRNA合成shRNA,并使shRNA正反义链分别连接RBD的N端,构成以RBD靶向递送shRNA的具有靶向基因药物和大分子疫苗双重作用的化合物,并使RBD和shRNA相互增效产生诸多新功能。其中shRNA既是广谱抗病毒药物又是使RBD疫苗增效的免疫佐剂;RBD作为靶向递送载体从而可避免非靶向治疗的副作用,同时RBD又是蛋白疫苗,其免疫产生的抗‑RBD能中和病毒、阻止病毒通过ACE2感染,且2分子RBD与shRNA合成的化合物增加了分子量及结构复杂性从而增强抗原性,被RBD结合的shRNA不易被酶降解、易通过细胞膜、易被递送到靶细胞浆。
Description
技术领域
本发明涉及一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,属于生物制药领域。
背景技术
新型冠状病毒的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N),其中S蛋白的N端由结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成,新型冠状病毒通过其受体结合域S1-RBD与宿主细胞受体ACE2结合引起感染。
ACE2为I型跨膜糖蛋白,由805个氨基酸组成,包括跨膜区、胞内羧基端和胞外氨基端,冠状病毒通过其S1-RBD与ACE2的细胞外催化结构域互动结合,导致细胞内吞、膜融合,使病毒进入表达ACE2或含有ACE2受体的细胞。
因新冠病毒通过其RBD与ACE2结合引起感染,所以现有疫苗基本针对RBD进行研发,已有多款疫苗用于临床,世界各国也尝试了如瑞德西韦、洛西那韦、利托那韦、氯喹、羟氯喹、激素、干扰素等药物,虽然取得了某些效果,但特别是针对变异毒株目前仍缺少特效药。
RNA干扰(RNAi)作为一种高效的序列特异性基因沉默技术,正在给疾病的治疗带来难以想象的应用前景,已有多种siRNA药物被FDA审批上市。小干扰RNA(siRNA)大约21~23bp,以参与RNA干扰(RNAi)的方式调节基因表达,特异性降解与之互补的靶信使RNA(mRNA),但无论是细胞水平还是活体内,使用siRNA进行基因干扰均要克服很多困难:1)膜通透性:siRNA带有大量的负电荷,分子量大(~13KD),自身很难穿过细胞膜,运输siRNA主要靠化学修饰和一些运输载体;2)抗核酸酶降解:siRNA由大量的核糖核酸分子构成,很容易被外界的RNA酶降解,如果在设计siRNA及选择运输载体时不对碱基进行特定的化学修饰或采取载体保护方法,则在siRNA进入作用位点前即被RNA酶降解;3)靶向递送及载体:siRNA的作用位点主要在靶细胞浆内,所以需将siRNA特异性递送给靶细胞浆,如果不能有效地选用合适的靶向递送载体并及时使siRNA从内涵体释放到胞浆,通常可激活细胞免疫反应,导致干扰素等细胞因子的释放,所以,如何有效地将siRNA运输并释放到靶细胞浆是影响RNAi效果的瓶颈问题,有些siRNA能导致序列或浓度依赖性非特异性基因沉默即脱靶,因此,在设计siRNA时,应同时考虑靶向递送、基因抑制效果以及尽可能选择低脱靶效应的序列。
在COVID-19的防治中,如果能以合适的靶向递送载体将nCoVsiRNA稳定地、特异地依次递送给靶器官、靶组织、靶细胞、定位于靶细胞、穿越靶细胞膜、释放到靶细胞浆,并对多种变异毒株广谱有效,就应能更好地开展COVID-19的靶向基因治疗。
所以,本发明要合成一种以RBD靶向递送shRNA的化学药物nCoVshRNA·2RBD。
发明内容
本发明的目的是要提供一种以RBD靶向递送shRNA的nCOVsiRNA药物及其合成和用途;在nCOVsiRNA药物中,shRNA具有靶向基因治疗和免疫佐剂的双重作用,RBD具有靶向递送和蛋白疫苗的双重作用,脂质体具有稳定shRNA、细胞转染和免疫佐剂的作用。
本发明的目的通过以下技术方案实施:
筛选抗变异毒株靶标siRNA,合成shRNA,进而在shRNA双链末端分别延接RBD多肽,合成集新冠病毒靶向药物和新型疫苗为一体的化学药物nCoVshRNA·2RBD。
抗变异毒株靶标的筛选:从各种致病性冠状病毒及其变异毒株的共有基因中筛选siRNA,这种共有基因包括保守基因、超保守基因和/或保守微卫星,使所筛选的siRNA为不随病毒变异而改变的各变异毒株的共同靶标,使之具有广谱抗变异毒株的作用。
合成抗变异毒株靶标siRNA:将筛选的siRNA合成2条互补的21-25nt的寡核苷酸siRNA,并合成起间隔作用的碱基序列。
合成shRNA:将已合成的2条互补寡核苷酸多肽siRNA和起间隔作用的碱基序列进一步合成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shRNA双链。
优选siRNA:将合成的shRNA构建干扰载体,检测其mRNA表达、蛋白表达和干扰效果,经siRNA设计、合成、筛选、迭代设计和验证,优选具有高沉默效率的siRNA。
合成优选的siRNA和shRNA:采用优选的siRNA序列按上述所述合成siRNA、shRNA,包括为增加稳定性和避免脱靶进行的化学修饰。
合成RBD多肽或蛋白:合成位于但不限于冠状病毒S蛋白的第319-510位氨基酸序列、位于但不限于N439、V483和Q493位点的保守氨基酸序列及经密码子优化的氨基酸序列。
化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成:以二硫键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、硫醚键、肟键、酰胺键或马来酰亚胺-巯基键等偶联方法将已合成的shRNA和RBD进行连接;或根据shRNA的核苷酸序列和RBD的氨基酸序列合成RBD-shRNA-RBD。
化合物的提纯:以高效液相色谱、反向高效液相色谱或离子交换色谱提纯化合物。
化合物的脂质体修饰:通过带负电荷的shRNA吸附带正电荷的脂质体制备脂质体修饰化合物;通过RBD氨基的巯基化使巯基与脂质体的马来酰胺形成马来酰亚胺-巯基键制备PEG内化的脂质体修饰化合物;通过RBD氨基末端与脂质体形成氨甲酸酯键制备脂质体修饰化合物;通过RBD或RBD片段连接脂质体修饰的siRNA制备脂质体或脂质纳米粒修饰的化合物。
化合物的验证:在体外细胞水平检测化合物对2种或以上不同变异毒株的抗病毒效果,观察是否具有以保守基因为靶标的广谱抗变异毒株作用;检测化合物在动物体内是否具有靶向递送shRNA的RNAi作用、疫苗的免疫作用以及是否有免疫增强的效果。
本发明的有益效果在于:
首次发现源自冠状病毒受体结合域的新型靶向递送载体RBD和源自冠状病毒保守基因的广谱抗变异毒株靶标shRNA,并将RBD和shRNA合成为以RBD靶向递送shRNA的化学药物nCoVshRNA·2RBD。其中shRNA起广谱抗变异毒株和免疫佐剂的作用,RBD起靶向递送shRNA、保护shRNA和蛋白疫苗的作用,并使RBD和shRNA相互增效,进一步产生诸多新功能。
本发明与传统siRNA药物的区别特征是:本发明从各种冠状病毒及其变异毒株中筛选不随病毒变异而改变的各毒株共同靶标siRNA,使这种siRNA具有广谱抗变异毒株作用。
本发明与传统siRNA药物的区别特征是:传统siRNA药物使用正义链siRNA或反义链siRNA,即使用单链siRNA;而本发明将正反义链siRNA合成shRNA进行使用。根据RNAi机制,双链RNA具有更有效的RNAi作用。所以本发明的设计更正确、更符合RNAi机制。
本发明与传统siRNA药物的区别特征是:本发明以RBD为载体靶向递送shRNA。冠状病毒特异性感染表达ACE2的靶细胞,目前还没有将siRNA特异性递送给病毒感染细胞而不递送给未感染细胞的靶向载体。本发明根据RBD与ACE2的特殊关系,将RBD与shRNA进行连接,使RBD产生靶向递送shRNA的新功能,从而可避免非特异性递送的副作用。
因siRNA/shRNA带负电荷、脂溶性、不易通过细胞膜、极易被核酸酶降解,所以很难被递送到靶细胞浆产生RNAi。但本发明将shRNA与RBD多肽合成为化合物后,因RBD具有穿胞肽特性,所以能保护shRNA不被核酸酶降解,并使之更易通过靶细胞膜被递送到胞浆。
本发明与传统RBD疫苗的区别特征是:本发明以1分子shRNA连接2分子RBD构成二聚体RBD疫苗,其中shRNA为免疫佐剂。以2分子RBD和1分子shRNA合成的化合物,其中RBD和shRNA相加的分子量要比传统单分子RBD疫苗的分子量增加1倍以上,分子结构也更复杂,所以其免疫原性更强。因为免疫佐剂的主要成分是寡核苷酸和脂质,所以本质为寡核苷酸的siRNA或shRNA具有增强RBD疫苗免疫效果的免疫佐剂作用。
脂质体除了使shRNA在体内缓慢释放、药效延长和内吞入浆等作用外,还能作为免疫佐剂增强RBD蛋白的免疫效果。
化学药物中的RBD能与冠状病毒竟争结合ACE2受体,从而起抑制病毒感染的作用。
体外细胞实验表明合成后的化合物对2种不同变异毒株同时有效,说明具有以保守基因为靶标的抗变异毒株作用;体内动物实验表明合成后的化合物在动物体内具有靶向递送的RNAi作用、疫苗的免疫作用以及免疫增强的效果。
本发明以shRNA双链未端连接靶向递送载体RBD制备nCoVsiRNA药物的设计方法有望应用于病毒、细菌、肿瘤、遗传病等siRNA基因治疗药物的制备。
附图说明
图1是本发明制备nCoVsiRNA药物的技术线路图。
图2是本发明的合成和应用示意图。
图3是本发明合成的化合物示意图。
图4是本发明的脂质体修饰siRNA示意图。
图5是本发明的脂质体修饰shRNA示意图。
在图1中,经保守基因筛选、以保守基因为靶标的广谱抗变异毒株靶标siRNA筛选、shRNA合成、RBD合成,最终合成RBD靶向递送的nCoVsiRNA药物。
在图2中,1是以冠状病毒保守基因为干扰靶标的siRNA;2是小发夹shRNA的正反义链,shRNA由2条互补的siRNA退火形成;3是shRNA中由间隔正反义链的碱基序列间隔形成的loop环;4是2条RBD多肽,通过其N氨基分别与shRNA的正反义链相连接;5是表达ACE2受体6的靶细胞,病毒10通过其RBD的C端与ACE2受体6的细胞膜外N端相结合而进入靶细胞5;本发明以RBD靶向递送shRNA的RBD与病毒10的RBD相同,也通过RBD4的C端与ACE2受体6的细胞膜外N端相结合,将shRNA2靶向递送到表达ACE2受体6的靶细胞5内,靶细胞5因含有ACE2受体6而易于感染病毒10;进一步如靶细胞9所示,其细胞内的7和8分别表示因RBD4的靶向递送并通过ACE2受体6而进入靶细胞浆的shRNA和RBD;然后如靶细胞16所示,随着靶细胞9所示的shRNA7被降解为靶细胞16所示的shRNA15,长链RNA的病毒10和11也被降解为小片段的RNA序列14而失活,而原先与shRNA7相连接的RBD8也被解离为RBD12,进而刺激宿主产生抗-RBD12的抗体13。
在图3中,1为loop环,2为由两条互补的正反义链形成的shRNA,3为两条RBD多肽(蛋白),两条RBD分别与shRNA正反义链相连接。shRNA被RBD保护并被RBD靶向递送至ACE2受体,然后随RBD通过ACE2受体而特异性进入靶细胞浆,降解病毒靶基因。
在图4中,1为被脂质体包裹的siRNA,2为脂质体层,3为PEG层,4为RBD。其中siRNA起RNAi作用,脂质体起保护siRNA和引起细胞内吞作用,PEG使siRNA缓慢释放和长效循环,RBD起靶向递送siRNA和疫苗的双重作用。
在图5中,1为loop环,2为由两条互补的正反义链形成的shRNA,3为两条RBD多肽(蛋白),两条RBD分别与shRNA正反义链相连接。4为脂质体层,5为PEG层,shRNA2被脂质体4包裹。其中shRNA起RNAi作用,脂质体起保护shRNA和引起细胞内吞作用,PEG使shRNA缓慢释放和长效循环,RBD起靶向递送和疫苗的双重作用。
具体实施方式
下面结合图1,2、3、4和5,对本发明的具体实施方法作详细的举例描述,但这些范例性的描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
一、设计以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的siRNA
1、超保守基因、保守基因及保守微卫星的设计
如技术线路图1所示,从Genbank数据库(http://www.NCBI.nlm.nih.gov/genome/)中下载β冠状病毒属(特别是新型冠状病毒及其变异毒株)全基因组(cDNA)序列,在全基因组序列中搜寻最长的公共子序列,获得超保守基因或保守基因;利用Clustal W软件对Genbank数据库下载的全基因组进行序列比对,检测不同序列之间的相似度,筛选保守微卫星序列;利用MEGA6.0分子进化遗传分析软件,用邻接法(Neighbour-Jioning,N-J)对下载的冠状病毒氨基酸序列构建氨基酸种系分子进化树,对氨基酸序列的分子变异特征进行分析和优化,推断保守基因序列,作为siRNA合成的依据。
获得以下3段最长及次长的超级保守子序列,其长度为22~30bp,与小RNA长度相当,但在高等生物特别是人类中不包含这3段子序列。具体序列如下:
SEQ ID NO.1(Subsequence 1)=ttaatacgacctctctgttggattttgaca(30bp);
SEQ ID NO.2(Subsequence 2)=ggttcgcaacttcacaca gagt(22bp);
SEQ ID NO.3(Subsequence 3)=caggcgtttgttggttgattaa(22bp)。
获得以下3段最长及次长的保守子序列,它们的长度为22~30bp,与小RNA长度相当,但在高等生物特别是人类中不包含这3段保守子序列:
SEQ ID NO.4(Subsequence 1)=gttttacgacaacgatgttggtttaggaca(30bp);
SEQ ID NO.5(Subsequence 2)=ggttcggttgttatatacgata(22bp);
SEQ ID NO.6(Subsequence 3)=ggttcagagagtctcctattta(22bp)。
获得以下5个由核苷酸重复多次的保守微卫星位点,微卫星分别为CTCTCT、AGAGAG、AAAAAAA、TATATA、CACACA。
2、新冠病毒变异毒株共同靶标siRNA的设计
根据Genbank数据库(http://www.NCBI.nlm.nih.gov/genome/)下载的β冠状病毒属(特别是新型冠状病毒及其变异毒株)的完整基因组(cDNA)序列,利用Ambion公司的shRNA在线设计软件(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNAtools.html)或DSIR等软件,获得长度约为19nt的多个siRNA备选序列,根据RNA结合的Tm值及特异性比对结果,优选siRNA。由此可从目前已发现的18株新冠病毒及其变异毒株的E、M、N、ORF1ab和S基因中获得各毒株各自RNAi序列(siRNA)和各毒株共有RNAi序列即共有靶标siRNA,其中各毒株共有siRNA见表1所示,其序列标记为SEQ ID NO.7~40。例如,表2-5中已做序列号标记的siRNA(SEQ ID NO.41~58)为NC_045512.2、Delta株、Omicron株的共同靶标siRNA,未做序列号标记的siRNA为各自的RNAi序列(siRNA),可见尽管最早出现的NC_045512.2株变异为Delta株和最近的Omicron株,但各毒株中除了各自独有的靶向干扰序列siRNA(未做序列标记部分)外,仍保持不变且理论上具有靶向干扰作用的共同保守序列SEQ ID NO.41~58。
表1从18株新冠病毒变异毒株中筛选的共同靶标siRNA(SEQ ID NO.7~40)
表2新冠病毒NC_045512.2、DELTA、OMICRON株E基因的siRNA候选序列
表3新冠病毒NC_045512.2、DELTA、OMICRON株M基因的siRNA候选序列
表4新冠病毒NC_045512.2、DELTA、OMICRON株N基因的siRNA候选序列
表5新冠病毒NC_045512.2、DELTA、OMICRON株ORF1ab基因的siRNA候选序列
表6新冠病毒NC_045512.2、DELTA、OMICRON株S基因的siRNA候选序列
3、筛选以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的siRNA
利用Clustal W软件或其他软件,将上述设计的超保守基因、保守基因及保守微卫星与常规筛选的siRNA进行基因序列比对,检测不同序列之间的相似度,设计既为超保守基因、保守基因或保守微卫星,又为RNAi靶位点的多对siRNA(设计以超保守基因、保守基因或保守微卫星为靶标的siRNA)。
(1)以超保守基因和保守微卫星为靶标的siRNA(S1/S2):
SEQ ID NO.1(Subsequence 1)=ttaatacgacctctctgttggattttgaca(30bp);
SEQ ID NO.2(Subsequence 2)=ggttcgcaacttcacaca gagt(22bp);
(2)以保守基因和保守微卫星为靶标的siRNA(S3/S4):
SEQ ID NO.5(Subsequence 3)=ggttcggttgttatatacgata(22bp);
SEQ ID NO.6(Subsequence 4)=ggttcagagagtctcctattta(22bp)。
通过上述设计,获得以超保守基因、保守基因或保守微卫星为干扰靶标的在理论上抗冠状病毒变异毒株的siRNA,命名为siRNA1/2/3/4。
二、共同靶标siRNA的验证
1、合成siRNA/shRNA
根据RNAi机制,当siRNA有效干扰S基因的mRNA表达时,会形成失去感染性的S蛋白缺陷型病毒。当siRNA有效干扰N基因的mRNA表达时,会抑制病毒的包装、复制。当siRNA有效干扰ORF1a或1b基因的mRNA表达时,会影响病毒RNA聚合酶(RdRp)或蛋白质加工酶(3CLpro)的合成。而M和E基因是病毒的膜基因,其缺陷对病毒的抑制作用可能不明显。所以本发明选用靶向N基因的siRNA(SEQ ID NO.16-18、SEQ ID NO.49-51)、靶向ORF1ab基因的siRNA(SEQID NO.20-22、SEQ ID NO.52-54)和靶向S基因的siRNA(SEQ ID NO.30-32、SEQ ID NO.56-58),以及SEQ ID NO.1~2、SEQ ID NO.5~6进行合成。另外根据pSilencer4.1.CMV.neo干扰载体的多克隆酶切位点设计能表达发夹结构的shRNA模板,每个模板由两条大部分互补的55bp的单链DNA构成,退火互补后能形成带有BamH I和Hind III酶切位点粘性末端的DNA双链,用于与线性化的pSilencer4.1.CMV.neo的连接。然后按设计的siRNA及其shRNA模板,委托公司合成。
2、shRNA表达载体的构建
将上述合成的shRNA分别与线性化的干扰载体pSilencer4.1.CMV.neo进行连接和鉴定,构建shRNA表达质粒,转化DH5a,分别获得shRNA表达载体。
3、shRNA表达(干扰)载体的效果鉴定
根据合成的siRNA/shRNA及其构建的表达质粒,选择相应的靶基因进行合成或PCR扩增,然后构建荧光标签载体,并分别与shRNA表达质粒共转染II型肺泡上皮细胞(AEC2s)或293T细胞,进行鉴定。PCR扩增的常规方法如下:
引物设计:设计上、下游引物,在上游引物5'端添加起始密码,为将扩增产物克隆到pEGFP-N1中,引物的5'端添加用于与载体发生同源重组的同源臂。
靶基因扩增:按上海生工试剂盒所提供的基因扩增反应体系及反应条件进行基因扩增、产物回收和纯化,获得扩增产物。
pEGFP-N1的线性化:复苏含有pEGFP-N1质粒的DH5a菌种,按试剂盒提取质粒,测定浓度后进行酶切,0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收线性化的载体。
将扩增的靶基因与荧光标签载体(pEGFP-N1)进行连接:使用金斯瑞公司的同源重组试剂盒进行连接,连接结束后可保存在-20℃备用或马上进行转化。
shRNA干扰载体的效果鉴定:分别将干扰载体(pSilencer-shRNA)和荧光标签载体(pEGFP-N/S/ORF1ab)共转染293T细胞,干扰载体与标签载体的质量比为1:2,同时设立对照,转染后48h观察细胞内GFP蛋白的融合表达,根据荧光强度评价干扰效果:
流式细胞检测:为定量分析不同干扰载体的干扰效果,用流式细胞术检测,分析荧光蛋白表达细胞在总细胞数中的比例。
Westernbolt分析:①细胞收集与裂解:以RIPA裂解细胞。②SDS-PAGE蛋白电泳:制备SDS-PAGE胶,将样品加入等体积的2xSDS缓冲液,沸水煮5min,冰浴2min,12000xg,10min。③Western blot检测:经转膜、封闭、一抗结合、洗涤、二抗结合和显色,观察结果。
RT-PCR检测mRNA:采用相对荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中靶基因的相对表达量,根据标准曲线,由CT值换算目的基因以及B-actin内参基因拷贝数,以B-actin内参基因校正病毒基因mRNA相对表达量(目的基因拷贝数/B-actin拷贝数),定量评价干扰效果。
4、获得高沉默效率的siRNA/shRNA
经上述设计、合成、筛选、迭代设计、再合成和细胞水平的验证,获得高沉默效率的siRNA,其序列分别为SEQ ID NO.1(命名为shRNA1,下同)、SEQ ID NO.2(shRNA2)、SEQ IDNO.5(shRNA3),以及靶向N基因的SEQ ID NO.16(shRNA4)、SEQ ID NO.49(shRNA5),靶向ORF1ab基因的SEQ ID NO.21(shRNA6)、SEQ ID NO.52(shRNA7),靶向S基因的SEQ ID NO.30(shRNA8),其沉默效率分别为78%、76%、88%、89%、89%、84%、91%、90%。
三、合成shRNA
根据上述筛选的共同靶标(SEQ ID NO.1~58,优选为shRNA1~8),委托生物公司,每个shRNA合成2条互补的19-25nt的寡核苷酸多肽siRNA,以及合成起间隔作用的9nt的碱基序列,然后将所合成的siRNA和碱基序列连接成由中间碱基序列间隔成loop环的小发夹shRNA双链,所合成的shRNA双链的每条单链均可以分别连接RBD多肽或蛋白。例如,分别将SEQ ID NO.1(shRNA1)、SEQ ID NO.2(shRNA2)和SEQ ID NO.5(shRNA3)合成5'-ttaatacgacctctctgttggattttgacattcaagagatgtcaaatccaacagagaggtcgtattaa-3'(shRNA1)、5'-ggttcgcaacttcacacagagtttcaagagaactctgtgtgaagttgcgaacc-3'(shRNA2)和5'-ggtt cggttgtta tatac gata ttcaagaga tatc gtata taaca accg aacc-3'(shRNA3),其中“TTCAAGAGA”为loop环,其左、右侧分别为互补的正、反义链,进而在其3'和/或5'连接RBD蛋白或其多肽。同理优选其他高沉默效率的siRNA,分别合成shRNA。
四、靶向递送载体RBD的设计和合成
RBD(SEQ ID NO.59)多肽具有靶向递送载体和重组蛋白疫苗的双重作用。因为冠状病毒通过RBD特异性结合ACE2受体引起感染,RBD与ACE2是配体与受体的关系,所以可通过RBD将药物靶向递送给病毒感染细胞并进入胞浆。另外现有技术通常以病毒通过RBD与ACE2结合感染的特性设计RBD蛋白疫苗,所以合成的RBD既是靶向递送载体也是蛋白疫苗。
1、RBD的氨基酸序列及合成设计:根据全球共享禽流感数据库(GISAID)和GenBank数据库收集SARS-CoV、MERS、SARS-CoV-2的S蛋白基因序列,进行氨基酸系统进化树分析,或经序列同源性分析,确定RBD中能与人ACE2受体结合并且不易发生变异的保守氨基酸序列位点N439、V483和Q493。另外根据SARS CoV S蛋白由1255个氨基酸组成、可被酶解为S1受体结合区(RBD)和S2膜融合区、RBD定位于S蛋白的第319到510位氨基酸(AA319-510)、RBD通过其C端与ACE2的细胞膜外N端结合、RBD能单独通过ACE2进入靶细胞、RBD S蛋白N连接的糖基化的去除不会影响RBD S蛋白的功能、SARS-CoV-2的RBD(aa.331-550)中有3个N-糖基化残基(N331,N343,N360)、组成肽链的色氨酸、组氨酸、鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸都有多个N等特点,可设计RBD的合成,以及将RBD与脂质体或shRNA进行连接。
2、RBD的合成:以氨基酸合成多肽通常是由两个氨基酸脱水缩合形成肽键,由多个氨基酸残基以肽键相连接形成多肽。可委托公司,采用多肽合成仪自动化合成位于S蛋白的第319-510位氨基酸序列、位于能与ACE2结合但不易发生变异的包含N439、V483和Q493位点的保守氨基酸序列以及经密码子优化的氨基酸序列。其基本方法是,按被合成多肽的氨基酸序列逐个加入氨基酸,使肽链从C端到N端残基逐步延长,要求每一个氨基酸残基以一端保护和另一端活化的形式缩合,并且在每一轮肽链延长循环后除去氨基上的临时性保护基团,直至目标多肽的全部氨基酸序列缩合完毕。目前常用的固相合成多肽的反应原理是在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知的序列从C端-羧基端向N端-氨基端的顺序不断添加所需氨基酸,进行合成反应,最终得到多肽。其主要步骤包括:①去保护:用碱性溶剂去除氨基的保护基团;②激活和交联:活化下一个氨基酸的羧基,使活化的单体羧基与游离的氨基交联,形成肽键,反复循环这两步反应,直到多肽合成完成。
五、以shRNA和RBD合成化合物
以shRNA和RBD合成的化合物,因为shRNA为基因治疗药物,而RBD又具有蛋白疫苗和靶向递送shRNA的作用,所以合成的化合物(RBD-shRNA-RBD)既是靶向药物又是疫苗。
1、RBD-shRNA-RBD的设计:如图2和图3所示,根据合成的shRNA及RBD序列,将以病毒保守基因为干扰靶标的siRNA的正反义链的一端与loop环(5'-TTCAAGAGA-3’)相连,另一端分别与RBD S蛋白N连接的糖基化位点相连,连接成“RBD-siRNA正义链-loop环-siRNA反义链-RBD”。其中两条互补的正反义链会形成双链,但两条多肽RBD不会形成双链,所以是带有两条多肽RBD和loop环的发夹状连接物shRNA。因为RBD可通过C端结合病毒受体ACE2并通过ACE2进入靶细胞浆,以及多肽与siRNA的结合可增加siRNA的通透性、稳定性及干扰效果,所以本设计使RBD产生靶向递送、穿膜肽、蛋白抗原和竞争受体的作用,不但能稳定、有效地将CoVsiRNA靶向递送至病毒感染的靶细胞浆进行靶向干扰,而且自身能作为重组蛋白刺激机体产生免疫性抗体,以及能与病毒竞争结合靶细胞受体ACE2从而抑制病毒感染。
2、RBD-shRNA-RBD的合成:可委托公司,采用多肽与寡核苷酸的常规合成方法,将多肽和寡核苷酸以肟键、酰胺键、硫醚键、二硫键、磷酰键、腙键、酰脲键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、马来酰亚胺-巯基键等形式偶联成缀合物,包括多肽和寡核苷酸的正义链(5'末端、3'末端)或反义链(3'末端)以较牢固的共价键、较松散的离子键、疏水键或以带间隔臂的羧腙键进行非共价或共价交联,合成多肽-寡核苷酸偶联物(POCs)。目前最常用的合成POCs法是共价交联-液相片段合成法,已广泛应用于合成各种POCs,其主要步骤是:分别在固相基质上分别合成多肽和寡核苷酸,然后同时将两个合成物从固相基质上剥离,所剥离的多肽和寡核苷酸在溶液中通过反应活性基团进行偶联。合成POCs主要包括:①马来酰亚胺-巯基偶联:在多肽或寡核苷酸上修饰马来酰亚胺,在另一单体上修饰巯基,然后将两个单体加入同一溶液中即可反应得到POCs;②二硫键或硫醚键偶联:其中硫醚键偶联包括巯基亲核取代卤代乙酰胺上卤代物的反应和巯基Michael加成到马来酰亚胺两类;二硫键偶联可以通过两个巯基直接氧化,或先通过联吡啶二硫醚等活化剂将巯基活化再与另一含有巯基的寡聚物偶联,常用二硫键合成siRNA与多肽的偶联物;③肟键偶联:醛基与氨基相互反应产生肟,该反应条件温和、反应效率高,并且可以直接生成双链DNA与特定多肽的偶联产物,同时,还可以通过双功能化的寡核苷酸与多肽或糖类通过肟键在核酸的5’与3’端同时连接上两条多肽,该方法不需要各种保护过程并能一步完成,用于合成了“肽-寡核苷酸-肽”产物,具体方法为在寡核苷酸的5’和3’均引入醛基,再与羟基胺修饰的多肽反应,得到“肽-寡核苷酸-肽”,且所得产率较高,这种双官能团化的寡核苷酸与多肽的一步反应不需要任何保护策略和交联剂,在微酸的条件下就能得到较高的产率;④酰胺键偶联:直接利用含有活化羧酸或硫酯的寡聚物与另一修饰有氨基的聚合物反应得到产物;⑤腙键偶联:需要先将肼基引入到多肽上,然后加入pH值为3~5之间的柠檬酸缓冲溶液,再与修饰有乙酰醛基的寡核苷酸进行反应,才可得到以腙键连接的POCs。
3、RBD-shRNA-RBD的提纯:色谱方法一直是纯化和分析多肽与寡核苷酸偶联物的最常用的方法之一。根据偶联物的复杂程度需选择不同的色谱方法进行分离,主要方法有高效液相色谱(HPLC)、反向高效液相色谱(RP-HPLC),离子交换色谱(IEC,通常为阴离子交换色谱),或者将其中的两个或几个进行串联使用,具体按操作说明。
按照上述shRNA的筛选、合成及其与RBD的合成,可获得包括但不限于以SEQ IDNO.1~58制备的siRNA药物、以RBD多肽或S蛋白多肽与序列为SEQ ID NO.1~58的siRNA相连接构成的结合物RBD-shRNA-RBD、RBD-siRNA或S-siRNA,以及进而经脂质体修饰的复合物。
本申请合成的化合物为RBD-shRNA(1~8)-RBD、RBD-siRNA和S-siRNA。
六、化合物的脂质体修饰
如图4-5,脂质体(Liposomes,Lip)修饰包括以带负电荷的shRNA吸附带正电荷的脂质体、以RBD氨基的巯基化使巯基与脂质体形成巯基-马来酰亚胺键或以RBD氨基末端与脂质体形成氨甲酸酯键等方法。如经脂质体DOTAP/Chol、DC-chol/DOPE或Lip包裹,制成RBD-shRNA(1-8)/Lip-RBD(缩写为RBD2-shRNA(1-8)/Lip)、RBD-siRNA/Lip和S-siRNA/Lip。
实施例1:以脂质体DOTAP/Chol制备脂质体修饰化合物
(1)RBD-shRNA-RBD的合成
采用本申请以shRNA和RBD合成的RBD-shRNA-RBD化合物。
(2)脂质溶液的配制
DOTAP(MW=698.5):10mg/ml,精确称取DOTAP[N-(2,3-二油酰氧基-1-丙基)三甲基甲磺酸铵:N-1-(2,3-di-oleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimeth ylammoniumethylsulfate]粉末100mg,加入10ml容量瓶中,加氯仿溶液至刻度线。
Chol(MW=386):5mg/ml,精确称取Chol[胆固醇:cholesterol]粉末50mg,加入10ml容量瓶中,加氯仿溶液至刻度线。
m-PEG2000-DSPE(MW=2787):1 0mg/ml,称取m-PEG2000-DSPE(甲氧基化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺:Methoxy-polyethylene glycol-distearoyl phosphatidyi-ethanolamine)粉末10mg,加入lml DEPC水,涡旋后超声1min,使之彻底溶解。
Mal-PEG2000-DSPE(MW=2941.6):1 0mg/ml,精确称取Mal-PEG2000-DSPE(Maleimide derivatized polyethylene glycol-distearoyl phosphatidyl-ethanolamine:马来酰亚胺化聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)粉末10mg,加1ml DEPC水,涡旋后超声1min,溶解。
(3)脂质体DOTAP/Chol的制备(薄膜水化法)
采用薄膜水化法(Lipid-film method)制备脂质体DOTAP/Chol,脂质浓度为10mM,主要步骤如下:按照制备1ml脂质体DOTAP/Chol的量,分别取DOTAP、Chol两种脂质的氯仿溶液,以DOTAP:Chol=1:1(M:M)的比例加至500ml三角烧瓶,加3~4ml氯仿溶液;37℃真空旋转蒸发45~60min,使成为均匀的脂质薄膜,用高纯氮气吹尽痕量氯仿;加入1ml DEPC水振摇,将脂质薄膜从瓶壁洗下,得脂质混悬液;待充分水合后,超声lmin,依次通过400nm、200nm、80nm、50nm聚碳酸酯膜挤出,各10~20次,即得脂质体DOTAP/Chol。
(4)RBD-shRNA-RBD的巯基化
2-IT(Traut'S reagent)是蛋白巯基化的常用试剂,可在RBD S蛋白N连接的糖基化处进行巯基化,步骤如下:取RBD-shRNA-RBD和2-IT(Traut'S reagent,2-iminothiolane-HCl),混合均匀(2-IT与RBD-shRNA-RBD的摩尔比为200:1),室温条件下反应2h;通过透析法除去多余的2-IT,每次以足量透析液(1×PBS,5mM EDTA,pH=7.4),4℃保存,隔夜透析,小心低速磁力搅拌,6~8h换透析液,共2次;巯基化抗体的浓度和巯基化程度分别采用BCA法和Ellman法测定其蛋白浓度和巯基化程度。
(5)以脂质体DOTAP/Chol制备脂质体修饰化合物
(A)利用带负电何的siRNA/shRNA吸附带正电荷的脂质体进行制备
①取120μl的DOTAP/Chol脂质体(10mM),加入20μ1的RBD-shRNA-RBD(约2μg/μ1,40μg),加DEPC水11μl,室温静置10min,获得脂质体包裹的RBD-shRNA-RBD复合物。
②取siRNA90μ1(24μg,20mM)、shRNA90μ1(24μg,10mM)和/或RBD-shRNA-RBD100μ1(约10μg/μ1,200μg),加DEPC水57.6μ1,室温静置10min,加入600μl的DOTAP/Chol脂质体(50mM),获得脂质体包裹的siRNA、shRNA和/或RBD-shRNA-RBD复合物。
③将①制备的脂质体复合物与②制备的siRNA、shRNA和/或RBD-shRNA-RBD脂质体复合物等量混合,获RBD修饰的含游离siRNA/shRNA的脂质体包裹RBD-shRNA/siRNA-RBD复合物。
(B)以RBD中的巯基与PEG中的马来酰亚胺的交联反应进行制备
为了增长脂质体的循环时间和靶向特异性,对(A)制备的各种脂质体进行PEG化和进一步的RBD靶向修饰,获得PEG化和以RBD为配体的脂质体修饰化合物。
分别取6.36μl、9.53μl和12.7μl的10mg/ml的MAL-DSPE-PEG,分别将其插入上述(A)制备的脂质体复合物RBD-shRNA/siRNA-RBD(分别将两者混合),50℃水浴孵育10min,室温静置10min,然后加入约200μg经上述巯基化的RBD-shRNA-RBD,使RBD中巯基化氨基上的巯基与MAL-DSPE-PEG中的马来酰亚胺发生交联反应,分别获得RBD修饰的5mo1%PEG、7.5mo1%PEG和10mo1%PEG的PEG化脂质体复合物RBD-shRNA/siRNA-RBD,即该复合物为由脂质体DOTAP/Chol以静电吸附包裹siRNA、shRNA和/或RBD-shRNA-RBD,再以MAL-DSPE-PEG包裹在外层,最后以MAL-DSPE-PEG连接RBD-shRNA-RBD,其中RBD起靶向递送、蛋白抗原和稳定siRNA/shRNA的作用,脂质体和PEG起保护siRNA/shRNA、缓慢释放siRNA/shRNA/RBD、向胞内转染siRNA/shRNA或疫苗佐剂的作用。
实施例2:以脂质体liposomal制备脂质体修饰化合物
当pH>8时,RBD的氨基末端与pNP-PEG-DPPE(PEG-PE)反应形成稳定的氨甲酸酯键偶联物,并定向定量地插入脂质体的外层膜,制成脂质体修饰化合物。本实施例以RBD片段和siRNA制备以RBD靶向递送siRNA(RBD-siRNA)的脂质体修饰化合物。
(1)RBD的合成
采用上述RBD合成方法合成RBD或其片段。
(2)pNP-PEG-DPPE的合成
取20mg/mL DPPE(二棕榈酰乙醇胺)氯仿溶液10ml,置50mL圆底烧瓶中,滴加三乙胺(TEA)0.65mL,取约4.0g浓度为200mg/mL的(pNP)2-PEG3400(聚乙二醇3400二对硝基苯碳酸酯)氯仿溶液加入上述混合液中,吹入氮气,密封,避光,于室温下磁力搅拌过夜,减压蒸干溶剂,真空除尽残留氯仿,加入0.01mol/L HCl水溶液100mL,超声处理形成透明的胶束溶液。0.01mol/L HCI水溶液为洗脱液,经CL-4B Sepharose进行分离,除去未反应的(pNP)2-PEG3400和释放的pNP,收集含pNP-PEG-DPPE胶束的洗脱液,冷冻干燥,用TLC、HPLC、MS和NMR对pNP-PEG-DPPE进行定性和定量。
(3)RBD-PEG-DPPE的合成:取pNP-PEG-DPPE 100mg溶于10mL氯仿中,置50mL烧瓶中,于旋转蒸发仪上减压除去氯仿,形成脂膜,真空除尽残留氯仿,将25mg RBD溶于0.01mol/L HCl 4mL中,加入内壁涂布脂膜的烧瓶中,于室温孵育30min,轻摇使脂膜充分分散。于混悬液中加10mum/L(pH 9.0)Tris缓冲液20mL,混匀,氮气保护,于4℃孵育过夜。将样品置于分子质量为5kD的透析袋中,在10mmol/L(pH 7.4)Tris缓冲液中透析约4h,再用去离子水于4℃透析24h,取出袋内溶液,冷冻干燥,置-20℃冰箱内保存。
(4)RBD-siRNA/liposomal的合成:将ePC(蛋黄磷脂)、Ch(胆固醇)、PEG2000-DSPE(二硬脂酰乙醇胺聚乙二醇2000)和DOTAP(二油酰三甲胺丙烷)的氯仿溶液按摩尔比(60:34:3.0:3.0)混合,如需标记脂膜,于上述混合液中加入占总脂质量摩尔比为0.1%Rho-PE,减压除尽氯仿,形成脂膜。将一定量的siRNA溶于经DEPC处理的超纯水中,siRNA用量应完全中和DOTAP所带的正电荷。于50℃水浴中用含siRNA的水溶液将上述磷脂膜水化30min,形成包裹siRNA的脂质体。用手动挤出装置(Avanti Polar Lipids),将初步形成的脂质体分别过0.4μm和0.1μm的聚碳酸酯核孔膜(Whatman)10次,制备粒径均一的脂质体。取适量RBD-PEG-DPPE溶于甲醇中,置烧瓶,氮气吹干成膜,加入制备的脂质体悬液,于37℃水浴温浴2h,使RBD-PEG-DPPE定向地插入到脂质体的外层膜上。其中RBD在脂质体中占总脂质的摩尔比一般为0.5%~1.O%(可适当调整)。用动态激光散射、冰冻蚀刻电子显微镜、核酸电泳检验RBD修饰的包载siRNA的聚乙二醇修饰的脂质体的特性。
七、化合物(nCOVsiRNA)的验证
1、体外验证以保守基因为靶标的广谱抗病毒效果
(1)病毒液的准备
在Vero E6细胞生长至30%汇合度的DMEM培养液(10%FBS)中加入病毒株,36℃、5%CO2培养箱培养5~7d,至出现细胞病变效应(CPE)时,分离病毒,用培养液配成103~105TCID50/ml病毒液备用。据此分别准备新冠病毒的两种变异毒株B.1.617.1和B.1.617.2的病毒液,用于验证化合物是否对2种或以上含有相同保守基因的变异病毒同时有效,以证明本发明的shRNA是否具有以保守基因为靶标的广谱抗病毒效果。
(2)化合物(nCOVsiRNA)和病毒共培养
分别设立实验组和对照组,试验合成物RBD2-shRNA(1-8)/Lip、RBD-siRNA/Lip和S-siRNA/Lip对抗B.1.617.1和B.1.617.2的效果。每组接种8孔板,每孔2×105个Vero-E6细胞、2mL DMEM培养液(10%FBS),置36℃、5%CO2培养箱中培养至30%汇合度时(24h后),更换培养液,同时加入试验化合物、B.1.617.1和B.1.617.2株病毒液。
其中实验组包括:RBD2-shRNA1(/lip)组(0.1nmol RBD2-shRNA1(/lip)+0.6ml病毒液)、RBD2-shRNA2(/lip)组(0.1nmol RBD2-shRNA2(/lip)+0.6ml病毒液)、依此类推RBD2-shRNA8(/lip)组(0.1nmol RBD2-shRNA8(/lip)+0.6ml病毒液)、RBD-siRNA(/lip)组(0.1nmol RBD-siRNA(/lip)+0.6ml病毒液);对照组包括:naked shRNA1组(0.1nmol nakedshRNA1+0.6ml病毒液)、naked shRNA2组(0.1nmol naked shRNA2+0.6ml病毒液)、nakedshRNA3组(0.1nmol naked shRNA3+0.6ml病毒液)、naked siRNA组(0.1nmol naked siRNA+0.6ml病毒液)、RBD对照组(0.1nmol RBD+0.6ml病毒液)、阳性对照组(0.6ml病毒液)、阴性对照组(0.6ml DMEM培养液)(表1-6)。
继续培养,然后于培养1小时、24小时和72小时后每组各取上清液,以1:4、1:12、1:36、1:108、1:324、1:972、1:2916、1:8748倍稀释,进行RT-PCR检测。
(3)实时荧光RT-PCR检测各组病毒RNA
病毒核酸提取和核酸(ORF1ab/N)检测按试剂盒说明书操作。
(4)病毒RNA检测结果
①B.1.617.1株检测结果:如表1所示,各组细胞培养1h后,阴性对照组病毒RNA检测结果为阴性,阳性对照组RNA检测结果的滴度为1:36,其他各组RNA检测结果滴度均为1:12。如表2所示,各组细胞培养24h后,阴性对照组病毒RNA检测结果仍为阴性,阳性对照组RNA检测结果滴度为1:2916,4组对照组的RNA检测结果滴度为1:972~1:2916,而实验组的RNA检测结果滴度为1:36~1:108,明显低于对照组(p<0.01)。如表3所示,各组细胞培养72h后,阴性对照组病毒RNA检测结果仍为阴性,阳性对照组RNA检测结果滴度>1:8748,对照组的RNA检测结果滴度>1:2916~1:8748,而实验组的RNA检测结果滴度为1:108~1:324,明显低于对照组(p<0.01)。
表1a、表2a和表3a中RBD2-shRNA(4-8)的实验结果与表1、表2和表3中RBD2-shRNA(1-3)的结果一致,与阳性对照相比,均具有明显的抑制病毒作用。
表1-3说明,实验组具有明显的抗B.1.617.1株作用,说明与RBD连接的shRNA或siRNA能被递送至靶细胞内进行RNA干扰,而未与RBD连接的shRNA或siRNA不能进入靶细胞内,不能发挥RNA干扰的作用,另外,RBD也有一定的抗病毒作用。
表1化合物与B.1.617.1株共培养1小时培养液中病毒RNA RT-PCR检测结果(+/-)
表1a RBD2-shRNA(4-8)与B.1.617.1株共培养1小时培养液病毒RNA RT-PCR检测结果
表2化合物与B.1.617.1株共培养24小时培养液中病毒RNA RT-PCR检测结果(+/-)
表2a RBD2-shRNA(4-8)与B.1.617.1株共培养24小时培养液病毒RNA RT-PCR检测结果
表3化合物与B.1.617.1株共培养72小时培养液中病毒RNA RT-PCR检测结果(+/-)
表3a RBD2-shRNA(4-8)与B.1.617.1株共培养72小时培养液病毒RNA RT-PCR检测结果
②B.1.617.2株检测结果:如表4所示,各组细胞培养1h后,阴性对照组病毒RNA检测结果为阴性,阳性对照组RNA检测结果的滴度为1:36,其他各组RNA检测结果滴度均为1:12~1:36。如表5所示,各组细胞培养24h后,阴性对照组病毒RNA检测结果仍为阴性,阳性对照组RNA检测结果滴度为1:2916,在4组对照组的的RNA检测结果中有3组的滴度为1:2916,而4组实验组的RNA检测结果滴度为1:108~1:324,明显低于对照组(p<0.01)。如表6所示,各组细胞培养72h后,阴性对照组病毒RNA检测结果仍为阴性,阳性对照组RNA检测结果滴度>1:8748,在4组对照组(naked)的RNA检测结果中有3组的滴度为1:8748或以上,在4组实验组的RNA检测结果中有1组的滴度为1:972、3组的滴度为1:324,与对照组相比仍有明显的差异(p<0.01)。
表4a、表5a和表6a中RBD2-shRNA(4-8)的实验结果与表4、表5和表6中RBD2-shRNA(1-3)的结果一致,与阳性对照相比,均具有明显的抑制病毒作用。
表4-6说明,实验组具有明显的抗B.1.617.2株作用,说明与RBD连接的shRNA或siRNA能被递送至靶细胞内进行RNA干扰,而未与RBD连接的shRNA或siRNA不能进入靶细胞内,从而不能发挥RNA干扰的作用。
表1-6表明,实验组同时具有抗B.1.617.1和B.1.617.2的作用,说明实验组以保守基因为干扰靶标的化合物(shRNA)具有广谱抗变异毒株的效果。
表4化合物与B.1.617.2株共培养1小时培养液中病毒RNA RT-PCR检测结果(+/-)
表4a RBD2-shRNA(4-8)与B.1.617.2株共培养1小时培养液病毒RNA RT-PCR检测结果
表5化合物与B.1.617.2株共培养24小时培养液中病毒RNA RT-PCR检测结果(+/-)
表5a RBD2-shRNA(4-8)与B.1.617.2株共培养24小时培养液病毒RNA RT-PCR检测结果
表6化合物与B.1.617.2株共培养72小时培养液中病毒RNA RT-PCR检测结果(+/-)
表6a RBD2-shRNA(4-8)与B.1.617.2株共培养24小时培养液病毒RNA RT-PCR检测结果
2、动物体内验证RBD的靶向递送和免疫功能
(1)动物分组和接种
动物分组:选择6-8周龄、40克左右的SPF级雌性BALB/c小鼠,随机分为RBD2-shRNA1(RBD2-shRNA1~8)/Lip组(接种RBD2-shRNA1/Lip+B.1.617.2株)、RBD-siRNA1/Lip组(接种RBD-siRNA1/Lip+B.1.617.2株)、RBD组(接种RBD+B.1.617.2株),shRNA1/Lip组(接种shRNA1/Lip+B.1.617.2株),shRNA1组(接种shRNA1+B.1.617.2株)阳性对照组(接种B.1.617.2株+生理盐水)和阴性对照组(仅接种生理盐水)。
动物接种:经鼻腔喷雾接种40μl滴度为105/mlTCID50的B.1.617.2株病毒液,阴性对照组经鼻腔喷雾接种40μl生理盐水。以腹腔注射5%水合氯醛溶液麻醉,分别将0.1nmol的RBD2-shRNA1/Lip、RBD-siRNA1/Lip、RBD、shRNA1/Lip和shRNA1缓慢注入小鼠气管,复位组织,在感染后第7天每组处死10只小鼠,进行病毒检测,另10只用于观察抗体。
(2)以细胞半数感染量(TCID50)的百分率检测病毒
将处死小鼠肺组织制备10%匀浆,取100pl离心后上清,以10倍递次稀释,接种于VeroE6单层生长的96孔板,每孔30μl,每个稀释度接种4个孔,轻摇匀浆,放37℃吸附lh,以Hank氏液清洗,加培养液,放37℃C02培养箱培养,观察细胞病变效应(CPE),分别计算各组VeroE6细胞半数感染量(TCID50)的百分率,百分率越大病毒含量越多,见表7-13。
表7 RBD2-shRNA1/Lip组小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
表8 RBD-siRNA1/Lip组小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
表9 RBD组小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
表10 shRNA1/Lip组小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
表11 shRNA1组小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
表12阳性对照组小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
表13阴性对照组小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
(3)RBD靶向递送的效果
从表7-13可知,各组小鼠肺匀浆致VeroE6半数感染量的百分率分别为RBD2-shRNA1/Lip组20.0%、RBD-siRNA1/Lip组27.5%、RBD组87.5%、shRNA1/Lip组82.5%、shRNA1组95.0%、阳性对照组95.0%和阴性对照组2.5%。因为RNAi主要发生在细胞浆内,shRNA1组的shRNA1极易被核酸酶降解、不易通过细胞膜,所以几乎不起RNAi作用;shRNA1/Lip组的shRNA1虽被Lip保护而不易被核酸酶降解并能通过细胞膜,但因不能特异性进入靶细胞而使RNAi效果较差,其VeroE6半数感染量的百分率达82.5%,与阳性对照组相比无显著性差异(p>0.05);而RBD2-shRNA1/Lip组和RBD-siRNA1/Lip组中的shRNA1/siRNA1因以RBD靶向递送至靶细胞浆,所以其RNAi效果较好,RBD2-shRNA1/Lip组和RBD-siRNA1/Lip组的VeroE6半数感染量的百分率与shRNA1/Lip组相比,均具有显著性差异(均为p<0.05)。
参照上述TCID50试验方法,根据shRNA7和shRNA8具有较高沉默效率(分别为90%和91%)的结果,选用RBD2-shRNA7/lip和RBD2-shRNA8/lip进行TCID50试验,结果发现RBD2-shRNA7/lip组、RBD2-shRNA8/lip组、阳性对照组和阴性对照组的TCID50分别为22.5%、22.5%、92.5%和5.0%,试验组的TCID50结果明显低于阳性对照组。
(4)化合物(nCOVsiRNA)的免疫功能检测
采集RBD2-shRNA1/Lip组和RBD组接种后第1、2、4、6周的10只小鼠静脉血,分离血清,保存于-20℃备用,按试剂盒操作,ELISA检测特异性抗体IgG和IgM(表14-15)。
表14 RBD2-shRNA1/Lip组和RBD组各10只小鼠血清特异性抗体检测结果比较
由表14可知,RBD2-shRNA1/Lip组的IgM、IgG及IgM+IgG的检出例次分别为21例、20例和16例,分别多于RBD组的8例、8例和5例。因为RBD2-shRNA1/Lip组的化合物由2分子RBD、1分子shRNA及Lip合成,比RBD组的单分子RBD的分子量更大、分子结构更复杂,而且shRNA及Lip又有免疫佐剂的作用,所以抗原性更强,更易于产生抗体。
Claims (10)
1.一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,将具有RNAi功能的正、反义链siRNA合成shRNA,然后在合成的shRNA的正义链siRNA和/或反义链siRNA的未端延伸连接靶向递送载体,合成以shRNA双链连接载体进行shRNA靶向递送的siRNA药物。
2.根据权利要求1所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,所述siRNA选自病原体及其变异毒株的共有RNAi序列,使以所述siRNA合成的shRNA靶向干扰含有所述共有RNAi序列的病毒基因,从而产生抗变异毒株的广谱RNAi作用。
3.根据权利要求1、2所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,所述合成shRNA包括但不限于首先合成2条互补的约21-25nt的siRNA,以及合成起间隔作用的碱基序列,然后将所合成的siRNA和碱基序列连接成由所述碱基序列间隔成中间为loop环的小发夹状shRNA,继之在shRNA的每条单链上各连接靶向递送载体。
4.根据权利要求1、3所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,合成以冠状病毒受体结合域S1-RBD为载体向ACE2表达细胞靶向递送冠状病毒变异毒株共有RNAi靶标shRNA的集广谱抗变异毒株靶向药物和二聚体S1-RBD疫苗为一体的化合物;所述广谱抗变异毒株靶向药物,是指基于冠状病毒及其变异毒株的共有RNAi序列设计不随病毒变异而改变的具有广谱抗变异毒株作用的siRNA,然后将所述siRNA合成shRNA;将所述shRNA和既是穿胞肽又是ACE2配体的S1-RBD多肽进行连接后,使shRNA的胞膜通透性和抗核酸酶稳定性得到优化,使shRNA更易被特异性递送至表达ACE2的靶细胞浆,特异性沉默易感染病毒的ACE2表达细胞内的靶基因;所述二聚体S1-RBD疫苗,是指将既具有广谱抗变异毒株作用又具有免疫佐剂作用的1分子shRNA和具有蛋白质抗原作用的2分子S1-RBD多肽进行连接,合成分子结构更复杂、分子量更大并含有自身免疫佐剂成分的新型技术线路疫苗。
5.根据权利要求1、4所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,所述合成shRNA的siRNA包括但不限于新冠病毒RNAi序列SEQ ID NO.1~58;包括但不限于优选的新冠病毒共有RNAi序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7~10、SEQ ID NO.16~18、SEQ ID NO.20~22、SEQ ID NO.30~32、SEQ ID NO.41~58。
6.根据权利要求1、5所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,所述合成shRNA的siRNA进一步优选为靶向冠状病毒N基因的SEQ ID NO.16-18和SEQ IDNO.49-51,靶向冠状病毒ORF1ab基因的SEQ ID NO.20-22和SEQ ID NO.52-54,以及靶向冠状病毒S基因的SEQ ID NO.30-32和SEQ ID NO.56-58;所述合成shRNA的siRNA序列更进一步优选为靶向N基因的SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.49,靶向ORF1ab基因的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.52,靶向S基因的SEQ ID NO.30。
7.根据权利要求1、4所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,所述合成RBD包括但不限于合成S蛋白的第319-510位氨基酸序列、能与ACE2结合但不易发生变异的包含N439、V483和Q493位点的保守氨基酸序列或经密码子优化的RBD多肽。
8.根据权利要求1、4所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,所述连接或合成包括但不限于将RBD的糖基化N氨基与shRNA的反义链3'末端、正义链5'末端或3'末端进行连接,包括但不限于以二硫键、磷酸二酯键、二硫代磷酸脂键、硫醚键、肟键、酰胺键、马来酰亚胺-巯基键的化学偶联或共价偶联进行连接,包括但不限于根据shRNA的核苷酸序列和RBD的氨基酸序列合成RBD-shRNA-RBD。
9.根据权利要求1、6所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,所述化学药物nCoVshRNA·2RBD包括但不限于以SEQ ID NO.1~58制备的siRNA药物、所制备的siRNA药物与RBD多肽或S蛋白多肽的结合物RBD-shRNA-RBD、RBD-siRNA和S-siRNA,以及进而经脂质体或脂质纳米粒修饰的复合物。
10.根据权利要求1、9所述的一种化学药物nCoVshRNA·2RBD的合成方法,其特征在于,所述化学药物nCoVshRNA·2RBD包括但不限于以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.49、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.30制备的nCOVsiRNA药物;所述nCOVsiRNA药物包括但不限于RBD-siRNA、RBD2-shRNA1、RBD2-shRNA2、RBD2-shRNA3、RBD2-shRNA4、RBD2-shRNA5、RBD2-shRNA6、RBD2-shRNA7、RBD2-shRNA8;所述nCOVsiRNA药物包括但不限于RBD-siRNA/lip、RBD2-shRNA1/lip、RBD2-shRNA2/lip、RBD2-shRNA3/lip、RBD2-shRNA4/lip、RBD2-shRNA5/lip、RBD2-shRNA6/lip、RBD2-shRNA7/lip、RBD2-shRNA8/lip。
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