CN116234898A

CN116234898A - 用于治疗肥胖症和代谢紊乱的Notch信号传导抑制剂

Info

Publication number: CN116234898A
Application number: CN202180064920.8A
Authority: CN
Inventors: 邓萌; 黄迪; 匡世焕
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 2020-07-23
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2023-06-06
Also published as: EP4185306A1; US20230277549A1; WO2022020658A1

Abstract

提供了Notch信号传导抑制剂，诸如γ‑分泌酶抑制剂(GSI)例如在治疗肥胖症和诸如2型糖尿病(T2DM)、脂肪肝疾病、动脉粥样硬化等代谢紊乱，包括其合并症中的用途，所述Notch信号传导抑制剂提高解偶联蛋白‑1(UCP‑1)的表达，以选择性提高白色脂肪组织的褐变。

Description

用于治疗肥胖症和代谢紊乱的Notch信号传导抑制剂

相关申请的交叉引用

本专利申请涉及并要求2020年7月23日提交的美国临时专利申请序列号63/055,410的优先权权益，其内容特此通过引用以其全文并入本公开。

政府支持

本公开在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的DK115277和CA212609的政府支持下做出。政府在本公开中具有某些权利。

序列表声明

序列表的计算机可读形式(CRF)与本申请同时提交。题为69133-02_Seq_Listing_ST25_txt的文件在2021年5月5日生成。申请人声明计算机可读形式的内容是相同的，并且以计算机可读形式记录的信息与书面序列表相同。

技术领域

本公开涉及Notch信号传导抑制剂，诸如γ-分泌酶抑制剂(GSI)例如在治疗肥胖症和诸如2型糖尿病(T2DM)、脂肪肝疾病、动脉粥样硬化等代谢紊乱，包括其合并症中的用途，所述Notch信号传导抑制剂提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达，以选择性提高白色脂肪组织的褐变。

发明背景

2型糖尿病(T2DM)和肥胖症是密切相关的代谢紊乱，造成了大量的过量发病和死亡。肥胖症是一种慢性疾病，其与预期寿命的减少和来自心血管疾病、糖尿病、癌症和其它原因的死亡的增加高度相关。目前的评估显示，如果这种趋势持续下去，则到2030年，超过50％的世界人口将超重或肥胖[1]。肥胖个体中的过量白色脂肪组织(WAT)在肌肉和肝脏等许多位置中累积，通过内分泌和旁分泌机制产生胰岛素抵抗。在易感人群中，这种胰岛素抵抗对胰腺的需求增加最终导致胰腺无法产生足够的胰岛素以将血糖维持在正常范围内，并导致T2DM结果。越来越多地，正在开发治疗肥胖症和T2DM两者的药物，其中利拉鲁肽(用于肥胖症的商标名为

而用于T2DM的商标名为/>

)是最突出的实例。

理解导致肥胖症中WAT累积的过程和代谢扰动对于肥胖症和T2DM两者的治疗策略的开发特别重要。WAT产生促进胰岛素抵抗的多种脂肪因子和炎症介质(Ouchi等人,NatureReviews Immunol.11:85-97,2011)。相反，在褐色脂肪组织(BAT)中发现的褐色脂肪细胞可以经由解偶联蛋白1(UCP1)-介导的生热作用来分解脂质并利用脂质来产生热量，这与更健康的代谢表型相关[2]。产热脂肪细胞也可以在某些WAT库中发现，并且它们的存在由内在因素和外部刺激来动态地调节。这种类型的脂肪细胞通常被称为米色(beige)(或“米色(brite)”，代表白中带棕)脂肪细胞，并且白色脂肪细胞向米色脂肪细胞的转化被称为“褐变”或“米色样变(beiging)”。

近来在成人中持续存在褐色和米色脂肪细胞的发现提示WAT的经典褐变过程的激活可能是提高能量消耗以治疗肥胖症和代谢疾病的替代策略[3][4]。

发明概述

在一些方面中，本公开提供了在有需要的受试者中提高白色脂肪组织的褐变的方法，其包括向受试者施用提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

在一些方面中，本公开提供了治疗肥胖症，包括其合并症的方法，其包括向受试者施用提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

在一些方面中，本公开提供了在有需要的受试者中治疗代谢紊乱的方法，其包括向受试者施用提高UCP-1的表达并例如在该受试者中提高白色脂肪组织的褐变的Notch信号传导抑制剂化合物。

在一些方面中，本公开提供了用于在有需要的受试者中提高白色脂肪组织的褐变的药物组合物，其包含提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

在一些方面中，本公开提供了包含Notch抑制剂化合物或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，以及可生物降解聚合物的颗粒(例如纳米颗粒或微米颗粒)。

在一些方面中，本公开提供了包含Notch抑制剂化合物或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，以及可生物降解聚合物的颗粒制剂。

在一些方面中，本公开提供了包含γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，以及聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)的纳米颗粒制剂，其中纳米颗粒具有大约150nm至大约200nm的平均直径。

在一些方面中，本公开提供了包含γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，以及聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)的微米颗粒制剂，其中微米颗粒具有大约50μm至大约150μm的平均直径。

在一些实施方案中，受试者患有肥胖症(包括其合并症)，或处于发展其的风险中。在某些实施方案中，受试者患有代谢紊乱，或处于发展其的风险中。还包括在有需要的受试者中治疗肥胖症(包括其合并症)和/或治疗代谢紊乱的方法，其包括向受试者施用提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达并任选在该受试者中提高白色脂肪组织的褐变的Notch信号传导抑制剂化合物。

在一些实施方案中，肥胖症的合并症和/或代谢紊乱选自2型糖尿病(T2DM)、胰岛素抵抗、前驱糖尿病、高脂血症、脂肪肝疾病，任选非酒精性脂肪肝炎(NASH)、心血管疾病、动脉粥样硬化、阻塞性睡眠呼吸暂停、哮喘和骨关节炎中的一种或多种。在一些实施方案中，受试者患有代谢综合征。在一些实施方案中，代谢综合征包含腹部肥胖症、高血压、高血糖，任选T2DM、高血清甘油三酯和低血清高密度脂蛋白(HDL)的任意组合。在一些实施方案中，受试者具有大约或至少大约25、30、35或40kg/m²的体重指数(BMI)。在一些实施方案中，受试者患有I级肥胖症(BMI为大约30-35kg/m²)、II级肥胖症(BMI为大约35-40kg/m²)、或III级肥胖症(BMI大于大约40kg/m²)。在一些实施方案中，受试者具有大约或至少大约100mg/dL的空腹血糖水平。在一些实施方案中，受试者具有大约100-125mg/dL(前驱糖尿病)、或大约126mg/dL或更高(糖尿病)的空腹血糖水平。

在一些实施方案中，化合物是γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，GSI是选自表1的化合物，或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，化合物配制为微米颗粒或纳米颗粒(例如如本文中所述的微米颗粒或纳米颗粒)。在一些实施方案中，化合物与可生物降解聚合物一起配制，并任选配制为基于可生物降解聚合物的纳米颗粒或微米颗粒，其任选由聚乳酸(PLA)、聚-D-L-乙交酯(PLG)、聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚已酸内酯(PCL)、聚(碳酸三亚甲基酯)(PTMC)、聚二氧六环酮(PDS)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(酸酐-共-酰亚胺)、聚(酸酐-酯)、聚氨酯、聚(癸二酸甘油酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)、聚(噁唑啉)、低聚(乙二醇)富马酸酯(OPF)、聚丙烯酰胺、合成聚(氨基酸)、聚磷腈、聚(磷酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、胶原、聚磷腈、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚羟基链烷酸酯、聚二氧六环酮(PDO)、多糖(任选地，透明质酸、壳聚糖、右旋糖酐、硫酸软骨素、海藻酸盐和/或纤维素)和/或聚氰基丙烯酸酯(PCA)构成。

某些实施方案包括在含有白色脂肪组织的部位处或邻近该部位将化合物直接施用于受试者。

一些实施方案相对于基线参照物或对照，将UCP-1的表达(包括在白色脂肪组织中)提高到大约或至少大约2、5、10、50、100、500或1000倍。一些实施方案相对于基线参照物或对照，在受试者中将白色脂肪组织的褐变提高了大约或至少大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。一些实施方案相对于基线参照物或对照，在受试者中将白色脂肪组织减少了例如大约或至少大约5、10、20、30、40或50％或更多。一些实施方案相对于基线参照物或对照，在受试者中将体重减少了例如大约或至少大约5、10、20、30、40或50％或更多，或任选减少了大约或至少大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kg或更多。

某些实施方案在受试者中将体重指数(BMI)减少了例如大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20kg/m²。在特定实施方案中，在受试者中减少的体重和/或减少的BMI维持大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年或更多。

某些实施方案在受试者中改善葡萄糖稳态，例如其中受试者患有前驱糖尿病或T2DM。某些实施方案相对于基线参照物或对照，在受试者中将空腹血糖水平任选减少了大约或至少大约10、20、30、40或50％或更多，任选减少至大约或小于大约100mg/dL的水平。某些实施方案相对于基线参照物或对照，在受试者中将葡萄糖耐量提高了例如大约或至少大约10、20、30、40或50％或更多，任选提高至大约或小于大约140mg/dL的水平，如在口服葡萄糖耐量试验中测得的那样。某些实施方案在受试者中将预期寿命提高了例如大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年或更多。

一些实施方案包括用于治疗肥胖症(包括其合并症)和/或用于治疗代谢紊乱的药物组合物，其包含提高UCP-1的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。某些实施方案包括组合物在制备用于在有需要的受试者中提高白色脂肪组织的褐变的药物中的用途，所述组合物包含提高UCP-1的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。一些实施方案包括组合物在制备用于治疗肥胖症(包括其合并症)和/或用于治疗代谢紊乱的药物中的用途，所述组合物包含提高UCP-1的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。在某些药物组合物或用途中，Notch信号传导抑制剂化合物是γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。在一些实施方案中，GSI是选自表1的化合物，或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。

附图简述

图1A–1B显示了GSI对Notch抑制的影响。(图1A)实时qPCR分析，显示了在用1μM的浓度的七种GSI处理12小时后，3T3-L1前脂肪细胞中Notch靶基因Hes1的mRNA水平；(图1B)实时qPCR分析，显示了在用0、0.5、1和10μM的浓度的四种最有效的GSI处理12小时后，3T3-L1前脂肪细胞中Hes1的mRNA水平。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005和****p<0.001(单因素或双因素ANOVA，随后进行Tukey’s多重比较检验)。数据显示为平均值±SEM。n＝3个单独实验。

图2显示GSI对细胞活力的影响。用0.5、1和10μM的浓度的四种GSI处理3T3-L1前脂肪细胞。还包括不含任何抑制剂(0μM)的DMSO溶媒对照和0.1％ Triton X-100的阳性对照。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005和****p<0.001(双因素ANOVA，随后进行Tukey’s多重比较检验)。数据显示为平均值±SEM。n＝3个单独实验。

图3A–3B显示了GSI促进3T3-L1前脂肪细胞的分化效率。用0.5、1和10μM的浓度的四种GSI处理3T3-L1前脂肪细胞，并诱导分化。还包括不含任何抑制剂(0μM)的DMSO溶媒对照物。在分化过程中每两天常规地更换含有GSI的培养基。(图3A)在用1μM的浓度的GSI处理后，用油红O染色的分化3T3-L1细胞的代表性相位对比和明场图像；(图3B)从用不同浓度的GSI处理的油红O染色的细胞中提取的细胞裂解物在500nm处的相对吸光度。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005和****p<0.001(双因素ANOVA，随后进行Tukey’s多重比较检验)。数据显示为平均值±SEM。n＝3个单独实验。

图4A–4E显示了GSI在分化的3T3-L1细胞中上调米色脂肪形成和褐变标记基因的表达。(图4A-4C)实时qPCR分析，显示了包括Fabp4和Ppargcα在内的脂肪形成基因(图4A)、包括Cox5B和Tmem26在内的线粒体和米色细胞表面标记基因(图4B)以及包括Ucp1、Cidea、Prdm16和Dio2在内的褐变标记基因(图4C)的相对mRNA水平；(图4D)蛋白印迹结果，显示了在用三种浓度的GSI处理的分化的3T3-L1细胞中UCP1、PPARγ和C/EBPα的相对蛋白丰度；(图4E)通过光密度分析定量相对于β-肌动蛋白对照归一化的UCP1、PPARγ和C/EBPα的相对蛋白水平。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005和****p<0.001(双因素ANOVA，随后进行Tukey’s多重比较检验)。数据显示为平均值±SEM。n＝3个单独实验。

图5显示了GSI在分化的3T3-L1细胞中提高了UCP1的蛋白表达。用1μM的浓度的四种GSI处理3T3-L1前脂肪细胞并诱导分化。还包括不含任何抑制剂(0μM)的DMSO溶媒对照。在分化过程中每两天常规地更换含有GSI的培养基。UCP1用Alexa

488染色成绿色，而细胞核用DAPI复染成蓝色。

图6显示了GSI促进3T3-L1前脂肪细胞的分化效率，与图3A-3B相关。在用GSI处理后用油红O染色的分化的3T3-L1细胞的相位对比和明场图像。用0.5和10μM的浓度的四种GSI处理3T3-L1前脂肪细胞并诱导分化。还包括不含任何抑制剂(0μM)的DMSO溶媒对照。在分化过程中每两天常规地更换含有GSI的培养基。

图7A-7D是显示使用DynaPro PlateReader-II测得的各种负载γ-分泌酶抑制剂的PLGANP的粒度分布的一系列图。测量了以下的的尺寸分布：(图7A)RO4929097-PLGA NP；(图7B)PF-03084014-PLGANP；(图7C)LY3039478-PLGANP；和(图7D)BMS-906024-PLGANP。

图8是显示RO4929097-PLGANP对Notch信号传导靶基因的影响的图。

图9A–9H是显示各种负载γ-分泌酶抑制剂的PLGANP的形态学图像的一系列TEM图像。在500nm(图9A)和200nm(图9B)处的RO4929097-PLGANP的TEM图像；在500nm(图9C)和200nm(图9C)处的PF-03084014-PLGANP的TEM图像；在500nm(图9E)和200nm(图9F)处的LY3039478-PLGA NP的TEM图像；和在500nm(图9G)和200nm(图9H)处的BMS-906024-PLGA NP的TEM图像。

发明详述

定义

除非另行定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文中描述的那些类似或等同类似或等同的任何方法、材料、组合物、试剂、细胞可用于本公开的主题的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，均通过引用以其全文并入本文，如同每个单独的出版物或参考文献被具体和单独地指明通过引用全文并入本文。本申请要求其优先权的任何专利申请也以上述出版物和参考文献的方式通过引用以其全文并入本文。

标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常实现的或如本文中所述那样进行。这些和相关的技术和程序一般可以根据本领域中公知的常规方法并如本说明书通篇中引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所述来进行。除非提供了具体定义，本文中描述的与分子生物学、分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学结合使用的命名以及上述的实验室程序和技术是本领域中公知和常用的那些。标准技术可用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。

为了本公开的目的，下面定义了以下术语。

冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。作为实例，“一个(an)要素”包括“一个(one)要素”、“一个或多个要素”和/或“至少一个要素”。

“大约”是指相对于参考量(quantity)、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量(amount)、重量或长度，变化多达20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的量(quantity)、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量(amount)、重量或长度。

“拮抗剂”或“抑制剂”是指干扰或以其它方式降低另一药剂或分子的生理作用的生物结构或化学药剂。在一些情况下，拮抗剂或抑制剂特异性结合其它药剂或分子。包括完整的和部分的拮抗剂/抑制剂。

“激动剂”是指提高或增强另一药剂或分子的生理作用的生物结构或化学药剂。在一些情况下，激动剂特异性结合其它试剂或分子。包括完整的和部分的激动剂。

如本文中所用，“处于发展疾病或不良反应的风险中”的受试者可以患有或可以未患有可检测的疾病或疾病的症状，并且在本文所述的治疗方法之前可以显示或可以未显示出可检测的疾病或疾病的症状。“处于……的风险”表示受试者具有本文中所述和本领域已知的一种或多种风险因素，其是与疾病发展相关的可测量的参数。与不具有一种或多种这些风险因素的受试者相比，具有一种或多种这些风险因素的受试者发展疾病或不良反应的概率更高。

“生物相容的”是指一般对细胞或受试者的生物功能无害并且不会导致任何程度的不可接受的毒性(包括变应原性和疾病状态)的材料或化合物。

术语“结合”是指例如由于共价、静电、疏水和离子和/或氢键相互作用(包括诸如盐桥和水桥的相互作用)，两个分子之间的直接缔合。

在本公开通篇中，除非上下文另行要求，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将理解为暗示包括所述步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤或要素或步骤或要素的组。

“由……组成”是指包括且限于短语“由……组成”后的任何事物。由此，短语“由……组成”指示所列要素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它要素。“基本上由……组成”是指包括在该短语后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于本公开中对所列要素指定的活性或作用的其它要素。由此，短语“基本上由……组成”指示所列要素是必需的或强制性的，但其它要素是任选的，并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否实质上影响所列要素的活性或作用。

术语“不含内毒素”或“基本不含内毒素”一般地涉及含有至多痕量(例如对受试者没有临床不良生理作用的量)的内毒素，和优选不可检出量的内毒素的组合物、溶剂和/或容器。内毒素是与某些微生物(诸如细菌，通常为革兰氏阴性细菌)相关的毒素，尽管内毒素可以在革兰氏阳性细菌(诸如单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes))中发现。最普遍存在的内毒素是在各种革兰氏阴性细菌的外膜中发现的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，并且其代表了这些细菌引起疾病的能力的中心致病特征。人体中少量的内毒素可产生发热、血压降低以及炎症和凝血的激活等不良生理作用。

因此，在药物生产中，经常需要从药物产品和/或药物容器中除去大部分或全部痕量内毒素，因为即使少量也可在人体中引起不良作用。为此目的，可以使用去热原烘箱，因为通常需要超过300℃的温度来分解大多数内毒素。例如，基于初级包装材料诸如注射器或小瓶，250℃的玻璃温度和30分钟的保持时间的组合通常足以实现内毒素水平的3个log的减少。考虑了去除内毒素的其它方法，包括例如本文中所述和本领域已知的色谱和过滤方法。

可以使用本领域已知的常规技术检测内毒素。例如，利用来自鲎的血液的鲎变形细胞溶解物测定是一种非常灵敏的用于检测内毒素存在的测定。在这个试验中，由于放大该反应的强大的酶级联，极低水平的LPS可以引起鲎溶解物的可检测的凝固。内毒素还可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来定量。为了基本上不含内毒素，内毒素水平可以小于大约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/mg的活性化合物。通常，1ng的脂多糖(LPS)对应于大约1-10EU。

术语“半最大有效浓度”或“EC₅₀”是指如本文中所述的药剂(例如Notch信号传导抑制剂、γ-分泌酶抑制剂)的浓度，在该浓度下所述药剂在某些特定暴露时间后诱导基线与最大值之间一半的反应；量反应曲线(graded dose response curve)的EC₅₀因此代表观察到其最大作用的50％时的化合物浓度。EC₅₀还代表在体内获得最大作用的50％所需的血浆浓度。类似地，“EC₉₀”是指观察到其最大作用的90％时药剂或组合物的浓度。“EC₉₀”可由“EC₅₀”和Hill斜率来计算，或者其可使用本领域的常规知识直接由数据来确定。在一些实施方案中，药剂(例如Notch信号传导抑制剂，γ-分泌酶抑制剂)的EC₅₀为小于大约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500nM。在一些实施方案中，药剂将具有大约1nM或更小的EC₅₀值。

药剂(例如Notch信号传导抑制剂，γ-分泌酶抑制剂)的“半衰期”是指相对于施用到生物体的血清或组织中时的药理学、生理学或其它活性，或相对于任何其它限定的时间点，试剂失去其药理学、生理学或其它活性的一半所花费的时间。“半衰期”也可以是指相对于施用到生物体的血清或组织中时的量或浓度，或相对于任何其它限定的时间点，试剂的量或浓度减少了施用到生物体的血清或组织中的起始量的一半所花费的时间。半衰期可以在血清和/或任意一种或多种所选组织中测得。

术语“调节”和“改变”包括通常相对于对照以统计学显著性或生理学显著的量或程度来“提高”、“增强”或“促进”，以及“降低”或“减少”。“提高的”、“促进的”或“增强的”量通常是“统计学显著的”量，并可包括是由无组合物或对照组合物(例如不存在药剂或不同的药剂)产生的量的大约或至少大约1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000倍或更多的量。“提高的”、“促进的”或“增强的”量也可包括是由无组合物或对照组合物产生的量的大约或至少大约2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％或更多的量。“降低的”或“减少的”量通常是“统计学显著的”量，并可包括是由无组合物或对照组合物产生的量的大约或至少大约1/1.1、1/1.2、1/1.5、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/15、1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/2000、1/3000、1/4000或1/5000的量。“降低的”或“减少的”量也可包括比由无组合物或对照组合物产生的量少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％或5000％。在本文中描述了比较和“统计学显著的”量的实例。

“前药”是指可以在生理条件下或通过溶剂分解转化为本文中描述的生物活性化合物(例如GSI化合物)的化合物。由此，术语“前药”是指药学上可接受的的化合物的代谢前体。当施用于有需要的受试者时，前药可以是无活性的，但其在体内转化为活性化合物。前药可以例如通过在血液中水解，在体内快速转化以产生母体化合物。前药化合物通常在哺乳动物生物体中提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见Bundgard,H.,Design ofProdrugs(1985),第7-9页,21-24(Elsevier,Amsterdam))。在Higuchi,T等人,A.C.S.Symposium Series,第14卷和Bioreversible Carriers in Drug Design,EdwardB.Roche编,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中提供了前药的论述。前药的实例包括但不限于本公开的化合物中的醇官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能团的酰胺衍生物等等。

术语“前药”还意味着包括任何共价键合的载体，在将此类前药施用于受试者时，所述载体在体内释放活性化合物。化合物的前药可通过以使得修饰物在常规操作中或在体内裂解为母体化合物的方式修饰化合物中存在的官能团来制备。前药包括其中羟基、氨基或巯基基团与任何基团键合的化合物，在将化合物的前药施用于受试者时，所述任何基团裂解以分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基基团。

“药学上可接受的的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于例如美国食品及药品管理局(United States Food and Drug Administration)批准为可接受用于人或家养动物的任何辅助剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。

“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐两者。

“药学上可接受的酸加成盐”是指保留游离碱的生物有效性和性质的那些盐，其不是生物学或其它方面不合意的，并且其用无机酸(诸如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)和有机酸(诸如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、羟基乙酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖醛酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等)来形成。

“药学上可接受的碱加成盐”是指保留游离酸的生物有效性和性质的那些盐，其不是生物学或其它方面不合意的。这些盐制备自向游离酸中加入无机碱或有机碱。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝盐等。优选的无机盐是铵、钠、钾、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯、仲和叔胺，取代胺(包括天然存在的取代胺)，环胺和碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

本文中使用的术语“溶剂化物”是指包含一个或多个本文中描述的化合物分子与一个或多个溶剂分子的聚集体。溶剂可以是水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。备选地溶剂可以是生物惰性有机溶剂。由此，本文中描述的化合物可以以水合物(包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等)，以及相应的溶剂化形式存在。本公开的化合物可以是真溶剂化物，而在另一些情况下，化合物可以仅保留外来的(adventitious)水或是水加一些外来溶剂的混合物。

“药物组合物”是指本文中描述的化合物和本领域中一般接受的用于将生物活性化合物递送至哺乳动物(例如人)的介质的制剂。因此，此类介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本文中描述的化合物或它们的药学上可接受的盐可含有一个或多个不对称中心，并可以由此产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，其在绝对立体化学方面可定义为(R)-或(S)-，或对氨基酸而言定义为(D)-或(L)-。本公开意在包括所有此类可能的异构体，以及它们的外消旋和光学纯形式。光学活性(+)和(-)、(R)-和(S)-、或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或使用常规技术(例如色谱和分步结晶)来拆分。制备/分离单个对映异构体的常规技术包括从合适的光学纯前体进行手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)拆分外消旋物(或盐或衍生物的外消旋物)。当本文中描述的化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时，且除非另行说明，旨在化合物包括E和Z几何异构体两者。同样，也旨在包括所有互变异构形式。

在某些实施方案中，可以定义组合物中任何给定药剂(例如Notch信号传导抑制剂，γ-分泌酶抑制剂)的“纯度”。例如，某些组合物可包含以重量-重量计为至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的药剂，包括其间的所有小数和范围，如例如但绝不限于通过高效液相色谱(HPLC)(一种在生物化学和分析化学中经常使用以分离、鉴定和量化化合物的公知形式的柱色谱法)测得的那样。

术语“溶解度”是指本文中提供的药剂(例如Notch信号传导抑制剂，γ-分泌酶抑制剂)溶解在液体溶剂中并形成均匀溶液的性质。溶解度通常表示为浓度，以每单位体积溶剂的溶质质量(每千克溶剂的溶质克数、每dL(100mL)的克数、mg/ml等)、摩尔浓度、重量摩尔浓度、摩尔分数或浓度的其它类似描述计。在规定条件下每一定量的溶剂可以溶解的溶质的最大平衡量是该溶质在该溶剂中的溶解度，所述条件包括温度、压力、pH和溶剂的性质。在某些实施方案中，溶解度在生理pH或其它pH下，例如在pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0、pH7.4、pH 7.6、pH 7.8或pH 8.0(例如大约pH 5-8)下测得。在某些实施方案中，溶解度在水或生理缓冲液(诸如PBS或NaCl(含有或不含有NaPO₄))中测得。在特定实施方案中，溶解度在相对较低的pH(例如pH 6.0)和相对较高的盐(例如500mM NaCl和10mM NaPO₄)下测得。在某些实施方案中，溶解度在生物流体(溶剂)(诸如血液或血清)中测得。在某些实施方案中，温度可以为大约室温(例如大约20、21、22、23、24、25℃)或大约体温(37℃)。在某些实施方案中，药剂在室温下或在37℃下具有至少大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/ml的溶解度。

“稳定的化合物”和“稳定的结构”意为指示足够稳健以经受从反应混合物中分离至可用纯度程度并配制为治疗剂的化合物。

“统计学显著”意为结果不可能是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法确定。常用的显著性量度包括p值，其是如果零假设为真，则观察到的事件将发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平被定义为0.05或更小的p值。

“受试者”或“有需要的受试者”或“患者”或“有需要的患者”包括哺乳动物受试者，诸如人受试者。

“基本上(substantially)”或“基本上(essentially)”包括几乎全部或全部，例如某些给定量的95％、96％、97％、98％、99％或更大。

“立体异构体”是指由通过相同的键键合的相同原子组成但具有不可互换的不同三维结构的化合物。本公开包括各种立体异构体及其混合物，并且包括“对映异构体”，其是指分子彼此为不可重叠镜像的两种立体异构体。

“互变异构体”是指质子从分子的一个原子转移到同一分子的另一原子。本公开包括任何所述化合物的互变异构体。

本文中使用的术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”、“治疗剂量”或“预防有效量”是施用后引起期望的生物反应所需的药剂(例如Notch信号传导抑制剂，γ-分泌酶抑制剂，另外的药剂)的量。

如本文中所用，受试者(例如哺乳动物，诸如人)或细胞的“治疗”是用于试图改变个体或细胞的自然过程的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用至少一种药物组合物，并且可以预防性地或在病理事件开始或与病原体接触之后进行。还包括“预防性”治疗，其可以针对降低所治疗的疾病或状况的进展速率、延迟该疾病或状况的发作、或降低其发作的严重程度。“治疗”或“预防”不一定指示疾病或状况、或其相关症状的完全根除、治愈或预防。

本公开的方法、颗粒和制剂

在一些方面中，本公开提供了治疗肥胖症(包括其合并症)的方法，其包括向受试者施用提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

在一些方面中，本公开提供了在有需要的受试者中治疗代谢紊乱的方法，其包括向受试者施用提高UCP-1的表达并例如在受试者中提高白色脂肪组织的褐变的Notch信号传导抑制剂化合物。

除非另行明确说明，本说明书中的每个实施方案将适用于其它每个实施方案。

本公开的实施方案包括在有需要的受试者中诱导或以其它方式提高白色脂肪组织的褐变的方法，其包括向受试者施用提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。还包括在有需要的受试者中治疗肥胖症(包括其合并症)的方法和/或治疗代谢紊乱的方法，其包括向受试者施用提高UCP-1的表达并例如在受试者中提高白色脂肪组织的褐变的Notch信号传导抑制剂化合物。

白色脂肪组织(WAT)或白色脂肪是在哺乳动物中发现的两种类型的脂肪组织中的一种。WAT主要用于储能，并且还充当热绝缘体，帮助维持体温。相反，褐色脂肪组织积极助力于温度调节，例如通过经由非战栗产热来产生热量。褐色脂肪细胞含有许多较小的液滴和数量高得多的(含铁)线粒体，这赋予组织其颜色。与白色脂肪相比，褐色脂肪还含有更多的毛细血管，其向组织供应氧和营养物并将产生的热量散发到全身。但是，产热脂肪细胞也可以在某些WAT库中发现，并且它们的存在由内在因素和外部刺激来动态地调节。这些类型的产热脂肪细胞通常被称为米色(beige)(或米色(brite)，代表白中带棕)脂肪细胞，并且本文中使用的术语“褐变”或“米色样变(beiging)”是指白色脂肪细胞向产热米色脂肪细胞的转化。

如上所述，某些化合物抑制或以其它方式减少Notch信号传导。Notch信号传导途径是高度保守的细胞信号传导系统。例如，哺乳动物具有四种不同的Notch受体，称为NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4。Notch受体是单次跨膜受体蛋白；包括由大的细胞外部分(其与由短的细胞外区域、单次跨膜和小的细胞内区域构成的notch蛋白的小片段以钙依赖性非共价相互作用缔合)构成的异源寡聚物。

Notch信号传导在干细胞/祖细胞的发育和再生以及细胞命运的调控中起关键作用[5]。其已知是平衡几种细胞类型(包括肌肉干细胞和脂肪细胞祖细胞)中的分化和增殖的进化保守机制[6][7][8]。Notch信号传导通过δ样和Serrate/Jagged家族配体与Notch受体(Notch-1、-2、-3和-4)的结合来介导，导致γ-分泌酶介导的蛋白水解裂解和Notch胞内结构域(NICD)的释放。随后，NICD易位至细胞核，在那里，其与免疫球蛋白κJ区(RBPJ)转录复合物的重组信号结合蛋白相互作用以激活下游靶标(包括HES和HEY家族基因)的转录，以调节细胞分化。Notch信号传导的抑制可以根据本领域的常规技术来测量。

在某些实施方案中，Notch信号传导抑制剂化合物诱导或以其它方式提高解偶联蛋白-1(UCP-1)或产热蛋白(在褐色脂肪组织的线粒体中发现的一种解偶联蛋白(参见例如UniProt:P25874))的表达。UCP-1是一种跨膜蛋白，其例如通过提高线粒体内膜的通透性，使得泵入膜间空间的质子能够返回线粒体基质来降低氧化磷酸化中产生的质子梯度。褐色脂肪中UCP-1介导的生热使呼吸链解偶联，允许具有低ATP产生速率的快速底物氧化。在一些实施方案中，Notch信号传导抑制剂化合物例如在白色脂肪组织中，相对于基线参照物或对照将UCP-1的表达提高到大约或至少大约2、5、10、50、100、500或1000倍。

在一些实施方案中，如上所述，有需要的受试者患有肥胖症(包括其合并症)，或处于发展其的风险中。在一些实施方案中，有需要的受试者患有代谢紊乱，或处于发展其的风险中，所述代谢紊乱可与肥胖症相关或不相关。在一些实施方案中，肥胖症的合并症和/或代谢紊乱选自2型糖尿病(T2DM)、高脂血症、胰岛素抵抗、前驱糖尿病、脂肪肝疾病，任选非酒精性脂肪肝炎(NASH)、心血管疾病、动脉粥样硬化、阻塞性睡眠呼吸暂停、哮喘和骨关节炎中的一种或多种。

在一些实施方案中，受试者患有代谢综合征，其通常是指五种以下医学状况中的至少三种的组合：腹部肥胖症、高血压、高血糖、高血清甘油三酯和低血清高密度脂蛋白(HDL)。由此，在某些实施方案中，受试者患有腹部肥胖症、高血压、高血糖(例如T2DM)、高血清甘油三酯和低血清HDL的任意组合。例如，在某些实施方案中，受试者的特征如下：向心性肥胖症：腰围≥102厘米或40英寸(男性)，≥88厘米或35英寸(女性)；血脂异常：TG≥1.7mmol/L(150mg/dl)；血脂异常：HDL-C<40mg/dL(男性)，<50mg/dL(女性)；血压≥130/85mmHg(或治疗高血压)；和/或空腹血糖≥5.6mmol/L(100mg/dl)，或使用用于高血糖的药物。

在某些实施方案中，受试者超重，或患有肥胖症或处于发展其的风险中。例如，在某些实施方案中，受试者具有大约或至少大约25、30、35或40kg/m²的体重指数(BMI)。在特定实施方案中，受试者患有I级肥胖症(大约30-35kg/m²)、II级肥胖症(大约35-40kg/m²)、或III级肥胖症(大于大约40kg/m²)。

在一些实施方案中，受试者患有前驱糖尿病或糖尿病(主要为T2DM)或处于发展其的风险中。例如，在特定实施方案中，受试者具有大约或至少大约100mg/dL的空腹血糖水平，包括其中受试者具有大约100-125mg/dL(前驱糖尿病)、或大约126mg/dL或更高(糖尿病)的空腹血糖水平。在一些实施方案中，受试者具有大约或至少大约140和199mg/dL(前驱糖尿病)、或大约200mg/dL或更高(糖尿病)的血糖水平，如在口服葡萄糖耐量试验后大约两小时后测得的那样。在一些实施方案中，受试者具有大约200mg/dL或更高的随机血糖水平。

在一些实施方案中，Notch信号传导抑制剂化合物是γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。在下表1中提供了示例性GSI。

表1.示例性GSI

由此，在某些实施方案中，GSI选自表1，包括其衍生物、前药和药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，GSI是丙二酰胺衍生物RO4929097(或RG-4733)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐(参见例如WO 2005/023772和美国申请号2005/0054633，其与RO4929097和衍生物相关的化学结构和合成方法通过引用并入)。

在一些实施方案中，GSI是下式I的丙二酰胺衍生物：

其中，

R¹是以下基团之一：

其中，

R²是低级烷基、低级炔基、-(CH₂)_n-O-低级烷基、-(CH₂)_n-S-低级烷基、-(CH₂)，，-CN、-(CR’R”)，，-CF₃、-(CR’R”)，，-CHF₂、-(CR’R”)_n-CH₂F、-(CH₂)_n-C(O)O-低级烷基、-(CH₂)_n-卤素，或是-(CH₂)_n-环烷基，其任选被一个或多个选自苯基、卤素和CF₃的取代基取代；

R’、R”独立于n且彼此独立地为氢、低级烷基、低级烷氧基、卤素或羟基；

R³、R⁴彼此独立地为氢、低级烷基、低级烷氧基、苯基或卤素；

R⁵为氢、低级烷基、-(CH₂)_n-CF₃或-(CH₂)_n-环烷基；

R⁶为氢或卤素；

R为氢或低级烷基；

R⁸为氢、低级烷基、低级炔基、-(CH₂)_n-CF₃、-(CH₂)_n-环烷基或-(CH₂)_n-苯基，其任选被卤素取代；

R⁹为氢、低级烷基、-C(O)H、-C(O)-低级烷基、-C(O)-CF₃、-C(O)-CH₂F、-C(O)-CHF₂、-C(O)-环烷基、-C(O)-(CH₂)_n-O-低级烷基、-C(O)O-(CH₂)_n-环烷基、-C(O)-苯基，其任选被一个或多个选自卤素的取代基取代、或-C(O)O-低级烷基，或为-S(O)₂-低级烷基、-S(O)₂-CF₃、～(CH₂)_n-环烷基，或为-(CH₂)_n-苯基，其任选被卤素取代；

n为0、1、2、3或4；

包括其药学上合适的酸加成盐、光学纯对映异构体、外消旋物和非对映体混合物。

本文中使用的术语“低级烷基”表示含有1至7个碳原子的饱和直链或支链烷基基团，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、2-丁基、叔丁基等。优选的低级烷基基团是具有1-4个碳原子的基团。

本文中使用的术语“低级炔基”表示含有2至7个碳原子并含有至少一个三键的不饱和直链或支链碳链。

术语“环烷基”表示含有3-7个碳原子的饱和碳环基团。

术语“卤素”表示氯、碘、氟和溴。

术语“低级烷氧基”表示其中烷基残基如上定义且经由氧原子连接的基团。

表述“-(CR’R”)_n-”可以是例如-CH₂-、-CH₂-CH₂-、-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH₂-CF₂-、-CH₂-CH₂-CF₂-、-CH₂-CH₂-CH(OCH₃)-、-CH₂CH(OH)-或-C(CH₃)₂-CH(OH)-。

在一些实施方案中，GSI是PF-03084014或其衍生物、前药或药学上可接受的盐(参见例如WO 2005/092864和美国申请号2005/0215610，其与PF-03084014和衍生物相关的化学结构和合成方法通过引用并入)。在一些实施方案中，GSI是LY3039478或其衍生物、前药或药学上可接受的盐(参见例如WO 2013/016081和美国申请号2013/0029972，其与LY3039478和衍生物相关的化学结构和合成方法通过引用并入)。

在一些实施方案中，GSI是苯并二氮杂

酮化合物BMS-906024或其衍生物、前药或药学上可接受的盐(参见例如WO 2012/129353和美国申请号2014/0357605，其与BMS-906024和衍生物相关的化学结构和合成方法通过引用并入)。

在一些实施方案中，GSI是下式II的苯并二氮杂

酮化合物：

其中：

R₁为-CH₂CF₃或-CH₂CH₂CF₃；

R₂为-CH₂CF₃、-CH₂CH₂CF₃或-CH₂CH₂CH₂CF₃；

R₃为H或-CH₃；

每个R_a独立地为F、Cl、-CN、-OCH₃和/或-NHCH₂CH₂OCH₃；且z为零、1或2。

在一些实施方案中，GSI是BMS-708163或其衍生物、前药或药学上可接受的盐(参见例如WO 2009/058552和美国申请号2009/0111858，其与BMS-708163和衍生物相关的化学结构和合成方法通过引用并入)。在一些实施方案中，GSI是LY450139或其衍生物、前药或药学上可接受的盐(参见例如WO 2002/040451和美国申请号2004/0248878，其与LY450139和衍生物相关的化学结构和合成方法通过引用并入)。在一些实施方案中，GSI是MK-0752或其衍生物、前药或药学上可接受的盐(参见例如WO 2002/081435和美国申请号2003/0114496，其与MK-0752和衍生物相关的化学结构和合成方法通过引用并入)。

在一些实施方案中，化合物(例如GSI)被配制为纳米颗粒或微米颗粒。在一些实施方案中，化合物与可生物降解聚合物一起配制(例如与其缀合)。例如，某些化合物被配制为基于可生物降解聚合物的纳米颗粒或微米颗粒。术语“纳米颗粒”是指直径大约为或介于1-100纳米(nm)左右，且在某些情况下至多大约500nm左右的物质颗粒。术语“微米颗粒”是指直径大约为或介于1-1000μm左右的物质颗粒。在某些情况下，基于可生物降解聚合物的纳米颗粒或微米颗粒由以下构成：聚乳酸(PLA)、聚-D-L-乙交酯(PLG)、聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚已酸内酯(PCL)、聚(碳酸三亚甲基酯)(PTMC)、聚二氧六环酮(PDS)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(酸酐-共-酰亚胺)、聚(酸酐-酯)、聚氨酯、聚(癸二酸甘油酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)、聚(噁唑啉)、低聚(乙二醇)富马酸酯(OPF)、聚丙烯酰胺、合成聚(氨基酸)、聚磷腈、聚(磷酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、胶原、聚磷腈、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚羟基链烷酸酯、聚二氧六环酮(PDO)、多糖(例如透明质酸、壳聚糖、右旋糖酐、硫酸软骨素、海藻酸盐和/或纤维素)和/或聚氰基丙烯酸酯(PCA)，包括其组合(参见例如美国申请号2018/0326080，其聚合物通过引用并入；以及Mahapatro和Singh,“Biodegradable Nanoparticles AreExcellent Vehicle for Site Directed In-Vivo Delivery of Drugs and Vaccines”,J.Nanobiotechnology.2011,9:55)。

在一些实施方案中，颗粒是纳米颗粒。

在一些实施方案中，颗粒是微米颗粒。

在一些实施方案中，颗粒制剂包含微米颗粒或纳米颗粒。

在一些实施方案中，颗粒制剂微米颗粒。

在一些实施方案中，颗粒制剂纳米颗粒。

在一些实施方案中，纳米颗粒具有大约1nm至大约500nm、大约5nm至大约450nm、大约10nm至大约400nm、大约25nm至大约350nm、大约50nm至大约300nm、大约100nm至大约250nm、大约125nm至大约200nm、大约150nm至大约200nm、大约160nm至大约185nm、大约165nm至大约180nm、或大约170nm至大约175nm的平均直径。

在一些实施方案中，纳米颗粒具有大约500nm或更小、大约450nm或更小、大约400nm或更小、大约350nm或更小、大约300nm或更小、大约250nm或更小、大约200nm或更小、大约190nm或更小、大约185nm或更小、大约180nm或更小、大约175nm或更小、大约170nm或更小、大约165nm或更小、大约160nm或更小、大约155nm或更小、大约150nm或更小、大约125nm或更小、大约100nm或更小、大约50nm或更小、大约25nm或更小、大约10nm或更小、大约5nm或更小、或大约1nm或更小的平均直径。

在一些实施方案中，纳米颗粒具有大约170±20nm、170±15nm、大约170±10nm、大约170±9nm、大约170±8nm、大约170±7nm、大约170±6nm、大约170±5nm、大约170±4nm、大约170±3nm、大约170±2nm、大约170±1nm、大约170±0.5nm、或大约170±0.1nm(例如大约170nm)的平均直径。

在一些实施方案中，纳米颗粒具有大约177±20nm、177±15nm、177±10nm、大约177±9nm、大约177±8nm、大约177±7nm、大约177±6nm、大约177±5nm、大约177±4nm、大约177±3nm、大约177±2nm、大约177±1nm、大约177±0.5nm、或大约177±0.1nm(例如大约177nm)的平均直径。

在一些实施方案中，纳米颗粒具有大约184±20nm、184±15nm、184±10nm、大约184±9nm、大约184±8nm、大约184±7nm、大约184±6nm、大约184±5nm、大约184±4nm、大约184±3nm、大约184±2nm、大约184±1nm、大约184±0.5nm、或大约184±0.1nm(例如大约184nm)的平均直径。

在一些实施方案中，纳米颗粒具有大约185±20nm、185±15nm、185±10nm、大约185±9nm、大约185±8nm、大约185±7nm、大约185±6nm、大约185±5nm、大约185±4nm、大约185±3nm、大约185±2nm、大约185±1nm、大约185±0.5nm、或大约185±0.1nm(例如大约185nm)的平均直径。

在一些实施方案中，微米颗粒具有大约500nm至大约1000μm、大约1μm至大约950μm、大约100μm至大约900μm、大约200μm至大约850μm、大约300μm至大约800μm、大约400μm至大约750μm、大约500μm至大约700μm、大约550μm至大约650μm、或大约600μm至大约650μm的平均直径。

在一些实施方案中，微米颗粒具有大约500μm至大约700μm的平均直径。

在一些实施方案中，微米颗粒具有大约1μm至大约250μm、大约10μm至大约200μm、大约25μm至大约175μm、大约50μm至大约150μm、大约75μm至大约125μm、或大约100μm至大约125μm的平均直径。

在一些实施方案中，微米颗粒具有大约50μm至大约150μm的平均直径。

在一些实施方案中，微米颗粒具有大约1000μm或更小、大约950μm或更小、大约900μm或更小、大约850μm或更小、大约800μm或更小、大约750μm或更小、大约700μm或更小、大约650μm或更小、大约600μm或更小、大约550μm或更小、大约500μm或更小、大约450μm或更小、大约400μm或更小、大约350μm或更小、大约300μm或更小、大约250μm或更小、大约200μm或更小、大约150μm或更小、大约100μm或更小、或大约1μm或更小的平均直径。

在一些实施方案中，微米颗粒具有大约700μm或更小的平均直径。

在一些实施方案中，微米颗粒具有大约200μm或更小的平均直径。

在一些实施方案中，Notch抑制剂化合物是γ-分泌酶抑制剂(GSI)。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)选自表1及其前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)选自表1。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)选自RO4929097、BMS-708163、PF-03084014、LY450139、LY3039478、MK-0752和BMS-906024，包括其衍生物、前药和药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)选自RO4929097、BMS-708163、PF-03084014、LY450139、LY3039478、MK-0752、BMS-906024及其前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)选自RO4929097、BMS-708163、PF-03084014、LY450139、LY3039478、MK-0752和BMS-906024。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是RO4929097或其前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是RO4929097。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是RO4929097的前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是PF-03084014或其前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是PF-03084014。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是PF-03084014的前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是LY3039478或其前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是LY3039478。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是LY3039478的前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是BMS-906024或其前药。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是BMS-906024。

在一些实施方案中，γ-分泌酶抑制剂(GSI)是BMS-906024的前药。

在一些实施方案中，颗粒制剂(例如颗粒)包含按重量计大约1％至大约50％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约1.5％至大约40％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约2％至大约30％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约2.5％至大约25％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约3％至大约20％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约4％至大约15％的Notch抑制剂化合物、或按重量计大约5％至大约10％的Notch抑制剂化合物。

在一些实施方案中，颗粒制剂(例如颗粒)包含按重量计大约5±2.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约5±2％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约5±1.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约5±1％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约5±0.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约5±0.1％的Notch抑制剂化合物(例如按重量计大约5％的Notch抑制剂化合物)。

在一些实施方案中，颗粒制剂(例如颗粒)包含按重量计大约10±5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约10±2.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约10±2％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约10±1.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约10±1％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约10±0.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约10±0.1％的Notch抑制剂化合物(例如按重量计大约10％的Notch抑制剂化合物)。

在一些实施方案中，颗粒制剂(例如颗粒)包含按重量计大约20±10％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约20±5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约20±2.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约20±2％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约20±1.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约20±1％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约20±0.5％的Notch抑制剂化合物、按重量计大约20±0.1％的Notch抑制剂化合物(例如按重量计大约20％的Notch抑制剂化合物)。

在一些实施方案中，制剂是溶液(例如冻干前溶液)。

在一些方面中，本公开提供了一种方法，其包括冻干本文中描述的制剂(例如冻干前溶液)，由此形成冻干制剂(例如冻干粉末或饼)。

在一些实施方案中，制剂是冻干制剂(例如冻干粉末或饼)。

在一些方面中，本公开提供了一种方法，其包括将溶剂加入到本文中描述的冻干制剂(例如冻干粉末或饼)中，由此形成重构溶液。

在一些实施方案中，制剂是(例如冻干粉末或饼的)重构溶液。

在一些实施方案中，可生物降解聚合物选自聚乳酸(PLA)、聚-D-L-乙交酯(PLG)、聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚已酸内酯(PCL)、聚(碳酸三亚甲基酯)(PTMC)、聚二氧六环酮(PDS)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(酸酐-共-酰亚胺)、聚(酸酐-酯)、聚氨酯、聚(癸二酸甘油酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)、聚(噁唑啉)、低聚(乙二醇)富马酸酯(OPF)、聚丙烯酰胺、合成聚(氨基酸)、聚磷腈、聚(磷酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、胶原、聚磷腈、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚羟基链烷酸酯、聚二氧六环酮(PDO)、多糖(任选透明质酸、壳聚糖、右旋糖酐、硫酸软骨素、海藻酸盐和/或纤维素)和/或聚氰基丙烯酸酯(PCA)。

在一些实施方案中，可生物降解聚合物是聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)。

在一些实施方案中，颗粒制剂包含冷冻保护剂。

在一些实施方案中，冷冻保护剂选自海藻糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、核糖、麦芽糖、甘露糖、右旋糖、山梨糖醇、甘氨酸、右旋糖酐、明胶、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)和气相二氧化硅。

在一些实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。

在某些实施方案中，本文中描述的方法和组合物采用一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物(诸如GSI)的“治疗有效”剂量或给药方案。化合物的治疗有效剂量或给药方案的精确量将根据多种因素而变化，所述因素包括所用具体化合物或制剂的活性；化合物或制剂的代谢稳定性和作用长度；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的方式和时间；排泄速率；药物组合(如果使用的话)；特定病症或状况的严重程度；和接受疗法的受试者。

在某些情况下，一种或多种化合物的治疗有效剂量范围为(例如对于70kg的哺乳动物)大约1.0mg/kg(即～70mg)至大约2500mg/kg(即～175g)。在一些实施方案中，治疗有效剂量以每日、每周、每两周或每月为基础施用至少一次，或以每日、每周、每两周或每月为基础施用至少两次或3、4、5或更多次。

在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物例如在白色脂肪组织中提高UCP-1的表达。在某些情况下，UCP-1表达相对于基线参照物或对照提高到大约或至少大约2、5、10、50、100、500或1000倍。在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物相对于基线参照物或对照，在受试者中将白色脂肪组织的褐变提高了例如大约或至少大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物相对于基线参照物或对照，在受试者中将白色脂肪组织减少了例如大约或至少大约5、10、20、30、40或50％或更多。

在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物相对于基线参照物或对照，在受试者中将体重和/或体重指数(BMI)减少了例如大约或至少大约5、10、20、30、40或50％或更多。在一些实施方案中，相对于基线参照物或对照，体重减少了大约或至少大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kg或更多。在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物在受试者中将BMI减少了例如大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20kg/m²。在特定实施方案中，减少的体重和/或减少的BMI在受试者中维持大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年或更多。

在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物在受试者中(包括其中受试者患有前驱糖尿病或T2DM，或处于发展其的风险中)改善葡萄糖稳态。例如，某些实施方案相对于基线参照物或对照，在受试者中将空腹血糖水平降低了例如大约或至少大约10、20、30、40或50％或更多。一些实施方案在受试者中将空腹血糖水平降低至大约或小于大约100mg/dL。某些实施方案相对于基线参照物或对照，在受试者中将葡萄糖耐量提高了例如大约或至少大约10、20、30、40或50％或更多。某些实施方案将葡萄糖耐量提高至大约或小于大约140mg/dL的水平，如在口服葡萄糖耐量测试中测得的那样。在某些情况下，基线参照物或对照包括在治疗开始之前或在治疗方案过程中的较早时间点获得的测量值或值。

在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物在受试者中将预期寿命提高了例如大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年或更多。

对于体内用途，如上所述，为了治疗人类疾病，通常在施用之前将一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物和本文中描述的其它药剂掺入到一种或多种药物或治疗组合物中。

由此，某些实施方式涉及药物或治疗组合物，其包含治疗有效量或剂量的一种或多种本文中描述的Notch信号传导抑制剂化合物。在某些情况下，本文中描述的药物或治疗组合物包含一种或多种与药学上或生理学上可接受的载体或赋形剂组合的Notch信号传导抑制剂化合物。某些药物或治疗组合物进一步包含至少一种如本文中描述的另外的药剂。

组合物的施用可以通过多种不同的途径来实现，包括肠胃外和肠内施用。肠胃外施用的实例包括皮下、静脉内(通过IV输注)、鞘内、硬膜外、脑内、脑室内、鼻内、肌内、动脉内和吸入施用。肠内施用的实例包括口服或直肠施用。特定实施方案包括在含有白色脂肪组织的部位处或邻近该部位将组合物或化合物直接或部位特异性地施用于受试者。

肠胃外施用的示例性方式包括针头(包括微针)注射器、无针头注射器和输注技术，以及本领域公认的任何其它肠胃外施用方式。肠胃外制剂通常是水溶液，其可含有赋形剂(诸如盐)、碳水化合物和缓冲剂(优选在范围为大约3至大约9的pH下)，但是对于一些应用而言，它们可以更合适地配制为无菌非水溶液或配制为干燥形式以便与合适的溶媒(诸如无菌无热原水)联合使用。在无菌条件下(例如通过冻干)制备肠胃外制剂可以使用本领域技术人员公知的标准制药技术容易地完成。化合物的肠胃外施用示例性地以盐水溶液的形式或将化合物掺入到脂质体中来进行。在其中化合物本身不充分可溶以溶解的情况下，可以使用增溶剂，诸如乙醇。

在一些实施方案中，如本领域已知那样，本文中描述的药物组合物不显著形成聚集体，具有期望的溶解度，和/或具有适用于人的免疫原性概况。由此，在一些实施方案中，包含一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物的组合物具有例如通过动态光散射测得的大约或小于大约50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％的聚集体。一些组合物包含一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物(例如GSI)，其相对于非聚集的Notch信号传导抑制剂化合物(例如GSI)的表观分子量为至少大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％或大约95％单分散的。

在某些实施方案中，如上所述，药物组合物包含Notch信号传导抑制剂化合物(例如GSI)和一种或多种另外的药剂，例如本文中描述的用于治疗肥胖症或其合并症，或用于治疗代谢疾病的另外的药剂。本文中描述的联合疗法可包括施用包含一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物和另外的药剂的单一药物剂量制剂，以及施用包含一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物和另外的药剂的组合物，所述一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物和另外的药剂各自在其自己的单独药物剂量制剂中。例如，可以将一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物和另外的药剂在单一剂量组合物中一起施用于受试者，或将每种药剂在单独的剂量制剂中施用。例如，可以将一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物和另外的治疗剂在单一肠胃外剂量组合物中(诸如在盐水溶液或其它生理学上可接受的溶液中)一起施用于受试者，或每种药剂在单独的肠胃外剂量制剂中施用。当使用单独的剂量制剂时，组合物可以在基本上同一时间(即同时)或在分开的交错时间(即顺序地)和以任何顺序施用。联合疗法应理解为包括所有这些方案。

在某些情况下，为了制备药物或治疗组合物，将有效或期望量的一种或多种药剂与本领域技术人员已知适于特定药剂和/或施用方式的任何一种或多种药物载体或赋形剂混合。药物载体可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、真皮内、皮下或局部施用的溶液或混悬液可包括例如无菌稀释剂(诸如水)、盐水溶液(例如磷酸盐缓冲盐水；PBS)、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗微生物剂(诸如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(诸如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)和螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(诸如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内施用(例如通过IV输注)，合适的载体的实例包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂(诸如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物)的溶液。

以纯的形式或以适当的治疗或药物组合物施用本文中描述的药剂可以经由任何公认的用于提供类似用途的药剂施用方式来进行。组合物可通过将含有药剂的组合物与适当的生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备，并可配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。此外，其它药物活性成分和/或合适的赋形剂(诸如盐、缓冲剂和稳定剂)可以但并非必须存在于组合物中。

载体可包括例如药学上或生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所用剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠离子；和/或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯20(TWEEN^TM)、聚乙二醇(PEG)和泊洛沙姆(PLURONICS^TM)等。

在一些实施方案中，一种或多种药剂可以包裹在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)-微胶囊)中、包裹在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包裹在粗乳液中。此类技术公开在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Oslo,A.,Ed.,(1980)中。一种或多种颗粒或脂质体可进一步包含其它治疗剂或诊断剂。

治疗或药物组合物可以为固体或液体形式。在一个实施方案中，一种或多种载体是颗粒，使得组合物为例如片剂或粉末形式。一种或多种载体可以是液体，其中组合物为例如口服油、可注射液体或气雾剂，其可用于例如吸入施用。当意在用于口服施用时，药物组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、混悬液和凝胶形式包括在本文认为是固体或液体的形式中。某些实施方案包括无菌的可注射溶液。

作为用于口服施用的固体组合物，可以将药物组合物配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、咀嚼胶、糯米纸囊剂(wafer)等。此类固体组合物将通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。此外，可以存在以下的一种或多种：粘合剂，诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，诸如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂，诸如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂；和着色剂。当药物组合物为胶囊形式(例如明胶胶囊)时，除上述类型的材料外，它可含有液体载体，诸如聚乙二醇或油。

治疗或药物组合物可以为液体形式，例如酏剂、糖浆剂、溶液、乳液或混悬液。作为两个实例，液体可用于口服施用或用于通过注射递送。当意在用于口服施用时，除本发明的化合物外，优选组合物还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和/或等渗剂中的一种或多种。

液体治疗或药物组合物，无论它们是溶液、混悬液还是其它类似形式，可包括一种或多种以下辅助剂：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发油，诸如可以用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的药剂，诸如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是优选的辅助剂。可注射药物组合物优选是无菌的。

治疗或药物组合物可包括改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，组合物可包括在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并可选自例如糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。备选地，活性成分可包装在明胶胶囊中。固体或液体形式的治疗或药物组合物可包括与药剂结合并由此帮助化合物递送的组分。可以发挥这种作用的合适的组分包括单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白或脂质体。

治疗或药物组合物可以基本上由可以作为气雾剂施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示从胶体性质的那些到由加压包装组成的系统的各种系统。可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适的泵系统进行递送。气溶胶可以以单相、双相或三相体系递送以递送一种或多种活性成分。气雾剂的递送包括必要的容器、激活剂、阀、子容器等，它们一起可以形成试剂盒。本领域普通技术人员无需过度实验即可确定优选的气雾剂。

本文中描述的组合物可以用保护药剂免于从体内快速消除的载体来制备，诸如定时释放制剂或包衣。此类载体包括控制释放制剂，诸如但不限于植入物和微囊包封的递送系统，和可生物降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚羟基乙酸、聚原酸酯、聚乳酸和本领域普通技术人员已知的其它。

治疗或药物组合物可通过制药领域公知的方法来制备。例如，旨在通过注射施用的治疗或药物组合物可包含盐、缓冲剂和/或稳定剂中的一种或多种，以及无菌蒸馏水以形成溶液。可以加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或混悬液。表面活性剂是与药剂非共价相互作用以促进药剂在水性递送系统中的溶解或均匀混悬的化合物。

治疗的精确剂量和持续时间随所治疗的疾病而变，并可以使用已知的试验方案或通过在本领域已知的模型系统中试验组合物并由此推断来经验地确定。还可以进行受控的临床试验。剂量也可随待减轻的状况的严重程度而变化。通常配制和施用药物组合物以发挥治疗有用的作用，同时最小化不合意的副作用。组合物可以一次施用，或者可以分成多个较小剂量以便以一定时间间隔施用。对任何具体的受试者，可以根据个体需要随时间调整具体的给药方案。

配制根据本公开的某些实施方案的治疗或药物组合物以便允许其中所含活性成分在将组合物施用于受试者或患者时是生物可利用的。将施用于受试者或患者的组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式。制备此类剂型的实际方法是本领域技术人员已知的，或将是显而易见的；例如参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。待施用的组合物通常将含有治疗有效量的本文中描述的药剂，用于治疗感兴趣的疾病或状况。

还包括患者护理试剂盒，其包含(a)治疗有效剂量的一种或多种如本文中描述的Notch信号传导抑制剂化合物(例如GSI)；和任选的(b)至少一种另外的药剂。在某些试剂盒中，(a)和(b)在单独的药物或治疗组合物中。在一些试剂盒中，(a)和(b)在相同的药物或治疗组合物中。

本文中的试剂盒还可包括一种或多种另外的药剂或适于或期望用于所治疗的适应症或用于所需诊断应用的其它组分。本文中的试剂盒还可包括一个或多个注射器或促进预期递送方式所必需或期望的其它组件(例如支架、可植入储库等)。

在一些实施方案中，患者护理试剂盒含有用于一种或多种组合物和一种或多种信息材料的单独容器、分隔物或隔室。例如，一种或多种组合物可包含在瓶、小瓶或注射器中，并且可包含与容器相关联的一种或多种信息材料。在一些实施方案中，试剂盒的单独元件包含在单个未分开的容器中。例如，组合物包含在瓶、小瓶或注射器中，所述瓶、小瓶或注射器具有以标签形式附接于其上的信息材料。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如一包)单独的容器，每个含有一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物(例如，GSI)和任选的至少一种另外的药剂的一种或多种单位剂型(例如本文中描述的剂型)。例如，试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔包装或泡罩包装，每个含有单一单位剂量的一种或多种Notch信号传导抑制剂化合物(例如GSI)和任选的至少一种另外的药剂。试剂盒的容器可以是气密的、防水的(例如对水分或蒸发的变化不可透)和/或不透光的。

患者护理试剂盒任选包括适于施用组合物的装置，例如注射器、吸入器、点滴器、纱布或任何此类递送装置。还包括例如通过组合本文中描述的组分而提供试剂盒的方法。

实施例

实施例1：Notch信号传导抑制剂对脂肪细胞的作用

进行实验以评估Notch信号传导对脂肪形成的作用。脂肪形成的过程包括五个步骤，其为细胞增殖、细胞接触抑制/生长停滞、克隆扩充、永久性生长停滞和脂质蓄积[10]。脂肪形成的转录控制涉及激活几个转录因子家族，诸如CCAAT/增强子结合蛋白家族蛋白(C/EBP)和过氧化物酶体增殖物激活受体家族蛋白(PPAR)。脂肪形成刺激诱导PPARγ和C/EBPα的表达提高。随后，C/EBPα直接结合PPARγ启动子并导致其表达。先前的研究已经表明Notch信号传导参与脂肪形成，但是，观察到Notch信号传导促进或抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化的矛盾结果[7][11]。在人原代细胞培养中，已经证明抑制Notch信号传导促进了脂肪源性间充质干细胞的脂肪形成分化[12]。

先前对Notch信号传导在脂肪形成中的作用的研究主要集中于白色脂肪细胞分化，很少有研究报道Notch信号传导如何调节米色脂肪形成和线粒体生物发生[15][16]。在本文中，在3T3-L1前脂肪细胞的体外培养中测试了γ-分泌酶抑制剂(GSI)抑制Notch信号传导以及促进脂肪细胞褐变和线粒体生物发生的能力。这些发现提供了对Notch抑制在脂肪组织代谢中的贡献的认识，突出了GSI经由抑制γ-分泌酶介导的Notch信号传导的加工而在肥胖症或代谢紊乱治疗中的交叉治疗应用的潜力，并且填补了基础科学与临床研究之间的缺口。

材料.MK-0752购自APExBIO(Houston,TX,USA)。RO4929097、PF-03084014、LY3039478和LY450139获自Sellechchem(Houston,TX,USA)。BMS-708163和BMS-906024分别购自Tocris Bioscience(Bristol,UK)和MilliporeSigma(Burlington,MA,USA)。含有四唑鎓化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓内盐；MTS]的CellTiter

AQ_ueous单溶液试剂购自Promega(Madison,WI,USA)。UCP1抗体(ab10983)和山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)-H&L多克隆第二抗体(Alexa />

488,ab15007)获自Abcam(Cambridge,UK)。CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα,SC-61)和β-肌动蛋白(SC-47778)抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX,USA)。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ,81B8)和辣根过氧化物酶(HRP)缀合第二抗体(包括抗兔IgG(7074S)和抗小鼠IgG(7076S))购自Cell Signaling Technology(Danvers,MA,USA)。所有其它试剂和溶剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。

细胞培养和药物处理.在37℃、5％ CO₂和95％相对湿度下，在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素(青霉素和链霉素)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中培养3T3-L1前脂肪细胞。每两天常规更换培养基，并在达到汇合之前通过胰蛋白酶将细胞分开。通过用含有DMEM、10％ FBS、0.5mM异丁基甲基黄嘌呤、1μM地塞米松、1.75μM胰岛素和1μM罗格列酮的脂肪形成诱导培养基处理汇合的前脂肪细胞来诱导米色脂肪细胞分化。诱导后三天，将培养基换成含有DMEM、10％ FBS、850nM胰岛素和10nM三碘甲状腺原氨酸的分化培养基，直到脂肪细胞成熟。对于药物处理，将一系列GSI分别以0.5、1和10μM的相同最终药物浓度加入培养基中的细胞中，并诱导细胞分化。

细胞活力的评估.使用基于四唑鎓盐的线粒体转化的MTS测定，确定了在用三种浓度的各种GSI温育后的体外细胞活力。将3T3-L1前脂肪细胞以每孔1×10⁴个细胞的密度接种到96孔板上并在5％ CO₂中在37℃下培养48小时。随后分别以0.5、1和10μM的相同最终药物浓度将GSI加入到培养基中的细胞中，并将细胞在37℃下进一步温育12小时。随后，在100μL培养基中将20μL的CellTiter

AQ_ueous单溶液试剂加入到每个孔中，并在潮湿的5％CO₂气氛中在37℃下温育2小时。使用Tecan Spark^TM 10M酶标仪(Tecan,/>

Switzerland)在490nm的波长下测量吸光度，在680nm下扣除背景。在培养基中与0.1％Triton X-100和二甲亚砜(DMSO)一起温育的细胞分别充当阳性和阴性对照。

形态学观察.使用具有×20物镜的Leica DM 6000B显微镜(Leica Camera,Wetzlar,Germany)观察用各种GSI处理后成熟脂肪细胞的形态。随后进行油红O染色以证明细胞中存在积累的脂滴。简而言之，细胞用4％多聚甲醛(PFA)固定并用新鲜制备的含有6mL油红O原液染色剂(5mg/mL在异丙醇中)和4mL ddH₂O的油红O工作溶液染色15分钟。用PBS重复洗涤染色的细胞，并使用安装在具有×20物镜的Leica DM 6000B显微镜上的Nikon D90数码相机拍照。成像后，使用异丙醇从染色细胞中提取油红O，并在500nm的波长下用分光光度法测定吸光度。

RNA提取、cDNA合成和实时qPCR.按照制造商的方案使用TRIzol(Thermo FisherScientific,Waltham,MA,USA)从细胞中提取总RNA。用不含RNase的DNase I处理RNA以除去污染的基因组DNA，并通过分光光度计NanoDrop 2000c(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)测定提取的RNA的纯度以及浓度。随后，使用随机六聚体引物与M-MLV逆转录酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将2μg的RNA逆转录为cDNA。在Roche Light Cycler480PCR系统(Roche,Basel,Switzerland)中用SYBR Green预混液进行实时qPCR。基因特异性引物的序列列举在下表2中。

表2.引物序列

基因	序列	SEQ ID NO:
			Hes1	5’-GCACAGAAAGTCATCAAAGCC-3’	1
	5’-TTGATCTGGGTCATGCAGTTG-3’	2
			Fabp4	5’-GATGCCTTTGTGGGAACCT-3’	3
	5’-CTGTCGTCTGCGGTGATTT-3’	4
			Ppargc1α	5’-AGCCGTGACCACTGACAACGAG-3’	5
	5’-GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG-3’	6
			Cox5B	5’-TTCAAGGTTACTTCGCGGAGT-3’	7
	5’-CGGGACTAGATTAGGGTCTTCC-3’	8
			Tmem26	5’-GAAACCAGTATTGCAGCACCC-3’	9
	5’-CCAGACCGGTTCACATACCA-3’	10
			Ucp1	5’-AGGCTTCCAGTACCATTAGGT-3’	11
	5’-CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT-3’	12
			Cidea	5’-TGACATTCATGGGATTGCAGAC-3’	13
	5’-GGCCAGTTGTGATGACTAAGAC-3’	14
			Prdm16	5’-CAGCACGGTGAAGCCATTC-3’	15
	5’-GCGTGCATCCGCTTGTG-3’	16
			Dio2	5’-AATTATGCCTCGGAGAAGACCG-3’	17
	5’-GGCAGTTGCCTAGTGAAAGGT-3’	18

2^-ΔΔCT方法用于在相对于β-肌动蛋白的表达归一化之后分析基因表达的相对变化。

蛋白提取和蛋白印迹.使用含有25mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.5％ NP-40、0.5％脱氧胆酸钠和0.1％ SDS的RIPA缓冲液从细胞中提取总蛋白。通过Pierce BCA蛋白测定试剂(Pierce Biotechnology,Waltham,MA,USA)测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白并转移到聚偏氟乙烯膜(Millipore,Burlington,MA,USA)上。随后将膜用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时，并与第一抗体一起在5％牛奶中在4℃下温育过夜，以及与第二抗体一起在室温下温育1小时。使用包括UCP1(1:1000稀释度)、C/EBPα(1:500稀释度)、PPARγ(1:500稀释度)和β-肌动蛋白(1:5000稀释度)的第一抗体。HRP缀合的第二抗体(包括抗兔和抗小鼠IgG)也以1:10,000的稀释度使用。使用用于蛋白印迹法的增强化学发光检测的鲁米诺试剂(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX,USA)，并用FluorChem R成像系统(ProteinSimple,San Jose,CA,USA)检测信号。

免疫荧光染色.用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤之后，细胞用4％ PFA固定，用甘氨酸(在PBS中的100mM甘氨酸和0.1％叠氮化钠)猝灭，并用含有2％ BSA、5％山羊血清和0.2％Triton X-100的PBS在室温下封闭1小时。随后，将细胞与在相同封闭缓冲液中以1:500稀释的UCP1抗体在4℃下温育过夜，并与Alexa

488缀合的山羊抗兔IgG(1:1000稀释度)在室温下温育1小时。细胞核用与第二抗体预混合的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,1μg/mL)复染。

统计分析.所有研究均一式三份进行，且数据点表示为平均值加或减平均值的标准误差(平均值±SEM)。为了确定统计学显著性，使用GraphPad Prism 7进行方差分析(单因素或双因素ANOVA)，随后进行Tukey’s多重比较检验。如果p≤0.05，则差异被认为是统计学显著的。

GSI对Notch抑制的作用.为了确定GSI对Notch信号传导的抑制的影响，用1μM的浓度的一系列GSI(参见表1)处理3T3-L1前脂肪细胞，并使用实时qPCR评估Hes1(Notch下游转录靶基因)的mRNA表达的变化。如图1A中所示，用RO4929097(p≤0.01)、PF-03084014(p≤0.01)、LY3039478(p≤0.001)和BMS-906024(p≤0.001)处理后，Hes1的表达被显著抑制，这提示Notch信号传导的有效抑制。但是，实验中使用的其它GSI，包括LY450139、MK-0752和BMS-708163，在1μM的浓度下没有显著降低Hes1的表达水平(图1A)。药物处理之间Notch信号传导的抑制活性的差异可能是由于变化的有效浓度。

为了进一步检查药物浓度与GSI的抑制作用之间的关系，用三种梯度浓度(0.5、1和10μM)的四种最有希望的抑制剂(即RO4929097、PF-03084014、LY3039478和BMS-906024)处理细胞。观察到，与DMSO对照组相比，在所有处理组中，Hes1的mRNA水平都显著下调了40-50％(p≤0.01)，即使在0.5μM的最低浓度下也如此(图1B)。随着PF-03084014、LY3039478和BMS-906024的药物浓度的提高，抑制作用变得更显著，而RO4929097的处理没有导致Hes1表达的剂量依赖性抑制。这些结果提示，3T3-L1前脂肪细胞以不同的灵敏度响应多种GSI。

GSI对细胞活力的作用.为了研究GSI对细胞活力的作用，用三种梯度浓度(0.5、1和10μM)的GSI处理3T3-L1前脂肪细胞12小时。发现用RO4929097、PF-03084014和BMS-906024处理后的细胞活力随着药物浓度从0.5μM提高至10μM而降低(图2)。这三种GSI对细胞毒性的诱导是剂量依赖性的，在10μM的最高浓度下观察到最显著的作用，特别是在用PF-03084014处理的组中(p≤0.001)。该结果与先前公开的数据一致，表明PF-03084014对细胞生长的抑制可能部分由于其对细胞周期阻断和凋亡的诱导的作用[17]。LY3039478在所有使用的浓度下均未导致任何显著的细胞毒性，指示了该化合物的有希望的安全性。

GSI促进3T3-L1前脂肪细胞的分化效率.为了确定Notch信号传导在脂肪形成中的作用，在诱导分化后，用三种梯度浓度(0.5、1和10μM)的各种GSI处理3T3-L1前脂肪细胞。如图3A中所示，在用诱导培养基温育三天，随后用分化培养基温育五天后，用细胞质中积累的脂滴有效诱导了3T3-L1细胞的分化。相位对比和油红O染色图像均证实，与DMSO对照相比，GSI(1μM)处理的细胞中脂滴的数量和尺寸增加，这提示GSI增强了3T3-L1细胞的分化效率。但是，在四种化合物之间没有观察到明显的差异。还注意到，三种梯度浓度在脂滴的数量和尺寸方面没有导致显著的差异(图S1)。通过油红O强度的定量分析进一步确定了细胞内的总脂质含量。结果显示，从GSI处理的细胞中提取的油红O的吸光度值显著高于对照组中的(图3B)，这表明即使极低剂量的GSI也促进了3T3-L1细胞的分化和脂滴的积累。

GSI在分化的3T3-L1细胞中上调米色脂肪形成和褐变标记基因的表达。尽管已经证明Notch信号传导影响脂肪细胞分化，但近来仅研究了其在米色脂肪细胞生物发生的调节中的潜在作用[15]。为了鉴定GSI对米色脂肪形成的影响，我们使用实时qPCR在用GSI连续处理后检查了分化的3T3-L1细胞中脂肪形成、线粒体相关和米色脂肪选择性基因的mRNA表达。如图4A中所示，在所有浓度下用GSI处理的细胞中，脂肪酸结合蛋白4(Fabp4)的表达均增加；但是，差异并不显著。GSI处理还上调过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α(Ppargc1α)的表达，其中在用10μM的最高浓度的PF-03084014和LY3039478处理的组中观察到显著变化(p≤0.05)。此外，图4B显示RO4929097在所有浓度下均提高细胞色素c氧化酶亚基5B(Cox5B)的表达，其中低剂量处理诱导最显著的变化(p≤0.001)。在用1μM的PF-03084014(p≤0.01)和10μM的LY3039478(p≤0.05)处理细胞时，也观察到Cox5B的显著上调。PF-03084014、LY3039478和BMS-906024以剂量依赖性方式提高了跨膜蛋白26(Tmem26)的表达，其中最高剂量引起处理组和对照组之间的显著差异。此外，米色脂肪选择性基因(包括解偶联蛋白1(Ucp1)、细胞死亡诱导DNA片段化因子α样效应子A(Cidea)、含PR结构域蛋白16(PR domain containing 16)(Prdm16)和2型脱碘酶(Dio2))的表达在用所有的GSI处理后均上调(图4C)。但是，仅在采用10μM的高浓度的PF-03084014和LY3039478的组中发现了显著变化(p≤0.05)。这些结果指示GSI在分化的脂肪细胞中促进米色脂肪形成和线粒体生物发生，但对于每种化合物，实现最大效率的最佳浓度是可变的。

蛋白印迹分析表明，当用1μM的RO4929097(p≤0.05)和PF-03084014(p≤0.01)处理细胞时，UCP1的蛋白表达显著上调(图4D和4E)。但是，当GSI的浓度从1μM提高至10μM时，表达水平的增强降低了大约50％，这可能归因于高剂量诱导的细胞毒性。还评估了脂肪形成标志物(诸如PPARγ和C/EBPα)的蛋白表达。发现四种GSI在所有浓度下均显著提高PPARγ的表达水平。在用所有浓度的RO4929097和LY3039478以及1μM的BMS-906024处理后，C/EBPα的表达显著上调(p≤0.005)。这些结果提示，GSI介导的Notch抑制促进脂肪形成和白色脂肪细胞的褐变。还注意到0.5μM的低浓度足以提高PPARγ的蛋白表达，但观察到1μM的更高浓度诱导UCP1的显著上调。

GSI在分化的3T3-L1细胞中促进UCP1的蛋白表达.已经证明，与UCP1的诱导相关的代谢速率的提高伴随着WAT中增强的线粒体生物发生和脂肪酸氧化。为了进一步证实GSI是否在细胞水平上增强UCP1的产热活性，通过免疫荧光染色研究了在用1μM的浓度的GSI处理后3T3-L1细胞中UCP1的表达。如图5中所示，在3T3-L1细胞的细胞质中检测到指示UCP1阳性染色的绿色荧光信号。在用DMSO处理的对照组中仅观察到很少的UCP1阳性脂肪细胞，而在用GSI处理细胞时，阳性脂肪细胞的数量增加。与RO4929097、PF-03084014和LY3039478相比，相同浓度下的BMS-906024在提高UCP1表达方面显示出最低的效率，这与图4D和4E中显示的蛋白印迹结果一致。总之，结果证明GSI可通过上调UCP1表达来诱导白色脂肪细胞的褐变。

讨论

Notch信号传导是一种进化上高度保守的途径，其在体内大多数器官和组织的正常发育过程中调节细胞-细胞通讯和细胞命运决定方面是重要的。已经报道了在组织稳态(诸如造血系统[18]、脉管系统[19]、骨骼肌[20]和脂肪组织[15])中需要Notch信号传导。尽管对调节脂肪形成的信号传导途径的了解已被认为是治疗肥胖症的基础，其中Notch信号传导的作用得到了各种研究组的表征[21][22]，但近来才发现其在调节脂肪细胞可塑性和米色脂肪细胞生物发生中的功能[15]。我们的研究发现Notch信号传导在小鼠中调节脂肪细胞产热以及白色脂肪细胞向米色脂肪细胞的转化中起到重要作用，因此影响身体能量代谢[15]。已经证明通过施用二苯并氮

对Notch信号传导的药理学抑制促进了WAT的广泛褐变。具体而言，褐变表型导致代谢有益效果，包括增强的能量消耗、葡萄糖耐量、胰岛素敏感度和对高脂肪饮食诱导的肥胖症的耐受力。但是，二苯并氮/>

目前仅用于研究，并且其在人中的作用尚未进行研究，这对将基础发现转变为临床实践构成挑战。这里，我们筛选了已经在1期临床试验中发现是相当安全的一系列GSI，并且目前正在对治疗癌症或阿尔茨海默病进行2或3期研究。系统地比较了它们对Notch信号传导途径的抑制和白色脂肪细胞褐变的诱导的影响。

我们发现，七种GSI中的四种，包括RO4929097、PF-03084014、LY3039478和BMS-906024，在1μM的浓度下在初始筛选中显著下调Notch下游靶基因Hes1的mRNA表达。GSI诱导的Notch信号传导的抑制活性方面的差异可能归因于变化的同工型特异性结合位点(isoform-specific binding site)和作用机制。通常，选择性同工型抑制被认为是具有降低的全身毒性的相对安全的治疗策略，另一方面，泛抑制剂(pan-inhibitor)可以表现出增强的抑制效率[23]。实际上，我们的结果显示，与其它泛Notch抑制剂相比，同工型特异性抑制剂，诸如BMS-708163和MK-0752，表现出Notch信号传导的相对适中的抑制作用。可能导致这些GSI之间差异的另一可能因素是阻断靶标的选择性。例如，一些化合物可能对Notch信号传导的γ-分泌酶裂解并非特异性的，而是同等地抑制许多其它γ-分泌酶底物(诸如β-淀粉样蛋白)的加工。综合阻断作用可以导致不同的药理学结果。在第二次筛选中进一步研究了三种梯度浓度的所选的四种化合物，即使在0.5μM的最低浓度下也实现了Notch的有效抑制。PF-03084014、LY3039478和BMS-906024表现出Notch的剂量依赖性抑制，而RO4929097在0.5至10μM的范围内没有表现出药物浓度和抑制活性之间明显的相关性。该结果表明RO4929097可能是非常有效的靶向Notch信号传导的GSI，并且抑制活性在0.5μM的浓度下可能已达到其阈值。先前，已经由Roche在人肿瘤来源的细胞中评估了RO4929097诱导的Notch的体外抑制活性[24]。他们发现，化合物处理导致在0.1μM处开始的剂量依赖性抑制，但当浓度分别高于0.5和1μM时，观察不到Hes1的蛋白和mRNA水平的进一步降低。

我们接下来测定了三种浓度的四种GSI在3T3-L1前脂肪细胞中的细胞毒性。我们发现，LY3039478对γ-分泌酶活性的抑制在所有使用的浓度下均对细胞活力没有显著影响。相反，用RO4929097、PF-03084014和BMS-906024进行处理，细胞活力以剂量依赖性方式降低。GSI的细胞毒性作用可能来自于细胞周期停滞和随后的凋亡性细胞死亡。先前的研究已经证明，用GSI处理可导致AKT磷酸化的显著降低，并且AKT的组成型活性形式阻断抑制剂介导的细胞周期停滞和凋亡性细胞死亡[25]。此外，GSI的细胞毒性是通过蛋白酶体活性的抑制来介导还是通过γ-分泌酶介导的Notch信号传导的加工来介导的问题也已成为若干研究的主题。例如，Han等人测定了GSI I在许多细胞系中的细胞毒性，但是用两种高度特异性的GSI处理不影响这些细胞的存活[26]。作者声称蛋白酶体活性的抑制是观察到的细胞毒性的主要原因。然而，关于GSI在与Notch信号传导无关的机制中的作用的若干问题仍有待解决。此外，为了以最小的细胞毒性实现GSI的增强的细胞内转运，开发临床可转移的Notch抑制药物递送系统可能是我们未来的方向之一[16][27]。

更重要的是，我们发现用GSI进行处理促进了3T3-L1前脂肪细胞的分化，并在转录和翻译水平上上调了脂肪形成标记基因。我们的结果得到了先前报道的数据的支持，所述数据显示Notch信号传导是3T3-L1前脂肪细胞的脂肪形成中的负调节物[28]。脂肪形成的过程涉及下调编码Hes1的基因，所述Hes1在脂肪细胞发育中作为抑制剂和激活剂发挥双重作用。但是，在3T3-L1前脂肪细胞中上调和下调基因的启动子分析已经证明Notch信号传导最有可能通过诱导Hes1同二聚体来抑制脂肪形成，所述Hes1同二聚体阻断靶基因的转录。此外，这种作用也可以通过将3T3-L1前脂肪细胞暴露于Notch配体Jagged1来实现，伴随PPARγ和C/EBPα的完全丧失[29]。这得到我们的研究中的发现的支持，即GSI即使在0.5μM的最低浓度下也有效诱导降低的Hes1的转录和提高的脂肪形成标记基因的表达。尽管PPARγ和C/EBPα是米色脂肪细胞产热程序的重要调节剂，但与它们协同的另外的转录组分，特别是PRDM16和PGCα，已经显示是激活米色脂肪选择性基因程序所必需的[30][31]。我们因此检查了线粒体相关和米色脂肪选择性基因的表达。结果表明，GSI诱导的Notch抑制上调了它们的表达水平，这与我们之前的发现一致，即Notch靶基因HES1直接结合PRDM16和PGCα的启动子区以抑制线粒体生物发生和米色脂肪形成的这两种主要调节物的转录[15]。

此外，我们测定了UCP1的表达，其长期被认为是通过解偶联细胞呼吸和线粒体ATP合成来刺激产热以及在脂肪转化的调节中起关键作用的关键蛋白[32][33]。在我们的研究中，当细胞与1μM的浓度的RO4929097、PF-03084014和LY3039478一起时，观察到UCP1的显著上调。与这三种化合物相比，BMS-906024对UCP1蛋白表达的提高的影响最小。值得关注是，当在用RO4929097和PF-03084014处理的组中使用10μM的更高浓度时，上调的UCP1的表达降低了大约50％。相反，高浓度的LY3039478，已显示比其它化合物更低的细胞毒性，不显著改变UCP1的蛋白表达。这些结果表明，米色脂肪形成的效率和白色脂肪细胞的褐变可能受高剂量GSI所诱导的细胞毒性影响。迄今为止的大多数研究使用10μM的浓度的GSI来体外诱导脂肪形成并研究Notch信号传导的作用[15][34]；但是，我们目前的发现证实了在相对低浓度下强效GSI的效率，并指出了选择足以实现药理学活性的最佳剂量的重要性，并将预期减轻与过量给药相关的毒性。

结论

在本研究中，我们已经证明，具有优化浓度的GSI的临床候选物对Notch信号传导的药理学抑制促进了3T3-L1前脂肪细胞中的米色脂肪形成和线粒体生物发生。这些发现不仅突出了GSI经由抑制γ-分泌酶介导的Notch信号传导的加工而在肥胖症和代谢疾病治疗中的交叉治疗应用的潜力，并且还提供了重要的实验证据以支持临床可转移的Notch抑制药物递送系统的进一步设计和开发。

实施例2：PLGA纳米颗粒的表征

各种负载γ-分泌酶抑制剂的PLGA NP的尺寸分布.测量各种负载γ-分泌酶抑制剂的PLGA NP的粒度分布。将配制的纳米颗粒(0.15mg)重新悬浮在1mL去离子水中，并使用DynaPro PlateReader-II测量尺寸分布。(图7A)RO4929097-PLGA NP；(图7B)PF-03084014-PLGA NP；(图7C)LY3039478-PLGA NP；和(图7D)BMS-906024-PLGA NP的尺寸分布显示在表3中。

表3：各种负载γ-分泌酶抑制剂的PLGA NP的尺寸分布

纳米颗粒	平均粒度(nm)
		RO4929097-PLGA	170±13
PF-03084014-PLGA	184±14
		LY3039478-PLGA	185±35
BMS-906024-PLGA	177±16

RO4929097-PLGA NP对Notch信号传导靶基因的作用.在5％ CO₂培养箱中在37℃下用DMSO、PLGA NP(0.1mg/mL)、DBZ(10μM)、RO4929097(1μM)或RO4929097-PLGA NP(0.1mg/mL)处理3T3-L1前脂肪细胞12小时。通过qRT-PCR分析Notch靶标Hes1mRNA表达(图8)。每个条是每组4至5次重复的平均值±SEM，并且数据通过单因素ANOVA和随后的Tukey's事后比较检验来分析。星号是指所示治疗组之间的统计学差异(*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001)。RO4929097-PLGA NP下调编码Hes-1的Notch信号传导靶基因，所述Hes-1参与脂肪细胞褐变的过程。

PLGA纳米颗粒的形态.通过TEM测定各种负载γ-分泌酶抑制剂的PLGA NP的形态。将0.1mg纳米颗粒与添加等浓度的蔗糖冷冻保护剂的混悬液一起在1mL蒸馏水中稀释，并使用FEI Tecnai G2 20TEM在200kV下拍摄透射电子显微镜(TEM)图像。TEM图像显示在图9A-9H中：在500nm(图9A)和200nm(图9B)处的RO4929097-PLGA NP；在500nm(图9C)和200nm(图9C)处的PF-03084014-PLGA NP；在500nm(图9E)和200nm(图9F)处的LY3039478-PLGA NP；以及在500nm(图9G)和200nm(图9H)处的BMS-906024-PLGA NP。

实施例3：可用于PLGA纳米颗粒制剂冻干过程的冷冻保护剂

冷冻干燥或冻干是储存胶体纳米颗粒和改善其长期稳定性的常用实践。但是，冷冻干燥过程可能导致纳米颗粒物理性质的改变，以及影响粒度、释放特性和稳健性，随后影响包封的有效负载释放和稳定性。

因此，作为冷冻保护剂的不同赋形剂如海藻糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、核糖、麦芽糖、甘露糖、右旋糖、山梨糖醇、甘氨酸、右旋糖酐、明胶、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)和气相二氧化硅将用于提高冷冻干燥过程中PLGA纳米颗粒制剂物理稳定性，以防止它们聚集并保护它们免受冰晶的机械应力。这些冷冻保护剂是重要的，因为它们影响玻璃化转变温度，这对于获得具有稳定的无定形形式、高的再分散速度、适当的残留水分含量和良好的货物保护以及储存时稳定的冻干饼是重要的。

缩写

BAT：褐色脂肪组织；C/EBP：CCAAT/增强子结合蛋白家族蛋白；CIDEA：细胞死亡诱导DNA片段化因子α样效应子A；COX5B：细胞色素c氧化酶亚基5B；DAPT：(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁基酯)；DIO2：2型脱碘酶；FABP4：脂肪酸结合蛋白4；GSI：γ-分泌酶抑制剂；NICD：Notch细胞内结构域；PPAR：过氧化物酶体增殖物激活受体家族蛋白；PPARGC1α：过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α；PRDM16：含PR结构域蛋白16；RBPJ：免疫球蛋白κJ区的重组信号结合蛋白；TMEM26：跨膜蛋白26；UCP1：解偶联蛋白1；WAT：白色脂肪组织；T2DM：2型糖尿病。

等同物

在上文的伴随描述中阐述了本公开的一个或多个实施方案的细节。尽管与本文中描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。本公开的其它特征、目的和优点将从描述和权利要求中显而易见。在说明书和所附权利要求中，单数形式包括复数对象，除非上下文另行明确指出。除非另行定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本说明书中引用的所有专利和出版物均通过引用并入。

前面的描述仅出于说明的目的而呈现，并且并非旨在将本公开限制于所公开的精确形式，而是由所附权利要求来限制。

本领域技术人员将认识到，可以对上述具体实施进行许多修改。实施不应限于所描述的特定限制。其它实施是可能的。

尽管在附图和前面的描述中详细地说明和描述了本公开，这些内容应被认为是说明性的而非限制性的，要理解的是，仅显示和描述了某些实施方案，并且期望保护落入本发明的精神的所有改变和修改。本发明的方法和设备的范围意在由以下权利要求来限定。但是，必须理解的是，在不脱离其精神或范围的情况下，本公开可以以不同于具体解释和说明的其它方式来实践。本领域技术人员应当理解的是，在不脱离以下权利要求中限定的精神和范围的情况下，可以在实践权利要求时采用本文中描述的实施方案的各种替代方案。

引用的参考文献(通过引用并入本文)

1.Smith KB,Smith MS.Obesity Statistics.Prim Care-Clin OffPract.Elsevier；2016；43:121–35.

2.Rosen ED,Spiegelman BM.Adipocytes as regulators of energy balanceand glucose homeostasis.Nature.Nature Publishing Group；2006；444:847–53.

3.Lshibashi J,Seale P.Beige can be slimming.Science(80-).AmericanAssociation for the Advancement of Science；2010；328:1113–4.

4.Wu J,

P,Sparks LM,Ye L,Choi JH,Giang AH等人,Beige adipocytesare a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.Cell.Elsevier；2012；150:366–76.

5.Artavanis-Tsakonas S,Rand MD,Lake RJ.Notch signaling:cell fatecontrol and signal integration in development.Science(80-).AmericanAssociation for the Advancement of Science；1999；284:770–6.

6.Luo D,Renault VM,Rando TA.The regulation of Notch signaling inmuscle stem cell activation and postnatal myogenesis.Semin Cell DevBiol.Elsevier；2005；16:612–22.

7.Urs S,Turner B,Tang Y,Rostama B,Small D,Liaw L.Effect of solubleJagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation anddifferentiation of an adipocyte progenitor cell model.Adipocyte.Taylor&Francis；2012；1:46–57.

8.Kadesch T.Notch signaling:The demise of elegant simplicity.CurrOpin Genet Dev.Elsevier；2004；14:506–12.

9.Schroeter EH,Kisslinger JA,Kopan R.Notch-1signalling requiresligand-induced proteolytic release of intracellular domain.Nature.NaturePublishing Group；1998；393:382–6.

10.Gregoire FM,Smas CM,Sul HS.Understanding adipocytedifferentiation.Physiol Rev.American Physiological Society Bethesda,MD；1998；78:783–809.

11.Lai PY,Tsai C Bin,Tseng MJ.Active form Notch4 promotes theproliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes.Biochem Biophys ResCommun.Elsevier；2013；430:1132–9.

12.Osathanon T,Subbalekha K,Sastravaha P,Pavasant P.Notch signallinginhibits the adipogenic differentiation of single-cell-derived mesenchymalstem cell clones isolated from human adipose tissue.Cell Biol Int.WileyOnline Library；2012；36:1161–70.

13.Woo HN,Park JS,Gwon AR,Arumugam T V.,Jo DG.Alzheimer’s disease andNotch signaling.Biochem Biophys Res Commun.Elsevier；2009；390:1093–7.

14.SpringWorks Therapeutics.无标题[互联网].2020.可获自:clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03785964

15.Bi P,Shan T,Liu W,Yue F,Yang X,Liang XR等人,Inhibition of Notchsignaling promotes browning of white adipose tissue and amelioratesobesity.Nat Med.2014；20:911–8.

16.Jiang C,Cano-Vega MA,Yue F,Kuang L,Narayanan N,Uzunalli G等人,Dibenzazepine-Loaded Nanoparticles Induce Local Browning of White AdiposeTissue to Counteract Obesity.Mol Ther[互联网].Elsevier Ltd.；2017；25:1718–29.可获自:http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.05.020

17.Wei P,Walls M,Qiu M,Ding R,Denlinger RH,Wong A等人,Evaluation ofselectiveγ-secretase inhibitor PF-03084014for its antitumor efficacy andgastrointestinal safety to guide optimal clinical trial design.Mol CancerTher.AACR；2010；9:1618–28.

18.Kelly A,Houston SA,Sherwood E,Casulli J,Travis MA.Regulation ofInnate and Adaptive Immunity by TGFβ.Adv Immunol.Nature Publishing Group；2017；134:137–233.

19.Gridley T.Notch signaling in the vasculature.Curr Top DevBiol.Elsevier；2010.p.277–309.

20.Mourikis P,Sambasivan R,Castel D,Rocheteau P,Bizzarro V,TajbakhshS.A critical requirement for notch signaling in maintenance of the quiescentskeletal muscle stem cell state.Stem Cells.Wiley Online Library；2012；30:243–52.

21.Garcés C,Ruiz-Hidalgo MJ,De Mora JF,Park C,Miele L,Goldstein J等人,Notch-1controls the expression of fatty acid-activated transcriptionfactors and is required for adipogenesis.J Biol Chem.ASBMB；1997；272:29729–34.

22.Song BQ,Chi Y,Li X,Du WJ,Han ZB,Tian JJ等人,Inhibition of NotchSignaling Promotes the Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem CellsThrough Autophagy Activation and PTEN-PI3K/AKT/mTOR Pathway.Cell PhysiolBiochem.Karger Publishers；2015；36:1991–2002.

23.Lonetti A,Cappellini A,SpartàAM,Chiarini F,Buontempo F,EvangelistiC等人,PI3K pan-inhibition impairs more efficiently proliferation and survivalof T-cell acute lymphoblastic leukemia cell lines when compared to isoform-selective PI3K inhibitors.Oncotarget.Impact Journals,LLC；2015；6:10399.

24.Luistro L,He W,Smith M,Packman K,Vilenchik M,Carvajal D等人,Preclinical profile of apotentγ-secretase inhibitor targeting notchsignaling with in vivo efficacy and pharmacodynamic properties.CancerRes.AACR；2009；69:7672–80.

25.Lee HW,Kim SJ,Choi IJ,Song J,Chun KH.Targeting Notch signaling byγ-secretase inhibitor I enhances the cytotoxic effect of 5-FU in gastriccancer.Clin Exp Metastasis.Springer；2015；32:593–603.

26.Han J,Ma I,Hendzel MJ,Allalunis-Turner J.The cytotoxicity ofγ-secretase inhibitor I to breast cancer cells is mediated by proteasomeinhibition,not byγ-secretase inhibition.Breast Cancer Res.Springer；2009；11:R57.

27.Huang D,Narayanan N,Cano-Vega MA,Jia Z,Ajuwon KM,Kuang S等人,Nanoparticle-Mediated Inhibition of Notch Signaling Promotes MitochondrialBiogenesis and Reduces Subcutaneous Adipose Tissue Expansion inPigs.iScience.Elsevier；2020；23:101167.

28.Ross DA,Rao PK,Kadesch T.Dual Roles for the Notch Target Gene Hes-1in the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes.Mol Cell Biol.Am SocMicrobiol；2004；24:3505–13.

29.Ross DA,Hannenhalli S,Tobias JW,Cooch N,Shiekhattar R,KadeschT.Functional analysis of Hes-1in preadipocytes.Mol Endocrinol.OxfordUniversity Press；2006；20:698–705.

30.Kajimura S,Seale P,Spiegelman BM.Transcriptional control of brownfat development.Cell Metab.Elsevier；2010；11:257–62.

31.Shapira SN,Seale P.Transcriptional Control of Brown and Beige FatDevelopment and Function.Obesity.Elsevier；2019；27:13–21.

32.Nedergaard J,Golozoubova V,Matthias A,Asadi A,Jacobsson A,CannonB.UCP1:The only protein able to mediate adaptive non-shivering thermogenesisand metabolic inefficiency.Biochim Biophys Acta-Bioenerg.Elsevier；2001；1504:82–106.

33.Shabalina IG,Petrovic N,deJong JMA,Kalinovich A V.,Cannon B,Nedergaard J.UCP1 in Brite/Beige adipose tissue mitochondria is functionallythermogenic.Cell Rep.Elsevier；2013；5:1196–203.

34.Huang Y,Yang X,Wu Y,Jing W,Cai X,Tang W等人,γ-secretase inhibitorinduces adipogenesis of adipose-derived stem cells by regulation of Notch andPPAR-γ.Cell Prolif.Wiley Online Library；2010；43:147–56.

<110> Purdue Research Foundation

<120> 用于治疗肥胖症和代谢紊乱的Notch信号传导抑制剂

<130> 69133-02

<150> US 63/055,410

<151> 2020-07-23

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Hes1

<400> 1

gcacagaaag tcatcaaagc c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Hes1反向

<400> 2

ttgatctggg tcatgcagtt g 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Fabp4

<400> 3

gatgcctttg tgggaacct 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Fabp4反向

<400> 4

ctgtcgtctg cggtgattt 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Ppargcl1α

<400> 5

agccgtgacc actgacaacg ag 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Ppargc1α反向

<400> 6

gctgcatggt tctgagtgct aag 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Cox5B

<400> 7

ttcaaggtta cttcgcggag t 21

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Cox5B反向

<400> 8

cgggactaga ttagggtctt cc 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Tmem26

<400> 9

gaaaccagta ttgcagcacc c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Tmem26反向

<400> 10

ccagaccggt tcacatacca 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Ucp1

<400> 11

aggcttccag taccattagg t 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Ucp1反向

<400> 12

ctgagtgagg caaagctgat tt 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Cidea

<400> 13

tgacattcat gggattgcag ac 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Cidea反向

<400> 14

ggccagttgt gatgactaag ac 22

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Prdm16

<400> 15

cagcacggtg aagccattc 19

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Prdm16反向

<400> 16

gcgtgcatcc gcttgtg 17

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Dio2

<400> 17

aattatgcct cggagaagac cg 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物Dio2反向

<400> 18

ggcagttgcc tagtgaaagg t 21

Claims

1.在有需要的受试者中提高白色脂肪组织的褐变的方法，其包括向所述受试者施用提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

2.治疗肥胖症，包括其合并症的方法，其包括向所述受试者施用提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

3.在有需要的受试者中治疗代谢紊乱的方法，其包括向所述受试者施用提高UCP-1的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

4.用于在有需要的受试者中提高白色脂肪组织的褐变的药物组合物，其包含提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

5.包含Notch抑制剂化合物或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，以及可生物降解聚合物的颗粒。

6.包含Notch抑制剂化合物或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，以及可生物降解聚合物的颗粒制剂。

7.包含γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，以及聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)的纳米颗粒制剂，其中所述纳米颗粒具有大约150nm至大约200nm的平均直径。

8.包含γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，以及聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)的微米颗粒制剂，其中所述微米颗粒具有大约50μm至大约150μm的平均直径。

9.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述受试者患有肥胖症或其合并症，或处于发展其的风险中。

10.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述受试者患有代谢紊乱，或处于发展其的风险中。

11.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述肥胖症的合并症和/或所述代谢紊乱选自2型糖尿病(T2DM)、胰岛素抵抗、前驱糖尿病、高脂血症、脂肪肝疾病，任选非酒精性脂肪肝炎(NASH)、心血管疾病、动脉粥样硬化、阻塞性睡眠呼吸暂停、哮喘和骨关节炎中的一种或多种。

12.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述受试者患有代谢综合征。

13.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述代谢综合征包含腹部肥胖症、高血压、高血糖，任选T2DM、高血清甘油三酯和低血清高密度脂蛋白(HDL)的任意组合。

14.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述受试者具有大约或至少大约25、30、35或40kg/m²的体重指数(BMI)。

15.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述受试者患有I级肥胖症(BMI为大约30-35kg/m²)、II级肥胖症(BMI为大约35-40kg/m²)、或III级肥胖症(BMI大于大约40kg/m²)。

16.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述受试者具有大约或至少大约100mg/dL的空腹血糖水平。

17.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述受试者具有大约100-125mg/dL(前驱糖尿病)、或大约126mg/dL或更高(糖尿病)的空腹血糖水平。

18.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述化合物是γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。

19.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述GSI是选自表1的化合物，或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。

20.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述化合物配制为微米颗粒或纳米颗粒。

21.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述化合物与可生物降解聚合物一起配制，并任选配制为基于可生物降解聚合物的纳米颗粒或微米颗粒，其任选由聚乳酸(PLA)、聚-D-L-乙交酯(PLG)、聚-D-L-丙交酯-共-乙交酯(PLGA)、聚已酸内酯(PCL)、聚(碳酸三亚甲基酯)(PTMC)、聚二氧六环酮(PDS)、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚(酸酐-共-酰亚胺)、聚(酸酐-酯)、聚氨酯、聚(癸二酸甘油酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAm)、聚(噁唑啉)、低聚(乙二醇)富马酸酯(OPF)、聚丙烯酰胺、合成聚(氨基酸)、聚磷腈、聚(磷酸酯)、聚(富马酸丙二醇酯)、胶原、聚磷腈、聚酸酐、聚(氨基酸)、聚羟基链烷酸酯、聚二氧六环酮(PDO)、多糖(任选地，透明质酸、壳聚糖、右旋糖酐、硫酸软骨素、海藻酸盐和/或纤维素)和/或聚氰基丙烯酸酯(PCA)构成。

22.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其包括在含有白色脂肪组织的部位处或邻近所述部位将所述化合物直接施用于所述受试者。

23.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其任选在白色脂肪组织中，相对于基线参照物或对照将UCP-1的表达提高到大约或至少大约2、5、10、50、100、500或1000倍。

24.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其相对于基线参照物或对照，在所述受试者中将白色脂肪组织的褐变提高了大约或至少大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％。

25.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其相对于基线参照物或对照，在所述受试者中将白色脂肪组织任选减少了大约或至少大约5、10、20、30、40或50％或更多。

26.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其相对于基线参照物或对照，在所述受试者中将体重任选减少了大约或至少大约5、10、20、30、40或50％或更多，或任选减少了大约或至少大约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100kg或更多。

27.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其在所述受试者中将体重指数(BMI)任选减少了大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20kg/m²。

28.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中在所述受试者中减少的体重和/或减少的BMI维持大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年或更多。

29.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其在所述受试者中改善葡萄糖稳态，任选地其中所述受试者患有前驱糖尿病或T2DM。

30.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其相对于基线参照物或对照，在所述受试者中将空腹血糖水平任选减少了大约或至少大约10、20、30、40或50％或更多，任选减少至大约或小于大约100mg/dL的水平。

31.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其相对于基线参照物或对照，在所述受试者中将葡萄糖耐量任选提高了大约或至少大约10、20、30、40或50％或更多，任选提高至大约或小于大约140mg/dL的水平，如在口服葡萄糖耐量试验中测得的那样。

32.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其在所述受试者中将预期寿命任选提高了大约或至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年或更多。

33.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述制剂是冻干前溶液。

34.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述制剂是冻干制剂。

35.前述权利要求任一项所述的方法、组合物、颗粒或制剂，其中所述制剂是重构溶液。

36.用于在有需要的受试者中提高白色脂肪组织的褐变的药物组合物，其包含提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

37.用于治疗肥胖症，包括其合并症和/或用于治疗代谢紊乱的药物组合物，其包含提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

38.组合物在制备用于在有需要的受试者中提高白色脂肪组织的褐变的药物中的用途，所述组合物包含提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

39.组合物在制备用于治疗肥胖症，包括其合并症和/或用于治疗代谢紊乱的药物中的用途，所述组合物包含提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达的Notch信号传导抑制剂化合物。

40.根据权利要求27-30任一项所述的药物组合物或用途，其中所述Notch信号传导抑制剂化合物是γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。

41.前述权利要求任一项所述的药物组合物或用途，其中所述GSI是选自表1的化合物，或其衍生物、前药或药学上可接受的盐。

42.用于治疗肥胖症，包括其合并症和/或用于治疗代谢紊乱的γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐，其中所述GSI提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达，并且所述GSI是下式I的丙二酰胺衍生物：

其中，

R¹是以下基团之一：

其中，

R²是低级烷基、低级炔基、-(CH₂)_n-O-低级烷基、-(CH₂)_n-S-低级烷基、-(CH₂)”-CN、-(CR’R”)，，-CF₃、-(CR’R”)”-CHF₂、-(CR’R”)_n-CH₂F、-(CH₂)_n-C(O)O-低级烷基、-(CH₂)_n-卤素，或是-(CH₂)_n-环烷基，其任选被一个或多个选自苯基、卤素和CF₃的取代基取代；

R⁵为氢、低级烷基、-(CH₂)_n-CF₃或-(CH₂)_n-环烷基；

R⁶为氢或卤素；

R为氢或低级烷基；

n为0、1、2、3或4；

43.包含γ-分泌酶抑制剂(GSI)或其衍生物、前药或药学上可接受的盐的药物组合物，其用于治疗肥胖症，包括其合并症和/或用于治疗代谢紊乱，其中所述GSI提高解偶联蛋白-1(UCP-1)的表达，并且所述GSI是下式I的丙二酰胺衍生物：

其中，

R¹是以下基团之一：

其中，

R’、R”独立于n且彼此独立地为氢、低级烷基、低级烷氧基、卤素或羟基；R³、R⁴彼此独立地为氢、低级烷基、低级烷氧基、苯基或卤素；

R⁵为氢、低级烷基、-(CH₂)_n-CF₃或-(CH₂)_n-环烷基；

R⁶为氢或卤素；R为氢或低级烷基；

n为0、1、2、3或4；包括其药学上合适的酸加成盐、光学纯对映异构体、外消旋物和非对映体混合物。