CN116239678B - 一种抗氧化组合物、用途、保护剂、溶液 - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种抗氧化组合物，包括维生素C、新橙皮苷二氢查尔酮；该组合物作为单克隆抗体的保护剂中的抗氧化剂，能够提升保护剂对于单克隆抗体的储存稳定性的保护，特别是利于低浓度的单克隆抗体在4℃环境下的储存稳定性。同时，本发明还提供了该组合物的用途、保护剂、溶液。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗氧化组合物、用途、保护剂、溶液。
背景技术
抗体是指由机体产生的能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体由B淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体（mAb），简称单抗。自从单克隆抗体制备技术被发明后，单抗制品在疾病诊断与治疗、细胞生物学研究等领域被广泛使用。
兽医生物制品体外诊断试剂ELISA试剂盒的多个组份均含有单克隆抗体，在夹心法、竞争法中应用甚广。但目前国内大部分的ELISA试剂盒含单克隆抗体组份均是制备成高浓度的液体，但其工作浓度通常是非常低的，基本在5ul/ml～50ng/ml，在检测过程中需要现配现用，给检测工作人员带来极大的不便，而且也容易导致操作错误。国外试剂盒单克隆抗体组份是制备成工作浓度，可以直接使用，但价格相对昂贵。
现有技术中，例如专利号CN113289027A“一种通用型单克隆抗体耐热保护剂”公布了一种单克隆抗体保护剂，但其保护的形式不是单抗克隆抗体的工作浓度，而是储存浓度，在使用时需要再次稀释；专利号CN 114163519 A“一种单克隆抗体保护液及其制备方法”公布的单克隆抗体保护剂不是应用于体外诊断试剂领域；专利号CN 105974121 A“一种含鱼明胶的生物制品稳定剂”研发的保护剂所保护的蛋白浓度也较高，所制备的抗体稀释液是非单克隆抗体。
研究表明，单克隆抗体抗体分子自身性质、温度、pH值、光照和机械应力的影响，化学不稳定性的作用机制包括氧化作用、脱酰胺作用、水解作用均可以导致单抗隆抗体的降解，物理不稳定性的作用机制包括聚集性增加，最终都有可能形成可溶性或不可溶性聚集物，并且抗体的聚集大多都是不可逆的。
因此，对商品化试剂盒而言，如何将单克隆抗体浓缩液稀释成可直接使用的单克隆抗体，在2～8℃下进行保存及运输是值得重点研究的。研发一款可直接使用的单克隆抗体稳定稀释的保护剂可大大减轻检测过程的工作量，具有很大的商业价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗氧化组合物，该组合物作为单克隆抗体的保护剂中的抗氧化剂，能够提升保护剂对于单克隆抗体的储存稳定性的保护，特别是利于低浓度的单克隆抗体在4℃环境下的储存稳定性。
同时，本发明还提供了该组合物的用途、保护剂、溶液。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：一种抗氧化组合物，包括维生素C、新橙皮苷二氢查尔酮。
在上述的抗氧化组合物中，所述维生素C、新橙皮苷二氢查尔酮的重量比为0.01-0.09：0.1-0.4。
在上述的抗氧化组合物中，所述维生素C、新橙皮苷二氢查尔酮的重量比为0.02-0.08：0.2-0.3。
同时，本发明还公开了一种如上任一所述的抗氧化组合物作为单克隆抗体存储时的抗氧化剂的用途。
特别的，该抗氧化组合物作为低浓度的单克隆抗体存储时的抗氧化剂的用途。
在上述的用途中，所述单克隆抗体的浓度为50ng/ml-5000ng/ml。
优选地，所述单克隆抗体的浓度为50ng/ml-500ng/ml。
同时，本发明还提供一种含单克隆抗体的溶液的保护剂，包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3-6.06g/L、牛血清白蛋白10-30g/L、海藻糖5-20g/L、proclin 300 0.5-1g/L、维生素C 0.01-0.09g/L、新橙皮苷二氢查尔酮 0.1-0.4g/L、吐温20 0.01-0.05g/L，余量为纯化水。
优选地，该保护剂包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3-6.06g/L、牛血清白蛋白10-30g/L、海藻糖5-20g/L、proclin 300 0.5-1g/L、维生素C 0.01-0.09g/L、新橙皮苷二氢查尔酮 0.1-0.31g/L、吐温20 0.01-0.05g/L，余量为纯化水。
较优选地，该保护剂包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐3.5-5.5g/L、牛血清白蛋白15-25g/L、海藻糖8-15g/L、proclin 300 0.6- 0.9g/L、维生素C0.02-0.08g/L、新橙皮苷二氢查尔酮0.1-0.3g/L、吐温20 0.01-0.05g/L，余量为纯化水；
更为优选地，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐4-5g/L、牛血清白蛋白18-22g/L、海藻糖10-14g/L、proclin 300 0.7-0.8g/L、维生素C 0.04-0.07g/L、新橙皮苷二氢查尔酮0.2-0.3g/L、吐温20 0.02-0.04g/L，余量为纯化水。
较优选地，该保护剂包括如下组分：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐4.2-4.8g/L、牛血清白蛋白19-21g/L、海藻糖11-13g/L、proclin 300 0.72-0.78g/L、维生素C 0.05-0.06g/L、新橙皮苷二氢查尔酮 0.22-0.28g/L、吐温20 0.02-0.03g/L，余量为纯化水。
此外本发明还公开了一种含单克隆抗体的溶液，包括单克隆抗体和如上任一所述的保护剂。
在上述的含单克隆抗体的溶液中，所述单克隆抗体为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE中的一种。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明惊奇的发现通常采用甜味剂的新橙皮苷二氢查尔酮在和维生素C复配使用时，作为抗氧化剂添加到单克隆抗体的溶液中时，能够显著提高单克隆抗体的保存稳定性。
特别是使得低浓度50ng/ml的单抗能在4℃条件下稳定保存18个月以上，可以满足商品化试剂盒的单克隆抗体低浓度要求。
维生素C是常用的水溶性抗氧化剂，广泛存在于生物体系中，具有多项生理功能。维生素C不仅与其他维生素之间具有抗氧化增效作用，而且与非维生素物质之间也具有抗氧化协同作用，一直是复配抗氧化剂的主要成分。另一方面，维生素C理化性质不稳定，在加工及储藏过程中易受到多种因素的影响而发生降解，从而造成损失。复合型抗氧化剂，能够有效地提高其稳定性。
新橙皮苷二氢查耳酮，为黄酮类化合物，此类化合物能清除自由基。研究表明，新橙皮苷二氢查耳酮在高温和酸性、碱性条件下都表现出很好的稳定性。维生素Ｃ和新橙皮苷二氢查耳酮联合使用既可以提高维生素C的稳定性，同时又能提高抗氧化作用。
单独使用维生素Ｃ或新橙皮苷二氢查耳酮则达不到上述效果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
BCA蛋白浓度测定试剂盒采购于碧云天，产品编号：P0011；
酶标仪采购于赛默飞，型号：Multiskan FC；
单克隆抗体购自中国兽医药品监察所。
实施例1
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 6.06g/L；
牛血清白蛋白 20g/L；
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
维生素C 0.09g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.4g/L；
吐温20 0.01g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合4。
实施例2
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 6.06g/L；
牛血清白蛋白 10g/L；
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
维生素C 0.09g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.4g/L；
吐温20 0.02g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合5。
实施例3
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 3g/L；
牛血清白蛋白 30g/L；
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
维生素C 0.09g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.4g/L；
吐温20 0.01g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合6。
实施例4
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 6.06g/L；
牛血清白蛋白 20g/L；
海藻糖 5g/L；
Proclin 300 1g/L；
维生素C 0.09g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.4g/L；
吐温20 0.01g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合7。
实施例5
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 6.06g/L；
牛血清白蛋白 20g/L；
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
维生素C 0.02g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.4g/L；
吐温20 0.01g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合8。
实施例6
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 3.06g/L；
牛血清白蛋白 20g/L；
海藻糖 10g/L；
Proclin 300 0.5g/L；
维生素C 0.09g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.1g/L；
吐温20 0.01g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合9。
实施例7
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 5g/L；
牛血清白蛋白 20g/L；
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
维生素C 0.06g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.2g/L；
吐温20 0.05g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合10。
对比例1
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 6.06g/L；
牛血清白蛋白 20g/L；
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
余量的水。
命名为：基础配方。
对比例2
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 6.06g/L；
牛血清白蛋白 20g/L；
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
维生素C 0.49g/L；
吐温20 0.01g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合1。
对比例3
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 6.06g/L；
牛血清白蛋白 20g/L；
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.49g/L；
吐温20 0.01g/L；
余量的水。
命名为：保护剂组合2。
对比例4
一种单克隆抗体保护剂，包括如下组分及其含量：
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 6.06g/L；
牛血清白蛋白 20g
海藻糖 20g/L；
Proclin 300 1g/L；
维生素C 0.09g/L；
新橙皮苷二氢查尔酮NHDC 0.4g/L。
命名为：保护剂组合3。
性能验证实验
BCA蛋白浓度测定试剂盒(采购与碧云天、产品编号：P0011 )。酶标仪(赛默飞Multiskan FC )。
单克隆抗体（布鲁氏菌单克隆体）购自中国兽医药品监察所，原始浓度为5mg/ml，用各种保护剂组合将单克隆抗体分别稀释至50ng/ml、500ng/ml和5000ng/ml。
第一部分
将上述稀释后的单克隆抗体溶液放置在37℃环境下高温作用15天，分别在1、3、5、10、15天测定其浓度值。
表1 布病单克隆抗体浓度50ng/ml经过37℃环境下作用后的浓度
表2 布病单克隆抗体浓度500ng/ml经过37℃环境下作用后的浓度
表3 布病单克隆抗体浓度5000ng/ml经过37℃环境下作用后的浓度
从3个表的数据看出，单独使用维生素C或新橙皮苷二氢查尔酮NHDC较基础配方均能对单克隆抗体的保护起到明显效果。但是在维生素C+新橙皮苷二氢查尔酮NHDC+吐温20三者的协同作用下，单克隆抗体的保护剂效果最好。
第二部分
将上述稀释后的单克隆抗体溶液在4℃环境下的稳定性。
将浓度为50ng/ml、500ng/ml的单克隆抗体溶液放置在4℃环境下，分别在1、6、12、18、24个月测定其浓度值。
表4 布病单克隆抗体浓度50ng/ml在4℃环境下保存不同时间的浓度
表5 布病单克隆抗体浓度500ng/ml在4℃环境下保存不同时间的浓度
从2个表的数据看出保护剂组合4对单克隆抗体的保护剂效果最好。
第三部分
取6.06g/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20g/L牛血清白蛋白、20g/L海藻糖、1g/Lproclin 300、0.09g/L维生素C、0.31g/L新橙皮苷二氢查尔酮、0.01g/L吐温20；
利用双蒸水按比例配制成抗体保护剂溶液。
从中国兽医药品监察所够买布鲁氏菌抗原、单克隆抗体，羊抗鼠酶标二抗，按照公司现有工艺组装成试剂盒。
单克隆抗体组份处理方式1：分别采用公司现有工艺，现配现用。
单克隆抗体组份处理方式2：用抗体保护剂稀释至工作浓度。
将两种处理方式的单克隆抗体组份放置在4℃环境下保存，分别在1、6、12、18、24个月测定其布鲁氏菌阳性质控血清的抑制率。
布鲁氏菌阳性质控血清（目录号：Z12）够自中国兽医药品监察所。
酶标仪(赛默飞Multiskan FC )。
表6 两种单克隆抗体组份处理方式对布鲁氏菌阳性质控血清的抑制率的影响
从以上表可以看出，单克隆抗体组份处理方式2在试剂盒放置24个月后，阳性血清的抑制率仍然保持在较高水平，而原有方式处理后的试剂盒保存12个后抑制率开始下降。
第四部分
取6.06g/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20g/L牛血清白蛋白、20g/L海藻糖、1g/Lproclin 300、0.09g/L维生素C、0.31g/L新橙皮苷二氢查尔酮、0.01g/L吐温2。
利用双蒸水按比例配制成抗体保护剂溶液。
从中国兽医药品监察所够买猪瘟抗原、猪瘟单克隆抗体，羊抗鼠酶标二抗，按照公司现有工艺组装成试剂盒。
用抗体保护剂对单克隆抗体组份稀释至工作浓度，放置在4℃环境下保存，分别在1、6、12、18、24个月测定其猪瘟阳性质控血清的抑制率，计算变异系数。
猪瘟阳性质控血清（目录号：Z218）够自中国兽医药品监察所。
酶标仪(赛默飞Multiskan FC )。
表7 猪瘟阳性质控血清的抑制率在4℃保存条件下的变化
上表 1、2、3 为重复实验。
从以上表可以看出，用保护剂稀释至工作浓度的单克隆抗体组份在4度放置24个月后仍然保持稳定，变异系数小于10%。
第五部分
取6.06g/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、20g/L牛血清白蛋白、20g/L海藻糖、1g/Lproclin 300、0.09g/L维生素C、0.31g/L新橙皮苷二氢查尔酮、0.01g/L吐温2，
利用双蒸水按比例配制成抗体保护剂溶液。
从菲鹏生物公司够买非洲猪瘟抗原、非洲猪瘟单克隆抗体，羊抗鼠酶标二抗，按照公司现有工艺组装成试剂盒。
用抗体保护剂对单克隆抗体组份稀释至工作浓度，放置在4℃环境下保存，分别在1、6、12、18、24个月测定其非洲猪瘟阳性质控血清的抑制率，计算变异系数。
非洲猪瘟阳性质控血清（目录号：Z287）够自中国兽医药品监察所。
酶标仪(赛默飞Multiskan FC )。
表8 非洲猪瘟阳性质控血清的抑制率在4℃保存条件下的变化
上表 1、2、3 为重复实验。
从以上表可以看出，用保护剂稀释至工作浓度的单克隆抗体组份在4℃环境下放置24个月后仍然保持稳定，变异系数小于10%。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (2)
1.一种含单克隆抗体的溶液，其特征在于，包括单克隆抗体和保护剂；所述保护剂包括如下组分：所述保护剂包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐6.06g/L、牛血清白蛋白20g/L、海藻糖20g/L、proclin 300 1g/L、维生素C0.09g/L、新橙皮苷二氢查尔酮0.4g/L、吐温20 0.01g/L，余量为纯化水；
或，所述保护剂包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐6.06g/L、牛血清白蛋白10g/L、海藻糖20g/L、proclin 300 1g/L、维生素C0.09g/L、新橙皮苷二氢查尔酮0.4g/L、吐温20 0.02g/L，余量为纯化水。
2.根据权利要求1所述的含单克隆抗体的溶液，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE中的一种。
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