CN116234928A - 用于筛选胚胎的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了基于pappalysin‑1(PAPPA)的表达(例如，如在来自处于囊胚阶段的胚胎的活检、囊胚腔液或胚胎培养条件培养基中所测量的)来评估胚胎产科结局的方法。
Description
背景技术
本申请要求于2020年7月31日提交的美国临时专利申请No.63/059,761和于2021年3月24日提交的美国临时专利申请No.63/165,221的权益，其整体通过引用并入本文。
根据37 C.F.R.1.821(c)，在此作为ASCII兼容文本文件提交序列表，该文件命名为“SHAHP0002WO_ST25.txt”，其创建于2021年7月30日，并且具有约1千字节的大小。前述文件的内容在此通过引用整体并入。
1.技术领域
本发明总体上涉及分子生物学和医学领域。更具体地，本发明涉及筛选胚胎的生存力和改善的产科结局的方法。
2.相关技术描述
尽管体外受精(in vitro fertilization，IVF)已经成功应用了数十年，但是不良产科结局(包括自然流产)仍然是IVF程序和患者的风险。存在对早期检测和预防不良的母体和胎儿产前结局的需要。虽然一些遗传筛选(例如筛选非整倍性)已是非常有帮助的，但这样的风险并没有被消除。需要另外的筛选技术来改善IVF情况的结局，包括在胚胎期可用于预测这样的结局的方法。
发明内容
本发明通过提供用于鉴定具有不良产科结局风险降低的胚胎的改进方法而克服了本领域在一些方面中的局限性。例如，在一些实施方案中，Pappalysin-1(PAPPA，也称为妊娠相关血浆蛋白-A或PAPP-A)在胚胎组织(例如滋养外胚层细胞或合体滋养层细胞)中或在囊胚腔液中的表达降低，可表明不良产科结局的风险提高(例如，导致妊娠期间胚胎丧失)。在一些方面中，提供了选择用于体外受精(IVF)程序的胚胎的方法。在一些方面中，本文中提供的方法可用于植入前产前筛选(preimplantation prenatal screening，PPS)。
在一些方面中，提供了体外检测胚胎活检、囊胚腔液和/或囊胚阶段植入前人胚胎的胚胎培养条件培养基中的PAPPA的方法。通过比较植入前囊胚阶段胚胎的PAPPA的mRNA表达或蛋白质表达的程度，可以提供除整倍体状态之外的另外水平的胚胎选择，以选择用于移植至体外受精患者子宫的胚胎。
本公开内容的一个方面涉及在体外筛选胚胎的方法，其包括：(i)在体外获得处于囊胚发育阶段的胚胎，以及(ii)在一个或更多个胚胎细胞中、在囊胚腔液中和/或在用于储存或培养胚胎的胚胎培养液中测量妊娠相关血浆蛋白-A(pregnancy-associated plasmaprotein-A，PAPPA)的表达；其中PAPPA的表达降低至低于对照水平表明如果将胚胎植入到哺乳动物对象中时，则不良产科结局的风险提高。在一些实施方案中，在囊胚腔液中、在胚胎培养液中或者在一个或更多个胚胎细胞中测量PAPPA的表达。一个或更多个胚胎细胞可包含一个或更多个滋养层细胞或滋养外胚层细胞，或者由一个或更多个滋养层细胞或滋养外胚层细胞组成。一个或更多个滋养层细胞可包含合体滋养层细胞或由其组成。一个或更多个胚胎细胞可包含一个或更多个内细胞团细胞或由其组成。在一些实施方案中，不良产科结局是异常胎盘形成、自然流产、小于胎龄(small for gestational age，SGA)、宫内生长受限(intrauterine growth restriction，IUGR)、宫内胎儿死亡(intrauterine fetaldemise，IUFD)或先兆子痫。在一些实施方案中，所述测量通过检测或测量编码PAPPA的mRNA来进行。例如，所述测量可通过以下来进行：Northern印迹分析、核酸酶保护测定(nucleaseprotection assay，NPA)、原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)或下一代mRNA测序(mRNA sequencing，mRNA-Seq)。在一些实施方案中，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步限定为逆转录定量PCR(RT-qPCR)或半定量PCR。在一些实施方案中，所述测量通过检测或测量PAPPA蛋白来进行，其是通过Western印迹、高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)、液相色谱-质谱(liquid chromatography–mass spectrometry，LC/MS)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、蛋白质免疫染色或电化学发光免疫测定(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)来实现。在一些实施方案中，所述测量通过ELISA来进行。所述方法还可包括测试胚胎的非整倍性(PGT-A)。所述方法还可包括选择用于植入到哺乳动物对象中的胚胎。在一些实施方案中，将胚胎植入到哺乳动物对象中作为体外受精(IVF)方法的一部分。在一些实施方案中，胚胎是由获自供体的卵母细胞和/或精子产生。供体是哺乳动物对象，例如人。在一些实施方案中，供体是第一人对象，并且其中所述哺乳动物对象是第二人对象。在一些实施方案中，哺乳动物对象是牛、绵羊、马、狗、猫、狮子、豹、雪貂(ferret)、山羊或猪。哺乳动物对象可以是家养动物。在一些实施方案中，哺乳动物对象是濒危物种。在一些实施方案中，哺乳动物对象是人。所述方法还可包括进行另外的遗传测试。另外的遗传测试可包含测试胚胎中遗传疾病的存在或由测试胚胎中遗传疾病的存在组成。在一些实施方案中，胚胎进一步限定为人胚胎，并且其中遗传疾病是亨廷顿病、镰状细胞贫血、肌营养不良、囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)、BRCA1突变、BRCA2突变、脆性X综合征或泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)。
本文中使用的就指定组分而言“基本上不含”在本文中用于意指指定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量优选低于0.01％(w/w)。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分之量的组合物。
如本文在说明书中所用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文在权利要求书中所使用的，当与词语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词可以意指一个/种或多于一个/种。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可意指至少第二个/种或更多个/种。
贯穿本申请中，术语“约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的固有误差变异，或者所述研究对象之间存在的变异。
通过以下详细描述，本发明的另一些目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，虽然指示了本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅以示例说明的方式给出，因为对本领域技术人员而言，根据该详细描述，本发明的精神和范围内的多种变化和修改将变得明显。
具体实施方式
在一些方面中，本公开内容提供了用于选择具有提高的生存力或降低的不良产科结局风险的用于植入(例如，用于体外受精(IVF)程序)的胚胎的改进方法。在一些方面中，如通过mRNA或蛋白质水平测量的在胚胎组织、囊胚腔液或胚胎培养基中PAPPA表达的降低可指示不良产科结局的风险提高(例如，异常胎盘形成、自然流产风险提高、小于胎龄(SGA)、宫内生长受限(IUGR)、宫内胎儿死亡(IUFD)或先兆子痫)。
I.PAPPA
PAPPA(也称为pappalysin-1，妊娠相关血浆蛋白-A或PAPP-A)是由细胞(包括人成纤维细胞)表达的丝氨酸蛋白酶。已表明PAPPA作为妊娠依赖性癌基因。在小鼠乳腺中在妊娠和内卷(involution)期间PAPP-A的转基因表达促进了胶原沉积，而哺乳可以使其免受这些影响(Takabatake et al.,2016)。从未受精的卵母细胞中获得的卵丘细胞中的PAPPAmRNA水平与卵母细胞发育能力相关(Kordus et al.,2019)。PAPPA是这样的金属蛋白酶，其选择性切割IGFBP-4和IGFBP-5，导致IGF的释放。IGFBP-4的切割可以通过IGF的存在来增强，而IGFBP-5的切割可被IGF的存在轻微抑制。PAPPA可以在骨形成、炎症、伤口愈合和雌性生育中发挥作用。PAPPA已在多种哺乳动物生物体中(包括在人中(例如，智人(Homosapiens)pappalysin-1，基因ID:5069))测序。
在IVF受孕的妊娠领域中，与没有IVF的情况下实现的妊娠相比，关于第一孕期母体血清PAPP-A水平的数据存在矛盾。一些数据表明，由新鲜胚胎移植(embryo transfer，ET)、冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer，FET)或自然受孕产生的妊娠中PAPP-A水平没有差异(Cavoretto et al,2016)，并且另一些研究已表明，与自然妊娠相比，由于新鲜ET或FET而受孕的妊娠中第一孕期母体血清PAPP-A水平较低(Liao et al,2001；Hui et al,2005；Tul et al,2006；Amor et al,2009；Gjerris et al,2009；Matilainen et al,2011；Gjerris et al,2012)。一项研究表明，在进行中的妊娠中，囊胚形态参数与第一孕期母体血清PAPP-A水平之间没有相关性(
et al,2020)。表明触发(trigger)当天的E2峰值水平的一些数据与由新鲜ET产生的妊娠中的低母体血清PAPP-A水平无关(Dunne etal.,2017)，但是另一出版物表明，与非IVF和ICSI妊娠相比，IVF和ICSI妊娠中的母体血清PAPP-A水平较低。在后一项研究中，发现了在IVF妊娠中触发时的峰值E2水平与低的第一孕期母体血清PAPP-A之间的相关性(Giorgetti et al.,2013)。已表明通过FET实现的妊娠的胎盘体积大于由新鲜ET和自然妊娠产生的妊娠的胎盘体积，其中在胎盘体积与第一孕期母体血清PAPP-A水平之间观察到正相关(Choux et al,2019)。
与此先前的工作相比，本文中提供了用于基于以下中的任一者来选择具有提高的生存力和/或降低的不良产科结局风险的用于植入(例如，用于体外受精(IVF)程序)的胚胎的方法：(i)选择在胚胎组织、囊胚腔液或胚胎培养基中显示出PAPPA表达提高的胚胎，和/或(ii)排除在胚胎组织、囊胚腔液或胚胎培养基中显示出PAPPA表达降低的胚胎。如在实施例中所示，分析在滋养外胚层活检之后玻璃化的冷冻整倍体囊胚阶段胚胎的PAPPA表达。
II.PAPPA检测方法
多种技术可用于检测编码PAPPA或PAPPA蛋白的mRNA。可在多个胚胎细胞(例如，滋养层细胞或滋养外胚层细胞、合体滋养层细胞或内细胞团细胞)中、在囊胚腔液中和/或在用于储存或培养胚胎的胚胎培养液中测量编码PAPPA或PAPPA蛋白的mRNA。
多种方法可用于检测或测量编码PAPPA的mRNA。例如，在多个实施方案中，该方法可以是Northern印迹分析、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或下一代mRNA测序(mRNA-Seq)。
在一些实施方案中，进行RT-PCR来测量PAPPA mRNA。例如，在一些实施方案中，可使用以下方法。可以用TRIzol从样品中提取RNA。可将样品在11,200g下离心10分钟，并且将所得RNA沉淀用70％乙醇洗涤一次，并重悬于40μl经焦碳酸二乙酯处理的水中。可例如使用Takara cDNA合成试剂盒(Takara Bio,Inc.,Otsu,Japan)按照制造商方案来合成cDNA。可使用SYBR来进行qPCR。在一些实施方案中，以下引物可例如在约56℃下用于PAPPA的扩增：正向引物GYCATCTTTGCCTGGAAGGGAGAA(SEQ ID NO:1)和反向引物AGGGCTGTTCAACATCAGGATGAC(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是逆转录定量PCR(RT-qPCR)方法或半定量PCR方法。半定量PCR方法是本领域已知的，并且包括例如在Chen et al.,1999中描述的那些。
在一些实施方案中，下一代测序用于通过RNA-seq(RNA-测序)来测量PAPPA mRNA。使用下一代测序的RNA-seq方法可用于定量基因的表达(例如，Mortazavi et al.,2008；Trapnell et al.,2010)。可使用的下一代测序方法包括：基于当核酸被添加至核酸链时独特荧光信号的发射来鉴定DNA碱基的测序方法(例如，通过llumina(Solexa))；焦磷酸测序方法(例如，454测序)；以及通过用半导体检测氢离子来检测核酸并入(例如，Ion Torrent方法)。下一代测序包括大规模平行标识测序(massively parallel signaturesequencing)、聚合酶克隆测序(polony sequencing)、cPAS测序、SOLiD测序、DNA纳米球测序和SMRT PacBio单分子实时测序(例如，通过Pacific Bioscience)。
可用于测量PAPPA mRNA的另外的方法包括定量实时RT-PCR。实时RT-PCR已经成功地用于广泛多种的领域一段时间。该方法可用于测量体内低拷贝数目的目的靶标的mRNA水平。该操作相对于用于测量RNA的其他方法的益处包括其灵敏度、大的动态范围、高通量的潜力以及精确的量化(Huggett,et al.,2005)。
在一些实施方案中，在多个胚胎细胞(例如，滋养层细胞或滋养外胚层细胞、合体滋养层细胞或内细胞团细胞)中、在囊胚腔液中和/或在用于储存或培养胚胎的胚胎培养液中测量PAPPA蛋白水平。可使用多种方法来检测PAPPA蛋白。例如，可使用的方法包括：Western印迹、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC/MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质免疫染色或电化学发光免疫测定“ECLIA”(Elecsys)。在一些实施方案中，微流控可用于量化PAPPA蛋白。
在一些方面中，将PAPPA的表达水平与对照水平或正常表达水平进行比较。在一些实施方案中，正常表达水平的对照水平可以在实验中建立并以胚胎水平量化，例如在使用培养基作为阴性对照的情况下。PAPPA表达降低可指示不良产科结局(例如，异常胎盘形成、自然流产、小于胎龄(SGA)、宫内生长受限(IUGR)、宫内胎儿死亡(IUFD)或先兆子痫)。因此，本文中提供的方法可用于选择用于植入的胚胎以提高健康、活产的机会，作为IVF方案的一部分。
III.用于PAPPA测试的胚胎组织
预期处于囊胚发育阶段的多种胚胎组织、囊胚腔液和/或胚胎培养基可用于以如在此所公开的方法来测量PAPPA表达，例如，以鉴定用于IVF程序的胚胎。在一些实施方案中，在处于发育的第3、4、5、6、7天的胚胎获得组织样品或活检；例如，可以获得来自第3天的一个细胞的活检，或者可以获得来自第5天、第6天或第7天胚胎的一个或更多个细胞(例如，1、2、3、4个细胞)的活检。胚胎组织可包含滋养层(例如合体滋养层细胞)或由其组成。
处于囊胚发育阶段的胚胎组织包括滋养层、囊胚腔(blastocyst cavity)(囊胚腔(blastocoele))和内细胞团(成胚细胞)。滋养层(滋养外胚层细胞)形成囊胚的外层，并通常在人中受精之后四至六天内观察到。一些滋养外胚层细胞可以分化成为胚外结构，并且滋养外胚层细胞不直接有助于胚胎。合体滋养层细胞是形成血管胚胎胎盘绒毛的上皮覆盖物的滋养层细胞的一种类型，其侵入子宫壁并参与从母体中获得营养物。
在一些实施方案中，来自内细胞团的一个或更多个细胞可用作用于测量PAPPA水平的组织活检。在一些情况下，胚胎组织活检不是内细胞团，因为这些细胞将形成发育中的哺乳动物对象；尽管如此，最近的研究支持这样的观点：在没有对发育中的胚胎产生不良影响的情况下，可以从囊胚中获得内细胞团细胞(Scott et al.,2013)。
在一些实施方案中，从胚胎中获得组织活检以检测和测量PAPPA的表达。例如，为了获得用于活检的胚胎细胞(其可以是滋养外胚层(TE)和/或内细胞团(ICM)细胞)，可以将激光脉冲施加至包围囊胚阶段胚胎的透明带，并随后将激光施加至胚胎细胞之间的连接处以便获得活检。然后可以取出活检的胚胎细胞(例如通过移液管)，并可以将其置于到缓冲溶液中。然后可以如本文中所述测量PAPPA，例如通过检测或量化PAPPA mRNA或蛋白质。在获得囊胚活检之后，胚胎可能会塌陷，导致囊胚腔液被挤出到周围介质(surroundingmedium)中。
还可获得包含囊胚腔液的胚胎培养基(ECB)(也称为囊胚腔液条件培养基(blastocoel fluid conditioned medium，BFCM))，并将其用于测试PAPPA表达。多种方法可用于获得囊胚腔液的样品。用于获得ECB的方法例如在Li et al.,2018或Stigliani,2014中描述。在一些实施方案中，ECB可以通过以下方法来获得。可使用红外激光(infraredlaser)以在远离内细胞团的透明带(zone pellucida，ZP)中照射小臀沟(small breech)，以将囊胚腔液释放到培养基中。与培养基混合的释放的囊胚腔液(例如，约25μl)可转移至不含RNA酶-DNA酶的试管以用于后续分析(例如，PCR)。为了防止培养基污染，每个样品可使用不同的巴斯德移液管(Pasteur pipette)。
可通过本领域已知的多种技术来获得滋养外胚层细胞。例如，可使用激光或活检移液管来获得滋养外胚层细胞。在一些实施方案中，通过用活检移液管施加轻柔的吸力，促进滋养外胚层细胞从带中脱出。可使用激光(例如，四个持续时间为3秒的激光脉冲)从囊胚中分离一个或更多个滋养外胚层细胞(例如，1、2、3、4或5个细胞)。活检的细胞可立即置于不含RNA酶-DNA酶的试管中以用于进一步分析PAPPA表达，如本文中所述(例如，使用PCR等)。
在一些实施方案中，使用包含囊胚腔液的胚胎培养基(ECB)。可以从第5天、第6天或第7天囊胚阶段哺乳动物胚胎(例如人胚胎)中收集并保存(例如活检后)通常被丢弃的囊胚腔液条件培养基。在一些实施方案中，活检从正在分析可能植入经受IVF的患者中的胚胎中获得，例如与植入前遗传测试非整倍性一起。可使用的用于获得囊胚腔液条件培养基的另外的方法包括，例如，Chosed et al.,2019；Vera-Rodriguez et al.,2018；Rule etal.,2018和Xu et al.,2016。
IV.体外受精(IVF)
测量处于囊胚阶段的胚胎中PAPPA的表达以预测产科结局可作为IVF程序的一部分进行。体外受精包括用于帮助受孕和诞下子女的多种技术。在一些优选实施方案中，IVF程序用于人患者。尽管如此，本文中所公开的技术可应用于广泛多种的哺乳动物(包括家养动物)，包括牛、马、狗、猫、绵羊、山羊或猪，或濒危物种，例如多种狮子和豹。
通常，在IVF期间，从来自哺乳动物的卵巢中收集成熟卵子，并在实验室中通过精子使其受精。然后，将一个或更多个受精卵(胚胎)转移至子宫。IVF的一个完整周期需要约三周。如果期望的话，这些步骤可以分成不同的部分。IVF程序可涉及胞浆内精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)(例如，Neri et al.,2014)。IVF自其在1978年引入以来已以多种形式使用。
在植入IVF程序之前，可以对胚胎进行多种另外的测试。例如，可以用以下来分析囊胚腔液或来自胚胎的组织活检(例如，也用于评估PAPPA表达的滋养外胚层细胞(如本文中所述))以测试非整倍性、确定胚胎的染色体状态、和/或以便于选择用于植入的期望的胚胎：荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization，aCGH)、单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)阵列、多重定量PCR或下一代测序(NGS)。
V.实施例
包括以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术表示本发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术，并因此可认为构成用于其实践的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在所公开的一些具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相同或类似的结果。
实施例1
分析PAPPA以选择用于体外受精(IVF)方法的胚胎
可通过以下方法进行PAPPA分析以选择用于体外受精(IVF)的胚胎。在囊胚阶段胚胎活检之前和/或之时，收集体积为25μL的囊胚腔液收集物和/或胚胎培养基，并在运送至参考研究实验室之前快速冷冻。为了获得用于活检的胚胎细胞(其可以是滋养外胚层细胞和/或内细胞团细胞)，首先将激光脉冲施加至包围囊胚阶段胚胎的透明带，并随后将激光施加至胚胎细胞之间的连接处，以便进行活检。然后通过移液管取出活检的胚胎细胞，并将其置于到缓冲液中以用于随后的PAPP-A测试，例如在研究实验室。在完成囊胚活检时，胚胎塌陷，导致囊胚腔液被挤出到周围介质中。
在自第5天或第6天囊胚阶段人胚胎的活检之后收集并保存通常被丢弃的囊胚腔液条件培养基，所述囊胚阶段人胚胎从经受IVF以及植入前遗传测试非整倍性的患者中获得。在运送至参考研究实验室之前，将体积为约25μL的囊胚液条件培养基快速冷冻。
从患者的胚胎培养基中收集胚胎培养条件培养基(消耗的培养基(spentmedium))。在运送至参考研究实验室之前，将约25μL的消耗的培养基快速冷冻。
由于来自活检的一些细胞将被送往在商业参考实验室通过下一代测序(NGS)进行PGT-A分析，因此将活检的胚胎冷冻保存，以等待测序结果的结局。将来自胚胎细胞活检的细胞、囊胚腔液和胚胎培养液送至研究实验室，并将对其测试PAPP-A蛋白和PAPP-A mRNA。
实施例2
人囊胚腔液条件培养基中妊娠相关血浆蛋白-A(PAPP-A)的表达
方法：在标准的常规受控性卵巢刺激和随后的IVF程序之后，从囊胚阶段胚胎中获得囊胚腔液条件培养基(BFCM)。女性患者经受了其计划的常规IVF情况(IVF case)，该常规IVF情况由以下组成：用外源性促性腺激素进行受控性卵巢刺激、使用促性腺激素拮抗剂抑制黄体化激素、然后用醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)和/或重组人绒毛膜促性腺激素(human Chorionic Gonadotropin，hCG)进行触发以使最终卵母细胞成熟、然后在35小时后进行经阴道超声引导的卵母细胞提取。分离卵母细胞并进行胞质内精子注射以实现体外受精，在胚胎培养的第5天和第6天将胚胎培养至胚胎发育的囊胚阶段。根据Gardner和Schoolcraft的囊胚分级系统(Gardner et al,2000)，优质囊胚被认为是等级为2BB或更高的那些。在囊胚玻璃化和BFCM收集之前，本研究中的所有80个囊胚均经受了滋养外胚层活检以用于植入前遗传测试非整倍性(PGT-A)。
按照常规胚胎学实验室方案，将每个囊胚置于20μL油下介质滴(medium drop)中，使用激光脉冲使滋养外胚层细胞之间的细胞连接打开，并进行滋养外胚层活检，以便可将活检的细胞送至参考遗传学实验室以通过下一代测序检测PGT-A。当囊胚塌陷时，囊胚腔液被挤出到介质滴中，并从介质滴中取出囊胚，以用于随后的囊胚玻璃化。收集含有BF的介质滴，并通过吸量(pipetting)进行混合。随后将每个BFCM样品储存在-20℃下用于进一步分析。
对PAPP-A进行RT-qPCR。用Agilent 2100生物分析仪使用RNA 6000Pico试剂盒，评估来自单独整倍体植入前胚胎的囊胚腔液条件培养基的RNA含量。将单独的样品在37℃下用不含RNA酶的DNA酶1处理30分钟，随后进行热灭活。然后用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)按照制造商说明对样品进行cDNA合成。然后用Agilent 2100生物分析仪用高灵敏度DNA试剂盒来确定cDNA的量。然后，按照制造商说明(AppliedBiosystems)，将cDNA与2X TaqMan Master Mix、20X基因表达测定(GAPDH和PAPP-A特异性)和不含RNA酶的水组合。使用7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems，USA)，在50℃下2分钟、在95℃下20秒，随后为40个循环：95℃下3秒和60℃下30秒，针对每个目的基因对每个样品进行重复反应。
由于数据的去标识性质(de-identified nature)以及在囊胚塌陷进行玻璃化时通常被丢弃的BFCM的使用，IRB豁免(IRB exemption)由St.David’s InstitutionalReview Board获得。
结果：来自36名经受IVF/ICSI/PGT-A/均冷冻的患者的80个滋养外胚层受试的整倍体第5天优质囊胚的样品量进行了PAPP-A mRNA表达的BFCM分析。患者和胚胎特征在表1中列出。在80个BFCM样品中的45个(56.3％)中检出PAPP-A mRNA，其中样品中的表达水平不等(表2)。具有至少一个有检出PAPP-A mRNA的BFCM样品的对象(n＝26)和不具有有可检出PAPP-A mRNA的BFCM样品的对象(n＝10)的平均年龄分别为36.1岁和36.4岁。在其BFCM样品中检出PAPP-A mRNA的45个囊胚中，36个囊胚(80％)的滋养外胚层分级为A，并且9个囊胚的滋养外胚层分级为B；在其BFCM样品中没有可检出PAPP-A mRNA的35个囊胚中，28个(80％)的滋养外胚层分级为A，并且7个囊胚的滋养外胚层分级为B。胚胎移植(n＝28)的妊娠结局数据在表2中示出。
表1：特征和变量，包括研究对象的人口统计和结局。
表2：整倍体囊胚移植的妊娠结果，BFCM中+PAPP-A表达与BFCM中-PAPP-A表达
*费希尔精确检验(Fisher’s exact test)
表3：胚胎移植之后的妊娠
倍数变化率的含义：B18中的表达是B23中的16.19倍，并且B18中的表达是B28中的16.19/9.23倍。
表2中SAB和SAB/化学性的定义：
SAB＝妊娠5周或更晚时，但在妊娠第20周之前的自然流产/妊娠丧失，临床上可通过超声(sonography)检出。
SAB/化学性＝在妊娠第5周(此时可在母体血流中测得人绒毛膜促性腺激素，但该时机太早而不能超声检测妊娠囊)之前发生的妊娠丧失。
与在人卵巢(特别是在颗粒细胞、卵泡膜细胞(Conover et al,2001；Spicer etal,2004)、卵泡液(Botkjaer et al,2015；Jepsen et al,2016)、以及在卵丘颗粒细胞团(cumulus granulosa cell mass)(Kordus et al,2019)、以及在滋养层细胞的下游)的水平下体外测量PAPP-A相反，在此在人囊胚阶段时在体外观察到PAPP-A表达。免疫反应性PAPP-A的存在已经在由人卵巢颗粒细胞条件化的培养基中得到证实(Conover et al,1999)。发现PAPP-A在卵泡液中表达，其中免疫染色已显示PAPP-A定位于4至6mm直径的小窦状卵泡中的卵泡膜细胞层(theca cell layer)，其中PAPP-A的表达随着卵泡尺寸成熟并变成排卵期前而向内转移至颗粒细胞层(Botkjaer et al,2015)。在对妊娠中PAPP-A产生的潜在来源的研究中，2003年的体外研究报道了PAPP-A mRNA在总胎盘提取物中的表达，并且在细胞滋养层细胞以及合体滋养层细胞的细胞质中检测到PAPP-A蛋白，随着后者细胞类型的形成，其表达更多(Guibourdenche et al,2003)。
本研究包括分析在滋养外胚层活检之后已玻璃化的冷冻整倍体囊胚阶段胚胎，其由于能够跟踪整倍体囊胚移植的临床结果而因此被视为本研究的优势。
在体外植入前囊胚阶段胚胎的BFCM中观察到PAPP-A的表达。关于在人囊胚阶段胚胎水平下的PAPP-A表达和滋养外胚层受试的整倍体囊胚移植的母体/胎儿妊娠结局，可以进行更大的前瞻性研究并且正在进行中。预计另外的数据显示BFCM和/或活检的胚胎细胞中的PAPP-A可以预测不良产科结局。除了整倍体状态之外，这些方法可以用于胚胎选择的过程。以这种方式，这些方法可用于优化或提高IVF患者活产的潜能或可能性。
***
根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法均无需过度实验即可进行和实施。尽管已根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说明显的是，可对本文中所述方法以及所述方法的步骤或步骤顺序作出改变而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，在化学和生理学上相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂，而将实现相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代和改变被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献就其提供补充本文中所阐述的那些操作或细节的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。
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序列表
<110> KAVOUSSI, Shahryar K.
<120> 用于筛选胚胎的方法
<130> SHAH.P0002WO
<140> 尚未分配
<141> 2021-07-30
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<151> 2021-03-24
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 1
gtcatctttg cctggaaggg agaa 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成引物
<400> 2
agggctgttc aacatcagga tgac 24
Claims (26)
1.在体外筛选胚胎的方法，其包括：
(i)在体外获得处于囊胚发育阶段的胚胎，以及
(ii)在一个或更多个胚胎细胞中、在囊胚腔液中和/或在用于储存或培养所述胚胎的胚胎培养液中测量妊娠相关血浆蛋白-A(PAPPA)的表达；
其中PAPPA的表达降低至低于对照水平表明如果将所述胚胎植入到哺乳动物对象中，则不良产科结局的风险提高。
2.权利要求1所述的方法，其中在所述囊胚腔液中测量所述PAPPA的表达。
3.权利要求1所述的方法，其中在所述胚胎培养液中测量所述PAPPA的表达。
4.权利要求1所述的方法，其中在一个或更多个胚胎细胞中测量所述PAPPA的表达。
5.权利要求4所述的方法，其中所述一个或更多个胚胎细胞包含一个或更多个滋养层细胞或滋养外胚层细胞，或者由一个或更多个滋养层细胞或滋养外胚层细胞组成。
6.权利要求5所述的方法，其中所述一个或更多个滋养层细胞包含合体滋养层细胞或由其组成。
7.权利要求4所述的方法，其中所述一个或更多个胚胎细胞包含一个或更多个内细胞团细胞或由其组成。
8.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述不良产科结局是异常胎盘形成、自然流产、小于胎龄(SGA)、宫内生长受限(IUGR)、宫内胎儿死亡(IUFD)或先兆子痫。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述测量通过检测或测量编码PAPPA的mRNA来进行。
10.权利要求9所述的方法，其中所述测量通过以下来进行：Northern印迹分析、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或下一代mRNA测序(mRNA-Seq)。
11.权利要求10所述的方法，其中所述逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进一步限定为逆转录定量PCR(RT-qPCR)。
12.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述测量通过检测或测量PAPPA蛋白来进行，其是通过Western印迹、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC/MS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质免疫染色或电化学发光免疫测定(ECLIA)来实现。
13.权利要求12所述的方法，其中所述测量通过ELISA来进行。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测试所述胚胎的非整倍性(PGT-A)。
15.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括选择用于植入到所述哺乳动物对象中的胚胎。
16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中将所述胚胎植入到所述哺乳动物对象中作为体外受精(IVF)方法的一部分。
17.权利要求16所述的方法，其中所述胚胎由获自供体的卵母细胞产生。
18.权利要求17所述的方法，其中所述供体是所述哺乳动物对象。
19.权利要求17所述的方法，其中所述供体是第一人对象，并且其中所述哺乳动物对象是第二人对象。
20.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物对象是牛、绵羊、马、狗、猫、狮子、豹、雪貂、山羊或猪。
21.权利要求20所述的方法，其中所述哺乳动物对象是家养动物。
22.权利要求20所述的方法，其中所述哺乳动物对象是濒危物种。
23.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物对象是人。
24.权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述方法还包括进行另外的遗传测试。
25.权利要求24所述的方法，其中所述另外的遗传测试包括测试所述胚胎中遗传疾病的存在，或者由测试所述胚胎中遗传疾病的存在组成。
26.权利要求25所述的方法，其中所述胚胎进一步限定为人胚胎，并且其中所述遗传疾病是亨廷顿病、镰状细胞贫血、肌营养不良、囊性纤维化(CF)、BRCA1突变、BRCA2突变、脆性X综合征或泰-萨克斯病。
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