CN116240144A

CN116240144A - 一种溶磷细菌芽孢杆菌dppg-26及其处理废蘑菇基质的方法

Info

Publication number: CN116240144A
Application number: CN202310277038.2A
Authority: CN
Inventors: 武占省; 李海杰; 李方向; 王涛; 常小箭; 李海丽; 张田林
Original assignee: Xian Polytechnic University
Current assignee: Xian Polytechnic University
Priority date: 2023-03-21
Filing date: 2023-03-21
Publication date: 2023-06-09

Abstract

本发明属于环境微生物技术领域，具体地说是一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG‑26及其处理废蘑菇基质的方法，本发明通过接种芽孢杆菌DPPG‑26进一步提高了堆肥产品的萌芽指数GI(高达88.4％)、pH(8.5)、总氮TN(16.6g/kg)、总磷含量(3.20g/kg)和有效磷含量(0.34g/kg)，降低了总有机碳TOC、C/N和EC。还发现，接种溶磷菌提高了堆肥的稳定性、腐殖质化程度和细菌多样性，有助于堆肥过程中磷组分的转化。芽孢杆菌DPPG‑26也增强了菌渣堆肥中本土微生物间的相互作用，降低了堆肥产品的生物毒性，提高堆肥中的碳水化合物代谢、全局和概览图谱以及氨基酸代谢等途径，本发明为接种具有溶磷功能的芽孢杆菌DPPG‑26，更好地调节废蘑菇基质堆肥中磷营养水平，降低环境风险提供了有效技术。

Description

一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26及其处理废蘑菇基质的方法

技术领域

本发明涉及环境微生物技术领域，具体是一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26及其处理废蘑菇基质的方法。

背景技术

随着人们对饮食质量和绿色食品品种需求的不断提高，统计显示，1吨新鲜食用菌将导致5吨SMS的生产。如果不及时处理，用过的蘑菇基质会积累腐烂，不仅造成生物质资源的浪费，还会造成一系列环境危害，因为SMS除代谢产物和真菌菌丝外，还含有大量的木质纤维素、蛋白质等残留有机质(OM)。

废弃物好氧堆肥是一种广泛应用于工农业的有机固体处理策略，可生产稳定、安全、营养丰富的有机肥料，有利于可持续发展和实现清洁生产。一些学者利用废弃的固体有机材料进行土壤生物修复，以实现回收珍贵资源的目的。磷(P)是作物生长必需的营养物质，但也是一种不可再生资源，在各种有机垃圾堆肥中都相对丰富。如果农业废弃物中的磷能够得到合理的回收和转化，在农业土壤应用中，提高有效磷的可持续性，减少化学磷肥的施用，将具有不可忽视的潜在价值。然而，据报道，营养物质是生物稳定的，在堆肥过程中，不稳定磷向中等稳定磷的转化也会导致有效磷的百分比下降，这在一定程度上限制了植物利用磷的效率。微生物菌剂的应用，如增加磷的转化，减少氨排放，改善腐殖质等，在调节养分形态和加快堆肥过程中已得到重视。在此基础上，本发明的一个创新之处是发明了一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26提升菌渣堆肥过程效率方法，同时促进与磷动态相关的养分流动。

堆肥过程中微生物群落的动态演替、代谢功能的变化以及微生物之间的相互作用决定了堆肥过程中的物质转化和堆肥效率。与传统的堆肥研究技术相比，高通量测序(HTS)技术是一种致力于对堆肥过程中复杂微生物群落进行深入研究的有效方法，可以破译堆肥机理，优化堆肥性能，更好地洞察接种后微生物群落的重建。同时，基于随机矩阵理论的网络方法被广泛用于识别微生物群落之间的相互作用及其与环境因子的关系。因此，结合HTS和网络分析可以更好地理解原生细菌与溶磷菌相互作用之间的相关性，以及它们如何驱动SMS堆肥过程中磷组分的动员。PICRUSt2是一种利用测序数据预测微生物代谢功能多样性的新方法。大量可靠的证据表明，不同堆肥系统微生物群落组成差异显著，微生物群落演替与代谢功能密切相关。此外，已有研究证实，温度、总有机碳(TOC)和总氮(TN)含量(C/N)、电导率(EC)和种子萌发指数(GI)等各种环境因素对堆肥微生物群落演替有显著影响，进而影响堆肥的安全性、病原灭活、稳定性、植物毒性和腐殖质化。然而，溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26对SMS堆肥过程中微生物群落演替、细菌相互作用和代谢功能特性的驱动作用尚未得到研究。

本发明以溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26在堆肥早期接种或不接种为处理组。在37天内监测植物毒性、营养成分和理化性质的变化。采用共发生网络分析和基于16S rRNA基因的HTS分析了SMS堆肥中细菌群落的相互作用，研究了溶磷菌接种剂在内源细菌群落影响P组分转化过程中的作用，并通过³¹P-NMR检测P组分。此外，利用PICRUSt2工具预测了堆肥5个阶段的细菌代谢功能。本发明为研究芽孢杆菌属的作用和接种对堆肥中磷组分的动员作用，以及如何更好地调控SMS堆肥中磷营养水平和降低环境风险提供了新的思路。

因此，针对上述问题提出一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26及其处理废蘑菇基质的方法。

发明内容

本发明的目的是研究在溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26驱动下提高废蘑菇基质堆肥效率的微生物机制，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：

一种微生物菌剂，这种细菌鉴定Bacillus subtilis，命名为枯草芽孢杆菌DPPG-26，其菌种保藏号为CGMCC No.9393。

枯草芽孢杆菌DPPG-26具有较强溶磷性能，对无机磷的溶解量为60.58mg/L，此外，菌株DPPG-26具有产嗜铁素、固氮和分泌IAA的能力。

利用筛选出的具有溶磷、耐盐的功能菌株，通过对照总共2个处理，测定2个堆肥处理的理化指标及产品营养含量，获得高效微生物菌剂。

一种微生物菌剂，由浓度不低于10⁹CFU/ml所述的枯草芽孢杆菌DPPG-26组成。

所述的枯草芽孢杆菌DPPG-26，其生理学特征是：

(1)菌种有效活菌数高，采用液态方式接种细菌浓度在10⁹CFU/ml以上；

(2)枯草芽孢杆菌DPPG-26具有较强溶磷能力；

(3)枯草芽孢杆菌DPPG-26对作物无害，对人和动物无致病性。

枯草芽孢杆菌DPPG-26的制备方法为：将活化后的枯草芽孢杆菌DPPG-26接种到LB液体培养基中，在30℃、170rpm下培养2天；待培养结束后，用蒸馏水调节浓度，使细菌浓度在10⁹CFU/ml以上。

其中，细菌通过OD值计算浓度。

在溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26驱动下提高废蘑菇基质堆肥效率的微生物机制研究，其包括如下步骤：

S1：原料混合：将废蘑菇基质粉碎至尺寸＜3cm，调节混合物中的含水率达到约60％，用氢氧化钾调节初始pH值为7；将均匀混合物放置在堆肥泡沫箱中；

S2：溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26接种：在所述均匀混合物中接种本发明所述的溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26，接种量为发酵原料质量的1.5％-2.5％，物料充分混匀后进行发酵；

S3：整个堆肥试验持续37d左右。为保证温度可以上升，在废蘑菇基质堆肥的初始和升温阶段，每天8小时用氧气泵以12.5L/min的速率通风。在第4、8、13、20、27、35天进行机械翻堆以增强通风，最终得到高质量堆肥产品。

本发明的有益之处在于：

本发明通过接种芽孢杆菌DPPG-26进一步提高堆肥产品的萌芽指数GI(高达88.4％)、pH(8.5)、TN(16.6g/kg)、总磷含量(3.20g/kg)和有效磷含量(0.34g/kg)，降低TOC、C/N和EC。提高了堆肥的稳定性、腐殖质化程度和细菌多样性，有助于堆肥过程中P组分的转化，同时也降低腐熟产品的生物毒性。此外，芽孢杆菌DPPG-26也增强了微生物间的相互作用，提高堆肥中的碳水化合物代谢、全局和概览图谱以及氨基酸代谢等途径，改善堆肥产品的营养质量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明堆肥过程温度、含水量、pH、EC的变化示意图；

图2为本发明堆肥过程GI、TOC、TN和C/N的变化示意图；

图3为本发明堆肥中总磷(TP)和有效磷(Olsen P)的变化示意图；

图4为本发明堆肥中磷组分的变化示意图；

图5为本发明溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26对共堆肥温度的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本试验共设计2个处理，进一步验证微生物菌剂提升菌渣堆肥产品质量方面的应用效果，设计溶磷菌枯草芽孢杆菌DPPG-26处理组(PSB)和对照组(CK)总共2个处理；用蒸馏水调节浓度，使细菌浓度在10⁹CFU/ml以上。

菌渣原料设计：将废蘑菇基质粉碎至尺寸＜3cm，调节混合物中的含水率达到约60％，用氢氧化钾调节初始pH值为7；将均匀混合物放置在堆肥泡沫箱中；

溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26接种：在所述均匀混合物中接种本发明所述的微生物菌剂，接种量为发酵原料质量的2％，物料充分混匀后进行发酵。

堆肥发酵：整个堆肥试验持续37d，第4、8、13、20、27、35天进行机械翻转以增强通风。为了保证温度可以上升，在菌渣堆肥的初始和升温阶段，每天8小时用氧气泵以12.5L/PSBn的速率通风。分别在初始期(第0天)、加热期(第1天)、嗜热期(第5天)、冷却期(第17天)和成熟期(第26天)收集堆肥样品，编号为C0、C1、C2、C3和C4。从不同堆肥处理的顶部、中部和底部采集400g新鲜样品，在不同堆肥阶段进行均匀混合。然后将所有样品置于-20℃保存，检测理化指标和细菌群落多样性。

堆肥过程各指标结果分析：

温度、含水量、pH、EC的变化

第4天，两种处理均进入C2阶段(50℃以上)，该阶段持续14天，可绝对保证杀灭虫卵、杂草种子和病原微生物(图1a)。结果表明:接种处理组温度显著升高(P<0.05)高于CK组，这反映了微生物活性的提高对高发酵强度的影响。随着堆肥时间的延长，两种处理的含水量逐渐降低。从C0到C4，PSB桩和CK桩的含水率分别从～60.0％下降到45.0％和47.0％(图1b)。PSB组的含水率在C4期较低，说明在堆肥试验中PSB中的微生物活性高于CK。如图1c所示，随着温度的快速升高，有机酸的挥发降解导致两种处理的pH值不断升高。在C1-C3阶段，PSB堆肥的pH值低于CK。PSB和CK的最终成熟产物pH值分别为8.5和8.0，均达到生物肥料完全成熟的碱性标准。两组堆肥的EC值均呈现先升高后降低的趋势(图1d)。在整个堆肥过程中，PSB的EC显著(P<0.05)低于CK。发酵堆肥的EC值PSB和CK分别为1.77mS/cm和2.79mS/cm，低于4mS/cm的成熟度标准。

萌芽指数(GI)、总有机碳(TOC)、总氮(TN)和C/N的变化

在C4期，PSB处理组的GI值(88.4％)显著(P<0.05)高于CK(72.1％)(图2a)。堆肥初期，2个处理的TOC含量约为620g/kg，并在堆肥过程中持续下降(图2b)。堆肥完全成熟时，CK和PSB的TOC含量分别降低34.7％和36.0％。总氮含量在各处理中逐渐升高(图2c)。全氮含量在13.60～16.6g/kg之间，CK的全氮含量低于最终产物PSB的全氮含量。图2d显示了C/N比值的整体变化，随着OM的退化，C/N比值不断下降，在第37天，PSB和CK桩均达到了一个相对稳定的值(分别为23.62和24.61)。

堆肥中总磷(TP)和有效磷(Olsen P)的变化

堆肥过程中各处理TP浓度均呈持续上升趋势，CK为2.25～2.93g/kg，PSB为2.27～3.2g/kg(图3a)。与前期相比，CK和PSB的TP含量在C4阶段分别提高了30％和41％。各桩的Olsen P浓度均明显升高(P<0.05)，CK桩为0.20～0.26g/kg，PSB桩为0.20～0.34g/kg(图3b)。发酵进入C4阶段，PSB组有效磷含量显著升高(P<0.05)，较CK组提高约31％。此外，PSB组TP中有效磷的比例(10.6％)高于CK组(8.9％)。

液相³¹P-NMR谱用于鉴定SMS堆肥中不同的有机和无机磷组分。如图4所示，与这些不同组分相关的信号出现在-25-25PPM范围内，包括聚磷酸盐(Poly-P，-5至-20PPM)、焦磷酸盐(Pyro-P，-3至-5PPM)、正磷酸盐二酯(Dies-P，-1至2.5PPM)、正磷酸盐单酯(Mono-P，3至6PPM)、正磷酸盐(Ortho-P，5至7PPM)和磷酸盐(Phon-P，18至20PPM)。这些信号被用来表征SMS堆肥中P组分的特征。有机磷(OP)组分中含有Mono-P和Dies-P，Mono-P峰范围为3.38～4.89PPM。Mono-P是生物质磷的重要组成部分，由多种高度稳定的OP化合物组成，包括肌醇磷酸、单核苷酸和磷酸碳水化合物，这些化合物在堆肥过程中会与阴离子或阳离子共沉淀。无机磷(IP)组分包括Poly-P、Ortho-P和Pyro-P。SMS堆肥中的磷化合物主要由正磷酸盐、正磷酸盐单酯、正磷酸盐二酯和焦磷酸盐组成，磷化合物在堆肥中的比例为正磷酸盐>正磷酸盐单酯>焦磷酸>正磷酸盐酯。在堆肥过程中，PSB组的Dies-P比例呈先升高后降低的趋势，这与对照组相反。Pyro-P的比例在两组中持续下降，与Ortho-P的上升趋势完全相反。而PSB组在C3期时，Ortho-P的比例下降。与CK组不同的是，堆肥过程中Poly-P的比例持续下降。此外，在堆肥结束时，PSB中Pyro-P和Mono-P的比例(7.7％、24.71％)均高于CK(4.23％、13.61％)，说明添加芽孢杆菌对P组分的动员是有影响的。

实施例二

本试验共设计2个处理，进一步验证微生物菌剂提升菌渣堆肥产品质量方面的应用效果，设计枯草芽孢杆菌DPPG-26的微生物菌剂(PSB)和对照组(CK)总共2个处理；用蒸馏水调节浓度，使细菌浓度在1×10⁹CFU/ml以上。

溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26接种：在所述均匀混合物中接种本发明所述的微生物菌剂，接种量为发酵原料质量的1％，物料充分混匀后进行发酵。

堆肥发酵：为了保证温度可以上升，在菌渣堆肥的初始和升温阶段，每天8小时用氧气泵以12.5L/min的速率通风。分别在初始期(第0天)、加热期(第1天)、嗜热期(第5天)、冷却期(第17天)和成熟期(第26天)收集堆肥样品，从不同堆肥处理的顶部、中部和底部采集200g新鲜样品，在不同堆肥阶段进行均匀混合。然后将所有样品置于-20℃保存，检测理化指标和细菌群落多样性。

表1部分理化性质变化

实施例三

堆肥原料设计：将香菇菌渣粉碎至＜3cm，然后将粉碎后的废蘑菇基质与鸡粪充分混合形成C/N比为25的均匀混合物，调节混合物中的含水率达到约60％，将均匀混合物放置在堆肥泡沫箱中，所述混合物中废蘑菇基质与鸡粪质量比为2:1。

表2初始原料理化性质：

本试验连同商品菌剂对照总共3个处理，具体情况见表2；整个堆肥试验持续40d左右。为保证温度可以上升，在废蘑菇基质堆肥的初始和升温阶段，每天8小时用氧气泵以12.5L/min的速率通风。在第4、8、13、20、27、35天进行机械翻堆以增强通风，最终得到高质量堆肥产品。

从不同堆肥处理的顶部、中部和底部采集400g新鲜样品，在不同堆肥阶段进行均匀混合。然后将所有样品置于-20℃保存，检测理化指标和细菌群落多样性。

购买的商品菌剂包含酵母菌、芽孢杆菌、光合细菌、放线菌、粪肠球菌，解磷、解钾、固氮菌等多种有益菌群。

表3不同处理的复合菌剂研制及堆肥的接种量应用

堆肥过程各理化指标结果分析：

堆肥过程持续进行30d后堆肥温度接近于室温(图4)。三个处理均能在第3d进入嗜温期(>55℃)，但相比于CK处理(61℃)、CI和PSB处理的在第3d达到更高的温度水平(分别为72℃和74℃)。PSB的嗜热温度更高说明接种微生物后堆肥中微生物更活跃。此外，三种处理均能在高温(>55℃)下维持10d。在嗜热期间，大量的致病菌和有毒物质被灭活，有机物迅速分解。随后堆体的温度不断下降，表明堆肥逐渐成熟。当堆体温度趋于室温时，表明堆体微生物基本停止降解活动，堆肥趋于成熟。

如表4示，随着堆肥的进行，两种处理的含水率均不断减小。在堆肥嗜温期时，由于堆肥微生物的新陈代谢，产生大量的热，造成堆体的水分大量蒸发。但是PSB处理的含水率显著低于CK和CI处理，这是由于PSB处理具有更高的温度，且嗜温期温度高于CK和CI处理。在堆肥的成熟期和冷却期时，堆肥温度趋于室温，堆体内的含水率趋于平稳。

随着堆肥的进行，CK、CI和PSB处理的pH呈现弱碱的变化范围，分别是8.12-8.76，8.14-8.81和8.25-9.06(表4)。在堆肥期间三种处理的pH值不断升高，堆肥5d后，堆肥pH值上升速度趋于平缓，这可能是由于堆肥中有机酸的生成。整个堆肥过程中，PSB处理的pH值均比其他两个处理组高，可能是由于复合菌剂的接种，促进堆肥生境内微生物对铵根离子的释放。

三个处理的电导率(EC)在2.30-3.2范围内不断波动(表4)，并且三种处理的最终EC都达到安全标准要求(<4mS/cm)。

表4堆肥中理化参数的变化

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims

1.一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26，其特征在于：所述溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26由菌体浓度不低于10⁹CFU/ml；其中：

溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26由以下方法制备得到：在LuriaBertani(LB)琼脂平板上生长的单菌落接种于LB培养基(5g/L酵母提取物，10g/L色氨酸，10g/LNaCl，pH＝7.2)，在恒定摇床中以200rpm转速，在30℃条件下培养24h(芽孢杆菌DPPG-26:1.3×10^-9CFU·mL^-1)作为种子液。

2.根据权利要求1所述的一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26的保藏号为CGMCCNo.9393。

3.根据权利要求1所述的一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26及其应用，其特征在于：所述溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26应用于提高废蘑菇基质堆肥效率的微生物性能，所述溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26应用在堆肥原料农作物废弃(如菌渣)和牲畜粪便中(如鸡粪)。

4.根据权利要求2所述的一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26处理废蘑菇基质的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：将废蘑菇基质粉碎至尺寸＜3cm，调节混合物中的含水率达到约60％，用氢氧化钾调节初始pH值为7；

S2：在混合物中添加溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26，所述的芽孢杆菌DPPG-26的添加量为发酵原料质量的1.5％-2.5％，物料充分混匀后进行发酵；

S3：整个堆肥试验持续40d左右。为了保证温度可以上升，在废蘑菇基质堆肥的初始和升温阶段，每天8小时用氧气泵以12.5L/min的速率通风。在第4、8、13、20、27、35天进行机械翻堆以增强通风，最终得到高质量堆肥产品。

5.根据权利要求2所述的一种汉语言教学系统，其特征在于：所述知识要求模块(103)，包括专业知识子模块、相关知识子模块与工具知识子模块。

6.根据权利要求4所述的一种溶磷细菌芽孢杆菌DPPG-26用于处理废蘑菇基质的方法，其特征在于通过接种芽孢杆菌DPPG-26进一步提高堆肥产品的萌芽指数GI(高达88.4％)、pH(8.5)、总氮TN(16.6g/kg)、总磷含量(3.20g/kg)和有效磷含量(0.34g/kg)，降低TOC、C/N和EC。还发现，接种芽孢杆菌DPPG-26提高了堆肥的稳定性、腐殖质化程度和细菌多样性，有助于堆肥过程中P组分的转化，同时也降低腐熟产品的生物毒性。以及芽孢杆菌DPPG-26也增强了微生物间的相互作用，提高堆肥中的碳水化合物代谢、全局和概览图谱以及氨基酸代谢等途径。