CN116251171A

CN116251171A - 可溶性晚期糖基化终末产物受体蛋白用于预防或治疗肺部感染疾病的用途

Info

Publication number: CN116251171A
Application number: CN202111506110.1A
Authority: CN
Inventors: 肖瑞平; 张秀琴; 胡新立; 王珏
Original assignee: Nanjing Jingruikang Molecular Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Jingruikang Molecular Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2023-06-13
Also published as: WO2023104199A1

Abstract

本发明涉及可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)蛋白、其功能性变体或片段用于预防或治疗肺部感染的用途，所述肺部感染优选为病毒性的肺部感染，更优选为由冠状病毒引起的病毒性肺部感染。本发明还涉及含有所述sRAGE蛋白、其功能性变体或片段的药物组合物。还涉及预防或治疗肺部感染的方法，包括使用所述sRAGE蛋白、其功能性变体或片段，或所述组合物。

Description

可溶性晚期糖基化终末产物受体蛋白用于预防或治疗肺部感染疾病的用途

技术领域

本发明涉及使用大分子药物治疗生物体肺部感染相关疾病的领域。具体而言，涉及可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)蛋白用于预防或治疗肺部感染相关疾病的用途，特别是与冠状病毒(HCoV)例如新冠病毒(COVID-19)感染相关的上述疾病。还涉及sRAGE的功能性变体、片段，或包含sRAGE或其功能性变体、片段的药物组合物，及它们在预防或治疗上述疾病中的用途。

背景技术

关于冠状病毒尤其是新型冠状病毒SARS-CoV-2，目前除了为了预防而开发供接种的疫苗外，也在积极寻找能够治疗由SARS-CoV-2感染引起的肺炎和相关症状的安全、有效策略，以挽救患者生命及减少新冠患者在治愈后的后遗症。

迄今为止，已有几种不同类型的疫苗可供使用，并已在世界各地的大规模接种中证明了其在降低新冠肺炎发病率方面的有效性。然而，SARS-CoV-2感染引起的肺部感染相关疾病的治疗药物的发展还远远滞后。目前的治疗方案都有其局限性。

目前报道新冠肺炎的临床治疗药物包括：康复患者恢复期血浆，妥珠单抗(针对双肺广泛病变者及重型患者，且针对IL-6升高者，用于阻断IL6受体)，静注COVID-19人免疫球蛋白，以及瑞德西韦(抗病毒)，瑞德西韦+巴瑞替尼(JAK抑制剂)，地塞米松(皮质类固醇)，以及结合冠状病毒刺突蛋白的中和单抗bamlanivimab、casirivimab和imdevimab的联合使用。

根据临床结果，现有药物只能在一定程度上缓解病情，降低死亡率，但总体临床疗效尚不确定。尤其是对于出现炎症风暴、败血症的重症患者，目前尚无有效治疗。另外，部分治愈的患者具有不同的后遗症。

与SARS-CoV和MERS一样，SARS-CoV-2病毒感染后可能引发细胞因子风暴，对多器官造成严重损害。SARS-CoV-2新冠肺炎作为一种呼吸道感染性疾病，肺部是受到攻击的主要器官。

在胸部CT表现上，新型冠状病毒肺炎早期可以见到肺外带的小斑片状阴影以及肺间质的改变，进而发展为两肺的磨玻璃影、浸润影，以及肺实变，严重时还可以出现肺实变，胸腔积液少见。实变区主要呈现弥漫性的肺泡损伤和渗出性的肺泡炎，肺泡腔内可以见到浆液、纤维蛋白性渗出物及透明膜形成，小支气管和细支气管亦见黏液栓形成。因此，认为减少炎症引起的器官损伤对病程控制，减少后遗症，及保证患者病愈后的生活质量具有重要意义。现有用于新冠肺炎治疗的抗炎治疗会起到一定作用，但效果都不是很强。

例如，使用JAK1/2抑制剂ruxolitinib治疗重症COVID-19感染患者时，虽然临床改善的中位时间要短一些，但就主要疗效终点而言，与接受安慰剂的对照组之间没有统计学差异，可知效果不够令人满意(Y.Cao et al.,J Allergy Clin Immunol,July 2020)。

在过去的一段时间，本领域尝试了很多被认为从机理上有望治疗新冠肺炎的药物，但都没有达到预期的效果。这样的例子包括羟喹啉、托珠单抗和抗病毒药物ensovibep、Ritonavir(K.-T.Choy,et al.Antiviral Research 178(2020)104786)。这样的事实说明，尽管从理论上分析可以作为新冠治疗药物的候选者众多，但是这些候选者是否真的能够发挥效用在进行实验研究之前是难以预期的。

晚期糖基化终末产物受体(RAGE，receptor for advanced glycation endproducts)及其配体参与众多疾病的病理过程，研究表明其与衰老、炎症及细胞应激等相关疾病的发生发展有关。

具体而言，RAGE是一种可诱导的模式识别受体，其内源性配体为一系列损伤相关模式分子(DAMPs)，包括晚期糖基化终末产物(AGEs)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、S100、病原体DNA及蛋白等。其中，HMGB1在败血症、自身免疫疾病等炎症相关疾病中具有重要功能。AGEs则是一种糖毒素，AGEs在体内的蓄积导致DNA损伤、氧化应激及炎症反应，因而与衰老及退行性疾病密切相关。

RAGE的下游通路包括JAK-STAT、PI3K-Akt、Ras-ERK等，这些通路的激活可导致细胞内免疫反应增强，促进炎症因子释放及活性氧(ROS)的产生。RAGE通路参与了包括炎症、氧化应激、血管内皮功能损伤等多种病理过程。

sRAGE(可溶性晚期糖基化终末产物受体(soluble receptor for advancedglycation end-products)是RAGE的N端胞外结构域，来源于全长受体的酶切或剪切异变体的表达。单独的sRAGE蛋白也可与RAGE的配体结合，其通过结合RAGE配体而阻止RAGE蛋白与这些配体结合，从而有效地阻断RAGE的信号转导，起到抗炎作用。此外，有报道称sRAGE通过抑制JAK2/STAT3信号通路发挥抗凋亡的作用。

研究表明，有肺部症状的新冠患者血清sRAGE水平高于健康对照以及无症状新冠病毒感染者(经过年龄矫正)(Kehribar et al.,Cancer Gunaydin&Metin Ozgen(2020))。同时，发现如果患有糖尿病的患者感染新冠病毒时，其呼吸窘迫综合征的发生率和死亡率高于非糖尿病患者，研究显示sRAGE总体水平在这些患者中也有显著升高，且某些亚型的变化与非糖尿病新冠病人相比有显著差异，提示RAGE通路参与了新冠肺炎的发生发展。

然而，至今并没有关于将sRAGE用于治疗肺炎病毒感染，尤其是冠状病毒感染引起的疾病的相关报道，也没有研究过sRAGE对于新冠肺炎重症患者是否有效。

因此，仍然亟需找到有效抑制肺部炎症，降低重症肺炎的发生率，同时降低毒副作用的治疗药物及方法。

发明内容

发明人通过将sRAGE施用于仓鼠新冠病毒感染模型，发现其显著改善了仓鼠新冠病毒感染模型的肺部病变情况。实验结果显示，sRAGE可以减弱炎症信号的过度激活，使肺内免疫细胞浸润和炎症因子表达减少，显著降低病毒感染模型动物中重症肺炎的发生率。

基于这些结果，证实了sRAGE能够作为COVID-19感染肺炎的治疗剂和或预防剂，由此完成了本发明。另外，肺部炎症的控制有助于减轻全身炎症反应，继而减少炎症引起的器官损伤，为患者提供了更好的恢复机会，减少后遗症。

本发明包括以下内容：

第一方面，本发明涉及分离的可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)多肽在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗病毒性肺部感染，优选为由SARS-CoV-2感染引起的病毒性肺部感染。

第二方面，本发明提供用于治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病的方法，包括对受试者施用分离的sRAGE多肽。

第三方面，本发明提供药物组合物，其包含分离的sRAGE多肽和药学上可接受的载体，所述药物组合物用于治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病。

优选地，上述第一、第二、第三方面所述分离的sRAGE多肽具有如下特征：

(a)包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；

(b)包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列组成，并且具有sRAGE活性；或

(c)其为(a)或(b)所述多肽的功能性片段，所述功能性片段具有sRAGE活性；

优选地，(b)中所述的具有至少80％同源性的氨基酸序列或(c)中所述的功能性片段包含sRAGE的V结构域、C1结构域和C2结构域中的一个或多个。

第四方面，本发明涉及将本发明的分离的sRAGE多肽或其功能片段或含有其的药物组合物与其他治疗病毒感染肺炎相关疾病的药物联合使用。所述其他药物例如但不限于，康复患者恢复期血浆，妥珠单抗(对双肺广泛病变者及重型患者，且IL-6升高者，阻断IL6受体)，静注COVID-19人免疫球蛋白，以及瑞德西韦(抗病毒)，瑞德西韦+巴瑞替尼(JAK抑制剂)，地塞米松(皮质类固醇)，以及结合冠状病毒刺突蛋白的中和单抗bamlanivimab，casiri vimab和imdevimab的联合使用。

第五方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码本发明的sRAGE多肽的多核苷酸。

本发明的优势至少在于sRAGE的毒性小、安全性较高。相比于可能具有强烈副作用的化学药物，sRAGE是一种天然存在于人体内的多肽，将其作为生物药物时没有明显毒副作用，因此不会对已经受到病毒感染的病人造成额外负担。

附图说明

图1为金黄仓鼠动物模型的给药方案示意图。

图2为仓鼠模型肺HE染色的病理切片图，包括阴性对照(未感染对照)、阳性对照(20ng/g体重的人血清白蛋白(HSA)处理)，以及不同剂量(10ng/g和20ng/g体重)的sRAGE处理。

图3显示sRAGE治疗实验中，各个处理组处于不同肺炎严重程度的实验动物占比。

图4显示不同处理组中肺炎分级的评分和统计。

图5显示利用qPCR检测的处理组和对照组中肺组织炎症因子的mRNA水平。

图6显示各个处理组血液中的外周血白细胞中的中性粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)的水平。

图7显示对照组和各个处理组的肺组织中CD68和1型干扰素应答标志物Mx1的mRNA表达水平。

图8为显示各组肺组织的切片的针对CD3(上图)和MxA(下图)免疫组化结果的图。

具体实施方案

除非另有说明，否则本文公开的一些方法的实践采用生物化学、化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook和Green，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，4th Edition(2012)等。

sRAGE

晚期糖基化终末产物受体(RAGE)是一种多配体、促炎症模式识别受体。它涉及引起慢性和无菌性炎症的各种条件。RAGE在许多成人组织中表达减弱，除了肺和皮肤。

RAGE不通过短肽基序，而通过3D结构来识别配体。因此，它可以被多种配体激活，如晚期糖基化终产物(AGEs)、HMGB1、S100/钙颗粒蛋白、β-淀粉样蛋白，甚至DNA和RNA分子、病原体蛋白等。一旦被激活，它通过几个下游激酶MAPKs、PI3K/Akt和JAK转导信号，这些激酶依次激活转录因子NF-κB、AP-1和Stat3。这些转录因子促进重要细胞因子的表达，如TNFα、IL-1和IL-6。在肺部感染相关疾病中这些细胞因子担任重要角色。

可溶性RAGE(sRAGE)顾名思义，是RAGE的可溶形式。sRAGE在结构上是RAGE的胞外结构域，由3个免疫球蛋白样结构域组成，即V结构域、C1结构域和C2结构域。作为没有跨膜结构域和c端结构域的RAGE，sRAGE由于保有胞外结构与而可以与所有配体相互作用，但并不诱导基于RAGE的细胞内信号级联反应，因为其缺乏胞内结构域。推测sRAGE或其功能性片段可以作为一种诱饵受体来减轻由全长RAGE引发的炎症反应。

与可能有强烈副作用的化学药物不同，sRAGE是一种天然存在于人体内的多肽，将其作为生物药物时没有明显毒副作用。因此，用于治疗时毒性小，安全性高。

不意在限定其机理，根据sRAGE及其片段的施用不影响仓鼠模型中的病毒载量这点，本发明人推断其治疗机理不涉及对病毒本身的杀灭，不依赖于对某种特定毒株的特异性识别和杀伤，因而不受新冠病毒变异的影响。换言之，即使新冠病毒出现新的变异株，本发明的sRAGE及含有其的药物组合物也能够有效发挥治疗作用。

本发明的进一步优点在于对肺部感染特别有效，尤其是发生多种炎症因子的因子风暴的肺部感染疾病。本发明的sRAGE在用于治疗新冠病毒引起的感染时，可以不区分且不受限于新冠病毒的变异株型，甚至不限于新冠病毒引起的肺部感染。

因此，在一个实施方案中，sRAGE及其功能性片段的施用可以应用于具有相关症状的其他肺部感染相关疾病，而不限于新型冠状病毒所引起的肺部感染的相关疾病。另外，与新冠病毒引起的肺部感染类似，即使病毒发生了突变，本发明的预防/治疗剂对突变株仍然具有保护和治疗效果。

在一个实施方案中，sRAGE优选为其N-糖基化形态(N-glycoform)，特别优选为具有多价唾液酸的形态，尤其是在第3和59位氨基酸处的N-糖基化。由于昆虫和哺乳动物细胞具有不同的糖基化途径，两个系统中表达的糖蛋白含有不同结构的多糖。糖基化修饰除了影响糖蛋白的疗效和体内半衰期外，也是免疫原性的一个潜在来源。目前，主要监管机构(FDA，EMEA)制定的生物安全规则要求从哺乳动物来源中生产人类治疗性糖蛋白。因此，sRAGE的N-糖基化形态(其中，可以进一步包含O-糖基化)作为在哺乳动物细胞中产生的sRAGE会是更好的治疗候选。

作为sRAGE的N-糖基化形态，可列举唾液酸化型N-糖基化，优选包括在对应于SEQID NO:1的氨基酸3和/或59位的N-糖基化等。也可以进一步包括O-糖基化，尤其是在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸5和/或61位的O-糖基化等。当sRAGE多肽是与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有同源性的sRAGE变体或其片段时，“对应于SEQ ID NO:1的氨基酸n位”意指在该变体或片段中与SEQ ID NO:1中的第n位氨基酸相对应的位置，而不代表该位置必然是变体或片段中的第n位。本领域技术人员能够确定相似多肽序列中的对应位置，例如可以通过将相似的两个或多个多肽序列对齐来确定其中的对应位置。

在一个实施方案中，sRAGE或其片段可以用于与JAK抑制剂联合治疗COVID-19。目前JAK抑制剂(JAKi)已被部分研究者和临床试验用作抗COVID-19的抗炎策略。已知SARS-CoV-2可能以jak1/2依赖的方式过度激活局部补体系统。然而，当用JAK1/2抑制剂Ruxolitinib治疗时，对NF-κB信号通路的抑制效果有限，且对重症COVID-19患者改善症状的效果也不够理想。sRAGE有效抑制NF-κB下游炎症因子的转录，提示sRAGE联合JAKi治疗COVID-19有可能显著提高治疗效果。

在一些实施方案中，本发明的“分离的sRAGE多肽”或“sRAGE蛋白”可以为重组蛋白，并涵盖sRAGE多肽的修饰形式，只要其仍然保有期望的功能。相对于野生型sRAGE蛋白，例如具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的sRAGE蛋白，所述修饰形式包含一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。例如，所述分离的sRAGE多肽可以是其变体，例如是截短的sRAGE，或具有一个或多个氨基酸突变的sRAGE。所述变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％的序列同一性，并具有sRAGE的活性，例如与RAGE竞争性结合其配体的能力。在一些情况下，将这样的变体称为sRAGE的功能性变体。在本发明的上下文中，氨基酸序列的百分比同源性与氨基酸序列的百分比同一性具有相同含义，其计算方式如下：将两条同源氨基酸序列对齐之后，用具有相同氨基酸的位置的数目除以两条氨基酸序列中较长者的氨基酸数，然后乘以100％。

本发明所述的sRAGE的“功能性片段”指具有本发明所期望的sRAGE活性的生物学功能的片段，包括半衰期增加的片段。需要说明的是，“功能性变体”和“功能性片段”的含义并非是排他的，所述“片段”也包括指sRAGE的功能性变体的片段的情况。本发明所期望的sRAGE活性包括但不限于与内源性RAGE竞争且与RAGE配体的结合。

在优选的实施方案中，所述功能性变体或功能性片段包含对于结合RAGE配体这一功能较为重要的结构域中的氨基酸。例如，sRAGE的功能性片段可包含至少一个，例如一个、两个或全部三个选自下组中的功能模块：sRAGE的V结构域(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-94位)，sRAGE的C1结构域(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基103-199位)和sRAGE的C2结构域(对应于SEQ ID NO:1的氨基酸205-295位)。在一些实施方案中，sRAGE的功能性变体或功能性片段至少包含sRAGE的V结构域或C1结构域之一，优选包含V结构域，更优选包含V结构域和C1结构域二者。在一些实施方案中，sRAGE的功能性片段包含V结构域及选自C1结构域和C2结构域中的一种，优选同时包含V结构域和C1结构域，更优选包含V结构域、C1结构域和C2结构域。在一个实施方案中，sRAGE的功能性变体包含V结构域、C1结构域和C2结构域，并且与SEQ ID NO:1相比具有少于40个氨基酸的差异或至少在87.5％的氨基酸位置处具有相同的氨基酸。

sRAGE的编码序列

本发明还提供sRAGE多肽的编码序列。所述sRAGE编码序列是指编码本发明的sRAGE多肽或其功能性片段或变体的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的编码序列是sRAGE多肽的野生型编码序列，如SEQ IDNO:2所示的序列。在另一个实施方案中，所述编码序列是野生型编码序列的片段，其编码sRAGE多肽的片段，优选包含V结构域或C1结构域之一的片段，优选包含V结构域的片段，更优选包含V结构域和C1结构域二者的片段。

在另一个实施方案中，本发明的编码序列是sRAGE多肽的野生型编码序列的变体，并且编码如SEQ ID NO:1所示的野生型sRAGE多肽或其片段。在一个实施方案中，sRAGE的编码序列是与如SEQ ID No:2所述的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。例如，所述编码序列是密码子优化的序列。

在另一个实施方案中，本发明的编码序列编码sRAGE多肽的变体。

在优选的实施方案中，sRAGE的编码核苷酸序列相对于野生型编码序列具有一个或多个核苷酸的差异，并且具有一种或多种期望的性质，所述性质包括但不限于：表达水平的提高，编码产物在治疗病毒性肺炎中的效力更高、所需剂量更小，具有改变的糖基化模式等。

例如，在本发明的sRAGE编码序列编码不同于野生型sRAGE的多肽的sRAGE变体或片段的情况下，所述变体或片段具有改变的糖基化模式，或在治疗病毒性肺炎例如新冠肺炎中具有增强的效力，或在治疗病毒性肺炎如新冠肺炎时需要的有效剂量(如摩尔量)更小。

例如，为了提高表达水平，本发明的编码序列可以是根据表达sRAGE多肽的宿主细胞类型进行过优化的密码子优化编码序列，从而提高所述多肽在特定宿主中的表达效率。

例如，为了改变多肽产物的糖基化模式，可以修饰所述编码序列中对应于糖基化位点氨基酸的密码子，例如所述修饰可以是缺失、取代、添加中的任意一种。

sRAGE的制备

用于本发明的sRAGE可以基于sRAGE或其重组蛋白的编码序列，通过本领域常用的各种表达系统制备。例如，可以通过采用Invitrogen公司的

Technology杆状病毒表达系统，使用pENTR1载体构建携带有人T7-sRAGE cDNA的杆状病毒，利用构建的重组病毒感染CHO细胞或293细胞，获得sRAGE的表达而制备，也可以使用大肠杆菌原核表达体系等，但不限于这样的方法。在制备过程中，作为sRAGE的编码序列，可使用例如示于SEQ IDNo:2的序列，或与其具有95％，96％，97％，98％或99％以上同一性的序列。本领域技术人员能够理解，由于密码子简并性，编码序列可以不限于具体的核苷酸序列，并且可以根据表达宿主的密码子偏好进行优化。

由于翻译后修饰对sRAGE的功效、半衰期、免疫原性均有影响，因此sRAGE的制备优选在哺乳动物体内进行，也可以利用常用的体外培养的哺乳动物细胞，如CHO细胞系、293细胞系等。

具体地，作为获得哺乳动物型翻译后修饰的sRAGE的方法，可列举：利用人RAGE(NM_001136)cDNA序列构建sRAGE表达载体；PCR扩增对应于RAGE 23-340位氨基酸的编码序列，亚克隆到含有RAGE信号肽和T7表位标签的膜靶向表达载体上，而后通过瞬时或稳定转染建立T7sRAGE CHO-CD14细胞系，从而表达哺乳动物型翻译后修饰的sRAGE。获得是sRAGE蛋白的N-糖基化信息可以通过基于HPAEC技术进行分析而确认。

翻译后修饰的sRAGE

“具有哺乳动物型翻译后修饰的sRAGE”是指sRAGE蛋白具有在哺乳动物细胞中所进行的翻译后修饰。翻译后修饰包括但不限于糖基化、磷酸化、硫酸化、羧酸化、乙酰基化等。

一个实施方案中，所述sRAGE多肽优选包含哺乳动物型N-聚糖谱，优选具有唾液酸化型N-糖基化。对于位点而言，N-糖基化特别优选为在氨基酸3和59位，任选地，所述哺乳动物型翻译后修饰可进一步包括O-糖基化，所述O-糖基化优选为在氨基酸5和61位。在优选的实施方案中，sRAGE具有例如WO2013103688A1中所描述的哺乳动物型翻译后修饰。

sRAGE的纯化

sRAGE蛋白及其功能片段可从表达其的细胞培养基中纯化获得。作为使用的纯化及定量方法没有特别限定，可以使用常用的蛋白质纯化及定量方法。在具有T7标签的情况下，例如可以使用Novagen的T7标签亲和纯化试剂盒进行纯化。纯化后的蛋白浓度可以通过例如RAGE ELISA试剂盒测定，经纯化的sRAGE蛋白可在-80℃下保存。

适应症

本世纪以来，全球先后暴发了3次人冠状病毒(HCoV)疫情，分别为2002年由人类严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)引发的严重急性呼吸系统综合征(SARS)、2012年的中东呼吸道综合征冠状病毒(MERS-CoV)引发的中东呼吸系统综合征(MERS)和本次的严重急性呼吸综合征新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。

需要说明的是，3种冠状病毒感染造成的临床表现及实验室检查基本一致，治疗方案也大致相同。因此虽然在本发明的实施例中使用了新型冠状病毒，但本发明的治疗方法及sRGAE蛋白，药物组合物也可以应用于其他冠状病毒例如，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SAR S-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)，优选为SARS-CoV，MERS-CoV，SARS-CoV-2。这是由于sRGAE的作用原理在于对免疫炎症反应的调控，而不是针对病毒本身，因此，其在新型冠状病毒肺炎中的治疗作用可以同样适用于其他病毒引起的肺炎。

新冠肺炎

“Sars-CoV-2”全称为严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2)。在一些实施方案中，sRAGE被用于治疗或预防由Sars-CoV-2或其突变株(例如,英国变异毒株B.1.1.7(世卫组织命名Alpha)、南非变异毒株B.1.351(世卫组织命名Beta)、巴西变异毒株P.1(世卫组织命名Gamma)、印度变异毒株B.1.617.2(世卫组织命名Delta，德尔塔)，丹麦水貂变异株等)引起的肺炎或炎症因子风暴及多系统损伤并发症，以及受试者出现免疫因子变化的肺部感染。

“COVID-19”全称为“2019冠状病毒病(Coronavirus disease 2019)”，指由新型冠状病毒感染的肺炎，在本文中也称为新冠肺炎。

新型冠状病毒肺部感染的临床表现

本发明所述的新型冠状病毒肺部感染的临床表现，临床分型(普通型，重型，危重型)等，可以利用例如中华人民共和国国家卫生健康委办公厅发布的新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版修订版，国卫办医函〔2021〕191号)中记载的标准进行判断。

作为临床分型标准，例如可参考以下项目。

(一)轻型

临床症状轻微，影像学未见肺炎表现。

(二)普通型

具有发热、呼吸道症状等，影像学可见肺炎表现。

(三)重型

成人符合下列任何一条:

1.出现气促，RR≥30次/分；

2.静息状态下，吸空气时指氧饱和度≤93％；

3.动脉血氧分压(PaO2)/吸氧浓度(FiO2)≤300mmHg

(1mmHg＝0.133kPa)；

高海拔(海拔超过1000米)地区应根据以下公式对PaO2/FiO2进行校正:PaO2/FiO2×[760/大气压(mmHg)]。

4.临床症状进行性加重，肺部影像学显示24～48小时内病灶明显进展>50％者。

儿童符合下列任何一条:

1.持续高热超过3天；

2.出现气促(＜2月龄，RR≥60次/分；2～12月龄，RR≥50次/分；1～5岁，RR≥40次/分；>5岁，RR≥30次/分)，除外发热和哭闹的影响；

3.静息状态下，吸空气时指氧饱和度≤93％；

4.辅助呼吸(鼻翼扇动、三凹征)；

5.出现嗜睡、惊厥；

6.拒食或喂养困难，有脱水征。

(四)危重型。

符合以下情况之一者:

1.出现呼吸衰竭，且需要机械通气；

2.出现休克；

3.合并其他器官功能衰竭需ICU监护治疗。

本发明的采用sRAGE的预防或治疗方法可用于治疗轻型、普通型、重型或危重型的新型冠状病毒肺部感染，及由其他冠状病毒引起的肺部感染。

新冠肺炎或其他冠状病毒引起的肺部感染的并发症可以选自下组中的一种或多种：急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、代谢性酸中毒，厌食症、恶心、呕吐和腹泻等消化道症状，眼球炎症，心血管损害，格林-巴利综合征等。

本发明所述的“治疗”包括治愈疾病，或者至少部分缓解、减轻疾病的一种或多种症状。例如，在本发明的上下文中，治疗可以减少新冠肺炎发展为重症，消除或减弱肺炎影像学指征，改善或减轻如上述“新型冠状病毒肺部感染的临床表现”中提到的临床症状等。

本发明所述的“预防”是指在发病期前所进行的防止或减缓疾病发展的主要措施，防止特定的疾病或由该疾病产生的1个以上的症状的发生。本发明主要为阻止或者延迟肺部的重症感染的产生或进展，预防肺部感染如冠状病毒例如新冠病毒感染导致的并发症和后遗症甚至伤残。

受试者

“受试者”在本发明中指动物，优选脊椎动物，更优选哺乳动物，如啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠；灵长类动物，例如猴；最优选人。

当受试者为人时，可以为婴幼儿、青少年、成人。在一些实施方案中，所述受试者为老年患者，其年龄在60岁以上，或65岁以上。老年患者免疫力较低，同时也因机体功能衰退而对药物的耐受力降低，存在更高的用药风险。而本发明使用sRAGE的治疗方案具有良好的安全性和耐受性，适合老年患者的使用。

在一些实施方案中，受试者患有其他基础疾病，例如可能导致在遭受肺部病毒感染时病死率升高的基础疾病。例如，所述受试者患有糖尿病。

药物组合物

本发明提供包含sRAGE和药学上可接受的载体的药物组合物。

“药学上可接受的载体”指适合作为药物用于递送给受试者如人的有效成分之外的材料，其没有不可接受的毒性或其他性质。药学上可接受的载体可以是固体如粉末，或是液体。实例包括赋形剂(如灭菌水、生理盐水)，缓冲剂，溶剂，表面活性剂，螯合剂(如EDTA)，填充剂等。

药物组合物还可以包括其他添加剂用于不同的功能，如稳定剂，防腐剂，崩解剂，粘合剂，包覆剂，润滑剂(lubricants)，调味剂，甜味剂，增溶剂等。

本发明的药物组合物中包含的sRAGE的剂量可以根据有效给药量结合施用时间间隔而决定。作为sRAGE的有效给药量，医生可以根据受试者的病情体重年龄性别而确定，可以列举将所述药物以分离的sRAGE多肽为0.001-100ng/g体重，优选为0.1-100ng/g体重，更优选为5-100ng/g体重的剂量施用。

施用频率可以为每日单次或多次，优选为每日1，2或3次的频率施用于受试者。对于施用的时间长短，可以由有经验的临床医生根据病情的变化确定并随时调整，例如为一周～数周，或一月～数月，给药日可以不是连续的，两个给药日之间可以有间隔。

施用途径

本发明的sRAGE及其功能性片段，或包含它们的药物组合物、药物制剂可通过任何合适的方式来施用，包括非肠道方式、皮下、腹膜内、肺内和鼻内方式，并且，如果需要的话，为了进行局部免疫抑制治疗，可以采用病灶内施用方式。可举例系统性施用递送，例如静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、胸骨内注射、皮下注射和输注施用于受试者。其它方式包括但不限于用于口服、舌下、经皮、皮下、静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、经黏膜、吸入、经鼻、滴眼、滴耳或阴道内给药。

可以设想本发明的sRAGE多肽也可以通过递送编码该多肽的多核苷酸序列施用给受试者，然后在受试者体内进行表达和翻译后修饰，继而发挥作用。在这种情况下，本发明也涉及编码本发明的sRAGE多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的载体(vector)，包含所述载体(vector)和药学上可接受的载体(carrier)的药物组合物，以及它们在治疗本发明的适应症中的用途。

药物联用

在一个实施方案中，本发明的sRAGE可以通过与JAKi或抗病毒药物联合治疗，使化学药物在较低剂量的情况下应用，同时保持甚至加强治疗效果。本发明的分离的sRAGE多肽或其功能片段或含有其的药物组合物能够与其他治疗病毒感染肺炎相关疾病的药物联合使用。

作为本发明所述的“其他抗病毒、抗炎或免疫治疗”，例如包括但不限于JAKi或抗病毒药物，康复患者恢复期血浆，妥珠单抗(对双肺广泛病变者及重型患者，且IL-6升高者，阻断IL6受体)，静注COVID-19人免疫球蛋白，以及瑞德西韦(抗病毒)，瑞德西韦+巴瑞替尼(JAK抑制剂)，地塞米松(皮质类固醇)，以及结合冠状病毒刺突蛋白的中和单抗bamlanivimab，casirivimab和imdevimab的联合使用。当与康复者恢复期血浆联合使用时，康复者恢复期血浆的用法用量可参考《新冠肺炎康复者恢复期血浆临床治疗方案(试行第二版)》。

以下说明本发明的一些具体实施方案，但不限于此。

1.可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)多肽在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防或治疗病毒性肺部感染。

2.实施方案1的用途，其中所述肺部感染是由人冠状病毒(HCoV)感染引起的病毒性肺部感染。

3.实施方案2的用途，其中所述人冠状病毒(HcoV)选自下组：人类严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸道综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征新型冠状病毒(SARS-CoV-2)；优选为SARS-CoV-2。

4.实施方案1-3中任一项的用途，其中所述分离的sRAGE多肽：

(b)包含与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％同源性的氨基酸序列或由与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％同源性的氨基酸序列组成，并且具有sRAGE活性；或

(c)其为(a)或(b)所述多肽的功能性片段，所述功能性片段具有sRAGE活性。

5.实施方案4的用途，其中所述功能性片段包含RAGE的V结构域、C1结构域和C2结构域中的一个、两个或三个。

6.实施方案5的用途，其中所述功能性片段至少包含RAGE的V结构域和/或C1结构域，更优选包含V结构域，或包含V结构域和C1结构域。

7.实施方案4-6任一项的用途，其中所述sRAGE活性包括与内源性RAGE竞争与RAGE配体的结合。

8.实施方案1-7中任一项的用途，其中所述分离的sRAGE多肽具有哺乳动物型翻译后修饰。

9.实施方案8的用途，其中所述哺乳动物型翻译后修饰包括哺乳动物型N-糖基化，优选所述N-糖基化为唾液酸化型N-糖基化。

10.实施方案8或9的用途，其中所述翻译后修饰在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸3和/或59位的N-糖基化。

11.实施方案8-10中任一项的用途，其中所述哺乳动物型翻译后修饰进一步包括O-糖基化。

12.实施方案11的用途，所述O-糖基化是在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸5和/或61位的O-糖基化。

13.实施方案1-11中任一项的用途，其中所述分离的sRAGE多肽由哺乳动物细胞生产。

14.实施方案13的用途，其中所述分离的sRAGE多肽由CHO细胞和293T细胞生产。

15.实施方案1-14中任一项的用途，其中所述药物以0.001-100ng/g体重，优选为0.1-100ng/g体重，更优选为5-100ng/g体重，可列举8-20ng/g体重的分离的sRAGE多肽的剂量施用。

16.实施方案1-15中任一项的用途，其中所述药物以每日单次或多次，优选为1-3次的频率施用于受试者。

17.实施方案1-16中任一项的用途，其中所述药物用于与其他抗病毒、抗炎或免疫治疗联用。

18.实施方案1-17中任一项的用途，其中所述药物通过系统性施用递送至所述受试者。

19.实施方案18的用途，其中所述药物通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、胸骨内注射、皮下注射或输注递送至所述受试者。

20.实施方案1-19中任一项的用途，其中所述受试者为哺乳动物，优选啮齿动物或灵长类动物，更优选人。

21.实施方案1-20中任一项的用途，其中所述受试者为老年患者和/或患有糖尿病。

22.实施方案1-21中任一项的用途，其中所述受试者具有选自下组的指征中的至少一种：

1)发热和/或呼吸道症状等肺炎相关临床表现；

2)具有肺炎影像学特征；

3)出现以下表现中的一种或多种：D-二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少，炎症因子升高；出现肝酶、乳酸脱氢酶、肌酶、肌红蛋白、肌钙蛋白和铁蛋白增高；或C反应蛋白(CRP)和血沉升高。

23.实施方案22的用途，其中所述肺炎影像学特征包括选自下组的指征中的至少一种：

肺脏呈不同程度的实变，实变区呈现弥漫性肺泡损伤和/或渗出性肺泡炎；肺泡腔内见浆液、纤维蛋白性渗出物及透明膜形成；渗出细胞主要为单核和巨噬细胞，可见多核巨细胞；II型肺泡上皮细胞增生，部分细胞脱落；II型肺泡上皮细胞和巨噬细胞内可见包涵体；肺泡隔可见充血、水肿，单核和淋巴细胞浸润；少数肺泡过度充气、肺泡隔断裂或囊腔形成；肺内各级支气管黏膜部分上皮脱落，腔内可见渗出物和黏液；小支气管和细支气管见黏液栓形成；肺外带的小斑片状阴影，肺间质的改变，肺的磨玻璃影，浸润影，肺实变，胸腔积液，肺部痰咳。

24.实施方案1-23中任一项的用途，其中所述受试者被诊断为患有临床分型为普通型、重型或危重型的新冠病毒肺炎。

25.一种用于治疗或预防与人冠状病毒(HCoV)感染相关的疾病的方法，包括对受试者施用分离的sRAGE多肽。

26.实施方案25的方法，其中所述分离的sRAGE多肽具有如下特征：

27.实施方案26的方法，其中所述功能性片段包含RAGE的V结构域、C1结构域和C2结构域中的一个、两个或三个。

28.实施方案27的方法，其中所述功能性片段至少包含RAGE的V结构域和/或C1结构域，更优选包含V结构域，或包含V结构域和C1结构域。

29.实施方案26-28中任一项的方法，其中所述sRAGE活性包括与内源性RAGE竞争与RAGE配体的结合。

30.实施方案25-29中任一项的方法，其中所述分离的sRAGE多肽具有哺乳动物型翻译后修饰。

31.实施方案30的方法，其中所述哺乳动物型翻译后修饰包括哺乳动物型N-糖基化，优选所述N-糖基化为唾液酸化型N-糖基化。

32.实施方案30或31的方法，其中所述翻译后修饰在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸3和/或59位的N-糖基化。

33.实施方案30-32中任一项的用途，其中所述哺乳动物型翻译后修饰进一步包括O-糖基化。

34.实施方案33的方法，所述O-糖基化是在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸5和/或61位的O-糖基化。

35.实施方案1-24中任一项的用途或实施方案25-34中任一项的方法，其中以0.001-100ng/g体重，优选为0.1-100ng/g体重，更优选为5-100ng/g体重的剂量施用所述分离的sRAGE多肽。

36.实施方案1-24中任一项的用途或中任一项实施方案25-34的方法，其中以每日单次或多次，优选为1-3次的频率施用所述分离的sRAGE多肽。

37.实施方案1-24中任一项的用途或中任一项实施方案25-34的方法，其中所述分离的sRAGE多肽通过系统性施用递送，例如通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、胸骨内注射、皮下注射和输注施用。

38.一种药物组合物，其包含分离的sRAGE多肽和药学上可接受的载体，所述药物组合物用于治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病。

39.实施方案38的药物组合物，其中所述分离的sRAGE多肽具有如下特征：

40.一种组合物，其包括分离的sRAGE多肽或其功能性片段或变体，和至少一种其他诊断剂和/或治疗剂。

41.实施方案41的组合物，其用于基于与内源性RAGE竞争与RAGE配体的结合的研究用途。

42.一种试剂盒，其包含本发明的分离的sRAGE多肽或其功能性片段或变体，所述试剂盒用于预防或治疗病毒性肺部感染。

43.实施方案42的试剂盒，其中所述病毒性肺部感染为由SARS-CoV-2感染引起的病毒性肺部感染。

44.一种分离的核酸分子，其编码实施方案39所述的分离的sRAGE多肽或其功能性片段或变体的核苷酸序列。

45.一种表达构建体，其包含实施方案44的分离的核酸分子。

46.一种表达载体，其包含实施方案44的分离的核酸分子或实施方案45的表达构建体。

47.一种宿主细胞，其包含实施方案46的表达载体。

48.实施方案47的宿主细胞，其为真核细胞，比如哺乳动物细胞。

49.实施方案47或48的宿主细胞，其能够稳定高效地产生具有上述哺乳动物型翻译后修饰的分离的sRAGE多肽。

实施例

为了更全面地理解和应用本发明，下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由的权利要求具体限定。

材料与方法

SARS-CoV-2病毒

实施例中采用了标准品SARS-CoV-2病毒SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN(中国医学科学院医学实验动物研究所)。与该病毒有关的实验是在生物安全3级(ABSL3)设施中使用hepa过滤的隔离器进行的。

实验动物

8-10周龄的雄性和雌性金黄仓鼠(Golden hamster，Mesocricetus auratus)均来自北京HFK生物科学有限公司。动物研究是在动物生物安全3级(ABSL3)设施中使用hepa过滤的隔离器进行的。本发明的实施例中涉及动物的所有程序均经北京协和医学院实验动物科学研究所动物护理与使用委员会审核批准。

动物处理

共使用35只仓鼠，雌雄随机。将仓鼠分为感染组(30只)和非感染组(5只)，感染组用10⁵TCID₅₀剂量的SARS-CoV-2原液以100μl PBS经鼻接种；非感染组仓鼠鼻内接种PBS。

根据sRAGE的施用剂量将感染组分为如下各组：sRAGE 20ng/g(10只)、10ng/g(5只)、5ng/g(5只)，对其分别在感染后1、2、3、4、5、6天(d)以20ng/g、10ng/g、5ng/g体重的剂量腹腔注射人重组sRAGE(购于义翘神州公司，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)作为治疗；并以在同样时间点注射人血清白蛋白(20ng/g体重)的仓鼠作为处理对照组(处理对照：10只)。

每天观察所有仓鼠的体重、临床症状和对外界刺激的反应。在7d处死仓鼠，采集心脏血液(1ml)进行全血计数，并通过外科方式采集整个肺进行病毒载量分析、病理检查和机制研究。

病毒载量测定

病毒载量采用qRT-PCR检测。用电匀浆器制备全肺匀浆，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取肺总RNA。使用PrimerScript RT试剂盒(TaKaRa)根据制造商的说明进行逆转录。使用PowerUp SYBG Green Master试剂盒(ABI)，按以下条件进行反应：50℃ 2分钟，95℃ 2分钟，随后进行95℃ 15秒和60℃ 30秒共40个循环，最后95℃ 15秒，60℃ 1分钟，95℃45秒。

qRT-PCR引物序列如下：

正向：5'-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3'(SEQ ID NO:3)，

反向：5'-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3'(SEQ ID NO:4)。

以拷贝数已知的重组质粒(每μl 1.47×10⁹～1.47×10¹个拷贝)，用10倍稀释法构建标准曲线。所有实验均在生物安全三级设施中进行。

将Ct值(qPCR中达到阈值的循环数)与标准曲线进行比较，将每个仓鼠肺的病毒载量结果表示为每ml基因组等效拷贝数的log10转化数。采用单尾t检验分析组间病毒载量的差异。p值<0.05为显著(*p<0.05，**p<0.01)。病毒载量以平均值±SD表示。

统计分析

使用Prism软件(GraphPad软件)进行统计分析。数据以均数±s.e.m.表示，实验组与对照组比较采用双尾学生t检验。P值≤0.05为差异有统计学意义。*:p<0.05；**:P<0.01；***:P<0.001。

Western印迹

上述各组的肺组织用RIPA裂解缓冲液(Solarbio,R0010)补充蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂在冰块上裂解30min。组织在裂解液中4℃，12000rmp/min离心15min，收集上清液，56℃灭活病毒30min，以上实验均在3级生物安全设施中进行。

用30μg蛋白进行Western印迹分析。使用以下抗体进行Western印迹：RAGE(Abcam,ab216329)，β-actin(Yeasen,30101)，重组Anti-MX1抗体[EPR24485-19](ab284603，Abcam)。使用ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij)计算western blot条带，获得定量数据，用于进一步统计分析。

肺组织基因表达

肺组织基因表达使用qRT-PCR检测:用电匀浆器制备全肺匀浆，用RNeasy MiniKit(Qiagen)提取肺总RNA。cDNA由cDNASynthesis SuperMix(TransGen,AE311-04)按照制造商的方案制备。使用SuperReal PreMix Plus SYBR Green(TIANGEN BIOTECH,FP205)进行基因表达分析。SYBR Green以ACTB作为内参基因。数据按ΔCt法进行分析。引物根据NCBI数据库中(Mesocricetus auratus)的预测序列设计(见表1)。

表1

病理检查

在动物生物安全3级(ABSL3)实验室中于7dpi(感染后天数，day(s)postinfection)时进行尸检。肉眼检查肺，用10％缓冲福尔马林溶液固定，并制作石蜡切片(3-4μm厚度)。H&E染色和免疫组化检测仓鼠肺组织病理学改变。H&E染色切片的病理诊断由两名独立实验组的病理学家进行，组织学半定量评分如下:

附：肺脏病变评价方法

一、单个肺叶病变分级标准：

1.肺泡隔增宽：

+，轻度病变，肺泡隔轻度增宽。

++，中度病变，肺泡隔明显增宽，病变范围大于1/2。

+++，重度病变，肺泡隔明显增宽，并出现肺泡隔增宽、融合、肺泡腔明显缩窄，病变范围大于1/2。

++++，极重度病变，肺泡隔增宽、融合、肺泡腔明显缩窄以致消失，局部肺组织实变，病变范围大于3/4。

2.其他、病变(肺泡内渗出、血管周围炎细胞浸润、支气管周围炎细胞浸润等)

+，轻度病变，病变范围小于肺组织切面1/4。

++，中度病变，病变范围约占肺组织切面1/4～2/4。

+++，重度病变，病变范围约占肺组织切面2/4～3/4。

++++，极重度病变，病变范围大于肺组织切面3/4。

二、动物肺脏病变综合判断标准

1.轻度：肺泡隔增宽炎细胞浸润+出现在1个以上肺叶，且肺泡间隔增宽炎细胞浸润++不超过2个肺叶。

2.中度：肺泡间隔增宽炎细胞浸润+++出现在1个肺叶，或肺泡间隔增宽炎细胞浸润++出现在2个以上肺叶(含2个)，或2个以上肺叶出现肺泡间隔增宽炎细胞浸润++伴有肺泡内渗出++～++++，及伴有血管周围炎细胞浸润++～++++。

3.重度：肺泡间隔增宽炎细胞浸润++++出现在1个以上肺叶，或肺泡间隔增宽炎细胞浸润+++出现在2个以上肺叶(含2个)，或3个以上肺叶出现肺泡间隔增宽炎细胞浸润++伴有肺泡内渗出++～++++，及伴有血管周围炎细胞浸润++～++++。

免疫组化

免疫组化使用了SABC系统的即用型免疫组化试剂盒(百奥莱博，ZN1830)按照说明书进行。获得切片的步骤同H&E染色切片。

实施例1 SARS-CoV-2鼻内感染诱导的COVID-19仓鼠模型

金黄仓鼠已被用作SARS-CoV-2诱导的肺炎动物模型，其病理表型与COVID-19患者高度相似。

在本实施例中，通过鼻内接种SARS-CoV-2病毒(剂量为1×10⁵TCID₅₀)建立了COVID-19金黄仓鼠模型。具体的接种过程及动物建模过程见“材料与方法”中的“体内动物建模”部分。

从接种后第1天开始，分别以体重为20ng/g、10ng/g、5ng/g的sRAGE处理仓鼠，并以20ng/g的人血清白蛋白(HSA)作为处理对照组。每天监测每只仓鼠的体重，连续7天。在7dpi处死仓鼠，采集血样和肺组织。如材料与方法中所述进行测定肺内病毒载量，将动物模型的病毒接种日程示于图1。

结果显示：在仓鼠被SARS-CoV-2感染后7dpi，肺部检测到约1x10⁶个病毒拷贝/ml，所有受SARS-CoV-2感染的仓鼠体重均逐渐减轻。sRAGE适度但显著地缓解了体重的下降，说明sRAGE可能减轻了SARS-CoV-2对机体的整体损害。sRAGE处理对病毒载量并未有显著影响，提示其效果并不是通过改变病毒载量实现的。

实施例2肺部损伤评估(仓鼠模型肺组织切片H&E染色)

在本实施例中，对实施例1中的各组动物通过H&E染色(方法见“材料与方法”中的“病理检查”)检查了肺组织切片，以评估肺炎的严重程度。各实验组金黄仓鼠模型的肺组织HE染色结果示于图2。根据肺整体损伤、肺泡壁增厚、肺泡内纤维蛋白沉积和炎症细胞浸润对切片进行了评分和统计。

结果显示，从图2可见，阴性对照组(未感染对照组)中可见正常肺组织结构，肺泡内无分泌物；在感染组的肺组织中，HSA处理对照组呈现重症肺炎特征，肺泡隔增宽、融合，肺泡腔明显缩窄以致消失，局部肺组织实变；而sRAGE处理组(10ng、20ng组)呈现中度肺炎表现，肺泡隔增宽、肺泡融合、肺泡腔缩窄等病理改变较处理对照组有明显的改善。

sRAGE治疗20ng组与sRAGE治疗10ng组有相同表现趋势(图3)。在使用HSA治疗的SARS-CoV-2感染仓鼠中，从数量方面有90％表现为严重的间质性肺炎，具体表现为弥漫性肺泡间隔增厚，大面积出血，肺内大量炎症细胞浸润。相比之下，sRAGE处理组中形成严重间质性肺炎仓鼠的数量更少。具体地，HSA处理对照组的重症动物数与总动物数的比例为9/10，sRAGE20ng组为3/10，sRAGE10ng组为1/5。可以看到，在10ng/g sRAGE组中，只有1物出现了严重的肺炎，大大降低了达到重症的动物的比例。

在图4所示的肺炎分级评分统计中，也可看出sRAGE的施用对评分的改善。

实施例3多种炎症因子的表达水平

在本实施例中，对实施例1获得的肺组织中的多种炎症因子(IL-1β，IL-6，TNFα，IL-18，IL-10，IL-12等)的mRNA水平进行了检测，以确定肺部的炎性反应水平。方法同材料与方法中的“qRT-PCR”部分，使用的引物示于表1，将结果示于图5。还检测了各组血液中的外周血白细胞和淋巴细胞，将结果示于图6。

结果显示，与给予HSA的处理对照组相比，在给予sRAGE处理的组中，IL-1β、IL-10，IL-6、TNFα、IL-18，IL-12等的mRNA表达水平均显著降低，并且在给予sRAGE治疗的组中，20ng组优于10ng组。另外，在给予sRAGE治疗的组中，与给予HSA的处理对照组相比，在外周血白细胞计数中呈现出中性粒细胞减少的趋势，而淋巴细胞在sRAGE处理组中呈增加趋势(图6)。

实施例4巨噬细胞标志物CD68和1型干扰素应答标志物Mx1

对实施例1中各组肺组织中CD68和1型干扰素应答标志物Mx1的mRNA表达水平进行了检测。方法如材料与方法中所述，将统计结果示于图7。

Mx1基因编码蛋白MxA(Myxovirus resistance protein A，粘病毒抗性蛋白A)，该基因和蛋白为1型干扰素应答标志物，可以在临床诊断中作为病毒感染的标记物，可作为1型干扰素生物利用度的可靠标记物，也可作为区分病毒和细菌疾病的标记物。CD68为巨噬细胞标志物。

RT-qPCR结果显示，与HSA处理对照组相比，sRAGE处理组中CD68和1型干扰素应答标志物Mx1的mRNA表达水平明显下降。说明sRAGE显著减少了巨噬细胞在肺组织中的聚集及肺部炎症程度。

实施例5 sRAGE显著抑制肺部炎性细胞浸润及炎症反应

对实施例1中各组肺组织的切片进行了针对CD3和MxA的免疫组化，方法如材料与方法中所述，将染色结果示于图8。

结果显示，SARS-CoV-2的感染诱导了CD3阳性T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的肺部浸润，特别是在血管周围和支气管周围区域。通过施用sRAGE治疗后，这些炎性细胞在肺部的浸润均明显减少，表明sRAGE可通过抑制炎症细胞的招募而抑制肺部炎症反应。

综上所述，用sRAGE治疗SARS-COV-2感染的仓鼠模型可以显著减少肺组织中炎症细胞的积累，包括中性粒细胞和巨噬细胞，并且细胞因子的表达也显著减少。结果表明，COVID-19肺炎的整体严重程度明显减轻，出现严重肺炎症状的仓鼠比例下降。表明sRAGE能够作为预防和治疗药用于肺部感染相关疾病特别是SARS-CoV-2引起的新冠肺炎。

工业实用性

发明人提供sRAGE在显著减弱SARS-CoV-2感染后肺部的促炎反应中的用途，其能通过多种机制抑制肺部炎症。sRAGE属于生物体自身产生的分子，无明显毒副作用，安全性高。此外，通过sRAGE与JAKi或抗病毒药物联合治疗，有望使化学药物在较低剂量的情况下应用，同时保留甚至加强治疗效果。本发明提供了强有力的证据支持在真实的临床环境，机理研究，动物模型，药物开发中应用sRAGE进行针对肺部病毒感染的治疗。

序列表

SEQ ID NO:1-sRAGE的氨基酸序列

/>

SEQ ID NO:2-sRAGE的编码序列-DNA

SEQ ID NO:3-测定病毒载量的qRT-PCR引物-正向

TCGTTTCGGA AGAGACAGGT 20

SEQ ID NO:4-测定病毒载量的qRT-PCR引物-反向

GCGCAGTAAG GATGGCTAGT 20

序列表

<110> 南京景瑞康分子医药科技有限公司

<120> 可溶性晚期糖基化终末产物受体蛋白用于预防或治疗肺部感染疾病的用途

<130> PS12930RAY33CN

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Gln Asn Ile Thr Ala Arg Ile Gly Glu Pro Leu Val Leu Lys Cys

1 5 10 15

Lys Gly Ala Pro Lys Lys Pro Pro Gln Arg Leu Glu Trp Lys Leu Asn

20 25 30

Thr Gly Arg Thr Glu Ala Trp Lys Val Leu Ser Pro Gln Gly Gly Gly

35 40 45

Pro Trp Asp Ser Val Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Leu

50 55 60

Pro Ala Val Gly Ile Gln Asp Glu Gly Ile Phe Arg Cys Gln Ala Met

65 70 75 80

Asn Arg Asn Gly Lys Glu Thr Lys Ser Asn Tyr Arg Val Arg Val Tyr

85 90 95

Gln Ile Pro Gly Lys Pro Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Glu Leu Thr

100 105 110

Ala Gly Val Pro Asn Lys Val Gly Thr Cys Val Ser Glu Gly Ser Tyr

115 120 125

Pro Ala Gly Thr Leu Ser Trp His Leu Asp Gly Lys Pro Leu Val Pro

130 135 140

Asn Glu Lys Gly Val Ser Val Lys Glu Gln Thr Arg Arg His Pro Glu

145 150 155 160

Thr Gly Leu Phe Thr Leu Gln Ser Glu Leu Met Val Thr Pro Ala Arg

165 170 175

Gly Gly Asp Pro Arg Pro Thr Phe Ser Cys Ser Phe Ser Pro Gly Leu

180 185 190

Pro Arg His Arg Ala Leu Arg Thr Ala Pro Ile Gln Pro Arg Val Trp

195 200 205

Glu Pro Val Pro Leu Glu Glu Val Gln Leu Val Val Glu Pro Glu Gly

210 215 220

Gly Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Val Pro

225 230 235 240

Ala Gln Pro Ser Pro Gln Ile His Trp Met Lys Asp Gly Val Pro Leu

245 250 255

Pro Leu Pro Pro Ser Pro Val Leu Ile Leu Pro Glu Ile Gly Pro Gln

260 265 270

Asp Gln Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Thr His Ser Ser His Gly Pro

275 280 285

Gln Glu Ser Arg Ala Val Ser Ile Ser Ile Ile Glu Pro Gly Glu Glu

290 295 300

Gly Pro Thr Ala Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Leu Gly Thr Leu Ala

305 310 315 320

Leu Ala Leu

<210> 2

<211> 927

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcaaaaca tcacagcccg gattggcgag ccactggtgc tgaagtgtaa gggggccccc 60

aagaaaccac cccagcggct ggaatggaaa ctgggaggag gcccctggga cagtgtggct 120

cgtgtccttc ccaacggctc cctcttcctt ccggctgtcg ggatccagga tgaggggatt 180

ttccggtgcc aggcaatgaa caggaatgga aaggagacca agtccaacta ccgagtccgt 240

gtctaccaga ttcctgggaa gccagaaatt gtagattctg cctctgaact cacggctggt 300

gttcccaata aggtggggac atgtgtgtca gagggaagct accctgcagg gactcttagc 360

tggcacttgg atgggaagcc cctggtgcct aatgagaagg gagtatctgt gaaggaacag 420

accaggagac accctgagac agggctcttc acactgcagt cggagctaat ggtgacccca 480

gcccggggag gagatccccg tcccaccttc tcctgtagct tcagcccagg ccttccccga 540

caccgggcct tgcgcacagc ccccatccag ccccgtgtct gggagcctgt gcctctggag 600

gaggtccaat tggtggtgga gccagaaggt ggagcagtag ctcctggtgg aaccgtaacc 660

ctgacctgtg aagtccctgc ccagccctct cctcaaatcc actggatgaa ggatggtgtg 720

cccttgcccc ttccccccag ccctgtgctg atcctccctg agatagggcc tcaggaccag 780

ggaacctaca gctgtgtggc cacccattcc agccacgggc cccaggaaag ccgtgctgtc 840

agcatcagca tcatcgaacc aggcgaggag gggccaactg caggctctgt gggaggatca 900

gggctgggaa ctctagccct ggccctg 927

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgtttcgga agagacaggt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgcagtaag gatggctagt 20

Claims

1.分离的可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)多肽在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中预防或治疗病毒性肺部感染，优选为由人冠状病毒(HCoV)感染引起的病毒性肺部感染，更优选为由SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2感染引起的病毒性肺部感染。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述分离的sRAGE多肽：

3.根据权利要求1-2中任一项所述的用途，其中所述分离的sRAGE多肽具有哺乳动物型翻译后修饰，所述哺乳动物型翻译后修饰优选包括哺乳动物型N-糖基化，所述N-糖基化优选为唾液酸化型N-糖基化，特别优选在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸3和/或59位的N-糖基化，

任选地，所述哺乳动物型翻译后修饰进一步包括O-糖基化，所述O-糖基化优选为在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸5和/或61位的O-糖基化。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述药物用于与其他抗病毒、抗炎或免疫治疗联用。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述受试者具有选自下组的指征中的至少一种：

1)发热和/或呼吸道症状等肺炎相关临床表现；

2)具有肺炎影像学特征；

3)出现以下表现中的一种或多种：D-二聚体升高、外周血淋巴细胞进行性减少，炎症因子升高；肝酶、乳酸脱氢酶、肌酶、肌红蛋白、肌钙蛋白和铁蛋白增高；或C反应蛋白(CRP)和血沉升高。

6.根据权利要求5所述的用途，所述肺炎影像学特征包括选自下组的指征中的至少一种：

7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中所述受试者被医师诊断为患有临床分型为普通型，重型或危重型的新冠病毒肺炎。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的用途，其中所述药物以sRAGE多肽的剂量为0.001-100ng/g体重，优选为0.1-100ng/g体重，更优选为5-100ng/g体重，和/或以每日单次或多次，优选为1-3次的频率施用于受试者。

9.药物组合物，其包含分离的sRAGE多肽和药学上可接受的载体，所述药物组合物用于治疗或预防与SARS-CoV-2感染相关的疾病，所述分离的sRAGE多肽具有如下特征：

10.权利要求9所述的药物组合物，其以sRAGE多肽的剂量为0.001-100ng/g体重，优选为0.1-100ng/g体重，更优选为5-100ng/g体重，和/或每日单次或多次，优选为1-3次的频率施用于受试者。