CN116234569A - 冠状病毒结合剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒学领域，更具体地涉及人畜共患冠状病毒领域。具体而言，本发明提供了对SARS‑冠状病毒的刺突蛋白受体结合结构域(RBD)特异的结合剂，更具体地，提供了对广泛存在于沙贝病毒(Sarbecovirus)及其突变体中，甚至更具体地存在于SARS‑Cov和SARS‑CoV‑2病毒中的RBD的表位特异的结合剂。更具体地，本发明涉及包含能够特异性结合和中和SARS‑冠状病毒的抗体的组合物。更具体地，本发明涉及包含单结构域抗体或特别是VHH的组合物，以及包含多价结合剂的组合物，该多价结合剂包含其IgG Fc融合物，特别是其VHH‑Fc融合物，甚至更具体地包含仅重链VHH72‑S56A‑IgG1‑Fc融合物，或包含其任何一种的任何人源化形式的组合物，并且能够特异性结合和中和SARS‑冠状病毒，特别是SARS‑Cov‑2病毒。所述组合物可用于诊断沙贝病毒，特别是SARS‑CoV‑2病毒，以及用于由沙贝病毒，特别是SARS‑冠状或SARS‑CoV‑2病毒，或其突变体感染引起的病症的预防性和/或治疗性处理。

Description

冠状病毒结合剂
技术领域
本发明涉及病毒学领域，更具体地涉及人畜共患冠状病毒领域。具体而言，本发明提供了对SARS-冠状病毒的刺突蛋白受体结合结构域(RBD)特异的结合剂，更具体地，提供了对广泛存在于沙贝病毒(Sarbecovirus)及其突变体中，甚至更具体地存在于SARS-Cov和SARS-CoV-2病毒中的RBD的表位特异的结合剂。更具体地，本发明涉及包含能够特异性结合和中和SARS-冠状病毒的抗体的组合物。更具体地，本发明涉及包含单结构域抗体或特别是VHH的组合物，以及包含多价结合剂的组合物，该多价结合剂包含其IgG Fc融合物，特别是其VHH-Fc融合物，甚至更具体地包含仅重链VHH72-S56A-IgG1-Fc融合物，或包含其任何一种的任何人源化形式的组合物，并且能够特异性结合和中和SARS-冠状病毒，特别是SARS-Cov-2病毒。所述组合物可用于诊断沙贝病毒，特别是SARS-CoV-2病毒，以及用于由沙贝病毒，特别是SARS-冠状或SARS-CoV-2病毒，或其突变体感染引起的病症的预防性和/或治疗性处理。
背景技术
冠状病毒科因存在于病毒表面的大刺突蛋白分子而得名，这种大刺突蛋白分子使病毒颗粒具有冠状形状。冠状病毒基因组是RNA病毒中最大的，该科已被分为至少三个主要属(α、β和γ)。因此，冠状病毒代表了多样化的大型包膜正链RNA病毒家族，其感染多种动物、多种脊椎动物和人类。冠状病毒的刺突(S)蛋白对于宿主受体结合以及随后病毒和宿主细胞膜的融合至关重要，有效地导致病毒核壳在宿主细胞胞质中释放53。四种可能来自人畜共患来源的冠状病毒在人类中流行：HCoV-NL63和HCoV-229E(α-冠状病毒)以及HCoV-OC43和HCoV-HKU1(β-冠状病毒)。由β-冠状病毒引起的严重呼吸道疾病包括由SARS-CoV-1引起的严重急性呼吸综合征病毒(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)，以及一种称为SARS-CoV-2的新型β-冠状病毒引起的严重的获得性肺炎。鉴于其与SARS-CoV-1的遗传关系，SARS-CoV-2是本世纪第三种人畜共患的人类冠状病毒(CoV)。与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染类似，在最严重的病例中，患者表现出病毒性肺炎的症状，包括发烧、呼吸困难和双侧肺浸润(Gralinski LE和Menachery VD等人(2020)病毒12,135)。
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)是COVID-19的病原体。SARS-CoV-2感染可以是无症状的，并且大多表现为轻度至中度严重的症状。然而，在大约10％的患者中，COVID-19进展到以呼吸困难和低氧血症为特征的更严重阶段，其可能进一步进展为急性呼吸窘迫，通常需要长期重症监护，并导致部分患者死亡。最有可能的是，由SARS-CoV-2病毒的先天识别引发的持续炎症，以及可能由来自无效免疫反应的抗体的免疫复合物引发的持续炎症76，导致了严重的疾病进展。
新型CoV(SARS-CoV-2病毒)从单个患者中分离出来，随后在另外16名患者中得到验证50-52。30.000个核苷酸的SARS-CoV-2基因组在创纪录的时间内被阐明(参见http://virological.org/t/novel-2019-coronavirus-genome/319(2020年1月19日访问))。
第一个可用的序列数据将新型人类病原体SARS-CoV-2置于冠状病毒科(Coronaviridae)的沙贝病毒(Sarbecovirus)亚属中，该亚属与SARS病毒相同。虽然SARS-CoV-2与SARS-CoV(B系)和MERS-CoV(C系)属于同一乙型冠状病毒属，但基因组分析显示SARS-CoV-2和SARS-CoV之间有更大的相似性，支持将其分类为B系成员(来自国际病毒分类委员会)。在其他乙型冠状病毒中，这种病毒的特征在于多碱基切割位点的独特组合，这是一种已知的增加致病性和传播性的独特特征。据报道，从中菊头蝠(Rhinolophus affinis)马蹄蝠身上采样的蝙蝠沙贝病毒Bat CoV RaTG13在几乎所有基因组区域都与SARS-CoV-2聚集在一起，基因组序列一致性约为96％，从SARS-CoV-2及其与RaTG13的相似性得出了结论，即COVID-19爆发起源于蝙蝠传播给人类。然而，蝙蝠与人类的一般生物学差异使得其他哺乳动物物种作为中间宿主成为可能，其中SARS-CoV-2获得了有效人类传播所需的部分或全部突变。疑似中间宿主之一马来亚穿山甲携带的冠状病毒在受体结合结构域与SARS-CoV-2具有高度相似性，其包含被认为促进与血管紧张素转换酶2(ACE2)受体结合的突变，并显示出97％的氨基酸序列相似性。SARS-CoV-1和-2都使用血管紧张素转换酶2(ACE2)作为人类细胞上的受体。SARS-CoV-2以比SARS-CoV-1更高的亲和力结合ACE223。
蝙蝠冠状病毒(RaTG13)的刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)也显示与SARS-CoV-2基因组的受体结合结构域高度相似，超过93％。另一方面，相对于SARS-CoV，在SARS-CoV-2的S基因序列中观察到显著差异，包括N-末端结构域中的三个短插入，受体结合基序中五个关键残基中的四个发生变化，并且在SARS-CoV-2刺突糖蛋白的S1/S2边界存在意想不到的弗林蛋白酶切割位点，从而将SARS-CoV-2与SARS-CoV和几种SARS相关的冠状病毒(SARSr-CoVs)区分开来(概述见75)。
COVID-19患者的严重肺部疾病似乎是由过度的炎症反应造成的。然而，由于即使是非人类灵长类动物也不能完全复制COVID-19，所以最初手头上的信息很少，也没有合适的动物模型来解决这一假设61。叙利亚仓鼠(金黄仓鼠)已被提议作为研究SARS-CoV诱导的致病性和免疫反应在加重肺部疾病中的作用的小动物模型。它们作为临床前模型的优越性目前有利于合理化和评估新型抗病毒药物或免疫调节剂治疗COVID-19患者的疗效。
抗体防止传染病。尽管预防性疫苗有望成为控制大流行病的基石，但此类疫苗仍将使很大一部分人口得不到充分保护。事实上，对冠状病毒的免疫可能是短暂的，而且对于季节性流感(人类的另一种主要呼吸道病毒)，疫苗有效性很少超过60％。特别是老年人，即在SARS-CoV-2感染后最容易罹患严重疾病的这部分人群，在接种疫苗时往往得不到有效保护。因此，即使在安全有效的疫苗问世之后，抑制甚至防止下呼吸道病毒复制的被动抗体免疫疗法也可能在拯救患病患者中发挥重要作用。在这些患者中，由于下呼吸道的炎症，从体循环进入支气管肺泡腔的免疫球蛋白增加，因此我们可以利用抗体的全身给药。当使用含有IgG Fc的抗体构建体时，这具有强大的优势，即通过FcRn介导的循环进入血液的此类抗体具有较长的天然循环半衰期。
尽管尚无定论抗体是否会加剧COVID-19中的炎症性疾病，但对于COVID-19疾病加重的患者而言，依靠纯粹的病毒中和作用机制，从而从抗体Fc结构域中设计出效应物功能可能是谨慎的。迄今为止的证据表明，补体激活，包括通过免疫复合物形成，是要避免的关键途径。例如，巨噬细胞上补体受体C5a的激活导致促炎细胞因子IL-6和TNF的产生，并且该途径的不受控制的激活可能导致细胞因子风暴。根据这一点，在患有急性呼吸窘迫的COVID-19患者中，抑制补体激活以及阻断IL-6受体信号可能是有益的，前提是根据患者的疾病阶段对其进行仔细分层。IgG Fc-LALA突变是钝化抗体Fc-介导的效应物功能的有效且充分验证的方法。这些突变消除了FcR介导的效应物功能，只有FcRI相互作用在体外仍可检测到，尽管它具有可能与生理无关的极高ED50。Fc-LALA分子的预期安全性也得到以下观察结果的支持，即针对所有四种登革热病毒血清型的中和人类单克隆抗体，引入的LALA突变避免了人类细胞的增强感染。残留的FcRI相互作用的痕迹可以通过Fc中额外的P329G突变(LALAPG)进一步去除。
冠状病毒的突变率低于其他RNA病毒，尤其是甲型流感病毒，并且由于与非结构蛋白nsp.14相关的3’-至-5’核糖核酸外切酶活性，病毒在宿主内的复制率较高。不过，自从出现了几种病毒突变体以来，严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)在全球的传播速度更快，感染可能性增加。由于SARS-CoV-2疫苗在历史上很短的时间内被开发和施用，因此无法预期它们对这些新型突变体的保护范围。为了对抗疾病，目前正在临床开发的许多抗体可能会提供替代治疗选择，这些选择可能会或可能不会覆盖未来的突变病毒。
因此，采用广泛中和分子的被动抗体免疫疗法来预防或抑制下呼吸道中的病毒复制，将在抢救COVID-19患者中发挥重要作用。事实上，患者早期产生足够滴度的中和抗体与避免发展成严重疾病相关77，早期施用重组中和抗体或存在于高滴度恢复期血浆中的中和抗体可以避免严重疾病78-80。与小分子药物相比，抗体和基于抗体Fc的融合的一个强大优势是它们通过FcRn介导的循环进入血液而具有较长的循环半衰期，即使在单次给药后也可以长期控制病毒复制3。
因此，仍然迫切需要对这种病毒有更多的了解，特别是在这种新型病毒的诊断、预防和/或治疗中，特别是其新型突变体，因为这种病毒现在已经在世界范围内传播。
发明内容
本发明提供了能够特异性结合SARS-冠状病毒(SARS-Cov或SARS-Cov-1)和SARS-CoV-2病毒的结合剂。更具体地，我们用严重急性呼吸综合征(SARS)和中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(CoV)的预融合稳定刺突(S)蛋白免疫美洲驼。这些S蛋白具有抗原多样性。我们分离了一种单结构域抗体，命名为SARS VHH-72(或在本文中进一步命名为“VHH-72”、“VHH72”、“VHH72-wt”、“亲本VHH72”、“WT-VHH”或“纳米抗体-72”(Nb72))，其有效中和SARS-CoV假型，因此能够预防该病毒的感染。令人惊讶的是，尽管存在抗原差异，但SARS VHH-72与SARS-CoV-2 S蛋白发生交叉反应，并且还中和了假型病毒。此外，共晶体结构分析显示，SARS-CoV和SARS-CoV-2交叉反应性单结构域抗体结合到刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)的保守表面，但阻止了该RBD结合到血管紧张素转换酶2(ACE2)，其为SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的已知受体。最近还报道了CR3022能够与纯化的重组2019-nCoV RBD结合，如通过ELISA和生物膜层干涉测量法测定的55。然而，CR3022并不与ACE2与SARS-CoV-2 RBD的结合竞争，而我们观察到ACE2和SARS VHH-72在与SARS RBD结合方面存在明显的竞争。此外，CR3022识别两个结构域中的环状肽，即肽ATSTGNYNYKYRYLRHGKLR和YTTTGIGYQPYRVVVLSFEL，它们具有共同的基序TXTGXXXXXYR，表明该抗体识别SARS CoV中的线性表位(专利申请US2008/0014204；注：在本申请中，CR3022被命名为CR03-022)。相反，SARS VHH-72与SARS CoV的RBD中明确定义的构象表位相互作用，与SARS-Cov-1的刺突蛋白的Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366、R426和Y494密切接触，如SEQID NO:24所示。所述表位对应于SARS-Cov-2的刺突蛋白的残基L368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508的表位，如SEQ ID NO:23所示。与本文所述的所述表位特异性结合的结合剂也特异性结合其他沙贝病毒的替代RBD结构域蛋白，如本文所示。
基于SARS-VHH72与SARS-CoV-1 RBD的共晶体结构，以及融合前构象23中SARS-CoV-2刺突的cryo-EM结构，设计了几种SARS-VHH72的变体，其具有优异的结合特性，例如改善的kon率和改善的koff率，和/或对SARC-CoV-2 RBD的更高亲和力，因此进一步增加了对SARS-CoV-2病毒的抗病毒潜力。具有优异结合和效力特征的VHH72的一种特定变体在本文中已被鉴定为VHH72-S56A变体(如SEQ ID NO:4中所示)，并被选择用于IgG Fc融合物的二价形式的进一步临床前开发，以便当作为Fc融合物给予受试者时，提供具有最佳效力、功效和生物物理性质的VHH72变体。所述与人IgG1Fc结构域融合的VHH72-S56A变体在假型测定中显示出增强的与SARS-CoV-1或SARS-CoV-2 S蛋白的中和效力，甚至在叙利亚仓鼠体内注射SARS-CoV-2后显示出中和效力和功效。
对VHH-72与SARS-CoV-1和/或SARS-CoV-2 RBD复合物的结合位点的分析表明，非常保守的残基与VHH结合，因此可能为其他冠状病毒提供交叉保护，并赋予对新的SARS-CoV-2突变变体的抗性。
为了增强病毒保护功效，本文设想了包含额外VHH的多价或多特异性分子，其中所述额外VHH或ISVD可以结合与VHH72相同的表位、重叠表位或不同的非竞争表位。在本申请中，描述了几种额外的方法以提供结合和/或竞争刺突蛋白上相同的保守RBD结合位点的额外VHH72家族成员和额外VHH家族，并且其中所述与VHH72相同家族或不同VHH家族的额外VHH在结合和中和特性方面得到进一步改善。
因此，在第一方面，本发明涉及一种结合剂，其通过至少经由来自SARS-Cov-1的刺突蛋白的残基Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366、R426和Y494，如SEQ ID NO:24中所述，或者可替换地，进一步经由如SEQ ID NO:24中所述的残基R426与其RBD结构域结合来识别冠状病毒SARS-Cov-1刺突蛋白。或者，结合剂可被定义为通过至少经由SARS-Cov-2的刺突蛋白的残基或残基L368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508与其RBD结构域结合来特异性识别冠状病毒SARS-Cov-2刺突蛋白，如SEQ ID NO:23中所示。另一实施方案涉及特异性结合冠状病毒刺突蛋白的结合剂，其以竞争模式与所述结合位点区域结合，所述结合剂特异性结合SARS-Cov-2的刺突蛋白的那些特异性残基L368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508，如SEQ ID NO:23中所示。具体地，所述竞争结合剂特异性结合包含SARS-Cov-2的刺突蛋白的残基L368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508的至少一部分的刺突蛋白上的表位，如SEQ ID NO:23所示，以提供重叠表位，更具体地，结合至少30％的残基，或至少50％的残基，或至少80％的残基，和/或具体地包括残基K378和/或F377。
在不同的实施方案中，所述结合剂可以是小分子、化学品、肽、化合物、肽模拟物、抗体、抗体模拟物、活性抗体片段、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或纳米抗体。
在一个实施方案中，所述结合剂特异性结合如本文所定义的刺突蛋白的RBD，特别涉及包含ISVD的多肽，所述ISVD包含根据以下结构的4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；例如，如VHH或纳米抗体中所示。在更具体的实施方案中，CDR定义为包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:111-119的CDR1，包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:120-130或SEQ ID NO:141的CDR2，以及包含SEQ ID NO:9或SEQID NO:131-140的CDR3。
一替代实施方案提供了所述结合剂，其中所述3个CDR选自如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:27-61或SEQ ID NO:92-105所示的那些CDR1、CDR2和CDR3区，其中所述CDR区可以根据Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia进行注释，如本文进一步定义。另一具体实施方案涉及本文所描述的所述结合剂，其中至少一种ISVD包含SEQ ID NO:1、4、27-61或SEQ ID NO:92-105，或从ISVD的整个长度考虑，与其具有至少90％氨基酸同一性的序列，并且其中CDR是相同的，或其任何一种的人源化变体。一具体实施方案涉及本文所述的结合剂，其中至少一种ISVD包含如SEQ ID NO:2、3、5、6或11中所述的人源化变体，或其进一步的变体。
在另一个实施方案中，如本文所述的结合剂包含连接至Fc结构域或融合至IgG Fc尾的ISVD，其可衍生自常规抗体结构或其变体，例如IgG、IgGl或IgG2 Fc结构域，或其变体。
另一实施方案涉及所述结合剂，其是多价或多特异性结合剂，可能具有一个或多个相同的或结合刺突蛋白上相同的不同表位的ISVD。在一具体实施方案中，结合剂包含二价ISVD，可能与Fc结构域融合。在另一具体实施方案中，所述二价ISVD可以包含SEQ ID NO:12，或其人源化变体。另一具体实施方案涉及本文所述的结合剂，其中所述ISVD以单价或多价形式融合到IgG Fc结构域，优选产生四价结合剂。
在一些实施方案中，如本文所述的所述结合剂包含二价ISVD-Fc结构域融合体，其中所述结合剂包含选自SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:22的序列，或其进一步的人源化变体，具有至少90％的同一性。在一具体实施方案中，本发明的结合剂由SEQ ID NO:22组成。
本发明的另一方面涉及一种编码如本文所述的任何结合剂的核酸分子。进一步的实施方案涉及包含编码本发明结合剂的所述核酸分子的重组载体。
本发明的另一方面涉及一种复合物，该复合物包含如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26中所述的SARS冠状病毒的受体结合结构域和特异性结合所述RBD的结合剂，如本文所述，更具体地，所述结合剂包含ISVD，该ISVD包含SEQ ID NO:1-6中的任一个。
再一方面涉及一种宿主细胞，其包含如本文所述的结合剂、核酸分子、重组载体或复合物。
另一方面涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的结合剂、核酸分子或重组载体，任选地包含载体、稀释剂或赋形剂。
又一方面涉及用作诊断的如本文所述的结合剂、核酸分子、重组载体或药物组合物。或用于体内成像的如本文所述的结合剂、核酸分子、重组载体或药物组合物。
本发明的其他方面涉及用作药物的如本文所述的结合剂、核酸分子、重组载体或药物组合物。
具体而言，本文所述的结合剂、核酸分子、重组载体或药物组合物被设想用于冠状病毒感染，更具体地β-冠状病毒感染，甚至更具体地，人畜共患沙贝病毒感染，例如SARS冠状病毒感染，例如SARS-CoV-2病毒感染或SARS-CoV-2突变病毒感染的受试者的预防性或治疗性处理，或用于COVID-19的治疗。预防性处理是指在患病或病毒感染之前给受试者施用结合剂。所述结合剂的预防性应用可以涉及以0.5mg/kg-25mg/kg、优选2mg/kg和20mg/kg之间的剂量进行治疗。另一实施方案涉及如本文所述的所述结合剂，其用于SARS冠状病毒感染的治疗性处理，更具体地用于治疗SARS Cov-2病毒感染。
在一具体实施方案中，SARS-CoV-2突变病毒感染是指在刺突蛋白中具有突变的SARS-CoV-2病毒，优选在RBD结构域中，甚至更优选包含N439K、S477N、E484K、N501Y和/或D614G的特异性突变，如SEQ ID NO:23所示。
一替代实施方案涉及本文所述的结合剂或药物组合物，其被设想用于对冠状病毒感染受试者的预防性或治疗性处理，所述处理包括施用0.5mg/kg-25mg/kg剂量的所述结合剂或药物组合物。更具体地说，可以设想静脉、腹腔、皮下、鼻内或通过吸入给药。
本发明的最后一个方面涉及本文所述的结合剂或其标记形式的用途，用于检测来自病毒的病毒颗粒或病毒刺突蛋白，所述病毒选自属于蝙蝠SARS相关沙贝病毒的进化枝1a、1b、2和/或3的病毒的组。更具体地，选自SARS-Cov-2、GD-Pangolin、RaTG13、WIV1、LYRa11、RsSHC014、Rs7327、SARS-CoV-1、Rs4231、Rs4084、Rp3、HKU3-1或BM48-31病毒的组。
附图说明
所描述的附图仅仅是示意性的，而非限制性的。在附图中，出于说明的目的，一些元件的尺寸可能被夸大并且没有按比例绘制。
图1 SARS VHH-72与SARS CoV S RBD结合，但不与SARS CoV S的N-末端结构域结合。
用100ng重组SARS-CoV S-2P蛋白(带foldon)(上)、SARS-CoV RBD(中)或SARS-CoVNTD(N-末端结构域，下)在4℃下包被微量滴定板(II型，F96 Maxisorp，Nuc)的孔过夜。用PBS中的5％的奶粉封闭包被的板。将指定VHH的稀释系列添加到孔中。通过依次将板与小鼠抗组氨酸标签抗体(MCA1396,Abd Serotec)和辣根过氧化物酶(HRP)连接的抗小鼠IgG(1/2000,NXA931,GE Healthcare)一起孵育来检测结合。洗涤后，将50μL TMB底物(四甲基联苯胺，BD OptETA)加入板中，并通过加入50μL 1M H2SO4终止反应。用iMark酶标仪(Bio Rad)测量450nM处的吸光度。
图2 SARS VHH-72与固定化的SARS冠状病毒RBD(上)、WIV1-CoV RBD(中)和2019-nCoV RBD(下)结合的表面等离子体共振(SPR)传感图。
图3 VHH72与SARS-Cov RBD结合的晶体结构。
A.SARS CoV RBD与SARS VHH-72(以蓝色示出)复合的晶体结构，揭示了表位-抗体结合部位相互作用。左上图示出了SARS VHH-72结合RBD的表位，该表位远离ACE2(SARS CoV受体)结合界面(以红色示出)。左下图是所标示的氨基酸之间相互作用的特写图像，例如SARS VHH-72中的Asp61和SARS CoV RBD中的Arg426之间的盐桥。右上描绘了与SARS CoVRBD结合的ACE2与SARS VHH-72和ACE2的CDR-远端框架之间的差异。B.序列变异映射到与SARS VHH-72复合的SARS CoV RBD晶体结构，说明构象表位的保守性。
图4 RBD-ACE2结合被VHH72阻断。
八隅体中和测定。图表描绘了配体/分析物。蓝色曲线示出了SARS RBD和ACE2之间的联系(在较低的紫色曲线中被VHH72阻断)。
图5 SARS-CoV和2019-nCoV的受体结合结构域的氨基酸序列的比对。
在SARS-CoV RBD中直接涉及与SARS-VHH-72相互作用的残基用下划线标出。2019-nCoV RBD中带下划线的残基与SARS RBD中直接参与与SARS VHH-72相互作用的相应残基相同。2019-nCoV RBD中粗体的氨基酸残基不同于SARS-CoV RBD中涉及与SARS VHH-72直接相互作用的相应氨基酸残基。
图6 VHH-72阻止ACE2与SARS-CoV(SARS-CoV RBD)和2019-nCoV(2019-nCoV RBD-SD1)的RBD结合。
基于八隅体的竞争分析。该图示出了在存在VHH-55(MERS RBD特异性)和VHH-72(SARS-CoV RBD和2019-nCoV RBD特异性)的情况下，RBD与其各自受体的关联。
图7 VSV-冠状病毒刺突假型中和测定。
在使用VHH-72(nb72)、VHH-55(nb55)、GFP结合蛋白(GBP＝结合GFP的纳米抗体)或与人IgG1 Fc融合的VHH-72(nb72Fc)的假型中和测定中，使用水疱性口炎病毒(VSV)报道病毒，其编码萤火虫荧光素酶并用2019-nCoV、SARS-CoV或MERS-CoV的刺突蛋白(如以上各图所示)假型化。还包括来自用于分离VHH的免疫美洲驼的免疫前和免疫后血清。A-C.将VSV假型与来自HEK293细胞的细胞上清液的系列稀释液预孵育30分钟，所述HEK 293细胞用用于分泌GBP或nb72Fc的表达构建体瞬时转染。VSV假型也与美洲驼免疫前或免疫后血清的系列稀释液或与指定的PBS预孵育30分钟。D-F.将VSV假型与纯化的VHH-72或VHH-55的系列稀释液或指定的PBS预孵育30分钟。孵育后，将假型样品转移至单层VeroE6细胞，接种于96孔微量滴定板的孔中。在37℃孵育16小时后，去除上清液，用100微升裂解缓冲液裂解细胞。然后将10微升裂解物与荧光素底物和荧光素酶缓冲液混合，并在Promega Glomax多板读数器中测量荧光素酶信号(RLU)。数据点描绘了测量的发光信号。NI：未感染。
图8用VHH72-Fc抗体或人血浆预防性处理后仓鼠肺中的病毒RNA水平。
(A)SARS-CoV-2接种时间表的示意图。用2×106的第6代SARS-CoV-2(BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020)鼻内接种WT仓鼠品系。在接种后的指定天数(d.p.i.)，收集器官和血液以确定病毒RNA水平。(B)用纯化的VHH72-Fc结合剂或恢复期SARS-CoV-2血浆处理后仓鼠的病毒RNA水平。仓鼠或者未经处理(IC，感染对照，n＝5)，或者用二价VHH72-Fc抗体(VHH-72-Fc，n＝4)、恢复期血浆(2号患者，n＝4)或阴性对照血浆(3号患者NC，阴性对照，n＝4)处理，并在接种后的第4天处死。测定肺中的病毒RNA水平，根据β-肌动蛋白进行归一化，并使用2(-ΔΔCq)方法计算与IC平均值相比的倍数变化。显示的数据是平均值±SEM。通过非参数双尾Mann-Whitney U检验计算组间的统计显著性(ns P>0.05，*P<0.05)。
图9 VHH72与SARS-CoV-2刺突蛋白RBD结构域复合的模型。
VHH72在右上角；RBD在底部。
图10放大VHH72-S56A/RBD模型的S56A附近。
VHH72在右上角，RBD在底部，如图9所示。VHH72的S56A、W52a、V100、V100a；以及RBD的Y369、F377和P384用棒状表示。尽管S56的OH基团位于RBD的小凹陷中，该凹陷显然是极性的(附近存在来自L368、Y369、S371和F374的骨架羰基，未示出)，但是选择该S56A突变体是因为其与RBD的Y369相对接近，我们怀疑其处于“向上”构象位置，与在许多SARS-RBD晶体结构中观察到的“向下”位置形成对比。在体外观察到改进的结合后，随后的分子动力学运行(使用带有Amber的Gromacs)反而出人意料地表明S56A与VHH72的V100和V100a以及RBD的Y369和F377发生疏水相互作用。
图11放大VHH72-T60W/RBD模型的T60W附近。
VHH72在右上角，RBD在底部，如图9所示。VHH72的T60W、F47、Y58；以及RBD的D437、V503和Y508用棒状表示。
图12含有表达不同VHH-IgG Fc融合构建体的毕赤酵母培养物上清液的SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色。
每个样品泳道表达的构建体如图所示。
图13含有表达不同VHH-IgG Fc融合构建体的毕赤酵母培养物上清液的SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色。
每个样品泳道表达的构建体如图所示。
图14含有表达不同VHH-IgG Fc融合构建体的毕赤酵母培养物上清液的SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色。
每个样品泳道表达的构建体如图所示。
图15含有表达不同VHH-IgG Fc融合构建体的HEK293-S培养物上清液的SDS-PAGE凝胶的考马斯蓝染色。
每个样品泳道表达的构建体如图所示。
图16来自含有表达不同VHH-IgG Fc融合构建体的HEK293-S培养物上清液的SDS-PAGE样品的蛋白质印迹图像。
每个样品泳道表达的构建体如图所示，如图15中的SDS-PAGE所示。左图中使用的抗体特异性结合VHH，右图中使用的抗体特异性结合抗体的人Fc部分。
图17由BLI测定VHH72-Fc与固定化SARS-CoV-2 RBD的结合。
测试的两种不同接头(没有或具有额外的(GGGGS)x2接头的hIgG1铰链)的结合和解离率相当。
图18由BLI测定的VHH72-Fc与固定化SARS-CoV-2 RBD的结合。
与亲本VHH72相比，VHH72-T60W变体具有改进的结合性，而VHH72-W52aH结合性较差。
图19由BLI测定VHH72-Fc与固定化SARS-CoV-2 RBD的结合。
VHH72-D61Q和VHH72-V100L变体与亲本VHH72结合的比较。
图20由BLI测定VHH72-Fc与固定化SARS-CoV-2 RBD的结合。
与亲本VHH72相比，变体VHH72-S56A具有较慢的解离速率。
图21由BLI测定VHH72-Fc与固定化SARS-CoV-2 RBD的结合。
基于BLI测量计算的VHH72-Fc亲本和VHH72-Fc变体的解离常数。
图22由BLI测定VHH72-Fc与固定化SARS-CoV-2 RBD的结合。
图23 SARS VHH-72变体与表达SARS-CoV(灰色)或SARS-CoV-2(黑色)刺突蛋白的细胞的结合。
柱代表GFP表达细胞(GFP+)的AF633平均荧光强度(MFI)除以GFP阴性细胞(GFP-)的MFI。
图24 VHH72和VHH72(S56A)与SARS-CoV-2 RBD上的保守表位结合。
a.RBD作为表面视图，VHH72表位以黄色表示，PDBePISA1预测其残基368-379、381-385、404、405、407、408、435-437、503、504和508。右图：由FastContact计算，从30个分子动力学快照中取平均值。RBD为表面视图，表位由FastContact2,3计算的每个残基的静电加去溶剂自由能阈值(kcal/mol)表示。该表位示出了由Lys378和Phe377组成的突出热点。红色：-9.8(K378)；橙色：-4.27(F377)；黄色：-2.21/-0.96(Y369、A372、S375、T376、C379、V407、R408、Y508)；绿色：-0.71/-0.30(S371、F374、P384、K386、W436、N437、V503)；蓝色：-0.27/-0.13(L368、S373、T385、R403、A411、Q414、N439、N501、G502、G504、Y505)。b.VHH72在SARS-CoV-2融合前刺突蛋白上的位置。VHH72(彩虹卡通，C末端为红色球体，左上)位于链C(洋红卡通，右上)的RBD上，来自其u1S2q四重突变体(A570L，T572I，F855Y，N856I)结构pdb-entry6x2b4中刺突的2-RBDs‘向上(up)’状态。VHH72-Fc构建体很小，侧向结合，并且其C末端指向外侧很远，可以很容易地跟随刺突蛋白上“向上”RBD的广泛移动。c.VHH72的表位在SARS-CoV-2刺突前融合蛋白的RBD封闭状态下被封闭。完整的野生型SARS-CoV-2融合前封闭状态刺突三聚体pdb-entry 6xr85的顶点视图，仅示出三个RBD。链A，灰色表面；链B，青色卡通；链C，洋红卡通。根据PDBePISA的VHH72表位用黄色表示，Lys378和Phe377热点用红色和橙色表示。d.与SARS-CoV-1 RBD(下)PDB条目6WAQ(链D)的复合物中的VHH72(上)与SARS-CoV-2 RBD(从I-TASSER服务器3获得的模型)的[vhh 72-S56A结合的同源性模型]的比较，放大到VHH72Ser56附近的区域。VHH72的残基Ser52、Trp52a、Ser53、Ser56和Val100，SARS-CoV-1 RBD的残基Tyr352、Tyr356、Asn357、Ser358、Thr359(该NXT序列带有N-聚糖，未示出)和Ala371，以及SARS-CoV-2 RBD残基Tyr365、Tyr369、Asn370、Ser371、Ala372(无NXT)和Pro384用棒状显示。左：VHH72/SARS-CoV-1 RBD。Tyr356和Tyr352在RBD的凹槽状凹陷中指向下方。右:VHH72/SARS-CoV-2 RBD。在这个I-TASSER RBD模型中，相应的Tyr356和Tyr369指向向上。由于附近的SARS-CoV-2 RBD中的Pro384(SARS-CoV-1 RBD中的Ala371)，Tyr369向上构象似乎是优选。然后，Tyr369驻留在VHH72的小腔中，并被Ser52、Trp52a、Ser53、Ser56和Val100包围。VHH72 Ser56的羟基朝向SARS-CoV-2RBDTyr369的芳香基团的中心。使用Pymol(Pymol分子图形系统,开源版本2.3.，薛定谔有限责任公司)制备的图。
图25单价人源化VHH72_S56A与SARS-CoV RBD结合亲和力测定。
a.与来自Sars-CoV-1和Sars-CoV-2的单体RBD结合的不同VHH72变体的BLI传感图。VHH72变体与Sars-CoV-2 RBD(通过Avi-tag的生物素化)在1:1相互作用中的KD值。b.为了评估VHH72变体在1:1相互作用中的亲和力，在BLI中评估单价亲和力优化的变体VHH72(S56A进入h1，然后进入h2)的动力学结合常数KD，比较与单体SARS-CoV-2 RBD蛋白和二聚体SARS-CoV-2 RBD-Fc-融合体的结合。作为参考，包括人源化VHH72 h1。VHH的浓度范围在100nM和1.56nM之间，结果根据1:1相互作用进行拟合。
图26单价VHH72_S56A结合和中和活性。
a.流式细胞术分析VHH72WT、VHH72S56A和作为对照的GBP与293T细胞的结合，所述293T细胞用GFP表达载体和SARS-CoV-2表达载体瞬时转染。使用小鼠单克隆抗HIS抗体和AF647缀合的驴抗小鼠IgG抗体检测HIS标记的VHH的结合。Y轴：GFP阳性细胞的AF647荧光的中值荧光强度(MFI)除以GFP阴性细胞的MFI。b.在不同浓度的VHH-72(moWT)、VHH-72S56A(moS56A)或GBP存在下，重组SARS-CoV-2 RBD-Fc融合蛋白与VeroE6细胞结合的流式细胞术分析。还包括PBS和无RBD作为对照。使用AF488缀合的驴抗小鼠IgG抗体检测与SARS-CoV-2RBD-Fc结合的细胞。该图示出了SARS-CoV-2 RBD-Fc结合的VeroE6细胞的平均值±标准差(n＝3)百分比。c.SARS-CoV-2刺突假型GFP报告水泡性口炎病毒(VSV)中和测定。在感染VeroE6细胞单层之前，将VHH-72h1、VHH-72h1-S56A或GBP以X轴所示的浓度加入VSV报告病毒中。19小时后测量细胞的GFP荧光。NI：未感染。该图示出了平均值±标准差(n＝4)GFPMFI。d.示出了VHH72-h1和VHH72-h1(S56A)与固定化SARS-CoV-1 RBD结合的ELISA。GBP＝GFP结合蛋白＝对绿色荧光蛋白有特异性的VHH。使用hrp缀合的兔抗VHH单克隆抗体检测VHH的结合。该图示出了450nm处外径的平均值±标准差(n＝3).e.SARS-CoV-1刺突假型GFP报告水泡性口炎病毒(VSV)中和测定。在感染VeroE6细胞单层之前，将VHH-72h1、VHH-72h1-S56A或GBP以X轴所示的浓度加入VSV报告病毒中。19小时后测量细胞的GFP荧光。NI：未感染。该图示出了平均值±标准差(n＝4)GFP MFI。
图27 VHH72_S56A-Fc构建体增加了对SARS-CoV-2刺突蛋白的亲和力。
a.证明与所示VHH-72-Fc构建体的固定化SARS-CoV-2刺突结合的ELISA。Syn＝synagis。使用hrp缀合的兔抗人IgG抗体检测VHH-Fc构建体的结合。该图示出了450nm处外径的平均值±标准差(n＝2).b.证明与所示VHH-72-Fc构建体的固定化SARS-CoV-2 RBD-鼠Fc融合蛋白的结合的ELISA。Syn＝synagis。该图示出了450nm处外径的平均值±标准差(n＝2).c和d.评估了表达HEK293T的SARS-CoV-2刺突糖蛋白的VHH72_h1(E1D，S56A)_10GS_FchIgG1 LALA(PB9683；SEQ ID NO:22)和VHH72_h1(E1D，S56A)_10GS_Fc hIgG1(d中的PB9587)的结合效率。通过将HEK293T细胞系与测试抗体(1.22–5000ng/mL，4倍稀释)或hIgG1同型对照(312.5–5000ng/mL)孵育，然后进行抗人IgG PE缀合的二级抗体染色，来确定结合。通过流式细胞仪分析未染色和染色的细胞。数据示出为技术复制的中值荧光强度(MFI)和％PE结合细胞+/-SEM。应用非线性四参数曲线拟合以尽可能生成最佳拟合曲线并计算MFI的EC50。e.VHH72_h1(E1D，S56A)-FchIgG1 LALA(PB9683)与重组SARS-CoV-2 RBD-SD1-hFc糖蛋白的结合效率。用30ng重组SARS-CoV-2 RBD-SD1-hFc在4℃下将微量滴定板(II型，F96 Maxisorp，Nuc)的孔包被过夜。用含3％ BSA的PBS封闭包被的板。将VHH的稀释系列添加到孔中。洗涤后，将连续稀释的单克隆抗体加入孔中，室温下孵育1小时。通过与HRP缀合的兔抗骆驼VHH monoRAB抗体96A3F5(A01861-200，GenScript，1:5000稀释)孵育平板来检测结合。洗涤后，将50μL TMB底物(四甲基联苯胺，BD OptETA)加入板中，并通过加入50μL 1M H2SO4终止反应。用iMark酶标仪(Bio Rad)测量450nM处的吸光度。使用非线性回归(Graphpad 8.0)进行曲线拟合。f.VHH72_h1(E1D，S56A)-Fc hIgG1 LALA(PB9683)对单价VHH72_h1(E1D，S56A)序列优化(SO)与重组SARS-CoV-2 RBD糖蛋白结合的竞争。
图28中和用SARS-CoV-1和-2刺突假型化的VSV。
a.水泡性口炎病毒(VSV)GFP报告病毒用SARS-CoV-1刺突中和测定假型化。在感染VeroE6细胞单层之前，将所示VHH-Fc构建体的系列稀释液以X轴所示的浓度加入到VSV报道病毒中。19小时后测量细胞的GFP荧光。该图示出了归一化GFP MFI的平均值±标准差(n＝3)。D72-2:VHH72-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc,D72-16:VHH72_h1-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc,D72-22:VHH72_h1_S56A-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc,D72-15:VHH72-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc_LALAPG,D72-17:VHH72_h1-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc_LALAPG,D72-23:VHH72_h1_S56A-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc_LALAPG.b-d.VSV SARS-CoV-2刺突假型病毒中和测定，使用VHH72_h1(E1D，S56A)_10GS_Fc hIgG1 LALA(PB9683)、VHH72_h1(E1D，S56A)_10GS_IgG1_LALAPG(PB9590)、VHH72_h1(E1D，S56A)_10GS_IgG4_FALA(PB9677)、VHH72_h1(E1D，S56A)_10GS_IgG1(PB9587)进行测试，并包括原始野生型VHH72-Fc作为参考10。GFP读数，归一化。
图29 SARS-CoV-2噬斑减少中和测定。
用所示VHH-Fc融合构建体的3倍系列稀释液进行SARS-CoV-2噬斑减少中和测定。将大约70个SARS-CoV-2的噬斑形成单位在37摄氏度下孵育1小时，然后转移到24孔板的孔中铺满的VeroE6细胞单层中。用甲基纤维素覆盖细胞并在37摄氏度下孵育72小时。除去覆盖层，用3.7％多聚甲醛固定细胞，并用0.5％结晶紫染色。图中的数据点代表噬斑的数量，代表一个重复一次的实验。PB9682和VHH23-Fc是阴性对照的VHH-Fc融合体。
图30 ACE2竞争测定。
左：通过流式细胞术测定的SARS-CoV-2 RBD-mFc蛋白与在VeroE6细胞上表达的ACE-2结合的抑制作用。VHH72_h1(E1D)_S56A-10GS-hIgG1Fc_LALAPG(D72-52；与PB9683相比的PG突变体)示出了ACE2的竞争性，其IC50为198.6ng/mL，而原型VHH72-Fc IC50为505ng/mL。
右：用重组人ACE2-mFc蛋白与通过Avi-tag生物素化的SARS-CoV-2 RBD蛋白结合，在竞争Alphascreen中评估ACE2与SARS-CoV-2 RBD结构域结合的竞争性。在此测定设置中，VHH72_h1(E1D)S56A-10GS-hIgG1Fc_LALA(PB9683)的IC50为15.4ng/mL(186pM)。在该测定中，原型VHH72-Fc示出了IC50为34ng/mL。
图31四价VHH72-Fc增加了对SARS-CoV-2 RBD的亲和力。
a.生物膜层干涉技术(BLI)传感图测量VHH72_h1_hFc、(VHH72_h1)2_hFc、VHH72_h1_E1D_S56A-hFc_EPKC-LALAPG-K和四价(VHH72_h1_E1D_S56A)2-hFc_EPKC-LALAPG-K与固定化SARS-CoV-2 RBD-mFc的表观结合亲和力。黑线代表减去双参考的数据，数据与1:1结合曲线的拟合为红色。b.用所示VHH-Fc融合构建体的3倍系列稀释液进行SARS-CoV-2噬斑减少中和测定。将大约70个SARS-CoV-2的噬斑形成单位在37摄氏度下孵育1小时，然后转移到24孔板的孔中铺满的VeroE6细胞单层中。用甲基纤维素覆盖细胞并在37摄氏度下孵育72小时。除去覆盖层，用3.7％多聚甲醛固定细胞，并用0.5％结晶紫染色。图中的数据点代表噬斑的数量，代表一个重复一次的实验。批次D72-52对应于构建体：VHH72_h1(E1D,S56A)-10GS-hIgG1Fc_LALAPG，批次D72-55对应于四价对应物：VHH72_h3_S56A-(G4S)3-VHH72_h3_S56A-GS-hIgG1Fc_LALAPG。
图32 SARS-CoV-2噬斑减少中和测定。
按照图29所述进行测定。本文比较的构建体揭示了E1D修饰，结合人IgG1铰链的截断和C-末端赖氨酸残基的缺失，不影响VHH72-Fc对RBD的亲和力和SARS-CoV-2中和活性。
图33 SARS-CoV-2活病毒测定中的中和活性。
含有hIgG1_LALAPG Fc的D72-51(VHH72_h1(E1D)S56A-10GS-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALAPG)和D72-52(VHH72_h1(E1D)_S56A-10GS-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALAPG_Kdel)的PRNT50分别为164.8ng/mL和163.9ng/mL。
图34预防性施用二价或四价(VHH-VHH72-Fc)形式的VHH72-Fc构建体可保护叙利亚仓鼠免受SARS-CoV-2病毒复制。
在用第6代BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020的2.4x106TCID50攻击前24小时，用20mg/kg剂量的二价D72-23和四价D72-13 VNN-Fc通过腹腔注射对金黄叙利亚仓鼠进行处理。对照组动物接受20mg/kg的Synagis(每组n＝6)。通过RT-qPCR在感染后第4天采集的肺、回肠和粪便组织中测定基因组SARS-CoV-2 RNA拷贝。b.肺部的传染性病毒载量(感染后第4天)。c.在攻击后第4天，通过显微CT扫描评估肺损伤和扩张支气管的严重程度评分。TCID50＝50％组织培养感染剂量。使用非参数Mann Whitney U-检验进行统计分析。**P<0.005，***P<0.001。虚线表示检测下限(LOD)。
图35预防性施用4mg/kg二价VHH72-Fc保护仓鼠免受SARS-CoV-2感染。
A、研究大纲。金黄叙利亚仓鼠在攻击前一天通过腹腔注射以4或20mg/kg接受二价D72-23(VHH72_S56A-Fc(LALAPG))(n＝5)。对照组动物以20mg/kg(n＝6)的剂量接受Synagis。使用第6代BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020的2.4x106TCID50进行鼻内攻击。B、在攻击后第4天的样品中，通过qPCR测定肺、回肠和粪便样品中的病毒基因组RNA拷贝，通过滴定测定肺和鼻拭子中的传染性病毒。两只接受20mg/kg D72-23并在肺部和鼻拭子中显示出高病毒载量的仓鼠没有暴露于VHH72-23。C、通过免疫组织化学分析评估的累积肺组织病理学评分(第4天)。
图36 VHH72-Fc的治疗性给药保护仓鼠免受SARS-CoV-2攻击感染。
用D72-52/PB9590和D72-55/PB9589(7或1mg/kg)或对照Ab Synagis(7mg/kg)进行预防性(感染后第1天)或治疗性(感染后第1天)IP处理后，叙利亚仓鼠肺中的传染性SARS-CoV-2。使用BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020(p6)的2.4x106TCID50完成攻击。A、研究大纲。B、肺部感染性SARS-CoV-2颗粒，以及在第4天收集的肺部、髂骨和粪便样本中的基因组SARS-CoV-2 RNA拷贝。C、通过免疫组织化学评估的第4天肺的组织病理学分析(左图)，示出了累积肺损伤评分。中间和右图：通过显微CT分析评估的一般肺损伤和支气管图像评分。使用非参数Mann Whitney U-检验进行统计分析。:****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。虚线表示检测下限(LOD)。
图37 VHH72-Fc的治疗性给药保护仓鼠免受上呼吸道和下呼吸道SARS-CoV-2感染的效果。
在用D72-52/PB9590和D72-55/PB9589(20、7或2mg/kg)或对照Ab Synagis(20mg/kg)进行治疗性IP处理，或以20mg/kg进行D72-52预防性处理后，在叙利亚仓鼠中的抗病毒功效。使用BetaCov/Belgium/BavPat1/2020(p3)的1x104TCID50完成攻击。
A：研究大纲；C：肺病理学，通过肉眼可见的损伤对受影响的肺区域的百分比进行评分。与对照组相比，观察到7mg/kg剂量组的肉眼可见病变显著减少。D-E：不同治疗组的体重随时间的减少和在终点第4天的减少百分比。与对照组相比，没有观察到治疗对体重减轻的显著影响，动物之间的差异很大。B、F-I：上呼吸道和下呼吸道样本中的病毒载量，通过qPCR和传染性SARS-CoV-2病毒滴定分析病毒基因组RNA拷贝。B+F)肺，G)支气管肺泡灌洗液(BALF)，H)鼻甲，I)第1天和第2天的咽拭子，J)咽喉传染性病毒与第4天肺部的相关性。测定的LLOD取决于组织样本的重量，如虚线所示。BALF的体积是每只动物1mL。TCID50＝50％组织培养感染剂量。使用非参数Mann Whitney U-检验进行统计分析。****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。
图38叙利亚仓鼠的药代动力学特征。
健康雄性仓鼠(体重范围为90-108g)腹腔(IP)和静脉(IV)单剂量给药5mg/kg后，VHH72_h1(E1D，S56A)_10GS_Fc hIgG1 LALA(D72-53,PB9683)的血清暴露时间。每组使用12只动物，每只动物在3个时间点取样(每个时间点n＝4)。样品生物分析在竞争AlphaLISA中进行(动态范围为1.2-142.5μg/mL)。
图39带有CDR注释的VHH72_S56A和人源化VHH72_S56A序列。
根据Kabat的氨基酸编号。根据MacCallum、AbM、Chothia、Kabat和IMGT的CDR注释，在对应于VHH72_S56A(SEQ ID NO:4)和VHH72_h1(E1D，S56A)(SEQ ID NO:6)序列的灰色标签框中。FR中的人源化替换以粗体显示；CDR替代S56A以红色粗体显示。
图40用D72-53(PB9683)进行的治疗性和预防性处理保护仓鼠免受SARS-CoV-2感染。
A：在用D72-53(批号PB9683)(7或2mg/kg)或对照Ab Synagis(7mg/kg)进行预防性(接种后第-1天)或治疗性(接种后第1天)IP处理疗后，叙利亚仓鼠肺中的传染性SARS-CoV-2颗粒。B：具有D72-53(PB9683)或对照抗体的叙利亚仓鼠肺中的基因组SARS-CoV-2 RNA拷贝。C：仓鼠肺部的组织病理学分析，显示累积肺损伤评分。使用非参数Mann Whitney U-检验进行统计分析。:****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05。虚线表示检测下限(LOD)。异常值由不同的符号表示。预防性7mg/kg组的一只动物血清中没有可检测到的药物水平，表明它没有接触药物。
图41用D72-53(PB9683)进行的治疗性和预防性处理保护仓鼠免受SARS-CoV-2感染。
左：用D72-53(PB9683)、D72-58(VHH72_h1_E1D-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALA_K447del))或对照抗体Synagis腹腔给药的叙利亚仓鼠肺部的基因组SARS-CoV-2 RNA拷贝。右:用D72-53(PB9683)、D72-58或对照抗体(Synagis)以4mg/kg的剂量进行治疗性IP治疗后，叙利亚仓鼠肺中的传染性SARS-CoV-2颗粒。使用非参数Mann Whitney U-检验进行统计分析。**P<0.01；*P<0.05。虚线表示检测下限(LOD)。TCID50＝50％组织培养感染剂量。异常值由不同的符号表示。
图42 VHH72_S56A-Fc与多种沙贝病毒的RBD结合。
本文使用构建体D72-53(VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALA_K477del)。a.基于SARS-CoV-1相关的、SARS-CoV-2相关的和进化枝2和进化枝3蝙蝠SARS相关的沙贝病毒的RBD的进化枝图(UPGMA方法)。彩色框表示由D72-53结合的RBD变体，如通过流式细胞术对显示所指示的RBD变体的酵母细胞或表达SARS-CoV-1刺突蛋白的HEK293T细胞所测定的，其中RBD被所指示的RBD变体取代。灰色框表示没有观察到D72-53结合的RBD变体。b.分析VHH72_S56A-Fc(D72-53)、S309、CB6和Synagis抗体与显示出所指示的沙贝病毒的RBD的酿酒酵母细胞的结合。该图示出了AF633缀合的抗人IgG的MFI，该MFI用于检测测试抗体的稀释系列与酿酒酵母细胞的结合，该酿酒酵母细胞表达衍生自所指示的沙贝病毒的RBD。c.测试的RBD变体的氨基酸序列比对。偏离SARS-CoV-2 RBD的氨基酸残基以粗体示出。构成VHH72表位一部分的氨基酸残基根据其结合能用颜色表示，该结合能通过分子动力学(Molecular Dynamics)进行计算，然后通过FastContact(7)进行分析。
图43 VHH72的表位在流行的SARS-CoV-2病毒中高度保守。
SARS-CoV-2 RBD中的突变及其对VHH72结合和RBD折叠的影响。图的上半部分描绘了在分析的240,239个SARS-CoV-2基因组中(2021年1月4日的分析)，在RBD序列(SEQ IDNO:23的刺突蛋白氨基酸330-518位)中检测到至少一次的所有错义突变。次要变体根据其频率垂直排列，用字母大小和观察到的病例数表示。字母颜色对应于给定突变对VHH72结合的估计影响，单位为Δkcal/mol。红色和蓝色病例数分别突出显示显著增强或降低的VHH72结合(p值≤0.05)。该图的下半部分示出：i)VHH72的表位(通过PISA埋藏表面估计)，根据表位与VHH72的相似性(Jaccard评分)着色，ii)ACE2结合位点，iii)RBD残基对vhh 72结合的单独贡献，单位为kcal/mol，iv)具有统计相关结合能贡献的RBD残基(基于30次模拟的95％置信度)。
图44具有VHH72的FastContact结合能颜色指示表位的SARS-CoV-2 RBD的表面表现。
观察到的变体残基N439K、S477N、E484K和N501Y的位置用洋红色表示。
图45VHH氨基酸序列的比对。
前5个序列被鉴定为VHH72与RBD结合的非竞争性VHH。VHH72和比对的其余序列包括VHH家族成员代表，在结合SARS-CoV-2 RBD方面与VHH72完全竞争，并且都具有阻断ACE2与RBD结合的能力。指示了根据Kabat注释的CDR。VHH72和VHH50中的56位Ser和第三代VHH72家族成员中的G在VHH72中加下划线。方框内的VHH根据CDR3序列定义属于同一家族。
图46来自不同家族的VHH对VHH72与SARS-CoV-2 RBD结合的剂量依赖性抑制。
使用avi标记的生物素化SARS-CoV-2 RBD(最终0.5nM)和Flag标记的VHH72h1S56A(0.6nM)的竞争Alphascreen。属于同一(超)家族的VHH用方框表示。VHH编号:VHH50。
图47来自不同家族的VHH对ACE-2与SARS-CoV-2 RBD结合的剂量依赖性抑制。
使用avi标记的生物素化SARS-CoV-2 RBD(最终1nM)和人ACE-2-mFc(0.2nM)的竞争Alphascreen。属于同一(超)家族的VHH用方框表示。
图48 VHH2.50能够中和SARS-CoV-1和-2假型VSV病毒。
A和B.SARS-CoV-2和-1刺突假型VSV-dG与20μg/ml的所示VHH在室温下孵育30分钟，随后用于感染Vero E6细胞。感染后二十小时，细胞被裂解并用于分析荧光素酶活性。图A和B示出了分别针对SARS-CoV-2和-1假型VSV(SARS-CoV-2的n＝4，SARS-CoV-1的n＝1)的中和活性测试的每种VHH的荧光素酶活性。C.将SARS-CoV-2刺突假型VSV-dG与CoV-2_VHH50(＝VHH2.50，SEQ ID NO:92)和VHH72的稀释系列在室温下孵育30分钟，随后用于感染VeroE6细胞。感染后20小时，使用Tecan infinite 200PRO平板读数器测量感染细胞表达的GFP。
图49鉴定存在于PE提取物中的VHH可以有效地中和SARS-CoV-2刺突假型VSV-dG。
将SARS-CoV-2刺突假型VSV-dG与16、80或400倍稀释的PE提取物在室温下孵育30分钟，随后用于感染Vero E6细胞。感染后二十小时，细胞被裂解并用于分析荧光素酶活性。示出了针对按VHH家族分组的16、80和400倍稀释的PE样品测量的荧光素酶活性。每个VHH家族由其代表VHH之一的F编号表示(F55代表VHH3.55家族；F36：VHH3.36家族；F38：VHH3.38家族；F121：VHH3.121家族；F29：VHH3.29家族；F72sim：归入VHH72家族的第三代VHH；F83：VHH3.83家族；F149：VHH3.149家族)；PE_2_VHH50，VHH2.50的周质提取物。
图50 VHH72-12GS-Fc与SARS-CoV-2突变变体的结合。
a.示出了VHH72(具有透明表面的灰色卡通，左中)和ACE-2(橙色卡通，上)与SARS-CoV-2RBD(青色卡通，中)的位置的复合叠加图。SARS-CoV-2 RBD的Tyr369用紫色棒表示并示出。N322处的ACE-2聚糖(与VHH72冲突)用橙色棒示出；N343处的RBD聚糖用青色棒示出。在残基K417(->N)、L452(->R)、S477(->N)、E484(->K)和N501(->Y)处出现的RBD变体用黄色棒表示并示出。其中，只有N501的骨架羰基位于VHH72的外围。b.VHH72-12GS-Fc和mAb CB6与SARS-CoV-1刺突的结合，其中RBD被SARS-CoV-2的WT、N439K或N501Y RBD取代，在293T细胞表面表达。数据点代表未转染的GFP阴性细胞与转染的GFP阳性细胞的平均荧光强度(MFI)的比值，如流式细胞术所测定的。
图51仓鼠攻击研究中的PK/PD。
A-B，IP处理的仓鼠的第4天血清浓度与肺传染性病毒载量(TCID50)的相关性，结合了在两个不同中心用两种不同的SARS-CoV-2分离株进行的仓鼠攻击研究。化合物：VHH72h1 S46A-Fc融合物(二价D72-23、D72-52(PB9690)、D72-53(PB9683)和四价D72-55/PB9589)。量化限度用虚线表示。对照动物的中值反应用条纹线表示。C，在感染后4小时用SARS-CoV-2慕尼黑分离株进行治疗性处理的仓鼠中，第4天BALF和血清浓度之间的相关性。回归：对于二价和四价形式的组合，R2 0.6128，P<000.1。
图52纯化的VHH的SDS PAGE分析。
由毕赤酵母(上图)或WK6大肠杆菌细胞(下图)产生的指定纯化VHH的SDS-PAGE和考马斯染色。注意VHH3.47的较高分子量带代表糖基化蛋白。
图53通过ELISA和BLI将VHH与SARS-CoV-2 RBD以及SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的刺突蛋白的结合。
VHH与SARS-CoV-2的RBD(B)、SARS-CoV-2的刺突(C)、SARS-CoV-1的刺突(D)和阴性对照抗原BSA(A)的结合。VHH72用作对照。(E)单一浓度(200nM)的VHH对通过抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(FortéBio)捕获的单体人Fc融合的SARS-CoV-2_RBD-SD1的亲和力测量。该图示出了1次重复测量的代表性数据。VHH72_h1_S56A(标记为VHH72，这是具有对SARS-CoV1和-2 RBD的亲和力增加的S56A取代的VHH72)用作参考。(F)VHH3.17、VHH3.77和VHH3.115与通过抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(FortéBio)捕获的单体人Fc融合的SARS-CoV-2_RBD-SD1的结合动力学。
图54 VHH与多种沙贝病毒的RBD的结合。
(A)基于SARS-CoV-1相关的、SARS-CoV-2相关的和进化枝2和进化枝3蝙蝠SARS相关的沙贝病毒的RBD的进化枝图(UPGMA方法)。(B)流式细胞术分析VHH与显示所示沙贝病毒的RBD的酿酒酵母细胞的结合。该图示出了对于测试的RBD变体，用于检测与表达RBD(FITC缀合的抗myc标签抗体阳性)的细胞结合的VHH的AF647缀合的抗小鼠IgG抗体的MFI与不表达RBD(FITC缀合的抗myc标签抗体阴性)的细胞的MFI之比。GFP结合VHH(GBP)用作阴性对照抗体，VHH72_h1_S56A(VHH72)用作参考。除VHH3.83外的所有VHH均以10μg/mL进行测试。VHH3.83的测试浓度为100μg/mL。
图55 VHH3.38和VHH3.83与多种沙贝病毒的RBD的结合。流式细胞术分析VHH3.38和VHH3.83在100、1和0.01μg/mL下与指定RBD的结合。PBS用作阴性对照，VHH72_h1_S56A(VHH72)用作参考。该图示出了对于指定的RBD变体，用于检测与表达RBD(FITC缀合的抗myc标签抗体阳性)的细胞结合的VHH的AF647缀合的抗小鼠IgG抗体的MFI与不表达RBD(FITC缀合的抗myc标签抗体阴性)的细胞的MFI之比。
图56进化枝1、2和3沙贝病毒之间RBD上保守表面斑块的可视化。
(A)具有VHH72表位的SARS-CoV-2 RBD的表面表示，根据显示颜色方案所示，该方案显示了VHH72和相应的RBD残基之间相互作用的结合能(kcal/mol)。基于VHH72/SARS-CoV-1复合物10,14的晶体结构，通过FastContact和分子动力学计算SARS-CoV-2 RBD上VHH72足迹的每个氨基酸的结合能。(B)沙贝病毒的RBD上保守表面斑块的表面表示。沙贝病毒的RBD蛋白保守性测试图55。使用Scop3D(Vermeire等人，2015Proteomics，15(8):1448-52)和PyMol(DeLano，2002)进行可视化。红色到蓝色代表高度到不保守。
图57选定的VHH与VHH72竞争结合SARS-CoV-2 RBD。
(A)所选的VHH可以与S309抗体捕获的SARS-CoV-2单体RBD结合，但不能与VHH72-Fc捕获的SARS-CoV-2 RBD结合。该图示出了所选VHH和两种额外的RBD特异性VHH(非竞争性VHH1和2)的平均(n＝2+变异)结合(OD405),以及由包被的VHH72-Fc或包被的S309捕获的0.5ug/mL的无关GFP结合VHH(GBP)与RBD的结合。包括10ug/mL的VHH72_h1_S56A(VHH72)作为参考。(B)由VHH72和S309抗体结合的SARS-CoV-2 RBD(白色表面)的表面表现(Pinto等人，2020,Nature,583)，均以黑色卡通表示。(C)BLI竞争实验的设置示意图。将VHH72-Fc装载在抗人Fc生物传感器尖端上，随后浸入含有SARS-CoV-1-muFc(Sino Biological)的溶液中，直到达到饱和。接下来，将尖端浸入含有正在研究的VHH的溶液中。这些VHH将结合或不结合VHH72-Fc捕获的RBD，并且随着时间的推移将分别增加或不增加BLI信号。相反，与VHH72竞争结合RBD的VHH可能从VHH72-Fc包被的尖端置换捕获的RBD-muFc，因此将会随着时间的推移降低BLI信号。(D)所选的VHH从VHH72-Fc涂覆的尖端中置换RBD-muFc。使用VHH72_h1_S56A(VHH72)作为对照缓冲液。该图示出了从尖端浸入含有正在研究的VHH的溶液中的那一刻开始的BLI信号随时间的变化。
图58 SARS-CoV-2 RBD中K378N取代严重影响了VHH3.38和VHH3.83的结合。
VH 3.8(A)和VH3.83(B)的系列稀释物用于染色HEK293细胞，该HEK293细胞用GFP表达载体与非编码表达载体(GFP)或SARS-CoV-1刺突的表达载体组合进行转染，其中RBD被WT SARS-CoV-2 RBD(WT)或SARS-CoV-2 RBD(其中K378被N取代)取代。用小鼠抗HIS标签抗体和AF647缀合的抗小鼠IgG抗体检测结合的VHH。该图示出了转染(GFP+)细胞的AF647 MFI与未转染细胞(GFP-)的比率。
图59所选的VHH可以有效地中和用SARS-CoV-2刺突蛋白假型化的VSV-delG。
(A)用毕赤酵母产生的VHH中和SARS-CoV-2假型VSV。包括VHH72_h1_S56A(VHH72)作为参照。图中显示出了三次稀释系列(n＝3±SEM)的GFP荧光强度，每个稀释系列都归一化到该稀释系列的最低和最高GFP荧光强度值。(B)用大肠杆菌产生的VHHs3.83和VHH3.E4中和SARS-CoV-2假型VSV。该图示出了归一化为每个稀释系列的最低和最高GFP FI值的GFP荧光(n＝1)。
图60所选的VHH可以有效地中和用SARS-CoV-1刺突蛋白假型化的VSV-delG。
用毕赤酵母产生的VHH中和SARS-CoV-1刺突假型VSV。包括不相关的GFP结合VHH(GBP)和未感染细胞(NI)作为对照，包括VHH72_h1_S56A(VHH72)作为参考。该图示出示了平均(n＝2变化)GFP荧光强度。
图61所选的VHH防止RBD与表达ACE2刺突受体的VeroE6靶细胞结合。
该图示出了与指示的VHH预孵育的RBD-muFc(Sino Biological)与VeroE6细胞(这些细胞表达可被SARS-CoV-2刺突、RBD和病毒识别的ACE2受体)的结合，如通过流式细胞术由AF647缀合的抗小鼠IgG抗体检测的。作为对照，使用未用RBD(noRBD)处理的VeroE6细胞和用PBS或不相关的对照VHH(GBP)预孵育的RBD-muFc染色的VeroE6细胞。VHH72_h1_S56A用作与2个不与VHH72竞争RBD结合的VHH(非VHH72-竞争的VHH)相邻的参照。柱代表每个VHH的一个单一分析。重复测试对照组、PBS和noRBD。
图62从RBD变体酵母显示库中分选表现出VHH72、VHH3.38、VHH3.83和VHH3.55结合减少的酵母细胞
(A)VHH72_h1_S56A(上图)和VHH3.38、VHH3.55和VHH3.83(下图)结合表面表达myc标记的WT SARS-CoV-2 RBD的酵母细胞的流式细胞术分析。该图示出了对于测试VHH的每个指示浓度，用于检测VHH与RBD+(myc-tag+)细胞结合和与RBD-(myc-tag-)酵母细胞结合的AF594缀合抗体的MFI的比率。虚线表示选择用于扫描RDB酵母显示库的VHH的浓度。(B)对VHH72_h1_S56A、VHH3.83、VHH3.38和VHH3.55结合减少的酵母细胞的RBD酵母显示库进行分类。点图示出了指定的VHH和抗myc标签抗体与展示RBD变体的酵母细胞的两个库之一的结合。对于每个VHH，图中示出了显示减少的VHH结合并落入“逃逸(escape)”门以用于分选和随后的深度序列分析的酵母细胞的百分比。
图63基于深度突变扫描的VHH72、VHH3.38、VHH3.83和VHH3.55的表位概述。
(A)通过深度突变扫描鉴定的显著影响VHH72_h1_S56A(VHH72)、VHH3.38、VHH3.83和VHH3.55结合的RBD氨基酸位置的指示。示出了SARS-CoV-2 RBD氨基酸序列。在上面一行(SARS-CoV-2 RBD)中，根据与SARS-CoV-1复合物中VHH72的晶体结构，通过FastContact和分子动力学确定的参与VHH72结合的氨基酸按照图C中描述的颜色代码显示。在第二行(SARS-CoV-2 RBD)中，定义VHH72足迹的RBD氨基酸以粗体显示。在第三行(Escape VHH72)、第四行(Escape VHH3.83)、第五行(Escape VHH3.55)和第六行(Escape VHH3.38)中，VHH72足迹以粗体表示，通过深度突变扫描鉴定的参与各自VHH结合的氨基酸位置用下划线粗体表示。(B)通过深度突变扫描(黑线)确定的涉及结合VHH72_h1_S56A、VHH3.38、VHH3.55和VHH3.83的RBD氨基酸位置的分布在VHH之间重叠，并与基于FastContact和建模的SARS-CoV-2 RBD上的VHH72表位重叠(橙色条)。(C)表示结合能(kcal/mol)的颜色代码示意图，该结合能是基于VHH72/SARS-CoV-1复合物10、14的晶体结构，通过FastContact和分子动力学计算SARS-CoV-2 RBD上VHH72足迹的每个氨基酸的结合能。(D)VHH72表位(根据图(C)中的颜色代码)、VHH 72足迹(蓝色)和通过深度突变扫描鉴定的参与指定VHH结合的RBD氨基酸(红色)的RBD表面表示。
图64参与VHH72-h1_S56A、VHH3.38、VHH3.83和VHH3.55结合的氨基酸的表示，通过位于VHH72足迹外的深度突变扫描鉴定。
(A)通过深度突变扫描鉴定的显著影响VHH72_h1_S56A(VHH72)、VHH3.38、VHH3.83和VHH3.55结合但位于VHH72足迹之外的RBD氨基酸位置的指示。显示的序列代表RBD氨基酸序列。在上面一行(SARS-CoV-2 RBD)中，根据与SARS-CoV-1复合物中VHH72的晶体结构，通过FastContact和分子动力学确定的参与VHH72结合的氨基酸按照图63的C图中描述的颜色代码显示。在第二行(SARS-CoV-2 RBD)中，定义VHH72足迹的RBD氨基酸以粗体显示。在第三行(Escape VHH72)、第四行(Escape VHH3.83)、第五行(Escape VHH3.55)和第六行(EscapeVHH3.38)中，VHH72的足迹用粗体表示。通过深度突变扫描鉴定的参与各VHH结合并位于VHH72足迹之内或之外的氨基酸位置分别用下划线粗体和下划线斜体表示。(B)用蓝色表示RBD表面和VHH72足迹的RBD的卡通表示。通过深度突变扫描鉴定的参与VHH72_h1_S56A结合的RBD氨基酸位置位于VHH72足迹之内或之外，分别用红色和绿色表示。结合在RBD上的VHH72的卡通表示以橙色示出。(C)用蓝色表示RBD表面和VHH72足迹的RBD的卡通表示。通过深度突变扫描鉴定的VHH3.38表位结合所涉及的氨基酸位置落在VHH72足迹之内或之外，分别用红色和绿色表示。与C336形成二硫键的RBD氨基酸C361用橙色表示。(D)用蓝色表示RBD表面和VHH72足迹的RBD的卡通表示。通过深度突变扫描鉴定的VHH3.55表位结合所涉及的氨基酸位置落在VHH72足迹之内或之外，分别用红色和绿色表示。与C391形成二硫键的RBD氨基酸C525用橙色表示。
图65 SC2-VHH3.38复合物的结构研究。(A、B)侧视图(A)或俯视图(B)中示出的SC2-VHH3.38复合物的3D cryoEM重建的电子势能图(灰色网格)和内置结构模型(卡通表示)。重建示出了SC2三聚体的密度(三个原聚体的蓝色、青色和紫色)以及VHH3.38的三个拷贝(黄色；标注为3.38)。SC2受体结合结构域、N-末端结构域和茎区分别标记为RBD、NTD和S2。(C)SC2-VH 3.38复合物中VH 3.38结合位点的特写图(cryoEM电子电势图示出为灰色网格)。纳米抗体结合SC2 RBD，覆盖包含权利要求1的结合表位主体的结合表面(残基S368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508；以绿色和棒状表示示出)。(D)SC2-VHH3.38复合物的顶视图，颜色如图A所示，SC2三聚体示出为分子表面，VHH3.38分子示出为二级结构卡通。以绿色示出的是权利要求1的结合表位。图中示出了SC2-VHH3.38复合物的3-RBD以向上方向。(E、F)与VHH3.38(黄色，卡通表示)复合的SC2 RBD(示出为分子表面)的特写视图。绿色(图E)或红色(图F)分别示出包含权利要求3中定义的VHH结合表位的残基，以及在深度突变扫描实验中鉴定为escape VHH3.38结合的突变体位点的残基。
图66 SC2构象状态和SC2-VHH3.38复合物的比较。
(A)从左至右示出的是SC2刺突三聚体的封闭或“3-RBD向下”构象(PDB：6ZGI)、开放或“1-RBD向上”构象(PDB：6ZGG)和SC2–VHH3.38复合物(本申请)的3D结构的分子表面，其示出了完全开放的3-RBD向上确认的RBD结构域。N-末端结构域、受体结合结构域和茎区分别为青色、蓝色和橙色。VHH3.38以红色示出，为二级结构卡通。(B)SC2-VHH3.38复合物的侧视图(下视图)和特写视图(上视图)，以及SARS-CoV-2 RBD结构复合人Ace2(PDB：7dmu)的叠加。RBD、VHH3.38和Ace2分别为蓝色、红色和青色。
发明详述
本发明将针对特定的实施方案和参考某些附图进行描述，但本发明不限于此，而仅限于权利要求书。权利要求中的任何参考标记不应解释为限制范围。当然，应该理解，根据本发明的任何特定实施方案，不一定可以实现所有方面或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化本文教导的一个优点或一组优点的方式来实施或执行，而不必实现本文教导或建议的其他方面或优点。当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述可以最好地理解本发明及其特征和优点。参考下文描述的实施方案，本发明的各方面和优点将变得显而易见。在整个说明书中对“一个实施方案”的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书的各个地方出现的短语“在一个实施例中不一定都指代相同的实施方案，但可以指同一实施方案。类似地，应当理解，在本发明的示例性实施方案的描述中，出于简化公开内容和帮助理解一个或多个各种发明方面的目的，本发明的各种特征有时被组合在单个实施方案、附图或其描述中。然而，这种公开方法不应被解释为反映了要求保护的发明需要比每个权利要求中明确记载的更多的特征的意图。
定义
当提到单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一个”或“该”，这包括该名词的复数形式，除非另有明确说明。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括”时，不排除其他元件或步骤。此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的元件，而不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或示出的其他顺序操作。提供以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明。除非在本文中特别定义，否则在本文中使用的所有术语对于本发明领域的技术人员来说具有相同的含义。从业者特别关注Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(2012)；和Ausubel等人的Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 114),John Wiley&Sons,New York(2016)关于本领域的定义和术语。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义(例如，在分子生物学、生物化学、结构生物学和/或计算生物学中)。
如本文所用，“核苷酸序列”、“DNA序列”或“核酸分子”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA以及RNA。它还包括已知类型的修饰，例如甲基化、用类似物对一种或多种天然存在的核苷酸进行“加帽”取代。“核酸构建体”是指已构建为包含一个或多个在自然界中未一起发现的功能单元的核酸序列。示例包括环状、线性、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包含非天然核酸序列的病毒基因组等。“编码序列”是核苷酸序列，当置于适当调节序列的控制下时，其被转录成mRNA和/或翻译成多肽。编码序列的边界由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，而在某些情况下也可以存在内含子。“嵌合基因”或“嵌合构建体”或“嵌合基因构建体”是指重组核酸序列，其中启动子或调节核酸序列与编码mRNA的核酸序列有效连接或相缔合，使得调节核酸序列能够调节相关核酸编码序列的转录或表达。嵌合基因的调节核酸序列不与自然界中发现的相关核酸序列有效连接。“表达盒”包括能够指导感兴趣的基因/编码序列的表达的任何核酸构建体，其可操作地连接到表达盒的启动子。表达盒通常是DNA构建体，优选地包括(在转录方向上的5'至3')：与转录起始区可操作地连接的启动子区、多核苷酸序列、其同源物、变体或片段，以及包括RNA聚合酶终止信号和多聚腺苷酸化信号的终止序列。应当理解，所有这些区域都应该能够在待转化的生物细胞(如原核或真核细胞)中操作。包含转录起始区(优选包含RNA聚合酶结合位点)和聚腺苷酸化信号的启动子区可以是待转化的生物细胞天然的，或者可以来自替代来源，其中该区域在生物细胞中起作用。这样的盒可以构建成“载体”。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中进一步可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。“肽”也可以称为源自其原始蛋白质的部分氨基酸序列，例如在胰蛋白酶消化之后。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语还包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化和乙酰化。基于氨基酸序列和修饰，多肽的原子或分子质量或重量以(千)道尔顿(kDa)表示。“蛋白质结构域”是蛋白质中独特的功能和/或结构单位。通常蛋白质结构域负责特定的功能或相互作用，有助于蛋白质的整体作用。结构域可能存在于各种生物环境中，其中相似的结构域可以在具有不同功能的蛋白质中找到。
“分离的”或“纯化的”是指基本上或本质上不含通常以其天然状态伴随的组分的材料。例如，“分离的多肽”或“纯化的多肽”是指已从天然存在状态的其侧翼的分子中纯化的多肽，例如本文鉴定和公开的抗体或纳米抗体已从样品或混合物中存在的与所述多肽相邻的分子(如生产宿主)中除去。分离的蛋白质或肽可以通过氨基酸化学合成产生，或者可以通过重组生产或通过从复杂样品中纯化产生。
本文所用的术语“融合到”，以及在本文中可互换使用的“连接到”、“缀合到”、“结扎到”，特别是指“基因融合”，例如通过重组DNA技术，以及产生稳定共价键的“化学和/或酶缀合”。这同样适用于术语“插入”，其中一个核酸或蛋白质序列部分可以通过遗传、酶促或化学融合两个序列而插入另一个序列。
蛋白质的“同源物”、“同系物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所述未改性蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并具有与衍生它们的未改性蛋白类似的生物和功能活性。本文所用的术语“氨基酸同一性”是指序列在比较窗口内逐个氨基酸相同的程度。因此,“序列同一性百分比”通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列来计算，确定两个序列中相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met，也用本文的单字母代码表示)出现的位置的数量，以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数(即窗口大小)，并将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。本文所用的“取代”，或“突变”，或“变体”，是分别与亲本蛋白质或其片段的氨基酸序列或核苷酸序列相比，由不同的氨基酸或核苷酸取代一个或多个氨基酸或核苷酸而产生的。应当理解，蛋白质或其片段可以具有对蛋白质活性基本上没有影响的保守氨基酸取代。
术语“野生型”指从天然来源分离的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，因此被任意设计为基因的“正常”或“野生型”形式。相反，术语“修饰的”、“突变体”、“改造的”或“变体”是指与野生型基因或基因产物相比，显示序列修饰、翻译后修饰和/或功能特性(即改变的特征)的基因或基因产物。值得注意的是，可以分离天然存在的突变体；与野生型基因或基因产物相比，它们具有改变的特征这一事实来鉴定它们。
术语“分子复合物”或“复合物”是指与至少一种其他分子结合的分子，所述其他分子可以是化学实体。术语“结合”是指化学实体或化合物或其部分与蛋白质上的结合袋或结合位点之间的接近状态。该结合可以是非共价的——其中氢键或范德华力或静电相互作用在能量上有利于并列——或者它可以是共价的。术语“化学实体”是指化合物、至少两种化合物的复合物以及这些化合物或复合物的片段。化学实体可以是例如配体、底物、磷酸盐、核苷酸、激动剂、拮抗剂、抑制剂、抗体、单结构域抗体、药物、肽、肽模拟物、蛋白质或化合物。
如本文所用，术语“晶体”是指一种结构(例如三维(3D)固体聚集体)，其中平面以确定的角度相交，并且其中存在组成化学物质的规则结构(例如内部结构)。术语“晶体”特别是指固体物理晶体形式，例如实验制备的晶体。如本文所用，术语“共晶”是指由两种或更多种组分组成的结构，这些组分形成具有独特性质的独特晶体结构，其中所述组分可以是原子、离子或分子。在当前申请的上下文中，包含冠状病毒S蛋白的RBD结构域和本文描述的纳米抗体(VHH-72)的共晶体等同于与本文描述的纳米抗体复合的RBD结构域的晶体。术语“结晶溶液”是指促进结晶的溶液，其包含至少一种试剂，包括缓冲剂、一种或多种盐、沉淀剂、一种或多种去污剂、糖或有机化合物、镧系离子、聚离子化合物、和/或稳定剂。
术语“合适的条件”是指环境因素，例如温度、运动、其它成分和/或“缓冲条件”等，其中“缓冲条件”特指分子存在于其中的溶液的组成。组合物包括缓冲溶液和/或溶质，例如pH缓冲物质、水、盐水、生理盐溶液、甘油、防腐剂等，本领域技术人员知道其适合于获得最佳测定性能。如本文所用的合适条件还可以指合适的结合条件，例如当Nbs旨在结合RBD时。如本文所用的合适条件还可以指合适的结晶或低温-EM条件，其可替代地意指其中预期目标结构分析的合适条件。合适的条件可以进一步涉及可以进行热稳定性测定的缓冲液条件。
术语“结合袋”或“结合位点”是指分子或分子复合物的区域，由于其形状和电荷，该区域有利地与另一种化学实体、化合物、蛋白质、肽、抗体或Nb结合。对于抗体相关分子，术语“表位”或“构象表位”在本文中也可互换使用。术语“袋”包括但不限于裂隙、通道或部位。本文所述的冠状病毒的RBD结构域包含结合袋或结合位点，其包括但不限于纳米抗体结合位点。术语“结合袋/位点的一部分”是指少于定义结合袋、结合位点或表位的所有氨基酸残基。例如，构成结合袋一部分的残基的原子坐标可能对定义结合袋的化学环境是特异的，或可用于设计可能与这些残基相互作用的抑制剂片段。例如，残基部分可以是在配体结合中起作用的关键残基，或者可以是在空间上相关并定义结合袋的三维区室的残基。残基在一级序列中可以是连续的或不连续的。
“结合”是指任何直接或间接的相互作用。直接相互作用意味着结合配偶体之间的接触。间接相互作用是指相互作用伙伴在两个以上分子的复合物中相互作用的任何相互作用。借助于一个或多个桥接分子，这种相互作用可以是完全间接的，或者是部分间接的，在这种情况下，配偶体之间仍然存在直接接触，这种直接接触通过一个或多个分子的额外相互作用来稳定。如本文所用，术语“特异性结合”是指识别特异性靶但基本上不识别或结合样品中的其他分子的结合域。特异性结合并不意味着排他性结合。然而，特异性结合确实意味着蛋白质对它们的一种或几种结合物具有一定增加的亲和力或偏好。如本文所用，术语“亲和力”通常指配体、化学物质、蛋白质或肽与另一种(靶点)蛋白质或肽结合的程度，从而使单个蛋白质单体的平衡向存在由它们的结合形成的复合物的方向移动。“结合剂”涉及能够与另一分子结合的分子，其中所述结合优选是识别确定的结合位点、袋或表位的特异性结合。结合剂可以是任何性质或类型，并且不依赖于其来源。结合剂可以是化学合成的、天然存在的、重组产生的(和纯化的)，以及设计的和合成产生的。因此，所述结合剂可以是小分子、化学品、肽、多肽、抗体或其任何衍生物，例如肽模拟物、抗体模拟物、活性片段、化学衍生物等。
本文所述的冠状病毒的RBD结构域包含结合袋或结合位点，其包括但不限于纳米抗体结合位点。术语“结合袋/位点的一部分”是指少于定义结合袋、结合位点或表位的所有氨基酸残基。例如，构成结合袋一部分的残基的原子坐标可能对定义结合袋的化学环境是特异的，或可用于设计可能与这些残基相互作用的抑制剂片段。例如，残基部分可以是在配体结合中起作用的关键残基，或者可以是在空间上相关并定义结合袋的三维区室的残基。残基在一级序列中可以是连续的或不连续的。
本文所用的“表位”是指多肽的抗原决定簇，其构成靶分子上的结合位点或结合袋，例如冠状病毒RBD结构域，更特别是2019-nCoV RBD结构域。表位可以在空间构象中包含3个氨基酸，这是该表位所独有的。通常，表位由至少4、5、6、7个此类氨基酸组成，更通常由至少8、9、10个此类氨基酸组成。确定氨基酸空间构象的方法是本领域已知的，包括例如X射线晶体学和多维核磁共振。本文所用的“构象表位”是指包含氨基酸的表位，其空间构象对于多肽的折叠三维构象是独特的。通常，构象表位由在线性序列中不连续但在蛋白质的折叠结构中聚集在一起的氨基酸组成。然而，构象表位也可以由氨基酸的线性序列组成，该序列采用多肽的折叠三维构象所特有的构象(并且不以变性状态存在)。在蛋白质复合物中，构象表位由在一种或多种多肽的线性序列中不连续的氨基酸组成，这些多肽在不同折叠的多肽折叠时结合在一起并且它们以独特的四级结构结合。类似地，构象表位在本文中也可以由一种或多种多肽的氨基酸的线性序列组成，这些多肽聚集在一起并采用四级结构所特有的构象。术语蛋白质的“构象”或“构象状态”通常指蛋白质在任何时刻可能采用的结构范围。本领域技术人员将认识到构象或构象状态的决定因素包括反映在蛋白质氨基酸序列(包括修饰的氨基酸)中的蛋白质一级结构和蛋白质周围环境。蛋白质的构象或构象状态也与结构特征相关，例如蛋白质二级结构(例如，α-螺旋、β-折叠等)、三级结构(例如，多肽链的三维折叠)和四级结构(例如，多肽链与其他蛋白质亚基的相互作用)。多肽链的翻译后和其他修饰，如配体结合、磷酸化、硫酸化、糖基化或疏水基团的连接等，可以影响蛋白质的构象。此外，环境因素，如周围溶液的pH、盐浓度、离子强度和渗透压，以及与其他蛋白质和辅因子的相互作用等，都会影响蛋白质的构象。蛋白质的构象状态可以通过活性或与另一个分子结合的功能性测定来确定，或者通过物理方法如X射线晶体学、NMR或自旋标记等方法来确定。对于蛋白质构象和构象状态的一般性讨论，可以参考Cantor和Schimmel的Biophysical Chemistry,Part I：The Conformation of Biological.Macromolecules,W.H.Freeman and Company,1980,and Creighton,Proteins：Structures and MolecularProperties,W.H.Freeman and Company,1993。
术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子或包含与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)结构域的分子。“抗体”还可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。术语“活性抗体片段”是指任何抗体或抗体样结构的一部分，其本身对抗原决定簇或表位具有高亲和力，并含有一个或多个解释这种特异性的CDR。非限制性实例包括免疫球蛋白结构域、Fab、F(ab)'2、scFv、重轻链二聚体、免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体(或VHH抗体)、结构域抗体和单链结构，例如完整的轻链或完整的重链。
如本文所用，术语“抗体片段”和“活性抗体片段”是指包含能够特异性结合存在于SARS-CoV-2病毒刺突蛋白中的RBD的免疫球蛋白结构域或抗原结合结构域的蛋白质。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。术语“免疫球蛋白(Ig)结构域”，或更具体地“免疫球蛋白可变结构域”(缩写为“IVD”)是指基本上由四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，这四个“框架区”在本领域和下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；称为“框架区2”或“FR2”；称为“框架区3”或“FR3”；并称为“框架区4”或“FR4”；框架区被三个“互补决定区”或“CDR”中断，这三个“互补决定区”在本领域和下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；称为“互补决定区2”或“CDR2”；以及称为“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可表示如下:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。正是(单数或复数个)免疫球蛋白可变结构域(IVD)通过携带抗原结合位点赋予抗体对抗原的特异性。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL的互补决定区(CDR)将有助于抗原结合位点，即总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。鉴于上述定义，常规4链抗体(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域已知的)或Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段如二硫键连接的Fv或scFv片段，或衍生自此类常规4链抗体的双抗体(本领域均已知)，通过一对(相关联的)免疫球蛋白结构域如轻链和重链可变结构域，即通过免疫球蛋白结构域的VH-VL对，其共同结合相应抗原的表位。本文所用的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)是指具有按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4格式的包含4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)的氨基酸序列的蛋白质。本发明的“免疫球蛋白结构域”是指“免疫球蛋白单可变结构域”(缩写为“ISVD”)，等同于术语“单可变结构域”，并定义其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的分子。这将免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白或其片段分开，其中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域，相互作用以形成抗原结合位点。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH/VHH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个CDR形成。这样，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH序列或VHH序列)或其合适的片段；只要它能够形成单个抗原结合单位(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单位，使得单个抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用来形成功能性抗原结合单位)。在本发明的一个实施方案中，免疫球蛋白单可变结构域是重链可变结构域序列(例如，VH序列)；更具体地，免疫球蛋白单可变结构域可以是衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。例如，免疫球蛋白单可变结构域可以是(单)结构域抗体(或适于用作(单)结构域抗体的氨基酸序列)、“dAb”或dAb(或适于用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体(如本文所定义，包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或其任何一个的任何合适片段。具体而言，免疫球蛋白单可变结构域可以是纳米抗体(如本文所定义的)或其合适的片段。注意：
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和
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是Ablynx N.V.(赛诺菲公司)的注册商标。对于纳米抗体的一般描述，参考下面的进一步描述，以及本文引用的现有技术，例如WO2008/020079中所描述的。“VHH结构域”，也称为VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，最初被描述为“重链抗体”(即“没有轻链的抗体(antibodies devoid of light chains)”；Hamers-Casterman等人(1993)Nature 363：446-448))的抗原结合免疫球蛋白(Ig)(可变)结构域。选择术语“VHH结构域”来将这些可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(本文称为“VH结构域”)和存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(本文称为“VL结构域”)区分开来。关于VHH和纳米抗体的进一步描述，可参考Muyldermans的综述文章(分子生物技术综述74：277-302，2001)，以及作为一般背景技术提及的下列专利申请：布鲁塞尔自由大学的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；联合利华的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams生物技术研究所(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 02/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO 01/90190；抗体研究所的WO 03/02520(＝EP 1433793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO06/122825以及Ablynnx N.V.的进一步公开的专利申请。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化纳米抗体)的特征尤其在于在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基(Hallmark residues)”。对于IVD的氨基酸残基的编号，可以应用不同的编号方案。例如，可以根据Honegger,A.和Pler,A.号，可以应(J.Mol.Biol.309,2001)给出的所有重链(VH)和轻链可变结构域(VL)的AHo编号方案进行编号，如应用于骆驼科动物的VHH域。本领域已知对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法，也可以类似于VHH结构域的方式应用。例如，FR和CDR序列的描绘可以通过使用Riechmann,L.和Muyldermans,S.的文章231(1-2),J Immunol Methods.1999中应用于骆驼科动物的VHH结构的Kabat编号系统来完成。应该注意的是——正如本领域公知的对于VH结构域和对于VHH结构域——每个CDR中的氨基酸残基总数可以不同并且可以不对应于Kabat编号所指示的氨基酸残基总数(即根据Kabat编号的一个或多个位置可能未在实际序列中占据，或者实际序列可能包含比Kabat编号允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可能对应于或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中氨基酸残基的总数通常在110至120的范围内，通常在112至115之间。然而，应该注意的是，更小和更长的序列也适用于本文所述的目的。也可以根据不同的方法来确定CDR区域，例如基于接触分析和结合位点形貌的指定，如MacCallum等人在J.Mol.Biol.(1996)262,732–745中所述。或者，CDR的注释可以根据AbM(AbM是Oxford Molecular Ltd.的抗体建模包，如http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html上所述)、Chothia(Chothia和Lesk，1987；MolBiol.196:901-17)、Kabat(Kabat等人，1991；第5版，NIH publication 91-3242)，以及IMGT((LeFranc,2014；Frontiers in Immunology.5(22)：1-22)。这些注释略有不同，但每个注释都旨在包含与结合目标相关的环的区域。
VHH或Nb通常被划分为不同的序列家族甚至超家族，以便在B细胞成熟过程中聚集来自同一祖细胞的克隆相关序列(Deschaght等人，2017.Front Immunol.10；8:420)。这种分类通常基于Nb的CDR序列，其中例如每个Nb家族被定义为具有CDR3区序列同一性阈值的(克隆)相关序列的集群。因此，在本文定义的单个VHH家族中，CDR3序列在氨基酸组成上是相同的或非常相似的，优选在CDR3序列中具有至少80％的同一性，或至少85％的同一性，或至少90％的同一性，导致相同家族的Nb结合到相同的结合位点，具有相同的效果。
免疫球蛋白单可变结构域如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域)可以进行人源化，即增加与最接近的人种系序列的序列同一性程度。具体而言，人源化免疫球蛋白单可变结构域，例如纳米抗体(包括VHH结构域)可以是其中存在至少一个氨基酸残基(特别是至少一个框架残基)的免疫球蛋白单可变结构域，所述氨基酸残基是和/或对应于人源化取代(如本文进一步定义的)。潜在有用的人源化取代可以通过将天然存在的VHH序列的框架区序列与一个或多个密切相关的人VH序列的相应框架序列进行比较来确定，之后可以将一个或多个如此确定的潜在有用的人源化取代(或其组合)引入到所述VHH序列中(以任何本身已知的方式，如本文进一步描述的)，并且可以测试所得人源化VHH序列对靶点的亲和力、稳定性、表达的容易性和水平，和/或其它所需的特性。这样，通过有限程度的试错，技术人员可以确定其他合适的人源化替代(或其合适的组合)。此外，基于前面所述，免疫球蛋白单可变结构域(的框架区)，如
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(包括VHH结构域)，可以是部分人源化的或完全人源化的。
与相应的天然存在的VHH结构域相比，人源化免疫球蛋白单可变结构域，特别是
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可能具有若干优点，例如降低的免疫原性。人源化是指突变使得在人类患者中给药时的免疫原性很小或不存在。应该选择人源化取代，使得得到的人源化氨基酸序列和/或VHH仍然保留VHH的有利特性，例如抗原结合能力。基于本文提供的描述，技术人员将能够选择人源化取代或人源化取代的合适组合，其优化或实现一方面由人源化取代提供的有利特性和另一方面天然存在的VHH结构域的有利特性之间的所需或合适的平衡。此类方法是本领域技术人员已知的。人共有序列可以用作人源化的靶序列，但其他方式也是本领域已知的。一种替代方案包括一种方法，其中技术人员比对许多人种系等位基因，例如但不限于IGHV3等位基因的比对，以使用所述比对来鉴定靶序列中适于人源化的残基。也可以比对与靶序列最同源的人类种系等位基因的子集作为起始点，以鉴定合适的人源化残基。或者，分析VHH以鉴定其在人类等位基因中最接近的同源物，并用于人源化构建体设计。应用于骆驼科VHH的人源化技术也可以通过包括单独或组合替换特定氨基酸的方法来进行。可以基于文献中已知的内容、来自已知的人源化努力，以及来自与天然VHH序列相比的人类共有序列，或与感兴趣的VHH序列最相似的人类等位基因来选择所述替换。从WO 08/020079的表A-5-A-8中给出的VHH熵和VHH变异性的数据中可以看出，构架区中的一些氨基酸残基在人和骆驼科之间比其他更保守。通常，尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，但是任何取代、缺失或插入优选在不太保守的位置进行。此外，通常，氨基酸取代比氨基酸缺失或插入更优选。例如，类人骆驼科单结构域抗体含有疏水性FR2残基，该残基通常存在于人源或其他物种的常规抗体中，但通过在103位的其他取代物来补偿这种亲水性的损失，所述取代物取代了来自双链抗体的VH中存在的保守色氨酸残基。因此，属于这两类的肽显示出与人VH构架区的高度氨基酸序列同源性，并且所述肽可以直接施用于人，而不期望由此产生不必要的免疫反应，并且没有进一步人源化的负担。事实上，一些骆驼科VHH序列显示出与人VH构架区的高度序列同源性，因此所述VHH可以直接施用于患者，而不期望由此产生免疫反应，并且没有额外的人源化负担。
可以在人源化过程中引入合适的突变，特别是取代，以产生与预先存在的抗体结合减少的多肽(例如参考WO 2012/175741和WO2015/173325)，例如在至少一个位点：11、13、14、15、40、41、42、82、82a、82b、83、84、85、87、88、89、103或108。本发明的氨基酸序列和/或VHH可以在任何框架残基处进行适当的人源化，例如在一个或多个标志残基处(如下文所定义的)或在一个或多个其它框架残基处(即非标志残基)或其任何合适的组合处。根据用于表达本发明的氨基酸序列、VHH或多肽的宿主生物，这种缺失和/或取代也可以设计成去除一个或多个翻译后修饰的位点(如一个或多个糖基化位点)，这在本领域技术人员的能力范围内。或者，可以设计取代或插入，以便引入一个或多个用于连接官能团的位点(如本文所述)，例如允许位点特异性聚乙二醇化。
在一些情况下，在位点37、44、45和/或47具有亲水特性的典型骆驼科标志残基中的至少一个被替换(参见WO2008/020079表A-03)。人源化的另一个示例包括FR 1中残基的取代，例如位点1、5、11、14、16和/或28；在FR3，例如位点73、74、75、76、78、79、82b、83、84、93和/或94；以及在FR4中，例如位点10 103、104、108和/或111(参见WO2008/020079表A-05-A08；所有编号均根据Kabat)。人源化通常只涉及FR中的取代，而不涉及CDR中的取代，因为这可能/会影响对靶点的结合亲和力和/或效力。
本文所用的“治疗活性剂”是指在疾病治疗中具有或可能具有治疗效果(即有疗效的或预防效果)的任何分子(如本文进一步描述的)。优选地，治疗活性剂是疾病调节剂，其可以是细胞毒性剂，例如毒素或细胞毒性药物，或能够将前体药物转化为细胞毒性药物的酶，或放射性核素，或细胞毒性药物细胞，或者可以是非细胞毒性剂。甚至更优选地，治疗活性剂对疾病具有疗效。当有益于治疗冠状病毒感染如SARS冠状病毒感染的患者或患有COVID-19的患者时，本发明的结合剂或组合物或药物组合物可作为治疗活性剂。结合剂可以包括包含变体VHH-72ISVD的试剂，优选与RBD的相同结合区结合的改进变体，更优选其人源化变体，并且可以包含或偶联至另外的官能团，当向受试者给药时是有利的。此类官能团和用于引入它们的技术的示例对本领域技术人员来说是清楚的，并且通常可以包括本领域中提到的所有官能团和技术以及本身已知的用于修饰药用蛋白质的官能团和技术，特别是对于抗体或抗体片段的修饰，例如参考Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1980)。这样的官能团可以例如直接(例如共价地)连接到ISVD或活性抗体片段，或任选地通过合适的接头或间隔物连接，这对于技术人员来说也是清楚的。用于增加药物蛋白质的半衰期和/或降低其免疫原性的最广泛使用的技术之一包括连接合适的药理学上可接受的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。例如，为此目的，PEG可以连接到本发明的免疫球蛋白单可变域中天然存在的半胱氨酸残基上，可以对本发明的免疫球蛋白单可变结构域进行修饰，以便适当地引入一个或多个半胱氨酸残基以用于PEG的连接，或可以将包含一个或多个用于连接PEG的半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的ISVD或活性抗体片段的N-和/或C-末端，所有这些都使用技术人员本身已知的蛋白质改造技术。另一种通常不太优选的修饰包括N-连接或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于用于表达抗体或活性抗体片段的宿主细胞。另一种用于增加结合结构域半衰期的技术可包括改造成双功能或双特异性结构域(例如，一个针对冠状病毒靶点RBD的ISVD或活性抗体片段和一个针对血清蛋白如白蛋白或表面活性蛋白A(SpA)-其是大量存在于肺中的表面蛋白，有助于延长半衰期)或抗体片段，特别是免疫球蛋白单可变结构域与肽(例如，针对血清蛋白诸如白蛋白的肽)的融合体。在另一个示例中，本发明的变体ISVD可以融合到免疫球蛋白Fc结构域，例如IgA Fc结构域或IgG Fc结构域，例如IgG1、IgG2或IgG4 Fc结构域。示例在实验部分进一步示出，并且在序列表中也进行了描述。
本文使用的术语“化合物”或“测试化合物”或“候选化合物”或“药物候选化合物”描述了任何天然存在的或合成的分子，其被设计、鉴定、筛选或产生，并且可以在测定中测试，例如筛选测定或药物发现测定，或特别是在用于鉴定能够中和冠状病毒，特别是2019-冠状病毒感染的化合物的方法中。因此，这些化合物包括有机和无机化合物。为了高通量的目的，可以使用测试化合物库，例如提供足够多样性范围的组合或随机库。示例包括但不限于天然化合物库、变构化合物库、肽库、抗体片段库、合成化合物库、基于片段的库、噬菌体展示库等。此类化合物也可称为结合剂；如本文所指，这些可以是“小分子”，其指的是低分子量(例如，<900Da或<500Da)的有机化合物。化合物或结合剂还包括以低分子量为特征的化学品、多核苷酸、脂质或激素类似物。其他生物聚合有机测试化合物包括包含约2至约40个氨基酸的小肽或肽样分子(肽模拟物)和包含约40至约500个氨基酸的较大多肽，例如抗体、抗体模拟物、抗体片段或抗体缀合物。
如本文所用，术语“确定、“测量”、“评估”、“鉴定”、“筛选”和“测定”可互换使用并且包括量化和定性确定。如本文所用，“同样的”可互换用于相像地、类似的、同类的、对应的和类似或同样的，并且意味着具有相同或共同的特征，和/或以可量化的方式显示可比较的结果，即具有最大20％、10％、更优选5％、或甚至更优选1％或更小的变化。
本文中可互换使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”涉及任何生物体，例如脊椎动物，特别是任何哺乳动物，包括人和另一种哺乳动物，需要对其进行诊断、治疗或预防，例如动物，如啮齿动物、兔、牛、羊、马、狗、猫、喇嘛、猪或非人灵长类动物(例如猴)。啮齿动物可以是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或栗鼠。在一个实施方案中，受试者是人、大鼠或非人灵长类动物。优选地，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是患有或怀疑患有疾病或病症，特别是本文公开的疾病或病症的受试者，在本文中也称为“患者”。然而，应当理解，上述术语并不意味着存在症状。
术语“处理”或“正在处理”或“进行处理”可以互换使用，并且定义为减缓、中断、阻止、控制、停止、减少或恢复体征、症状、障碍、病症或疾病的进展或严重性的治疗性干预，但不一定涉及完全消除所有与疾病相关的体征、症状、病症或障碍。因此，治疗性处理旨在处理疾病或改善人的健康，而不是预防疾病。处理也可以指与药物或处理相关的预防性处理，该药物或处理设计和用于预防疾病的发生。
发明详述
在本发明的第一方面，公开了一种结合剂，其与冠状病毒(特别是SARS-CoV-1病毒和SARS-Cov-2冠状病毒)的刺突蛋白中存在的受体结合结构域特异性相互作用。药剂和刺突蛋白之间的结合导致冠状病毒感染能力的中和。在一具体的实施方案中，本发明提供了一种结合剂，该结合剂在包含氨基酸残基Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366和Y494的表位处特异性结合冠状病毒刺突蛋白，其中所述刺突蛋白的序列在SEQID NO:24中给出。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了一种结合剂，该结合剂在包含氨基酸残基Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366、Y494和R426的表位处特异性结合冠状病毒刺突蛋白，其中所述刺突蛋白的序列在SEQ ID NO:24中给出。SARS-CoV-1和-2的刺突的比较，以及结构比较和进一步的cryo-EM分析揭示了本文定义的SARS-CoV-1刺突上的表位对应于与SARS-Cov-2刺突的相同表位的结合，该相同表位由SEQ IDNO:23中列出的残基L368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508所形成的构象表位所定义，该SEQ ID NO:23为SARS-Cov-2刺突蛋白的序列。此外，结构分析进一步证明，本文定义的所述表位，特异性结合本文定义的结合剂，特别是VHH72，被封闭在封闭的刺突构象中，该构象是天然病毒上的优势构象81。即使在可以结合ACE2受体的“1-RBD-up”构象中，表位的位点也使得人单克隆抗体无法轻易到达它。可能正因为如此，在数百种针对刺突其他区域的抗体中，很少有人抗体因此结合与VHH72表位基本重叠的表位82。此外，表位由残基组成，这些残基在三聚体刺突的原聚体之间形成关键的堆积接触。到目前为止，在该表位上发生突变的SARS-CoV-2病毒仍然极为罕见。一直以来，新兴且迅速传播的病毒变体的RBD突变都不会影响VHH72结合位点。因此，交叉中和SARS-CoV-1和-2以及其他沙贝病毒亚属病毒的抗体(如本发明的结合剂的情况)是罕见的，因此包含所述ISVD的本发明结合剂是独特的。
另一个实施方案涉及特异性结合冠状病毒刺突蛋白的结合剂，其被定义为竞争如本文定义的表位或与VHH72竞争结合RBD表位的结合剂。“竞争性”是指在所述竞争性结合剂的存在下，VHH72与SEQ ID NO:23中描述的刺突蛋白的结合强度降低至少30％，或至少50％，或优选至少80％。更具体地，所述竞争性结合剂特异性结合包含SARS-Cov-2的刺突蛋白的至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或更多个残基L368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508的刺突蛋白上的表位，如SEQ ID NO:23中所述，从而提供重叠表位，更具体地至少结合其2个残基，或其至少3个、或至少4个或至少6个残基。在一个具体的实施方案中，竞争性结合剂特异性结合残基K378、Y369和F377。
在另一个具体实施方案中，竞争结合剂特异性结合如SEQ ID NO:23中所述的残基K378、Y369和F377，并且所述竞争结合剂竞争ACE2受体与刺突蛋白和/或RBD结构域的结合。
在另一个具体的实施方案中，所述竞争结合剂也能够与SARS-CoV-1刺突蛋白结合，如SEQ ID NO:24所示。
对具有优异结合特性(例如改进的Kon比率和改进的Koff比率)的VHH72的改进变体的需求导致了VHH72-S56A变体的鉴定，其在第56位(Kabat编号)具有丝氨酸到丙氨酸的突变作为构件，或者其人源化变体，例如VHH72_h1_E1D_S56A。当与人IgG1 Fc融合时(参见示例)，S56A突变示出了导致对SARS-CoV-1和-2刺突和受体结合结构域的更高亲和力，以及大约高5-7倍的真实SARS-CoV-2中和活性。与VHH72-Fc的人源化变体相比，在本文的SARS-Cov2仓鼠模型中分析了所述S56A突变的体内功效，并揭示其优于不包含S56A突变的VHH72形式。然而，本文所公开的具有与VHH72竞争或结合相同的RBD表位并与Fc结构域融合的类似或改善的结合和中和特性的任何替代VHH构件，在本文中被设想为VHH72或vHH72S56A的任何此类组合或变体。通常，如本文所述的任何进一步的人源化努力也可用于产生更多临床相关形式，例如本文由SEQ ID NO:27至61或SEQ ID NO:92至105鉴定的VHH ISVD。
因此，在另一个具体实施方案中，结合剂是多肽结合剂，含有至少一个ISVD，其进一步由其结合残基或副位残基定义，在本文中限于其CDR的序列。如结构示例中所示，CDR区域赋予ISVD的结合特性，因此包含以下CDR1、CDR2和CDR3组合之一：
-CDR1由SEQ ID NO:7组成；CDR2由SEQ ID NO:8或10组成；并且CDR3由SEQ ID NO:9组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:111组成；CDR2由SEQ ID NO:120组成；并且CDR3由SEQ ID NO:9组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:112组成；CDR2由SEQ ID NO:121组成；并且CDR3由SEQ ID NO:131组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:113组成；CDR2由SEQ ID NO:121组成；并且CDR3由SEQ ID NO:131组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:114组成；CDR2由SEQ ID NO:122组成；并且CDR3由SEQ ID NO:132组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:113组成；CDR2由SEQ ID NO:123组成；并且CDR3由SEQ ID NO:133组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:114组成；CDR2由SEQ ID NO:124组成；并且CDR3由SEQ ID NO:134组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:114组成；CDR2由SEQ ID NO:125组成；并且CDR3由SEQ ID NO:135组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:115组成；CDR2由SEQ ID NO:126组成；并且CDR3由SEQ ID NO:136组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:116组成；CDR2由SEQ ID NO:127组成；并且CDR3由SEQ ID NO:137组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:117组成；CDR2由SEQ ID NO:128组成；并且CDR3由SEQ ID NO:138组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:118组成；CDR2由SEQ ID NO:129组成；并且CDR3由SEQ ID NO:139组成，或
-CDR1由SEQ ID NO:119组成；CDR2由SEQ ID NO:130组成；并且CDR3由SEQ ID NO:140组成。
在另一个具体的实施方案中，结合多肽包含含有选自特定ISVD的CDR1、CDR2和CDR3的ISVD，所述特定ISVD选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:27-61、或SEQ IDNO:92-105，其中所述CDR序列由Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia提供的任何一种注释来定义，如本文所述，以及如图39中VHH72-S56A的示例。
在更具体的实施方案中，包含一个或多个ISVD的所述结合剂由ISVD的全长序列定义，其中所述序列选自SEQ ID NO:1至6、11、27至61和92至105，或与其具有至少90％同一性或至少95％同一性的序列，其中所述同一性差异或可变性限于FR残基，或其任何人源化变体，其中所述人源化变体是功能性直向同源物，即结合剂仍保留相同的结合位点特异性和与ACE2竞争结合RBD的能力。
在另一个具体的实施方案中，所述结合剂包含一个或多个属于VHH72家族的ISVD，并且由包含选自特定ISVD的CDR1、CDR2和CDR3的ISVD的ISVD定义，所述特定ISVD选自SEQID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:27-61或SEQ ID NO:92-97，其中所述CDR序列由Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia提供的任何一种注释来定义，如本文所述，并且如图39中VHH72-S56A的示例，以及表6中SEQ ID NO:92-97的Kabat注释的示例。
在另一个具体的实施方案中，所述结合剂包含一个或多个ISVD，其属于与VHH72家族不同的VHH家族，并且已经显示结合完全相同的表位，并且由包含选自特定ISVD的CDR1、CDR2和CDR3的ISVD的ISVD定义，所述特定ISVD选自SEQ ID NO:98(VHH3.83)、SEQ D NO:101(VHH3.55)、SEQ ID NO:102(VHH3.35)和SEQ ID NO:104(VHH3.38)，其中所述CDR序列由Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia提供的任何一种注释中来定义，如本文所述，并且如图39中VHH72-S56A的示例，以及表6中SEQ ID NO:98、101、102和104的Kabat注释的示例。
在另一个具体实施方案中，所述结合剂包含一种或多种ISVD，其属于与VHH72家族不同的VHH家族，并且已示出为与VHH72竞争相同的表位，并且由包含选自特定ISVD的CDR1、CDR2和CDR3的ISVD的ISVD定义，所述特定ISVD选自SEQ ID NO:99(VHH3.36)、SEQ D NO:100(VHH3.47)、SEQ ID NO:103(VHH3.29)和SEQ ID NO:105(VHH3.149)，其中所述CDR序列由Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia提供的任何一种注释中来定义，如本文所述，并且如图39中VHH72-S56A的示例，以及表6中SEQ ID NO:99、SEQ D NO:100、SEQ ID NO:103和SEQID NO:105的Kabat注释的示例。
另一个实施方案涉及所述蛋白质结合剂，其中至少一个或多个ISVD与Fc结构域结合或融合，其中Fc结构域是指抗体的片段可结晶区(Fc区)，其是已知与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用的尾部区域。所述Fc结构域由两个相同的蛋白质片段组成，该蛋白质片段来源于抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域。所有常规抗体都包含Fc结构域，因此，Fc结构域融合体可以包含衍生自IgG、IgA和IgD抗体Fc区或作为其变体的Fc结构域，甚至更具体地是IgG1、IgG2或IgG4。IgG2的铰链区可以被人IgG1的铰链取代，以产生SARS VHH-72融合构建体，反之亦然。用于将SARS VHH-72融合到IgG1和IgG2Fc结构域的其它接头包含(G4S)2-3。此外，可以使用具有已知半衰期延长的Fc变体，例如M257Y/S259T/T261E(也称为YTE)或LS变体(M428L与N434S组合)。这些突变增加了传统抗体的Fc结构域与新生受体(FcRn)的结合。
在一个具体的实施方案中，包含一个或多个免疫球蛋白单可变结构域的本发明的结合剂是“多价”或“多特异性”形式，并且通过化学或重组DNA技术将两个或多个相同或变异的单价ISVD结合在一起而形成。所述多价形式可通过直接或经由接头连接构件，或通过与Fc结构域编码序列融合而形成。多价构建体的非限制性示例包括“二价”构建体、“三价”构建体、“四价”构建体等。这种二价构建体的示例在本文中在所附实施例部分中进行进一步描述。包含在多价构建体中的免疫球蛋白单可变结构域可以相同或不同。在另一个具体实施方案中，本发明的免疫球蛋白单可变结构域是“多特异性”形式，并且通过将两个或多个免疫球蛋白单可变结构域结合在一起而形成，其中至少一个具有不同的特异性。多特异性构建体的非限制性示例包括“双特异性”构建体、“三特异性”构建体、“四特异性”构建体等。为了进一步说明这一点，本发明的任何多价或多特异性(如本文所定义)ISVD可以适当地针对冠状病毒抗原的同一RBD上的两个或多个不同表位，或者可以针对两个或多个不同抗原，例如针对冠状RBD和一个针对血清白蛋白或SpA的半衰期延长。本发明的多价或多特异性ISVD还可具有(或被改造和/或选择用于)增加的亲和力和/或对所需的冠状RBD相互作用和/或任何其它所需性质或所需性质的组合的改善的选择性，所述性质可通过使用这种多价或多特异性免疫球蛋白单可变结构域获得。在结合冠状RBD时，所述多特异性结合剂或多价ISVD可对冠状病毒(如SARS冠状病毒或2019-新型冠状病毒)的结合和中和具有累加或协同影响。在另一个实施方案中，本发明提供了包含单价、多价或多特异性形式的根据本发明的任何免疫球蛋白单可变结构域的多肽。因此，包含单价、多价或多特异性纳米抗体的多肽作为非限制性示例包括在本文中。
特别地，本文所述的单个ISVD可以在其C-末端与IgG Fc结构域融合，产生二价形式的SARS-Cov-2结合剂，其中两个所述VHH72_S56A IgG Fcs或其人源化形式通过IgG Fc部分铰链区中的二硫键形成仅重链抗体型分子。其所述人源化形式包括但不限于本领域已知的IgG人源化变体，例如赖氨酸的C-末端缺失、铰链区的改变或截短、如本文所述的LALA或LALAPG突变，以及IgG序列中的其他替代。在一个具体的实施方案中，所述SARS-Cov-2结合剂包含SEQ ID NO:13-22中所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％同一性的变体。
特别地，SEQ ID NO:18的氨基酸序列提供了由VHH72构件组成的构建体，该构件通过GS(G4S)2-接头与人IgG1铰链序列连接，该铰链序列进一步与人IgG1的Fc部分连接。该蛋白质序列提供了原型或野生型VHH72-Fc，也如10中所述。SEQ ID NO:17的氨基酸序列(在本文中用作D72-58批次)提供了由作为构件的VHH72的VHH72_h1(E1D)人源化变体组成的构建体，所述变体通过10GS接头与含有缺失的人IgG1铰链序列(EPKSC)连接，所述铰链序列进一步与人IgG1的Fc部分连接，所述Fc部分含有用于减少Fcγ受体结合的LALA突变，并且C-末端赖氨酸缺失。所以事实上，前导序列提供了SEQ ID NO:18的完全优化的人源化变体。SEQID NO:22的氨基酸序列(在本文中用作PB9683批次，也代表引导分子)提供了由VHH72_h1(E1D)构件(与SEQ ID NO:17的构件相同)组成的构建体，该构件在CDR2区含有突变，S56A(根据Kabat)，通过10GS接头与含有缺失的人IgG1铰链序列(EPKSC)连接，所述铰链序列进一步与人IgG1的Fc部分连接，所述Fc部分含有用于减少Fcγ受体结合的LALA突变，并且C-末端赖氨酸缺失。因此，本文所用的引导蛋白批次提供了与前导蛋白相同的VHH72-Fc的人源化变体，但除外改进的S56A突变。
在又一方面，本发明提供了编码如本文所述的SARS-CoV-2结合剂的核酸分子。在又一个实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的核酸分子的重组载体。所述载体可以包括克隆或表达载体，以及递送载体，例如病毒、慢病毒或腺病毒载体。本文使用的术语“载体”、“载体构建体”、“表达载体”、“重组载体”或“基因转移载体”是指能够转运与其连接的另一核酸分子的核酸分子。更具体地，所述载体可以包括技术人员已知的任何载体，包括任何合适的类型，但不限于，例如，质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(诸如λ噬菌体)、病毒载体，甚至更具体地慢病毒、腺病毒、AAV或杆状病毒载体，或人工染色体载体(诸如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC))。表达载体包括质粒以及病毒载体，并且通常包含在特定宿主生物(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或体外表达系统中表达可操作连接的编码序列所必需的所需编码序列和合适的DNA序列。克隆载体通常用于改造和扩增某种所需的DNA片段，并且可能缺乏表达所需DNA片段所需的功能序列。用于转染细胞的表达载体的构建也是本领域众所周知的，因此可以通过标准技术完成(参见，例如Sambrook、Fritsch和Maniatis在Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989；Gene Transfer and Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clif ton,N.J.)和Ambion1998Catalog(Ambion，Austin，Texas)。此外，一个替代实施方案涉及本文所述的编码本发明的所述结合剂的所述核酸分子、表达盒或载体用于作为胞内抗体产生的用途。细胞内抗体或“胞内抗体”是在指定的胞内区室中异源表达的抗体或抗体的活性片段，该过程通过框内整合胞内运输信号而成为可能。胞内抗体通过与靶抗原的精细特异性相互作用发挥其功能。这导致靶蛋白的生物学功能的中断或改变。胞内抗体可以以任何形状或形式表达，例如完整的IgG分子或Fab片段。更常见的是，胞内抗体用于基因工程抗体片段形式和scFv胞内抗体、单结构域胞内抗体或双特异性四价胞内抗体的结构。综述参见Zhu和Marasco 2008(Therapeutic Antibodies.Handbook of Experimental Pharmacology 181._cSpringer-Verlag Berlin Heidelberg)。包含本文所述的ISVD、可能由核酸分子或表达盒编码的结合剂存在于本文所述的载体上，在合适的宿主系统中表达时产生胞内抗体，当鉴定了适用的基因递送形式时，也可用作体内成像的工具、诊断剂或治疗剂。技术人员了解目前应用的给药和递送方法(也参见Zhu和Marasco 2008)。
当所述结合剂以核酸或载体的形式提供时，特别设想通过基因治疗施用调节剂。本文所用的“基因治疗”是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸而进行的治疗。对于此类应用，本文所述的核酸分子或载体允许在细胞内产生结合剂。本领域有大量的基因治疗方法，包括例如(腺相关)病毒介导的基因沉默，或病毒介导的基因治疗(例如US20040023390；Mendell等人2017，N Eng J Med 377:1713-1722)。本领域技术人员熟知多种递送方法，包括但不限于病毒递送系统、DNA质粒的显微注射、裸核酸的生物射弹、脂质体的使用。通过向个体患者给药的体内递送通常通过全身给药进行(例如，静脉、腹腔输注或脑注射；例如Mendell等人2017,N Eng J Med 377:1713-1722)。当所述结合剂以核酸或载体的形式提供时，更具体地说，还设想通过包含纳米颗粒或基于脂质的递送系统(例如人工外泌体)的递送方法和载体来施用调节剂，所述递送系统也可以是细胞特异性的，并且适于以胞内抗体或以DNA形式递送结合剂或多特异性结合剂以编码所述结合剂或调节剂。
本发明的另一方面提供了包含本发明的ISVD或活性抗体片段的宿主细胞。因此，宿主细胞可以包含编码所述ISVD的核酸分子。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞。宿主细胞也可以是重组宿主细胞，其包括已经被遗传修饰以含有分离的DNA分子、编码本发明ISVD的核酸分子的细胞。可用于产生所述ISVD的代表性宿主细胞但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。适于生产本发明结合剂的细菌宿主细胞包括埃希氏菌属细胞，芽孢杆菌属细胞，链霉菌属细胞，欧文氏菌属细胞，克雷伯氏菌属细胞，沙雷氏菌属细胞，假单胞菌属细胞和沙门氏菌细胞。适用于本发明的酵母宿主细胞包括酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属(例如巴斯德毕赤酵母)、汉逊酵母属(例如多形汉逊酵母)、耶氏酵母属、许旺酵母属(Schwaniomyces)、裂殖酵母属、接合酵母属等中的物种。酿酒酵母、嘉士伯糖酵母和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)是最常用的酵母宿主，并且是方便的真菌宿主。适用于本发明的动物宿主细胞包括昆虫细胞和哺乳动物细胞(最特别地来自中国仓鼠(例如CHO)和人类细胞系，例如HeLa)。示例性的昆虫细胞系包括但不限于Sf9细胞、杆状病毒-昆虫细胞系统(例如review Jarvis,Virology Volume 310,Issue 1，2003年5月25日，第1-7页)。或者，宿主细胞也可以是转基因动物。
晶体复合物
本发明的另一方面涉及包含冠状病毒RBD和本文所述结合剂的复合物。在另一个实施方案中，所述复合物是结晶形式。晶体允许进一步使用所述复合物中相互作用的所述原子细节作为分子模板来设计将概括RBD结合剂界面的关键特征的分子。鉴于计算对接和药效团构建的最新发展，分离可以模拟蛋白质-蛋白质界面的小化合物正在成为一种现实的策略。
因此，一个具体的实施方案涉及包含如SEQ ID NO:26中描述的SARS-Corona RBP和SEQ ID NO:1中描述的结合剂的晶体，其特征在于该晶体是：
i)空间群P3121中介于SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:1之间的晶体，具有以下晶格常数：
Figure GDA0004045908510000431
α＝900，β＝900，γ＝1200。
所述晶体具有三维结构，其中晶体i)包含以PDB 6WAQ坐标为特征的原子结构(于2020年3月25日存入RCSB蛋白质数据库；于2020年4月1日作为版本1.0发布)或其原子坐标的子集。
存在于如本文定义的晶体i)中的由原子坐标的子集组成的结合位点，其中所述结合位点由以下氨基酸残基组成：如SEQ ID NO:24所示的Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366和Y494，或Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366、Y494和R426，其中所述氨基酸残基代表结合剂的SARS-Corona病毒RBP，尤其是2019-nCoV RBP。
因此，另一个具体实施方案涉及鉴定、设计或筛选冠状病毒RBP结构域中和剂的计算机辅助方法，其中所述中和剂是选自小分子化合物、化学物质、肽、肽模拟物、抗体模拟物、ISVD、抗体或抗体片段的结合剂，并且包括：
i.将定义所述结合位点三维结构的参数引入合适的计算机程序中，
ii.在所述计算机程序中创建测试化合物的三维结构；
iii.在结合位点的三维模型上显示所述测试化合物的叠加模型；和
iv.评估所述测试化合物模型是否在空间和化学上适合结合位点。
本文所述的所述结合位点在本文中也被称为本发明的表位。此外，这里的表位是指SARS冠状病毒的刺突蛋白的RBD中的特定残基，其刺突蛋白序列在SEQ ID NO:24中所描述。这些残基与结合剂“接触”。特别地，当如本文所公开的那样描述表位时，“接触”在本文中被定义为距离属于纳米抗体(VHH-72或本文也称为SARS VHH-72，或其变体)的任何残基(或原子)或特异性结合SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒中的RBD的任何其它感兴趣的结合剂(特别是与相同表位结合的任何所述结合剂)小于
Figure GDA0004045908510000441
小于
Figure GDA0004045908510000442
小于
Figure GDA0004045908510000443
或小于
Figure GDA0004045908510000444
并具有在与所述刺突蛋白的RBD结合方面具有一定的潜力胜过ACE2受体。
合理的药物设计
使用各种已知的建模技术，本申请的晶体结构可用于产生模型，用于评估化合物与SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒的相互作用，特别是与RBD的相互作用，或者反之亦然，用于评估新型表位模拟化合物的设计以及它们与本发明的结合剂的相互作用。如本文所用，术语“建模”包括基于原子结构信息和相互作用模型的分子结构和/或功能的量化和定性分析。术语“建模”包括传统的基于数字的分子动力学和能量最小化模型、交互式计算机图形模型、改进的分子力学模型、距离几何和其他基于结构的约束模型。分子建模技术可应用于SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒RBD结构域的原子坐标，以导出一系列3D模型并研究结合位点的结构，如与化学实体的结合位点。
这些技术也可用于筛选或设计能够结合SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒RBD结构域，或与本文公开的ISVD结合的小型和大型化学实体，并可调节SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒的中和。这种筛选可以采用立体3D筛选系统或计算筛选系统。这种建模方法是设计或选择具有与RBD结构域中已鉴定的结合位点或袋互补的立体化学互补性的化学实体。“立体化学互补性”是指该化合物与RBD结构域进行足够数量的能量上有利的接触，从而在与RBD结构域结合时具有自由能的净减少。“立体化学相似性”是指该化合物与附录I中所示的坐标所示的RBD结构域进行大约相同次数的能量上有利的接触。立体化学互补性是与排列在受体位点凹槽内的位点内表面残基相匹配的分子的特征，所述受体位点凹槽由为本发明的复合物提供的蛋白质数据库条目中列出的坐标列举，例如PDB 6WAQ。“匹配”是指识别的部分与表面残基相互作用，例如，通过氢键或通过非共价范德华力和库仑相互作用(与表面或残基)促进分子在位点内的溶解，以这种方式，分子在结合位点的保留在能量上是有利的。优选的是，立体化学互补性使得化合物对结合位点的Kd小于10-4M，更优选小于10-5M，更优选10-6M。在最特别的实施方案中，Kd值小于10-8M，更特别地小于10-9M。
许多方法可用于鉴定对RBD结合结构域的结构或亚结构具有立体化学互补性的化学实体。例如，该过程可以开始于基于从机器可读存储介质产生的PDB 6WAQ中的坐标，在计算机屏幕上目视检查RBD结构域中选定的结合位点。或者，选定的片段或化学实体可以在选定的结合位点内以各种方向定位或停靠。建模软件在本领域中是众所周知的并且是可获得的。该建模步骤之后可以使用标准可获得的分子力学力场进行能量最小化。一旦选择了合适的化学实体或片段，它们就可以组装成单一的化合物。在一个实施方案中，可以通过目视观察显示在计算机屏幕上的三维图像上的片段相对于RBD结合位点中所选结合位点或结合袋的原子坐标的相互关系来进行组装。接下来是手动建模，通常使用可用的软件。或者，可以使用标准的化学几何将片段连接到额外的原子上。化学实体的上述评估过程可以以类似于化学化合物的方式进行。
化学结构数据库可从许多来源获得，包括剑桥晶体学数据中心(CambridgeCrystallographic Data Centre)(英国剑桥)、分子设计有限公司(Molecular Design,Ltd.)(加州圣莱安德罗)、Tripos Associates，Inc.(密苏里州圣路易斯)、化学文摘社(Chemical Abstracts Service)(俄亥俄州哥伦布市)、可用化学品目录(the AvailableChemical Directory)(Symyx Technologies，Inc.)、德温特世界药物索引(WDI)、BioByteMasterFile、国家癌症研究所数据库(National Cancer Institute database，NCI)、Medchem数据库(BioByte Corp.)、锌对接数据库(加利福尼亚大学，Sterling andIrwin,J.Chem.Inf.Model，2015)，以及Maybridge目录(Maybridge catalogue)。一旦通过上述方法设计或选择了实体或化合物，就可以通过计算评估来测试和优化该实体或化合物结合RBD结构域或结合位点的效率。例如，已经设计或选择用作RBD结构域结合化合物的化合物还必须优选地穿过与天然RBD结构域结合时不与结合位点占据的体积重叠的体积。有效的SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒RBD结合化合物必须优选地在其结合态和自由态之间表现出相对较小的能量差异(即小的结合的变形能)。因此，最有效的RBD结合化合物应优选设计成结合的变形能不大于约10千卡/摩尔，特别是不大于7千卡/摩尔。RBD结合化合物可以与例如但不限于RBD结构域以一种以上的构象相互作用，所述构象在总结合能上相似。在这些情况下，结合的变形能被认为是游离化合物的能量和当化合物与蛋白质结合时观察到的构象的平均能量之间的差。此外，被设计或选择为与RBD结构域结合的化合物可以在计算上进一步优化，使得在其结合状态下，其优选缺乏与靶蛋白的排斥静电相互作用。
如上所述，一旦优化选择或设计了RBD结构域或SARS-冠状(SARS-CoV-1)病毒或SARS-CoV-2病毒或突变型SARS-CoV-2病毒结合化合物，那么可以在其一些原子或侧基中进行取代以改善或修饰其结合特性。通常，初始取代是保守的，即取代基团将具有与原始基团大致相同的大小、形状、疏水性和电荷。优选的保守取代是那些满足Dayhoff等人在Atlasof Protein Sequence and Structure,5,pp.345-352(1978&Supp.)中为可接受的点突变定义的标准的取代，该文献通过引用并入本文。保守取代的例子是包括但不限于下列基团的取代:(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。当然，应当理解，应当避免本领域已知的改变构象的组分。然后可以通过与上述相同的计算机方法分析这种取代的化合物对RBD域的拟合效率。
本领域可使用特定的计算机软件来评估复合变形能和静电相互作用。筛选/设计方法可以用硬件或软件或两者的组合来实现。然而，优选地，这些方法在可编程计算机上执行的计算机程序中实现，每个可编程计算机包括处理器、数据存储系统(包括易失性和非易失性存储器和/或存储元件)、至少一个输入设备和至少一个输出设备。将程序代码应用于输入数据以执行上述功能并生成输出信息。以已知方式将输出信息应用于一个或多个输出设备。例如，计算机可以是个人计算机、微型计算机或传统设计的工作站。每个程序优选地以高级过程或面向对象的编程语言实现，以与计算机系统通信。然而，如果需要，程序可以用汇编语言或机器语言来实现。在任何情况下，该语言都可以是编译语言或解释语言。每个这样的计算机程序优选地存储在通用或专用可编程计算机可读的存储介质或设备(例如，ROM或磁盘)上，用于在计算机读取存储介质或设备时配置和操作计算机，以执行本文描述的程序。该系统还可以被认为被实现为配置有计算机程序的计算机可读存储介质，其中如此配置的存储介质使计算机以特定和预定义的方式操作以执行本文所述的功能。
化合物
本文使用的术语“化合物”或“测试化合物”或“候选化合物”或“药物候选化合物”描述了任何天然存在的或合成的分子，其可以在测定中进行测试，例如筛选测定或药物发现测定，或特别是在用于鉴定能够中和冠状病毒，或者具体地在用于鉴定能够结合和中和SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒的化合物的方法中测试。因此，这些化合物包括有机和无机化合物。该化合物可以是小分子、化学物质、肽、抗体或ISVD或活性抗体片段。
本发明的化合物包括使用本发明的筛选方法设计或鉴定的化合物以及能够结合和中和如上定义的SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒的化合物。可以使用筛选方法产生能够结合和中和SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒的化合物，所述筛选方法基于使用对应于本文所述的RBD-VHH-72复合物的3D结构的原子坐标。使用本发明的方法鉴定或设计的候选化合物和/或化合物可以是任何合适的化合物，合成的或天然存在的，优选合成的。在一个实施方案中，通过本发明的方法选择或设计的合成化合物优选具有等于或小于约5000、4000、3000、2000、1000或更优选小于约500道尔顿的分子量，或者优选为肽。本发明的化合物优选在生理条件下可溶。此类化合物可以包含与蛋白质结构相互作用所必需的官能团，特别是氢键，并且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两个官能化学基团。该化合物可以包含被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。化合物还可以包含生物分子，包括肽、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。化合物可以包括，例如：(1)肽，例如可溶性肽，包括Ig尾融合肽和随机肽库的成员以及由D和/或L构型氨基酸制成的组合化学衍生分子库；(2)磷酸肽(例如随机和部分简并、定向磷酸肽库的成员)；(3)抗体(例如多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合和单链抗体、纳米抗体以及抗体的Fab、(Fab)2、Fab表达库和表位结合片段)；(4)非免疫球蛋白结合蛋白，例如但不限于高亲和性多聚体(avimers)、预设计锚蛋白重复蛋白(DARPins)和脂笼蛋白质类(lipocalins)；(5)基于核酸的适体；(6)有机和无机小分子。
合成化合物库从例如Maybridge Chemical Co.(Tintagel,Cornwall,英国)、AMRI(Budapest,匈牙利)和ChemDiv(圣地亚哥，加州)、Specs(代尔夫特，荷兰)、ZINC15(加利福尼亚大学)市售可得。此外，许多方法可用于多种有机化合物和生物分子的随机和定向合成，包括随机寡核苷酸的表达。或者，可以容易地产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库。此外，天然或合成的化合物库和化合物可通过常规的化学、物理和生物化学方法容易地修饰，并可用于产生组合库。此外，本领域已知许多产生组合库的方法，包括涉及生物库的方法；空间可寻址的平行固相或溶液相库；需要解卷积的合成库方法；“一珠一化合物(one-bead one-compound)”库法；和使用亲和层析选择的合成库方法。生物库方法限于多肽或肽库，而其他四种方法适用于多肽、肽、非肽寡聚体或化合物的小分子库。化合物还包括可以由基于片段的药物设计产生的先导物合成的化合物，其中通过将这种筛选片段浸泡或共结晶到本发明提供的晶体中，然后使其经受X射线束并获得衍射数据来评估这种化学片段的结合。本领域技术人员可以容易地应用差分傅立叶技术来确定这些片段在RBD结构中结合的位置，然后可以通过合成化学将这些片段组装成对SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒具有增强亲和力的更大化合物。此外，使用本发明的方法鉴定或设计的化合物可以是肽或其模拟物。本发明的分离的肽或模拟物可以是构象受限的分子，或者是构象未受限的分子，例如非受限的肽序列。术语“构象受限的分子”是指构象受限的肽和构象受限的肽类似物和衍生物。此外，氨基酸可以用多种未编码或修饰的氨基酸如相应的D-氨基酸或N-甲基氨基酸代替。其他修饰包括用化学相似的基团取代羟基、硫醇、氨基和羧基官能团。关于肽及其模拟物，可以引入其它非天然氨基酸或化学氨基酸类似物/衍生物的其它示例作为取代或添加。此外，可以使用肽模拟物。肽模拟物是模拟肽的生物活性但在化学性质上不再是肽的分子。根据严格的定义，肽模拟物是不再包含任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的分子。然而，术语肽模拟物有时用于描述本质上不再完全是肽的分子，例如假肽、半肽和类肽。无论是完全还是部分非肽，用于本发明的肽模拟物提供了反应性化学部分的空间排列，其非常类似于肽模拟物所基于的肽中活性基团的三维排列。
例如，肽或肽模拟物可以被设计成模拟本文所述表位的三维结构；并且可能作为免疫原或疫苗，作为人工抗原向受试者的免疫系统呈递构象表位。或者，公开了一种筛选方法，该方法筛选特异性结合本发明ISVD的人工肽抗原分子，以产生包含所述肽的新型疫苗，所述肽任选存在于合适的支架结构中。
通常，由于这种相似的活性位点几何结构，肽模拟物对与肽的生物活性相似的生物系统具有影响。有时使用给定肽的模拟物而不是肽本身是有利的，因为肽通常表现出两种不良特性：(1)生物利用度差；(2)作用时间短。肽模拟物提供了绕过这两个主要障碍的明显途径，因为所涉及的分子足够小，既具有口服活性，又具有较长的作用时间。与肽的肠胃外给药相比，肽模拟物可以口服给药，因此还可以节省大量成本，提高患者的依从性。此外，肽模拟物的生产通常比肽便宜。自然地，本领域技术人员将认识到肽模拟物的设计可能需要对使用本发明的方法设计或鉴定的化学结构进行轻微的结构改变或调整。通常，可以化学合成使用本发明的结合剂鉴定或设计的化合物或肽，然后使用本文所述的任何方法测试结合和中和SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒或本发明的ISVD的能力。本发明的肽或肽模拟物可用于筛选与SARS冠状病毒或2019新型冠状病毒的选定区域或选定构象结合的候选化合物的测定。结合可以通过共价或非共价相互作用，或两者兼而有之。非共价相互作用的示例包括静电相互作用、范德华相互作用、疏水相互作用和亲水相互作用。
药物组合物
另一方面提供了一种药物组合物，其包含本文提供的所述结合剂或核酸分子或重组载体，任选包含载体、稀释剂或赋形剂。“载体”或“佐剂”，特别是“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的佐剂”是任何合适的赋形剂、稀释剂、载体和/或佐剂，它们本身不会诱发产生对接受组合物的个体有害的抗体，也不会引起保护。“药学上可接受的”是指不是生物学上或其它方面不希望的物质，即该物质可以与化合物一起给药于个体，而不会引起任何不希望的生物效应或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体优选是在与活性成分的有效活性相一致的浓度下对患者相对无毒无害的载体，以便由载体引起的任何副作用不会损害活性成分的有益效果。优选地，药学上可接受的载体或佐剂增强由抗原引发的免疫反应。合适的载体或佐剂通常包含一种或多种包括在以下非穷尽列表中的化合物：大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。如本文所用，术语“赋形剂”旨在包括可存在于药物组合物中且不是活性成分的所有物质，例如盐、粘合剂(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇)、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、稳定剂、调味剂或着色剂。“稀释剂”，特别是“药学上可接受的载体”，包括载体，如水、盐水、生理盐溶液、甘油、乙醇等。此类载体中可以包含辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、防腐剂。本发明的多肽或缀合物和药学上可接受的载体的药学有效量优选是对所治疗的特定病症产生结果或施加影响的量。对于治疗，本发明的药物组合物可以根据标准技术给药于任何患者。可以通过任何合适的方式给药，包括口服、肠胃外、局部、鼻内、眼内、鞘内、脑室内、舌下、直肠、阴道等。其他制剂技术如纳米技术和气雾剂和吸入剂也在本发明的范围内。给药的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况、其他药物的同时给药、禁忌症和临床医生要考虑的其他参数。本发明的药物组合物可以冻干储存，并在使用前在合适的载体中重构。当制备成冻干物或液体时，需要向本发明的药物组合物中加入生理学上可接受的载体、赋形剂、稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition,Ed.Allen,Loyd V,Jr.(2012))。载体、赋形剂和稳定剂的剂量和浓度应该对受试者(人、小鼠和其他哺乳动物)安全，包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂如维生素C、小多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如PVP；氨基酸如氨基乙酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸；葡萄糖、二糖和其它碳水化合物如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇、山梨醇；抗衡离子如Na+和/或表面活性剂如吐温TM、PLURONICSTM或PEG等。含有本发明药物组合物的制剂在注射前应进行灭菌处理。该过程可以在冻干和重构之前或之后使用无菌过滤膜来完成。药物组合物通常填充在具有无菌入口的容器中，例如具有软木塞的静脉注射溶液瓶。
另一方面涉及本发明的结合剂、核酸分子或药物组合物用作药物。更具体地，本发明的结合剂、核酸分子或药物组合物用于预防，以防止受试者的病毒感染。或者，本发明的结合剂、核酸分子或药物组合物用于治疗冠状病毒感染的受试者，例如患有COVID19疾病的患者。具体实施方案涉及本发明的结合剂用于治疗患有冠状病毒感染的哺乳动物，更具体地用于治疗哺乳动物，例如人类，用于治疗2019新型冠状病毒感染。在一个具体的实施方案中，本发明的结合剂核酸分子或药物组合物用于治疗SARS冠状病毒突变体的感染，特别是新出现的刺突蛋白突变体的感染，例如但不限于位置N439、S477、E484、N501或D614的突变体，如SEQ ID NO:23中所示，描述了SARS-CoV-2刺突蛋白氨基酸序列。
关于二级结构预测的614位D到G和47位S到N的突变显示二级结构没有变化，同时保留在卷曲区域，而501位N到Y的突变从卷曲结构变为延伸链。基于对接研究，与D614G和S477N相比，N501Y突变对人ACE2蛋白具有更高的亲和力。根据对水貂和人类之间衍生的SARS-CoV-2的比较，D614G刺突突变被鉴定存在于两个宿主之间。需要进一步研究水貂突变N501T和人类突变N501Y之间的联系，后者已演化为一个独立的变体。
另一个具体实施方案涉及预防性处理，优选使用0.5mg/kg至25mg/kg范围内的单剂量结合剂。或者，设想用0.5mg/kg至25mg/kg范围内的单剂量结合剂进行治疗性处理。
进一步的实施方案提供了使用结合剂或药物组合物的治疗，其中受试者通过静脉注射、皮下注射或鼻内给药。或者吸入和肺部给药也在范围内。
本发明的另一个实施方案涉及一种治疗受试者的方法，通过向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的结合剂，以抑制、预防和/或治愈所述受试者的冠状病毒感染。所述治疗方法可以具体涉及对由SARS冠状病毒感染引起的病症的预防性和/或治疗性处理。
最后一个方面涉及本文所述的结合剂在检测方法中的用途，所述检测方法通过结合到本文所述的病毒刺突蛋白的RBD的结合位点来检测病毒颗粒或刺突蛋白。所述方法可以是体外方法，或者使用包含病毒蛋白或颗粒的受试者样品。可以使用本文所述的结合剂的标记变体来分析样品，所述标记可以是可检测标记和/或标签。因此，本文所用的标记或标签在本文中是指允许检测和/或量化本文所述的病毒颗粒或蛋白质或结合剂的可检测标记或标签，并意在包括本领域已知的用于这些目的的任何标记/标签。特别优选但不限于亲和标签，例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚(His)(例如，6x His或His6)、生物素或链霉亲和素，例如
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Strep-tag
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和
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增溶标签，例如硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)和SUMO；色谱标签，例如FLAG-标签；表位标签，如V5-tag、myc-tag和HA-标签；荧光标记或标签(即荧光染料/荧光团)，例如荧光蛋白(例如GFP、YFP、RFP等)和荧光染料(例如FITC、TRITC、香豆素和花青)；发光标记或标签，例如萤光素酶、生物发光或化学发光化合物(例如鲁米那(luminal)、异鲁米诺(isoluminol)、热化吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)；磷光标记；金属螯合剂；和(其他)酶标记物(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或葡萄糖氧化酶)；放射性同位素。还包括任何前述标记或标签的组合。用于产生标记的多肽和蛋白质的技术是本领域众所周知的。包含本发明的含ISVD的结合物、偶联或进一步包含标记或标签的结合剂允许例如对所述结合的病毒颗粒进行基于免疫的检测。基于免疫的检测在本领域是众所周知的，并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于对标记或标记物的检测，例如上文所述。参见例如美国专利第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241号。在多种抗体与单个阵列反应的情况下，可以用不同的标记或标签标记每种抗体，用于同时检测。又一个实施方案可以包括引入一种或多种可检测标记或其它产生信号的基团或部分，或标签，这取决于本发明标记或标签的结合剂的预期用途。其他合适的标记对技术人员来说是清楚的，例如包括可以使用NMR或ESR光谱学检测的部分。本文公开的这种标记的基于ISVD的结合剂可以例如用于体外、体内或原位测定(包括本身已知的免疫测定，如ELISA、RIA、EIA和其它“夹心测定”等)以及体内成像目的，这取决于特定标记的选择。
一个具体的实施方案公开了任选地以标记形式的结合剂用于检测病毒或所述病毒的刺突蛋白的用途，其中所述病毒选自进化枝1a、1b、2和/或进化枝3蝙蝠SARS相关的沙贝病毒，例如SARS-Cov-2、GD-Pangolin、RaTG13、WIV1、LYRa11、RsSHC014、Rs7327、SARS-CoV-1、Rs4231、Rs4084、Rp3、HKU3-1或BM48-31病毒。
在本发明的另一个可供选择的方面，本文所述的(任选地带有标记的)任意结合剂，或编码所述结合剂的任意核酸分子，或本文所述的任意组合物或载体也可用作本文所述的冠状病毒的诊断剂或检测剂。诊断方法是技术人员已知的，并且可以涉及来自受试者的生物样品。体外方法也可以在使用本文所述的结合剂检测病毒蛋白或颗粒的范围内。最后，本文所述的任选标记的结合剂也适用于体内成像。
应当理解，尽管本文已经针对根据本公开的方法、样品和生物标志物产品讨论了特定实施方案、特定配置以及材料和/或分子，但是可以在形式和细节上进行各种改变或修改而不脱离本发明的范围。提供以下实施例以更好地说明特定的实施方案，它们不应被视为对本申请的限制。本申请仅受权利要求的限制。
实施例
实施例1.分离SARS VHH-72
美洲驼用SARS-CoV S蛋白进行皮下免疫两次，再用MERS-CoV S蛋白进行皮下免疫两次，第五次用SARS-CoV S蛋白进行皮下免疫，第六次用SARS-CoV和MERS-CoV S蛋白进行皮下免疫。重组S蛋白稳定在融合前构象中52。免疫后，从美洲驼中分离外周血淋巴细胞，构建了一个约3×108个克隆的免疫VHH噬菌体展示库。通过在含有SARS CoS的纯化重组foldon上对重组噬菌体进行两轮生物淘选来选择SARS CoV S特异性VHH，所述纯化重组foldon使用抗foldon单克隆抗体固定在微量滴定板的孔中。通过预先在人呼吸道合胞病毒衍生的含有C末端foldon的DS-Cav1上淘选噬菌体库，去除foldon特异性噬菌体53。接下来，从淘选后获得的单个噬粒克隆制备周质提取物，并通过ELISA在SARS CoV S蛋白结合中评估这些提取物中VHH的特异性。所选的VHH之一显示出与SARS CoV S蛋白的强结合，该蛋白被保留用于进一步分析，本文中将其命名为SARS VHH-72。SARS VHH-72的序列在SEQ IDNO:1中描述。
实施例2.SARS VHH-72与SARS-CoV S、SARS-CoV RBD、WIV1-CoV RBD和2019-nCoVRBD的结合
SARS VHH-72基因融合到His标签，在毕赤酵母中表达，并通过镍-NTA亲和层析从酵母培养基中纯化。随后在ELISA中使用纯化的SARS VHH-72来确认与全长SARS CoV S的结合，并评估与SARS CoV S的RBD或N-末端结构域的结合。我们发现SARS VHH-72与全长S以及RBD结合，但不与SARS CoV的N-末端结构域结合(图1)。我们还通过表面等离子体共振(SPR)确定了SARS VHH-72与纯化的重组SARS CoV、WIV1 CoV和2019-nCoV RBD的结合动力学。WIV1-CoV是一种在蝙蝠中发现的新型冠状病毒，与SARS-CoV密切相关，并利用ACE2作为宿主细胞受体。使用Biacore X100(GE Healthcare)将带His标签的SARS VHH72以每周期约400个响应单位(RU)的水平固定在NTA传感器芯片的单个流动池上。使用0.35M EDTA和0.1MNaOH，接着使用0.5mM NiCl2对芯片进行双重再生。将仅包含运行缓冲液(由10mM HEPES pH8.0、150mM NaCl和0.005％吐温20组成)的三个样品注射到配体和参比流动池上，随后将SARS-CoV RBD、WIV1-CoV RBD或2019-nCoV RBD从50-1.56nM连续稀释，复制品的浓度为3.1nM。使用Biacore X100评估软件对所得数据减去双重参考并拟合到1:1结合模型。
该SPR分析显示SARS VHH-72和相应RBDs之间相互作用的解离常数最低为SARSCoV RBD(1.15×10-9M；相互作用最强)，其次为WIV1 CoV RBD(7.47×10-9M)和2019-nCoVRBD(38.68×10-9M)(见图2)。我们的结论是，SARS VHH-72对WIV1-CoV和2019-nCoV RBD表现出高结合亲和力，表明它在相关的冠状病毒SARS-CoV、WIV1-CoV和2019-nCoV之间具有交叉反应性。
实施例3.由SARS VHH-72识别的SARS CoV RBD上的表位
在确定了SARS VHH-72识别SARS S的RBD之后，我们确定了SARS VHH-72与SARSCoV RBD(SEQ ID NO:26)的复合物的共晶体结构。将编码SARS VHH-72和具有C-末端HRV3C切割位点和单体人Fc标签的SARS-CoV S的320-502位残基的质粒共转染到几夫碱(kifunensin)处理过的FreeStyle 293F细胞中。用蛋白A树脂纯化细胞上清液后，用HRV3C蛋白酶和糖苷内切酶H处理固定化复合物，以除去标签和聚糖。使用Superdex 75柱在2mMTris pH 8.0、200mM NaCl和0.02％ NaN3中对处理过的复合物进行尺寸排阻色谱。然后将纯化的复合物浓缩至10.00mg/mL，并用于制备悬滴结晶托盘。将在0.1M Tris pH 8.5、0.2MLiSO4、0.1M LiCl和8％ PEG 8000中生长的晶体浸泡在补充有20％甘油的母液中，并在液氮中冷冻。在SBC光束线19-ID(APS，阿贡国家实验室)以
Figure GDA0004045908510000531
的分辨率收集衍射数据。
复合物的衍射数据在AIMLESS中进行缩放之前，使用iMOSFLM进行索引和整合。SARS-CoV RBD+SARS VHH-72数据集在PhaserMR中使用来自PDBs 2AJF和5F1O的坐标作为搜索集合通过分子替换进行定相。晶体学软件包由SBGrid负责。
这种复合物的晶体在空间群P3121中生长，衍射X射线的分辨率为
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由此产生的结构揭示了SARS VHH-72和SARS-CoV RBD之间广泛的氢键网络，CDR 2和3包含了结合界面处
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埋藏表面积的大部分(图3)。尽管SARS VHH-72表位覆盖了SARS-CoV RBD上的一大片表面积，但它与ACE2结合界面没有明显重叠。然而，如果ACE2与SARS VHH-72结合的RBD结合，我们预测在SARS VHH-72的CDR远端框架和ACE2之间会形成相当大的空间冲突(图3)。
SARS VHH-72通过与其CDR 2和3形成广泛的氢键网络与SARS-CoV RBD结合(图3)。来自SARS VHH-72CDR2的Ser56同时与来自SARS-CoV RBD的三个残基Leu355、Tyr356和Ser358的肽骨架形成氢键。Ser358的肽骨架也与来自CDR2的相邻Thr57的骨架形成氢键。Asp61和Arg426之间形成的盐桥将CDR2的C-末端与SARS-CoV RBD相连。SARS VHH72 CDR3的N-末端形成短的β链，其与来自SARS-CoV RBD的β链配对以桥接这两个分子之间的界面。这种相互作用由来自SARS-CoV RBD的Gly98、Val100和Val100a到Cys366和Phe364的骨架氢键介导。来自SARS VHH72CDR3的Glu100c与来自SARS-CoV RBD的Ser362和Tyr494的侧链羟基形成氢键。相邻的CDR3残基也通过在Trp100d的吡咯氮和Thr363的羟基之间形成盐桥而参与侧链特异性相互作用。Asp101通过与SARS CoV RBD的Lys365形成盐桥而参与了CDR3的大部分C末端相互作用。SARS VHH72的CDR 2和3与SARS-CoV RBD之间形成的广泛相互作用有助于解释我们在这些分子之间观察到的高亲和力结合。
此外，对可用SARS-CoV菌株序列的分析揭示了构成SARS VHH-72表位的残基的高度保守性(见图3)。SARS VHH-72表位中的这种高度的序列保守性，加上SARS VHH-72对SARS-CoV RBD的高亲和力，表明这种分子在未来SARS-CoV和类似SARS-CoV的疫情中可能是一种有吸引力的潜在治疗剂。
SARS-CoV和2019-nCoV都可以使用ACE2作为宿主细胞受体。然而，从这两个RBD的氨基酸序列比对中可以看出，SARS-CoV和2019-nCoV的RBD之间存在相当大的序列差异(图5)。然而，值得注意的是，直接参与SARS-CoV RBD与SARS-VHH-72相互作用的10个残基中有9个在2019-nCoV的RBD中是相同的(图5)。SARS-CoV RBD与SARS-VHH-72的接触残基的这种高度序列相似性与SARS-VHH-72与重组纯化的2019-nCoV RBD的结合一致(见图2)。
实施例4.SARS CoV VHH-72阻止与ACE2受体相互作用
基于我们的结构分析，我们假设SARS VHH-72可以中和其病毒靶点的机制是通过阻断SARS-CoV的RBD与其宿主细胞受体之间的相互作用。为了测试这一假设，我们进行了基于生物层干涉测量法(BLI)的测定，其中SARS-CoV RBD被固定在生物传感器尖端，浸入SARSVHH-72或阴性对照VHH，然后浸入含有重组、可溶性宿主细胞受体ACE2的孔中(图4)。为此，在用于捕获Fc标记的SARS-CoV RBD之前，将抗人捕获(AHC)尖端(FortéBio)在由10mMHEPES pH 7.5、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％吐温20和1mg/mL BSA组成的运行缓冲液中浸泡20分钟，以在Octet RED96(FortéBio)中达到0.8nM的水平。然后将尖端浸入100nM阴性对照VHH或100nM SARS VHH-72中。接下来将尖端浸入含有1μM ACE2的孔中，并添加纳米抗体(尖端已经浸入其中以确保饱和)。基于在浸入含有ACE2或DPP4的最终孔组之前进行的基线测量，在Octet数据分析软件v11.1(FortéBio)中减去参考数据并相互对齐。
我们发现，当将涂有SARS CoV RBD的尖端浸入阴性对照VHH中，然后浸入ACE2中时，观察到强烈的响应信号，表明阴性对照VHH之间没有发生可能破坏SARS-CoV RBD与其受体之间的关联的非特异性相互作用。然而，当涂有SARS-CoV RBD的尖端被浸入SARS VHH-72中，而SARS-72浸入ACE2中时，响应只有很小的增加，这可能归因于受体结合。这些结果支持我们的结构分析，即SARS VHH-72能够通过阻止宿主细胞受体结合来中和其病毒靶点。
实施例5.SARS VHH-72可以中和SARS S假型慢病毒
为了评估SARS-CoV VHH-72的抗病毒活性，使用SARS-CoV Urbani病毒进行了体外中和测定。先前已经描述了假型慢病毒的病毒中和检测方法54。简而言之，表达SARS-CoVUrbani(GenBank ID:AAP 13441.1)或2019-nCoV S(刺突蛋白序列在SEQ ID NO:23中描述)的刺突基因的假病毒通过在293T细胞中共转染编码荧光素酶报告基因、慢病毒骨架和刺突基因的质粒而产生55。将系列稀释的VHH与假病毒混合，在室温下孵育30分钟，然后加入到先前铺板的Huh7.5细胞中。72h小时后，细胞裂解，并测量相对荧光素酶活性。将未感染的细胞视为100％中和，将仅用假病毒转导的细胞视为0％中和，计算中和百分比。基于S形非线性回归确定IC50滴度。该中和测定表明SARS VHH-72能够中和SARS-CoV Urbani病毒，IC50值为0.14g/mL。
实施例6.SARS VHH-72人IgG Fc融合构建体和其他二价构建体
我们还在SARS VHH-72和人IgG1和IgG2衍生的Fc结构域之间生成了基因融合。SARS VHH-72与人IgG1的铰链区直接相连。IgG2的铰链区被人IgG1的铰链取代，以生成SARSVHH-72融合构建体。用于将SARS VHH-72融合到IgG1和IgG2 Fc结构域的其它接头包含(G4S)2-3。此外，我们使用具有已知半衰期延长的Fc变体，例如M257Y/S259T/T261E(也称为YTE)或LS变体(M428L与N434S组合)57。这些突变增加了常规抗体的Fc结构域与新生受体(FcRn)的结合。此外，我们构建了SARS VHH-72的同二价串联遗传融合体，其中两个拷贝被柔性接头如(G4S)2-3分离。后一种构建体在SEQ ID NO:12中有描述。这种串联重复构建体可以增加亲和力，并且对于一些其他病毒，可以增加抗病毒VHH的中和广度和效力58。
如上所述，使用ELISA和SPR评估SARS VHH-72的这些融合构建体与SARS CoV和2019-nCoV S的结合以及与RBD的结合。此外，这些在病毒中和测定中使用如上所述的假型病毒进行测试(例如实施例7)。还用SARS CoV和2019-nCoV菌株进行了体外抗病毒活性测试。
在另一个实施例中，我们将SARS VHH-72融合到人血清白蛋白特异性VHH，如WO2019016237、WO2004041865或WO2006122787中所述。由此产生的融合使VHH与血清白蛋白结合，因此提供了延长的半衰期。
实施例7.VHH-72阻止ACE2与2019-nCoV的RBD(2019-nCoV RBD-SD1)结合
在用于捕获Fc标记的MERS-CoV RBD、Fc标记的SARS-CoV RBD或Fc标记的2019-nCoV RBD-SD1之前，将抗人捕获(AHC)尖端(FortéBio)在由10mM HEPES pH 7.5、150mMNaCl、3mM EDTA、0.005％吐温20和1mg/mL BSA组成的运行缓冲液中浸泡20分钟，以在OctetRED96(FortéBio)中达到0.8nM的水平。然后将尖端浸入100nM的VHH-55或100nM的VHH-72中。接下来，将尖端浸入含有100nM DPP4或1μM ACE2的孔中，并添加纳米抗体(尖端已经浸入其中以确保饱和)。基于在浸入含有DPP4或ACE2的最终孔组之前进行的基线测量，在Octet数据分析软件v11.1(FortéBio)中减去参考数据并相互对齐(数据如图6所示)。
实施例8.VSV假型中和测定
此外，我们还使用先前报道的方案进行了VSV假型中和测定，以生成此类报告病毒并评估中和作用(Hoffmann,M.等人(2020)Cell 181,1-10)。我们发现VHH-72融合到人IgG1Fc(SEQ ID NO:13)并分泌到转染的293T细胞的无血清培养基中，可以中和2019-nCoV和SARS-CoV刺突假型病毒，而含有GFP结合蛋白的阴性对照上清液无法做到这一点(见图7)。VHH-72Fc融合体未能中和MERS-CoV刺突假型病毒。纯化的VHH-72可以中和SARS-CoV，但不能中和2019-CoV假型病毒(图7D-F)。VHH-55中和了MERS-CoV，但没有中和SARS-CoV或2019-nCoV假型病毒(图7D-F)。
实施例9.用VHH-72IgG1 Fc抗体对仓鼠进行预防性处理可防止SARS-Cov-2感染
与分泌到转染的293T细胞的无血清培养基中的人IgG1 Fc(SEQ ID NO:13)融合的VHH-72示出通过VSV假型中和测定，VHH-72能够中和2019-nCoV和SARS-CoV刺突假型病毒(实施例8)。
在对SARS-CoV-234高度敏感的叙利亚仓鼠中，进一步评估了SARS VHH-72融合构建体的预防性用途。在仓鼠鼻内接种2019-nCoV(本文也称为SARS-Cov-2)前1天，用中和β冠状病毒特异性单结构域抗体VHH-72Fc10和人恢复期血浆对野生型仓鼠进行预防性处理。在感染后4天产生的肺样品中测量了病毒RNA载量，其用作病毒载量量化的指标(图8A和B)。VHH-72Fc抗体以20mg/kg的剂量使用。与单剂量的恢复期血浆(其不会显著降低肺部病毒载量)不同，与未经治疗的对照动物相比，VHH-72-Fc预治疗使肺部病毒载量降低了约105倍。
实施例10.VHH-72变体的设计及IgG Fc融合构建体在毕赤酵母中的表达
此前，我们鉴定了VHH-72与SARS-CoV-1的RBD结构域结合，并且证明其能够与SARS-CoV-2的RBD结构域结合。VHH-72和SARS-CoV-1的RBD结构域之间的共晶体结构用PDB6WAQ提供的三维结构的原子坐标来确定。基于VHH72与SARS-CoV-1 RBD的共晶体结构和融合前构象23中SARS-CoV-2刺突的cryo-EM结构，预测了VHH72的几种变体，它们可能对SARS-CoV-2 RBD具有更高的亲和力。使用目视检查和分子建模生成一组VHH-72突变蛋白，其与SARS-CoV-2 RBD的结合可能得到改进(见图9至11)。变体(和VHH-72对照序列，和VHH-72的人源化变体)在本申请的序列表中描述。通过基于MoClo Golden Gate的模块化克隆系统，将VHH72及其变体克隆到毕赤酵母(别名为Komagataella phaffii)表达载体中，如下所示：毕赤酵母pGAP启动子控制一个编码序列，该编码序列由不含EAEA四肽的酿酒酵母α-交配因子前原分泌先导物组成，与没有起始密码子的VHH-72突变蛋白的编码序列融合，直接与hIgG1铰链和Fc融合，或通过(GGGGS)×2接头与hIgG1铰链和Fc融合，并以终止密码子终止。转录被毕赤酵母AOX1转录终止子终止。该载体包含Zeocin选择盒、氨苄青霉素选择标记和用于载体在大肠杆菌中繁殖的ColE1复制起点。后三个元素的两侧为LoxP位点。
通过这种方式，变体VHH-72Fc融合体的表达由组成型甘油醛磷酸脱氢酶启动子控制。将构建体转化到具有抑制OCH1p活性的Komagataella phaffii菌株NRRLY11430中，以降低N-糖基化异质性。从每个转化中随机选择两个克隆，用于分析所需VHH-Fc融合体在酵母生长培养基中的表达。将各个酵母克隆接种在2mL BMDY(2％葡萄糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物、1.34％酵母氮碱，在pH 6.0下用100mM磷酸钾缓冲液缓冲)培养基中，该培养基置于用透气膜密封的24方壁圆底孔板中，在28℃的培养箱中以225rpm转速摇动，两天后，收获培养物并通过离心除去酵母细胞。将一部分上清液(27微升)加载到用考马斯蓝染色的SDS PAGE凝胶(4-20％梯度)上。除了VHH72_S52A-(GGGGS)×2-hIgG1.Hinge-hIgG1.Fc构建体外，所有VHH-Fc融合体的表达通过对粗酵母培养上清液进行考马斯染色检测到。基于加载的纯化参考材料(GFP-结合蛋白Fc＝GBP-Fc)，我们估计酵母培养物在约35-50mg/L的浓度下表达了所需的VHH-Fc融合体(见图12-14)。
实施例11.IgG Fc融合构建体在哺乳动物细胞中的表达
对于哺乳动物表达测试，将一系列与SARS-VHH72 VHH的C-末端相连的Fc变体克隆到pcDNA3.3表达载体中。这些Fc变体可能赋予嵌合抗体不同的特性，例如灵活性、Fc-受体接合、体内半衰期延长。图15和16示出了瞬时表达的构建体的实施例。
用不同的VHH-Fc融合体瞬时转染悬浮适应、无血清适应的HEK293-S细胞。为此，将细胞向下旋转并重新悬浮在Freestyle-293培养基中，达到每毫升3×106个细胞的密度。每2.5mL细胞分装在50mL生物培养管中，并在37℃和5％ CO2下在摇床(200rpm)上进行培养。对于每个构建体，向细胞中加入11.125μg表达质粒和0.125μg编码SV40大T抗原的质粒的组合(以增强表达)。在摇床上孵育5分钟后，将22.5μg线性化25kDa聚乙烯亚胺(PEI)加入细胞/DNA混合物中。转染5小时后，将等量(2.5mL)的ExCell-293培养基加入到转染的细胞中，以停止转染并提供必要的生长因子。转染后三天，收获粗细胞上清液并加载到SDS-PAGE上，随后进行考马斯蓝染色或使用单克隆兔抗VHH抗体或抗人IgG免疫血清进行蛋白质印迹分析(见图15和16)。我们注意到，由于事后发现的无意移码，无法检测到构建体VHH72-GSGGGGSGGGGS-hIgG1Hinge-hIgG1Fc_YTE的表达。
实施例12.变体VHH72-hFc融合体的生物膜层干涉测量法(BLI)筛选
毕赤酵母表达的VHH72-hIgG1 Fc变体的RBD结合特性通过生物膜层干涉测量法进行筛选。将10至20μg/mL小鼠IgG1 Fc融合SARS-CoV-2-RBD(Sino Biological)固定在抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器(FortéBio)上。将表达变体VHH-72-Fc融合体的毕赤酵母OCH-培养物沉淀，并将粗细胞上清液在动力学缓冲液(10mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl，1mg/mL牛血清白蛋白，0.05％吐温-20和3mM EDTA)中稀释50倍。在30℃下测量对RBD的亲和力。在动力学缓冲液中以50倍稀释的非转化毕赤酵母OCH上清液中测量基线和解离。在分析期间，生物传感器通过暴露于再生缓冲液(10mM甘氨酸pH 1.7)三次20秒进行再生。使用ForteBio Data Analysis 9.0软件，在整体1:1模型中拟合非饱和曲线的缔合和解离，并确定解离过程中响应信号的减少。与纯化的VHH-hFc蛋白相比，基于考马斯染色的SDS-PAGE上的条带强度来估计蛋白浓度(见图17-21)。
类似地，转染的HEK293T细胞表达的VHH72-hIgG1 Fc变体的RBD结合特征也通过生物膜层干涉测量法进行评估。将10至20μg/mL小鼠IgG1 Fc融合SARS-CoV-2-RBD(SinoBiological)固定在抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器(FortéBio)上。沉淀未转染的HEK293T细胞和表达VHH72-hIgG1 Fc的HEK293T细胞，并在动力学缓冲液中制备三倍稀释系列的粗细胞上清液。在30℃下测量HEK293T上清液中VHH72-hIgG1 Fc的RBD亲和力，在动力学缓冲液中等量稀释的未转化HEK上清液中测量基线和解离。在分析期间，生物传感器通过暴露于再生缓冲液(10mM甘氨酸pH1.7)三次20秒进行再生。使用ForteBio Data Analysis9.0软件，在整体1:1模型中拟合非饱和曲线的缔合和解离。与纯化的VHH-hFc蛋白相比，基于考马斯染色的SDS-PAGE上的条带强度来估计蛋白浓度。报告的近似kD、kon和koff值是两次重复测量的平均值和伴随的标准偏差(见图22)。
实施例13.流式细胞术
为了测试VHH-72变体与SARS-CoV-2刺突结合的能力，使用GFP表达质粒与SARS-CoV或SARS-Cov-2 S的表达质粒组合转染的细胞进行流式细胞术分析。毕赤酵母克隆的培养基(在PBS+0.5％BSA中稀释1/20)与转染的细胞一起孵育，所述毕赤酵母克隆表达与具有GS或GS(G4S)2接头的人IgG1 Fc融合的SARS VHH-72的不同变体。通过AF633缀合的山羊抗人IgG抗体检测SARS VHH-72变体与细胞的结合。柱代表GFP表达细胞(GFP+)的AF633平均荧光强度(MFI)除以GFP阴性细胞(GFP-)的MFI(见图23)。
实施例14.变体VHH-72IgG Fc融合构建体的体内保护
评估了几种变体VHH-72IgG Fc融合构建体对用SARS-CoV-2攻击的ACE2转基因小鼠的预防性和治疗性用途。这些小鼠表达人ACE2，并且容易受由SARS-CoV-2感染引起的疾病的影响(McRay，PB等人(2007)J.Virol.81,813-821)。在用SARS-CoV-2攻击感染前1天，用SARS VHH-Fc和上述其它融合构建体对小鼠进行预防性处理，并监测发病率(体重变化、肺部炎症、肺部免疫细胞浸润)。变体VHH-72IgG融合构建体经鼻内或静脉内给药到小鼠。还监测攻击后肺和脑中的病毒复制，以评估变体VHH-72IgG融合构建体的抗病毒活性。在最后一组实验中，首先用SARS-CoV-2感染ACE2转基因小鼠，并在感染后第1天用变体VHH-72IgG融合构建体进行治疗。变体VHH-72IgG融合构建体以0.5至5mg/kg的剂量范围用于预防和治疗。
实施例15.VHH72结合SARS-CoV-2刺突蛋白中的保守表位
进一步研究VHH72变体对SARS-CoV-1和-2 RBD的亲和力增强和对SARS-CoV-1与-2的中和活性增强，揭示了几种具有潜在增加治疗价值的多价融合构建体形式。如本领域技术人员所知，融合构建体的进一步测试还包括人源化取代和具有或不具有Fcγ受体功能的Fc，以选择最合适的结合剂。重要的是，所选择的分子显示在CHO细胞中以非常高的水平表达，并表现出突出的同质性和生物物理稳定性。
通过FastContact14对VHH72-RBD复合物的分子动力学模拟快照的自由能贡献分析表明，该表位具有一个突出的双残基热点，由与VHH72的Asp100g离子接触的Lys378和主要与VHH72接触的Val100的Phe377组成(图24a)。当三聚体刺突蛋白具有至少一个“向上”构象的RBD时，表位是可接近的(图24b)10。迄今为止，从恢复期SARS-CoV-2感染患者(包括那些处于病程演变阶段的患者)中分离出的数十种人类IgG中，其中只有两种识别出与VHH72的表位基本重叠的表位，即EY6A15和COVA1-1616。从恢复期SARS-CoV-1患者17分离的CR3022表位和人源化小鼠单克隆抗体H01418与VHH72的表位部分重叠。
在融合前刺突蛋白的三RBD“向下”状态中，VHH72的表位属于封闭区，该封闭区与两个相邻的RBD互补(图24c)，也在七肽重复1和中央螺旋之间的螺旋-转角-螺旋处接触S2结构域的顶部。这种微妙的RBD间和S1/S2间的界面对于保持免疫逃避的三RBD“向下”融合前状态和构象动力学非常重要，这种构象动力学允许一个或多个RBD的间歇性“向上”RBD定位，这是完全暴露ACE-2识别区所需要的。这些功能限制可能严重限制了病毒对VHH72表位上的天然或疫苗诱导的人类免疫压力的突变逃逸。与此一致，VHH72表位具有非常低的漂移水平。分子动力学和FastContact分析预测，只有变体Lys378Asn(在分析的62,000多个SARS-CoV-2病毒基因组中仅观察到两次)会破坏与VHH72的相互作用(表1)。在表位中最常观察到的变体为Asn439Lys，它是一种类似于SARS-CoV-1 RBD序列中Arg的逆转，恢复了与VHH7210的Asp61的有益离子相互作用。此外，深度突变扫描分析表明VHH72表位与RBD的一个区域大部分重叠，在该区域中突变可能严重破坏折叠，进一步支持该表位可能是sarbecoviridal RBD19上最稳定的序列区域之一的断言。
表1.h1_VHH72_S56A表位处报告的SARS-CoV-2 RBD变体及其对识别的预测影响。
Figure GDA0004045908510000611
FastContact计算了与h1_VHH72_S56A复合的SARS-CoV-2 RBD变体的5纳秒分子动力学运行中，每0.5纳秒快照的界面相互作用静电和脱溶自由能(kcal/mol),以及它们的平均值。预测Lys378Asn变体(用*表示)会严重损害识别能力，而预测最常观察到的Asn439Lys变体(用**表示)会改善结合。
实施例16.鉴定具有增加的病毒中和活性的VHH72变体
为了进一步改善VHH72与SARS-CoV-2 RBD的结合，使用结构导向的分子建模方法，在沿着副表位的若干位置引入突变。由于在我们开始研究时还没有SARS-CoV-2RBD结构可用，因此通过I-TASSER服务器20获得了SARS-CoV-2 RBD的模型，该模型通过Swiss-PdbViewer21叠加到SARS-CoV-1 RBD(PDB代码：6WAQ链D)与VHH72复合物的晶体结构上(图24d)。在VHH72表位处或其附近，SARS-CoV-1和-2的RBD之间只有三个残基不同：(1)Ala372(SARS-CoV-1中的Thr359)，导致Asn370(SARS-CoV-1中的Asn357)上没有聚糖；(2)Asn439(SARS-CoV-1中的Arg426)，导致与VHH72的Asp61失去离子相互作用；和(3)Pro384(SARS-CoV-1中的Ala371)。Pro384靠近Tyr369(SARS-CoV-1中的Tyr356)，对于Tyr 369，I-TASSER预测了不同的构象：在SARS-CoV-2 RBD模型中指向上方，而在SARS-CoV-1 RBD-VHH72共晶体结构中，该酪氨酸指向下方，并位于RBD的两个小螺旋之间的凹槽状凹陷中。Tyr369的向上构象将其置于VHH72的一个主要疏水的小空腔中，与残基Ser52、Trp52a、Ser53、Ser56(均在CDR2中)和Val100(CDR3)接触(图24d)。用Gromacs进行的分子动力学模拟表明，Tyr369可以很容易地被容纳在该空腔中。然而，该模型揭示了与Ser56的羟基功能的极性/疏水性不匹配，这指向Tyr369芳香系统的中心。事实上，不同突变体的结合实验表明，VHH72Ser56Ala取代产生了实质性的结合改善(见下文和图25)。在FastContact 2.0服务器14上查阅分子动力学模拟的时间框架表明，Ser56Ala突变体的结合增益主要是由于局部脱溶效应，这表明Ser56Ala使得VHH72的小空腔中的水分子更容易被Tyr369取代。同时出现了许多含有SARS-CoV-2 RBD的cryo-EM或晶体结构(例如PDB条目6vsb、6m17和6vxx)23-25，其中大多数显示了与Tyr369相同的向上构象。我们假设Tyr369以及其在SARS-CoV-1 RBD中的Tyr356对应物可以翻转成向上或向下的位置，并且SARS-CoV-2 RBD中的向上位置主要由于附近的Pro384(SARS-CoV-1中的Ala371)。值得注意的是，在I-TASSER SARS-CoV-1 RBD模型中，Tyr365也指向上方，但cryo-EM或晶体结构总是显示出向下的构象，如在SARS-CoV-1 RBD中观察到的相应Tyr352一样(图24d)。
实施例17.通过生物膜层干涉测量法(BLI)测定单价人源化VHH72变体的结合亲和力
基于与人IGHV3-JH共有序列(下文称为VHH72_h1(SEQ ID NO:2))的序列比较，我们通过突变框架区域1、3和4使VHH72人源化，并进一步通过保守地将位置1的Q或E替换为D，产生VHH72_h1(E1D)(SEQ ID NO:3)。随后将S56A突变引入人源化变体，产生VHH72_h1(S56A)(SEQ ID NO:5)和vhh 72_h1(E1D；S56A)(SEQ ID NO:6)，之后对纯化的单体VHH72变体的功能、生物化学和生物物理稳定性进行评估。
为了评估在1:1相互作用中引入S56A突变对结合亲和力的影响，对人源化VHH72变体h1分别针对SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的单体病毒刺突RBD蛋白进行了解离率分析。在此基础上，生物素化的RBD结构域被捕获到链霉亲和素尖端(FortéBio)上，然后受不同的VHH72变体的影响。S56A的引入将人源化VHH72变体对SARS-CoV-1RBD蛋白和SARS-CoV-2RBD蛋白的解离率提高了约1.5倍，解离率在1.0-2.4×10-3s-1之间(图25a)。
为了评估VHH72变体在1:1相互作用中的亲和力，在BLI中评估单价亲和力优化的变体VHH72(S56A转化为h1)的动力学结合常数KD，比较与单体SARS-CoV-2 RBD蛋白和二聚体SARS-CoV-2 RBD-Fc-融合体的结合。作为参考，包括人源化VHH72 h1。VHH的浓度范围在100nM和1.56nM之间，结果根据1:1相互作用进行拟合。结果如图25b和26所示。
S56A的引入提高了1:1KD，单体RBD提高了3倍，Fc融合提高了6倍以上。
值得注意的是，单体RBD和Fc融合之间的动力学参数有明显的差异。在单体RBD上，结合速率较慢，由较慢的解离率(在10-3s-1范围内)补偿，导致Fc融合的KD值相当。VHH72 h1_S56A在单体RBD上的KD为3.09nM，在RBD-Fc上的KD为5.26nM。与VHH72 h1相比，VHH72 h1S56A变体的解离率提高了3至6倍。
总之，S56A取代增加了VHH72对固定化SARS-CoV-2刺突蛋白和RBD蛋白的亲和力，在BLI中以1:1相互作用测得的KD 3.1nM(Kd为6.9×10-4s-1)(图25b)。此外，单价VHH72_h1_S56A与SARS-CoV-2 RBD在VeroE6细胞表面结合ACE2的能力比VHH72 wt和VHH72-h1强7倍(图26b)。这种提高的亲和力导致VHH72_h1_S56A的中和效力显著提高，如用VSV-dG SARS-CoV-2刺突假型病毒中和测定所确定的(图26c)。重要的是，VHH72_S56A还显示出对SARS-CoV-1 RBD增加的亲和力(图25a和26d)，并且可以比亲本VHH72(IC50 VHH72_h1：0.491μg/mL；IC50 VHH72_h1_S56A：0.045μg/mL)好10倍地中和SV-dG SARS-CoV-1刺突假型(图26e)。
实施例18.二价VHH72_S56A构建体增加抗SARS-CoV效力
将序列优化的VHH72融合到人IgG1 Fc结构域，并用一系列接头和铰链区进行分析。与IgG Fc的基因融合是一种行之有效的方法，可延长VHH在循环中的半衰期，并产生VHH72的二价体，以增加其抗病毒效力10,26。
一组VHH72变体在毕赤酵母中表达为VHH72-Fc融合体，并通过生物膜层干涉测量法(BLI)筛选以提高与SARS-CoV-2 RBD蛋白的结合解离率。在位置S56A引入的突变提高了解离率。与VHH72-Fc构建体相比，VHH72_S56A-Fc突变体在随后的SARS-CoV-2 RBD ELISA和使用SARS-CoV-1和-2刺突表达的293T细胞的流式细胞术的测定中始终表现更好。
IgG效应器功能对COVID-19患者疾病严重程度的可能作用尚不清楚27。我们选择在VHH72-Fc设计中包括具有最小Fc效应器功能的人IgG1，因为对于IgG效应器功能对COVID-19患者疾病严重程度的可能作用存在不确定性9,27,86。为此，正如其他几个抗SARS-CoV-2抗体开发者87-88所选择的，我们选择使用Fc部分特征良好的LALA突变，无论是否扩展P329G突变7,89,90。因此，除了野生型IgG1 Fc，我们的VHH72-Fc融合构建体设计9中还包括了具有最小Fc效应器功能的人IgG1 Fc LALA和LALAPG变体。VHH72-Fc构建体系列在瞬时转染的ExpiCHO细胞中表达，从培养基中纯化的蛋白质用于进一步表征。与VHH72-Fc和VHH72_h1-Fc相比，VHH72_h1_S56A-Fc显示出对SARS-CoV-2刺突的亲和力高出2至4倍(表2；图27a和b)。
表2.由BLI确定的VHH72变体的动力学
Figure GDA0004045908510000641
VHH72单价和多价Fc融合体对固定化SARS-CoV-2 RBD的结合亲和力，无论是小鼠Fc融合体(RBD-mFc)还是单体人Fc融合体(RBD-mono-hFc)。表观动力学基于数据的整体1:1拟合。
在使用细胞表面表达的全长刺突的基于流式细胞术的定量分析(一种基于VeroE6细胞的SARS-CoV-2 RBD竞争分析)中也观察到了这种增加的亲和力。
VHH72_h1(E1D,S56A)_10GS_Fc hIgG1 LALA(批次PB9683；SEQ ID NO:22)显示出对Hek293细胞上表达的Sars-CoV-2的全长S蛋白具有明显的结合亲和力，EC50为45.08ng/mL(图27c和d)。在ELISA中与Sars-CoV-2 RBD-SD1-hFc蛋白的结合使得EC50为47.8ng/mL(图27e)。VHH72_h1(E1D，S56A)_10GS_Fc hIgG1 LALA(批次PB9683)在竞争AlphaLISA中与单价VHH72_h1(E1D，S56A)序列优化(SO)竞争与SARS-CoV-2 RBD蛋白的结合，IC50为6.7ng/mL(图27f)。因此，通过ELISA、流式细胞术和BLI测定，VHH72(S56A)-Fc的Fc区的LALA或LALAPG突变没有改变SARS-CoV-2 S或-RBD结合的亲和力。
VHH72_h1_(E1D,S56A)-Fc IgG1在Fc部分有或没有LALA、FALA或LALAPG取代，对SARS-CoV-2刺突假型VSV的中和效果比它们的wt VHH72-Fc好约3-7倍(图28)。VHH72_h1(E1D,S56A)_10GS_Fc hIgG1 LALA(PB9683)示出了对Sars-CoV-2假型慢病毒(VSV)的中和效力为IC50 31ng/mL(0.37nM)，与原型VHH72-Fc(IC50263ng/mL)相比提高了约8倍。具有替代Fc类型的构建体，如hIgG4_FALA、hIgG1和IgG1_LALAPG，显示出类似的亚纳摩尔效力，IC50在40-55ng/mL之间(图28)。在使用真正的SARS-CoV-2病毒进行的噬斑减少中和测定中也观察到VHH72-Fc中S56A取代物的中和效力得到提高：VHH72_h1_S56A-Fc(IC50＝0.12μg/mL)的中和效力为VHH72-Fc(IC50＝1.01μg/mL)和VHH72_h1-Fc(IC50＝0.94μg/mL)的6倍，在这些构建体的Fc部分，LALA或LALAPG取代没有明显影响(图29)。最后，VHH72_S56A-Fc在阻止SARS-CoV-2 RBD和人ACE2之间的相互作用方面优于其wt对应物(图30)。
实施例19.四价VHH72_S56A-Fc构建体进一步增加抗SARS-CoV效力
VHH可以很容易地格式化为串联的尾对头融合，通常不会影响表达水平和稳定性28。此外，这种多价构建体通常具有增加的靶结合亲和力，并且在展示抗原多样性的病毒的情况下，具有广泛的保护作用29-31。因此，我们将VHH72_S56A_h1作为串联重复序列进行移植，其中VHH通过(G4S)3接头彼此分开，并通过GS接头与人IgG1 Fc融合(例如在SEQ ID NO:21；D72-55样品)并在瞬时转染的ExpiCHO细胞中表达该分子。得到的四价VHH72-Fc融合构建体对SARS-CoV-2 RBD的亲和力比其二价对应物高100倍以上(图31a)。通过将S56A突变体与四价结构组合，其体外抗病毒效力进一步增加，达到0.02μg/mL的PRNT50值，即比亲本构建体低50倍(图31b)。
实施例20.多价VHH72-Fc融合体的高表达和稳定性
稳健的表达水平、化学和物理稳定性以及翻译后修饰的同质性是蛋白质生物制品“可开发性”的重要先决条件32。在用于临床应用的重组单克隆抗体的两端经常引入两种突变：易于在生产和储存过程中自发形成焦谷氨酸的N-末端谷氨酸残基转变为天冬氨酸残基(前述称为E1D)，以及C-末端赖氨酸残基缺失，该C-末端赖氨酸残基易于被羧肽酶去除，并可能导致原料药的电荷异质性33。此外，对人IgG1铰链进行截短以避免可能的非标准二硫键形成，因为天然存在的铰链具有与成对轻链的恒定结构域形成分子间二硫键的半胱氨酸残基。例如批次D72-52(VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1_LALAPG_Kdel的构建体；本文通常缩写为VHH72_h1_E1D_S56A-10GS-hIgG1Fc_LALAPG；SEQ ID NO:20)、D72-55(SEQ ID NO:21)、D72-53或PB9683((VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1_LALA_Kdel；本文中通常缩写为VHH72_h1_E1D_S56A-10GS-hIgG1Fc_LALA，SEQ ID NO:22)，如本文所用。有或没有铰链截短的RBD结合动力学和SARS-CoV-2中和活性被证实是相似的(图32)。
无论接头和Fc类型如何，VHH72-Fc变体在瞬时转染的ExpiCHO细胞中的表达水平高达1.2mg/mL。我们还确定了纯化的VHH72-Fc变体构建体的物理稳定性。0.01℃/s速率的差示扫描荧光测定表明，人源化和S56A突变的引入增强了热稳定性，而四价对热稳定性有轻微的负面影响(表3)。当探测二价结构相对于四价结构的聚集温度时，也观察到了这种负面影响，即对于四价构建体的失稳为7℃。
表3.热稳定性
Figure GDA0004045908510000661
使用SYPRO Orange探针以0.01℃/s的速率进行差示扫描荧光测定。空白减去的数据被归一化为0-100％。在熔解曲线的三次样条插值后，绘制一阶导数以识别每个熔融温度(Tm)。Tm值示出为三次测量的平均值和标准差(SD)。
实施例21.活病毒中和
SARS-CoV-2菌株BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020(EPI ISL 407976|2020-02-03)用于如所述在VeroE6细胞上生长的P6代。使用20μg/mL的起始浓度，将VHH-Fc构建体连续稀释三倍，与100PFU SARS-CoV-2混合，并在37℃孵育1小时。然后将VHH-Fc-病毒复合物加入12孔板中的Vero E6细胞单层中，并在37℃孵育1小时。随后，在添加2％ FBS的DMEM中，用0.8％(w/v)甲基纤维素代替接种物混合物。在37℃孵育3天后，除去覆盖层，用3.7％ PFA固定细胞，随后用0.5％结晶紫染色。半最大中和滴度(PRNT50)定义为导致噬斑减少50％的VHH-Fc浓度。结果如图10所示。含有hIgG1_LALAPG Fc的分子D72-51(VHH72_h1_E1D__S56A-10GS-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALAPG)和D72-52(VHH72_h1_E1D_S56A-10GS-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALAPG_Kdel；SEQ ID NO:11)分别显示出164.8ng/mL和163.9ng/mL的PRNT50。
实施例22.保护仓鼠免受SARS-CoV-2攻击
为了评估我们的二价和四价分子的体内抗病毒效力，我们选用了金黄叙利亚仓鼠作为攻击模型，该模型模拟了人类严重COVID-19的各个方面，包括肺部病毒高载量和肺部病变的出现34。在第一个试验中，我们比较了二价(D72-23＝VHH72_h1_S56A-Fc_LALAPG；SEQID NO:19)和四价(D72-13＝VHH72_h1-(G4S)3-VHH72_h1-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc)构建体的保护潜力，它们具有相似的体外SARS-CoV-2中和效力((D72-23,PRNT50＝0.13μg/mL；D72-13,PRNT50＝0.10μg/mL)，在用2.4×106TCID50的SARS-CoV-2攻击感染前一天，以20mg/kg腹腔内给药(图34a)。对照组动物接受相同剂量的帕利珠单抗(Synagis)。与Synagis对照组相比，在感染后第4天，在两个VHH72-Fc治疗组中观察到肺(>4log)和回肠(2log)中的病毒RNA水平大幅度降低，并且在粪便样品中也观察到二价构建体(图34b)。重要的是，除了一只仓鼠之外，在任何VHH72-Fc处理的仓鼠的肺匀浆中没有检测到传染性病毒(图34b)。基于第4天肺部的μ-CT成像也显示了明显的保护作用，这示出了在VHH72-Fc治疗的动物中支气管扩张的发生率显著降低(图34c)。在后续研究中，预防性施用4mg/kg的较低剂量的二价铅也显著降低了肺病毒载量(图35a)。在该试验中，在20mg/kg剂量组中观察到更高的可变性，5只仓鼠中有2只在肺和鼻洗液中具有与Synagis对照组相当的病毒载量(图35b)。然而，这两个异常值在终点血清中没有检测到VHH72-Fc，这可能是由于注射时的技术失误(图35c)。下一步，我们评估了二价和四价分子的治疗潜力，并在感染后16小时腹腔内给药1和7mg/kg。作为预防性对照，在攻击前1天以7mg/kg施用二价构建体(图36a)。与Synagis对照动物相比，除了用二价构建体1mg/kg的治疗组之外，对于所有VHH72-Fc治疗组，观察到肺传染性病毒显著减少(4log)(图36b)。此外，在治疗和预防设置中，观察到在最高剂量的二价体的治疗组中，基因组病毒RNA水平显著降低(>5log)，而其他组显示出更高的变异性(图36b)。μCT成像显示预防组和令人惊讶的是，在使用最低剂量四价构建物治疗的动物中病理学降低，但在其他组中没有(图36c)。
在上述的3个仓鼠试验中，我们使用了来自BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020的攻击病毒。自2020年2月以来，出现了一种SARS-CoV-2变异病毒，其在刺突中的614为含有甘氨酸而不是天冬氨酸残基，现在已经成为主要的疫情形式36。具有这种D614G刺突变体的SARS-CoV-2病毒分离株在体外复制到更高的滴度，但是没有证据表明感染这些病毒会导致传染性或疾病增加，或者它们对中和抗体更不敏感36。鉴于D614G变体病毒目前在疫情中占主导地位，我们还在仓鼠中进行了一项攻击试验，该试验使用的病毒制剂来自于带有这种突变的BetaCoV/Munich/BavPat1/2020菌株(图37a)。为了评估剂量关系，在攻击后4小时，用三个剂量20、7和2mg/kg IP的二价或四价分子进行治疗性处理，此时肺部病毒滴度已经在增加。作为对照，一组中的仓鼠在攻击前一天接受20mg/kg剂量的二价体，Synagis在治疗环境中作为阴性对照。肺病毒复制在20和7mg/kg时被完全控制，尽管在四价20mg/kg组的6只动物中有2只显示出残留的病毒滴度，在2mg/kg剂量的二价构建体组出现了变异性(图37b)。有趣的是，用7mg/kg二价构建体治疗的动物的大体肺病理学最低。总之，使用两种不同病毒株在仓鼠中进行的这4种攻击试验的结果表明，在这种严格的SARS-CoV-2攻击模型中，预防性以及治疗性注射VHH72_S56A-Fc融合构建体可以完全控制病毒复制。
此外，大体病理学分析(图37C)显示，在对照动物中，20-40％的肺表面显示肺损伤。D72-52的治疗性给药在7mg/kg剂量下强烈预防了肺损伤，其中5/6的动物没有检测到肺损伤。感染SARS-CoV-2分离株(Munich P3)后，所有组的体重都逐渐减轻。没有一个治疗组显著防止体重减轻(图37D-E)。
在下呼吸道中，二价和四价VHH-Fc结构在治疗环境中均显著防止传染性病毒扩散到肺部，在两种结构的2个最高剂量下，完全减少>4logs(图37B)。第4天，在所有浓度下，在支气管肺泡灌洗液(BALF)中均未观察到传染性病毒颗粒，而病毒RNA载量在二价和四价结构均显示出剂量关系(图37F和G)。
在上呼吸道中，在第4天的鼻甲中，在对照组中观察到非常高的病毒水平，在两个治疗组中均出现剂量依赖性降低(图37H)。在用二价D72-52和四价D72-55 VHH72h1 S56A-Fcs治疗后第1天和第2天采集的咽拭子中的传染性病毒中观察到明确的剂量关系(图37i)。在咽拭子和鼻甲中清除传染性病毒后，病毒mRNA拷贝数仍然很高。上呼吸道和下呼吸道的病毒载量具有良好的相关性(图37J)。
总之，在肺病毒载量和大体肺病理学中观察到治疗性处理后明显的抗病毒功效。一般来说，在用20mg/kg和7mg/kg剂量的两种化合物进行治疗性处理的动物和进行预防性处理的动物中，观察到上呼吸道和下呼吸道中病毒复制以及大体和组织病理学变化的最大减少。
实施例23.用D72-53(PB9683)进行仓鼠攻击研究
最后，对于VHH72_h1(E1D,S56A)_10GS_IgG1_LALA构建体(D72-53；SEQ ID NO:22；PB9683批次)，VHH72-Fc的结构优化涉及通过柔性甘氨酸-丝氨酸接头(GSGGGGSGGGGS，或10GS)融合到人IgG1的缩短铰链(EPKSCdel)，连接到人IgG1_LALA的Fc结构域，形成二价单结构域抗体形式，并且在C-末端缺失了赖氨酸残基。这导致39.6kDa(单体)或79.1kDa(二聚体)的分子量和6.26(PI)的等电点。由于对于LALA或LALAPG变体一直观察到类似的数据，所以已经在体内对包含任何这些变体的组合物进行了类似的分析。金黄叙利亚仓鼠对SARS-CoV-2感染高度敏感，并在肺部出现支气管肺炎和强烈的炎症反应，且伴有中性粒细胞浸润和水肿。因此，这被认为是疾病的相关模型，并用于评估D72-53(批号PB9683)在2个剂量水平(2和7mg/kg)和2种设置(治疗和预防)下的疗效(图40)。
使用的SARS-CoV-2毒株BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020是经RT-qPCR确认的无症状患者的鼻咽拭子中提取的。通过在HuH7和Vero E6细胞上连续传代分离感染性病毒；第6代病毒用于本文所述的研究，类似于体外中和试验。通过Reed和Muench方法在Vero E6细胞进行终点稀释来确定病毒原液的滴度。Synagis(帕利珠单抗)是一种靶向呼吸道合胞病毒的单克隆抗体，被用作阴性对照。将90-120g的6-8周龄雌性叙利亚金黄(SG)仓鼠随机分配到不同的治疗组。
在感染前24小时或感染后19小时，通过腹腔内给药在治疗性或预防性环境中用D72-53(PB9683)(7、4或2mg/kg)治疗动物。监测仓鼠的外观、行为和体重。在感染后(pi)第4天，仓鼠被安乐死。收集肺，分别通过RT-qPCR和终点病毒滴定对病毒RNA和传染性病毒进行定量(图40)。在感染前(预防组)和第4天收集血样用于PK分析。制备肺组织切片用于组织学检查。由病理专家对组织切片进行盲法肺损伤评分。评分参数(累积评分为1至3分)如下：充血、肺泡内出血、支气管壁凋亡小体、坏死性细支气管炎、血管周围水肿、支气管肺炎、血管周围炎症、支气管周围炎症和血管炎。分数越高表示病变越严重。
与对照组相比，所有D72-53(PB9683)治疗组的肺部病毒RNA载量显著降低(图40A)。在预防性设置和两个最高治疗剂量的组中都观察到了保护作用，而2mg/kg剂量组显示了肺病毒RNA的变异性更高。在大多数经D72-53(PB9683)治疗的仓鼠中，无论剂量如何，肺部的传染性病毒水平都降低至检测水平以下(图40B)。
组织学评估显示，在D72-53(PB9683)2mg/kg治疗组中累积肺损伤评分的变异性最高，其与阴性对照组相比也无统计学上的显著差异(图40C)。与对照组相比，其他PB9683组均有显著改善(由较低的评分表示)。总之，在治疗环境中观察到明显的剂量关系，其中2mg/kg剂量失去保护作用。
在进一步的研究中，与前导D72-58相比，评估了4mg/kg D72-53(批次PB9683)的中间治疗剂量，除S56A点突变外，前导D72-58与D72-53相同(图41)。D72-53蛋白批次PB9683的生产是在ExpiCHO系统中从瞬时转染的细胞进行的，其中抗体被分泌到培养基中。通过标准蛋白A亲和层析进行纯化，然后进行凝胶过滤，通过尺寸排阻-UPLC评估得到>99％的纯度。该批次在pH 7.4的10mM PBS中配制。内毒素水平<1EU/mg。使用pCDNA3.3 TOPO表达载体在ExpiCHO系统中从瞬时转染的细胞中生产“前导”蛋白批次D72-58。通过蛋白A层析从培养基中纯化抗体，然后进行多轮凝胶过滤(Superdex 200pg)，使得内毒素水平<1EU/mg。配制在pH7.4的10mM PBS中。
将所有蛋白质在pH 7.4的PBS中稀释至1mg/mL的浓度，允许给药体积为每只仓鼠0.5mL(体重范围为100-120g)，以获得4mg/kg的剂量。
如参考文献13和69中所述，使用经过验证的SARS-CoV-2叙利亚金仓鼠感染模型。该模型适用于评估新型化合物/抗体的潜在抗病毒活性和选择性(参见材料和方法)70。治疗计划见表4。
表4治疗计划
Figure GDA0004045908510000691
Figure GDA0004045908510000701
通过q-RT-PCR分析确定了肺中的RNA病毒载量(图41，左图)，在融合的Vero E6细胞上使用病毒终点滴定确定了肺中的传染性病毒载量(图41，右图)。
在该SARS-Cov-2仓鼠感染模型中，与对照Ab Synagis(4mg/kg)相比，用D72-53(PB9683)(4mg/kg)或前导(D72-58)(4mg/kg)进行的治疗性处理有效地减少了肺部病毒RNA载量和传染性病毒颗粒。
从分析中，我们还可以得出结论，与前导批次相比，D72-53批次显示TCID50和病毒RNA拷贝读数的中值肺部病毒载量差异为1.5log。这是根据中值计算的：TCID50分别为312.5对10(＝LLOQ)，病毒RNA拷贝的中值分别为67406对2381。
作为Synagis阴性对照的参考，获得的对数差异为：
·前导对Synagis：RNA上1.4log，TCID50上3log。
·D72-53 Lead对Synagis：RNA上有2.9log，TCID50上>4log。
由于D72-53(PB9386；SEQ ID NO:22)和前导(D72-58；SEQ ID NO:17)蛋白之间的唯一区别为VHH CDR2区域中的S56A突变，因此，这种D72-53 Lead的对数减少的抗病毒功效的贡献可能归因于其在S56A突变中的差异，而不是归因于其人源化取代。
低剂量VHH72_S56A-Fc抗体的治疗性全身给药有效抑制了SARS-CoV-2病毒原株和D614G突变株在仓鼠体内的复制，并最大限度地减少了肺损伤的发展。
实施例24.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表面显示的抗体结合沙贝病毒(Sarbecovirus)RBD的流式细胞术分析
Jesse Bloom博士慷慨地提供了基于pETcon酵母表面展示表达载体的质粒池，其编码一组SARS-CoV2同源物的RBD72。通过10ng规模的电穿孔将该池转化至大肠杆菌TOP10细胞，并接种在添加了羧苄青霉素的低盐LB琼脂板上。选择单个克隆，在添加了羧苄青霉素的液体低盐LB中生长，并进行微量制备。用覆盖整个RBD CDS的引物对选择的质粒进行Sanger测序，并重复该过程，直到每个所需的RBD同源物作为序列验证的单克隆被挑选出来。此外，SARS-CoV 2 RBD的CDS被排序为酵母密码子优化的gBlock，并通过Gibson组装克隆到pETcon载体中。将质粒转化到大肠杆菌中，如上所述进行制备和序列验证。根据Gietz和Schiestl73的方案，将选择的pETcon RBD质粒的DNA转化到酿酒酵母菌株EBY100中，并接种在酵母脱离培养基(SD agar-trp-ura)上。选择单个克隆，并通过菌落PCR验证正确的插入长度。选择每个RBD同源物的单个克隆，并在28℃下在10mL液体抑制培养基(SRaf-ura-trp)中生长过夜。然后，将这些预培养物以0.67/mL的OD600反稀释至50mL液体诱导培养基(SRaf/Gal-ura-Trp)，并在收获前生长16小时。在PBS中洗涤后，将细胞固定在1％ PFA中，用PBS洗涤两次，用1％ PFA封闭，并用系列稀释的抗RBD抗体或synagis染色。
VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALA_K477del(＝D72-53构建体)氨基酸序列在SEQ ID NO:22中描述。CB6抗体对应于SEQ ID NO:64-65中轻链和重链的序列(Genbank MT470196和MT470197)。S309抗体对应于来自Pinto等人91的SEQID NO:62-63。包括同型对照抗体Synagis hIgG1(MedImmune)作为阴性对照。
使用Alexa fluor 633缀合的抗人IgG抗体检测抗体的结合。使用FITC缀合的鸡抗myc抗体检测表面显示的myc标记的RBD的表达。然后使用BD LSR II流式细胞仪分析细胞的荧光强度。
如图42b所示，D72-53 VHH72-Fc抗体的结合显示用于所有测试的进化枝1a和进化枝1b RBD，以及BM48-31的进化枝3RBD，和一些进化枝2Bat SARS相关的沙贝病毒(RP-3和HKU3-1，但不是Rf1、ZXC21和ZC45)，表明VHH72-Fc抗体可以为沙贝病毒提供非常广泛的交叉保护。对于本文测试的其它Sars-Cov-2特异性单克隆抗体，与RBD结构域的结合仅限于进化枝1b(CB6)，或进化枝1a和1b(S309)。总之，VHH72_S56A-Fc与沙贝病毒的进化枝1、-2和-3RBD结合。
实施例25.SARS-CoV-2刺突蛋白序列变异分析
源自人类宿主的SARS-CoV-2基因组序列从GISAID下载(N＝322,187个基因组于2021年1月4日提供)。删除了具有无效DNA字符代码的基因组。通过将基因组与NC_045512.2(NCBI RefSeq)中注释的参考刺突序列进行比对来检索刺突编码序列。为此，使用Rpackage Biostrings 2.54.0版本进行了成对比对，这是一种“重叠”模式下的固定替换矩阵，根据bio strings文档具有以下参数：匹配和错配替换分数为1和-3；5和2分别作为空位开放和空位扩大处罚。没有刺突编码序列的不完整基因组，或产生非常短或没有比对的基因组被去除。具有框架干扰缺失的编码序列也被排除，剩余的开放阅读框架使用Biostrings选项进行计算机内翻译，以解决含有未确定核苷酸的“模糊”密码子。在下一步中，来自不良测序结果(Ns)的具有未确定氨基酸的预测刺突蛋白序列(表示为X)被去除。此外，保留了具有单个终止密码子或缺乏终止信号(由于可能的C末端延伸)的全长序列，而排除了具有过早终止密码子的蛋白质。
使用具有默认参数的ClustalOmega算法和R package msa 1.18.0版本和BLOSUM65替换矩阵对齐得到的240,239个质量受控的刺突蛋白序列。R packages seqinr3.6-1和BALCONY 0.2.10用于计算数据集中至少出现一次的所有突变的氨基酸频率。分配主要和次要等位基因频率和计数。Starr等人研究了单个突变对刺突表达和折叠的影响72。分别基于30和10个分子动力学模拟，使用FastContact 2.014估计VHH72与参考和突变RBD的结合能。突变对VHH72结合的影响(与参考RBD数据相比的kcal/mol差异)使用t检验(突变体对参考RBD)进行了统计评估，基于10次模拟，p值≤0.05。VHH72和其他抗RBD抗体的表位(通过PISA掩埋表面估计74)表示为逻辑载体，并使用二元的单论分析聚类(R包簇)进行聚类。计算每个表位与VHH72的Jaccard相似性(得分在0和1之间，R package fpc)。使用ggplot23.3.0版本可视化收集的刺突蛋白RBD(333-516位)的数据。
SARS VHH-72与SARS-CoV-2 RBD相互作用的分子模型是通过分子动力学模拟进行的，该模拟具有VHH72(来自PDB-entry 6WAQ的C链)和变体的模型复合物，具有来自SARS-CoV-2融合前刺突糖蛋白(链A，残基335-528)的cryo-EM结构PDB-entry 6VSB的外向定位的RBD和变体。cryo-EM RBD中残基444-448、455-490和501-502处缺失的环由I-TASSER SARS-CoV-2 RBD模型20重建，缺失的残基由Swiss-PDBViewer21添加。模拟是用Gromacs 2020.1版本22，使用Amber ff99SB-ILDN力场42，运行5纳秒。在将轨迹转换成PDB格式后，每0.5纳秒提取快照，并提交给FastContact2.0服务器14。
如图43所示，基于计算的结合能和建模信息，我们得出结论，本文分析的RBD突变变体，涵盖大多数传播的SARS-Cov-2变体，应该对VHH72-S56A-Fc敏感。此外，N439K突变变体在VHH72的表位区域提供了替代，并且经常发生(约2％)，基于这种分析可以增强VHH72_S56A结合，如图43和44中的结合能所示。
在最近快速出现的SARS-CoV-2分离株中，在VHH72表位的远处边缘的最近的RBM突变是在变体B.1.1.783和501.V284变体中见到的N501Y突变。分子动力学计算表明，该位置的取代不会影响VHH72结合(图43)。这在流式细胞术测定中得到了试验验证，显示在SARS-CoV-1完全刺突的情况下，VHH72-Fc与SARS-CoV-2野生型RBD的结合强度与表达在哺乳动物细胞表面的RBD N501Y突变体的结合强度相同(图50)。VHH72-Fc与RBD变体N439K85的结合也不受影响(图50)。最后，我们提供了证据表明D72-53前导分子的结合不受目前快速传播的SARS-CoV-2变体的影响，并证明了其独特的广泛的跨沙贝病毒分支的结合范围。
实施例26.分离额外的SARS-CoV-2中和VHH
除了选择和优化的VHH72 ISVD，通过与其刺突蛋白相互作用，其他VHH被鉴定为有效中和SARS-CoV-2。为了获得额外的VHH家族，使用了以下方法。VHH-72最初是作为SARS-Cov-1中和VHH从美洲驼中分离的，该美洲驼通过使用相同的SARS-CoV-1刺突蛋白的生物淘选用SARS-CoV-1的刺突蛋白进行了4次免疫。由于这种VHH也可以通过与RBD上远离与SARS-CoV-2宿主细胞受体ACE2相互作用的位点的保守区域结合来中和SARS-CoV-2病毒，但仍然能够通过与ACE2蛋白骨架和ACE2聚糖的空间位阻来阻断这种相互作用，这表明使用的VHH免疫库可能含有更大的能与SARS-CoV-1和SARS-Cov-2 RBD交叉反应的全部VHH。为了分离能够有效中和SARS-CoV-2的第二代VHH，使用单价SARS-CoV-2 RBD(RBD-SD1-huFc)淘选原始非淘选的(用SARS-CoV-1和MERS-CoV刺突蛋白连续免疫后获得的)VHH免疫库。淘选后，挑选94个克隆并用于在PE ELISA中使用与二价鼠Fc融合的SARS-CoV-2 RBD、单价人Fc融合的SARS-CoV-2 RBD SD1、SARS-CoV-1 RBD和SARS-CoV-1刺突蛋白进行测试。PE提取物中存在的多种VHH可与所有四种测试抗原结合(数据未示出)。对能够结合两种SARS-CoV-2抗原的克隆进行测序，产生25个没有内部终止密码子的独特VHH序列。通过ELISA测试纯化的VHH与SARS-CoV-1和-2 RBD以及刺突蛋白结合的能力。尽管若干个测试的VHH可以容易地结合SARS-CoV-1刺突蛋白和SARS-CoV-2 RBD，它们分别是用于免疫和生物淘选的抗原。然而，除了少数VHH的少量结合，大多数VHH不能有效结合SARS-CoV-2刺突蛋白。除了ELISA，我们还通过流式细胞术研究了VHH与在细胞表面表达的SARS-CoV-2刺突蛋白的结合。与ELISA结果一致，绝大多数测试的VHH未能结合SARS-CoV-2刺突蛋白。在20μg/mL时，仅观察到与VHH-72高度相关的CoV-2VHH2.50的清晰结合，并且这被分类在相同的VHH72家族中。接下来，我们研究了VHH2.50是否能够使用SARS-CoV-2刺突假型VSV-d病毒在体外中和SARS-CoV-2。在20μg/mL时，只有VHH2.50能够几乎完全中和SARS-CoV-2刺突假型VSV病毒(图48)。进一步分析显示，VHH2.50的中和活性与其相关VHH、VHH-72高度相似(图45)。
此外，通过用SARS-CoV-2刺突蛋白对先前免疫的美洲驼进行3次额外的免疫，得到了第三代VHH。用SARS-CoV-2刺突蛋白或其RBD结构域淘选获得的免疫库。CDR3的序列分析显示，在PE ELISA中可以结合SARS-CoV-2 RBD和刺突的VHH可以归属于22个离散的VHH家族。尽管其中一些家族中的CDR3与从美洲驼Winter的第一次免疫系列后获得的VHH库中分离的VHH相关，只有属于VHH3.17家族的VHH3.115具有与VHH-72高度相似的CDR1和CDR2序列，此外其CDR3也高度相似，将这些第3代VHH(VHH3.17、VHH3.77、VHH3.115、VHH3.144和VHHBE4)归类于与VHH-72相同的序列家族，称为家族72(图45)。我们先前证明了VHH-72中的S56A取代增加了其对SARS-CoV-2刺突蛋白的亲和力及其中和活性。值得注意的是，所有与先前分离的VHH-72相关的VHH都具有S56G取代。选择所有(54个)在PE ELISA中与重组融合前稳定的SARS-Cov-2刺突蛋白或单体RBD-SD1-huFc结合，且不含内部终止密码子的独特VHH被选出用于进一步PE分析，包括与细胞表面表达的WT全长SARS-Cov-2刺突蛋白结合，抑制RBD与表达ACE2的VERO E6靶细胞结合，以及中和SARS-Cov-2刺突假型VSV。通过流式细胞术测试选定的VHH与细胞表面表达的SARS-CoV-2刺突蛋白的结合。我们研究了含有VHH的PE提取物干扰RBD与表达ACE2受体的Vero E6靶细胞结合的能力。将重组RBD-muFc与20倍稀释的PE混合，随后加入Vero E6细胞以允许RBD结合。通过流式细胞术测试RBD-muFc的结合，并揭示54个VHH中的19个可以完全或几乎完全阻止RBD与Vero E6细胞表面的ACE2结合。只有能够最有效地与表达SARS-CoV-2刺突蛋白的细胞表面的RBD结合的VHH能够阻止RBD与VeroE6靶细胞结合。尽管阻断RBD-ACE2相互作用需要VHH与细胞表面表达的刺突蛋白有效结合，但这还不够。这可以通过各种VHH来说明，这些VHH可以有效地结合表达刺突蛋白的HekS细胞，但不能阻断RBD与VeroE6细胞的结合。然而，并非所有有效结合细胞表面RBD的VHH都能阻断RBD与Vero E6靶细胞的结合。有效抑制RBD与Vero E6细胞结合的VHH主要限于VHH家族：55、36、38、29、72和149，其中VHH家族是根据其代表性的VHH家族成员之一进行识别/编号(另参见图45，以及表5和表6)。
为了测试PE提取物中存在的VHH是否能在体外中和SARS-Cov-2，我们使用表达GFP和荧光素酶的SARS-Cov-2刺突假型VSV-dG病毒进行了中和测定。将VSV-dG-SARS-CoV-2S(VSV-S)与16、80和400倍稀释的PE提取物在室温下孵育30分钟，然后加入到在96孔板中生长至亚融合状态的Vero E6细胞中。PBS和纯化的亲和力增强的VHH72变体(500μg/mL的VHH72h1-S56A)分别用作阴性和阳性对照。VHH2.50的PE提取物(一种先前分离的具有中和活性的VHH72变体，与VHH72高度相似)用作参照。感染后二十小时，细胞被裂解并用于测量GFP和荧光素酶活性。若干VHH PE提取物可以在体外400倍稀释时完全中和VSV-S，而其他VHH即使在最低稀释度也无法做到这一点。观察到若干PE提取物，包括新鉴定的与VHH72相关的VHH，具有比VHH2.50的PE提取物高得多的中和活性，表明这些VHH可能具有比VHH72及其相关VHH2.50更好的中和活性。中和活性最高的VHH主要来自VHH家族F-55、-36、-38、-149以及与VHH72相关的VHH(图49)。与VHH72相关的VHH的增强的中和活性最可能是由于对SARS-CoV-2刺突蛋白上的VHH72表位的亲和力成熟所致，这是通过使用SARS-CoV-2刺突蛋白的额外免疫所实现的。先前表征的VHH72h1-S56A对SARS-CoV-2刺突上的VHH72表位具有增强的亲和力。在该免疫活动中鉴定的所有VHH72相关的VHH(VHH72家族成员)中存在S56G取代的观察结果证明了56位残基(根据Kabat编号)在VHH72家族与刺突蛋白的结合特性中的重要性。
分别干扰RBD与ACE2结合和中和的浓度依赖性在VHH中似乎是可变的。其原因可能来自这样一个事实，即一些VHH可以有效地与重组RBD在表位上相互作用，而这些表位在刺突三聚体的情况下可能更难接近。此外，当使用PE提取物替代纯化的VHH时，所进行的测定可能量化较少。因此，在该筛选中测试的最有效中和VHH的子集的生产和纯化作为选择VHH的下一步，以鉴定哪些VHH具有与VHH72表位重叠或相同的表位。
实施例27.通过AlphaLISA免疫测定抑制VHH72与刺突蛋白RBD的结合
VHH与VHH72竞争结合SARS-CoV-2 RBD的能力在竞争性AlphaLISA(放大发光邻近均相测定)中进行了评估。
从实施例26中选择的代表不同VHH家族的克隆被再次克隆，用于在毕赤酵母或大肠杆菌中生产，以进一步表征为纯化的单价蛋白。单价VHH分别含有C-末端His6标签或C-末端HA-His6标签。如本文所述，使用Ni-NTA亲和层析进行纯化(另参见实施例30)。
在测定缓冲液(含0.5％ BSA和0.05％吐温-20的PBS)中进行抗SARS-CoV-2VHH和不相关的对照VHH的系列稀释(终浓度范围在90nM-0.04nM之间)。随后将VHH与VHH72-h1(S65A)-Flag3-His6(终浓度0.6nM)和SARS-CoV-2 RBD蛋白Avi-tag生物素化(AcroBiosystems,目录号SPD-C82E9)(终浓度0.5nM)混合在白色低结合384孔微量滴定板(F-底部，Greiner，目录号781904)中。在室温下孵育1小时后，加入供体和受体珠，每种珠的终浓度为20μg/mL，最终体积为0.025mL。生物素化的RBD被捕获在链霉亲和素包被的Alpha供体珠上(Perkin Elmer，目录号6760002)，而VHH72_h1(S56A)-Flag3-His6被捕获在抗Flag AlphaLISA受体珠上(Perkin Elmer，目录号AL112C)在室温下黑暗中孵育1小时。VHH72和捕获在珠子上的RBD的结合使得能量从一个珠子转移到另一个珠子，在Ensight仪器上在680nm处照射并且在615nm处读数后评估。
结果如图46所示。由IC50值确定的效力如表5所示。结果表明，作为超家族一部分的7个VHH(家族F-36/55/29/38/149)和VHH3.83(家族83)完全阻断了VHH72与SARS-CoV-2 RBD蛋白的相互作用，表明它们与VHH72至少重叠或相同的表位结合。与原始VHH72相比，在SARS-CoV-2蛋白加强后从免疫库中鉴定的VHH72家族成员表现出增强的效力，具有亚纳摩尔IC50值(表5)。许多其他VHH家族，包括VHH3.151、VHHBD9、VHH3.39、VHH3.89和VHH3.141，都不是VHH72的竞争者，表明它们与VHH72结合不同的表位。
实施例28.通过AlphaLISA免疫测定抑制ACE-2/RBD相互作用
在竞争AlphaLISA中评估了SARS-CoV-2 RBD蛋白与ACE-2受体相互作用的剂量依赖性抑制。
从实施例26中选择的代表不同VHH家族的克隆被再次克隆，用于在毕赤酵母或大肠杆菌中生产，以进一步表征为纯化的单价蛋白。单价VHH分别含有C-末端His6标签或C-末端HA-His6标签。如本文所述，使用Ni-NTA亲和层析进行纯化(另参见实施例30)。
在测定缓冲液(含0.5％ BSA和0.05％吐温-20的PBS)中制备VHH的系列稀释(终浓度范围在90nM-0.04nM之间)，并在白色低结合384孔微量滴定板(F-底部，Greiner目录号781904)中与通过Avi-tag(AcroBiosystems，目录号SPD-C82E9)生物素化的SARS-CoV-2RBD混合(终浓度1nM)。向混合物中加入重组人ACE-2-Fc(终浓度0.2nM)。在室温下孵育1小时后，加入供体和受体珠，每种珠的终浓度为20μg/mL，最终体积为0.025mL。RBD被捕获在链霉亲和素包被的Alpha供体珠上(Perkin Elmer，目录号6760002)。人ACE-2-mFc蛋白(SinoBiological，目录号10108-H05H)被捕获在抗小鼠IgG(Fc特异性)受体珠(Perkin Elmer，目录号AL105C)，在室温下黑暗中额外孵育1小时。在Ensight仪器上在680nm处照射并在615nm处读数后，评估珠子之间的相互作用。结果如图47所示。IC50值表示的效力如表5所示。所有与VHH72竞争的VHH也阻断了人ACE2与SARS-CoV-2 RBD蛋白的相互作用。在用SARS-CoV-2刺突蛋白进行蛋白加强后，观察到从免疫库获得的VHH72家族成员的效力增加。除了显示部分阻断(75％抑制)的VHH3.83之外，其他所有都显示完全阻断ACE-2结合。
总之，竞争测定结果证实了来自家族F-83、36、55、29、38和149的纯化VHH与VHH72结合相同的表位，并与类似于VHH72家族成员的ACE-2结合竞争。不属于VHH72家族的最有力的竞争对手分别为VHH3.36和VHH3.83(表5)。
表5.通过VHH72家族和不同VHH家族的额外抗SARS-CoV-2VHH抑制VHH72(h1 S56A)或ACE2与SARS-CoV-2 RBD的结合，如在竞争AlphaLISA中所确定的。
Figure GDA0004045908510000771
VHH家族根据其代表性VHH家族成员之一进行识别/编号(另参见图45)。
表6.VHH72家族和竞争结合VHH72表位的不同家族的其他VHH的VHH氨基酸序列。
Figure GDA0004045908510000772
Figure GDA0004045908510000781
实施例29.PK/PD分析仓鼠攻击研究
为了从腹腔内(IP)给药过渡到静脉内(IV)给药，在一项对健康叙利亚仓鼠的独立研究中确定了IP和IV递送后的药代动力学特征。为了药代动力学研究，在健康雄性叙利亚仓鼠(n＝12/组，每只动物在3个时间点取样)中通过IV或IP递送单剂量5mg/kg D72-53(PB9683)。取样时间点为5分钟、15分钟、1小时、3小时、8小时、24小时、48小时、96小时和168小时。如上所述，使用竞争AlphaLISA进行量化。
健康雄性仓鼠腹腔内(IP)和静脉内(IV)单剂量给药5mg/kg后，D72-53(PB9683)的血清暴露随时间变化如图38所示。每组使用12只动物(体重范围90-108g)，每只动物在3个时间点取样(每个时间点n＝4)。D72-53/PB9683的血清动力学特征表明，仓鼠的血清半衰期约为90-100小时。IP给药后，血清水平在最初24小时内逐渐增加，达到与IV注射后相似的血清水平。在感染前24小时给药的预防性处理动物因此在感染时具有稳定的血清水平，而治疗组(感染后4-19小时)的动物在感染后28-43小时之间达到稳定的血清水平(图38)。
为了确认受攻击仓鼠的药物暴露，对不同VHH72 h1S56A-Fc形式(具有不同Fc类型的二价和四价结构)的第4天血清浓度进行量化。此外，对一项攻击研究中获得的BALF样本中的化合物浓度进行了分析。在受攻击的仓鼠中，肺部病毒载量(传染性病毒)和终点第4天的药物血清浓度之间的PK/PD关系如图51所示。图51C示出了二价和四价结构的BALF和血清的相关性。无论化合价如何，BALF暴露都在全身暴露之后。
PK/PD结果表明，在预防性设置中，最低剂量为1mg/kg的所有剂量均具有保护性。在治疗性设置中存在剂量关系，最低剂量的动物表现出抗病毒反应的变异性增加。在各治疗组中，无反应的异常值在血清中缺乏可检测到的药物，表明这些动物没有接触到药物。
PD终点已转换为二元响应变量。在每个实验中，用VHH72 h1 S56A-Fc(不同Fc类型)治疗的动物中的病毒载量数据与对照组中的病毒载量的中值进行比较，阳性结果定义为病毒载量低于log TCID50/mg减少4倍的阈值。对转换后的二元变量应用逻辑回归可以将病毒击倒的概率定义为血清浓度的函数，因此，可以定义导致95％治疗成功概率的浓度水平(具有90％置信区间)。
实施例30.特异性结合SARS-CoV-1和-2刺突蛋白的第三代VHH家族的选定组的纯化和结合特性
将第三代家族的代表性VHH(参见实施例26-28)克隆到毕赤酵母表达质粒中，在毕赤酵母中产生，通过镍-NTA亲和层析纯化，并将缓冲液交换到PBS中。SDS-PAGE和考马斯蓝染色显示产生的VHH具有下列VHH家族的预期大小：(F，为家族；根据其在本文中表征的代表性家族成员之一编号)F72(VHH3.17、VHH3.77、VHH3.115和VHH3.144)、F55(VHH3.35和VHH3.55)、F36(VHH3.36和VHH3.47)、F149(VHH3.19)、F38(VHH3.38)和F29(VHH3.29)。与N-糖基化位点的存在相一致，在非糖基化的VHH3.47旁边，观察到在凝胶中迁移较慢的附加蛋白条带(图52A)。产生的VHH的正确大小由完整的MS证实(数据未示出)。VHH3.83在用用于生物淘选的pMECS-VHH3.83载体转化的WK6大肠杆菌中产生。通过镍-NTA亲和层析和缓冲液交换纯化后，通过SDS-PAGE分析VHH3.83的表达。凝胶的考马斯染色显示了预期分子大小的单个蛋白质条带(图52B)。
通过ELISA测试纯化的VHH与SARS-CoV-2刺突蛋白和RBD的结合。将VHH、VHH72和不相关的对照VHH(GBP)的稀释系列应用于包被有重组预融合稳定的SARS-CoV-2-2P刺突蛋白或SARS-Cov-2 RBD-muFc(Sinobiological)的ELISA板。除了VHH3.47，所有VHH都以比VHH72高得多的亲和力与SARS-CoV-2 RBD和刺突蛋白(图53A-C)结合。VHH3.47缺乏可检测的结合可能是其糖基化的结果，这可能会克服对用于检测结合的VHH的抗VHH抗体的识别。除了SARS-CoV-2刺突外，所有VHH还有效地结合了SARS-CoV-1刺突蛋白(图53D)。这表明测试的VHH与在沙贝病毒进化枝1(SARS-CoV-1和SARS-CoV-2)中保守的刺突上的表位结合，例如VHH72表位(如本文和参考文献10中所述)。VHH与SARS-CoV-2的RBD的结合也通过生物膜层干涉测量法(BLI)进行了测试，其中单价SARS-CoV-2 RBD-人Fc被固定在抗人Fc生物传感器上。这表明所有测试的VHH以比VHH72慢得多的解离速率与RBD结合(图53E)。对于VHH3.17、VHH3.77和VHH3.115，结合动力学由BLI确定。图53F说明VHH3.115、VHH3.17和VHH3.77结合单体RBD，其KD分别为7.34×0-10M、2.34×10-10M和1.5×10-10M。
为了研究VHH是否也能识别沙贝病毒进化枝2和3的RBD，通过流式细胞术测试VHH与表达沙贝病毒代表性进化枝1.A(WIV1)、进化枝1.B(GD-pangolin)、进化枝2(HKU3和ZCX21)和进化枝3(BM48-31)的RBD的酵母细胞的结合(图54A)。与ELISA中SARS-CoV-2和-1的刺突蛋白的结合一致，除GBP(GFP结合蛋白)对照VHH外，所有测试的VHH在其表面结合了表达分支1.A(WIV1)和分支1.B(GD-pangolin)的RBD的酵母细胞(图54B)。此外，以高亲和力结合SARS-CoV-2刺突和RBD的VHH72家族的两个VHH(VHH3.17和VHH3.77)也能够识别沙贝病毒进化枝2的RBD。两个测试的沙贝病毒进化枝2中至少一个的RBD被属于F55、F36、F149、F38、F29和F83的VHH识别。F55、F36、V83、f38和F29的VHH能够结合BM48-31进化枝3RBD，而VHH3.38、VHH3.83和VHH3.47能够结合本试验中测试的所有RBD(图54B)。此外，VHH3.38和VHH3.83示出为与更广泛的沙贝病毒进化枝1和2的所有RBD结合，除了分支2 Rf1病毒。对于VHH3.83与酵母表面展示的Rf1 RBD的结合可以在100μg/mL观察到，对于VHH3.83在较低浓度下可以观察到没有结合或仅边缘结合。氨基酸比对表明，在测试的沙贝病毒中，只有RBD表面的几个斑块是高度保守的。其中一个斑块位于VHH72表位，如本文所述(图55)。
为了测试所选的VHH是否与VHH72或S309竞争RBD的结合，在用VHH72-Fc(D72-23＝humVHH_S56A/LALAPG-Fc)包被的ELISA板上捕获单体RBD(RBD-SD1-Avi(生物素化的Avi-tag)；这是VHH72-人IgG1融合体，其中VHH72具有S56A取代，与VHH72相比，其对SARS-CoV-1和-2 RBD的亲和力增加)或抗体S309，其也结合RBD核心，但在与VHH72表位相反的位点(图57B)。相比之下，对于S309捕获的RBD，没有一个VHH能与VHH72-Fc捕获的RBD结合，这表明测试的VHH识别与VHH72相同的表位或与VHH72重叠的表位(图57A)。在相同的测定中，由VHH72-Fc捕获的RBD可以容易地被2个VHH(非竞争性VHH)识别，所述两个VHH在不同于VHH72表位的位点结合SARS-CoV-2 RBD。这些数据表明，选择的VHH与远离S309表位但在包含VHH72表位或与VHH72表位重叠的位点或在靠近VHH72表位的位点结合。
实施例31.SARS-CoV-2刺突蛋白残基K378是VHH72结合表位的关键残基，对于VHH3.38和VHH3.83的结合也很重要。
VHH72与SARS-CoV-1 RBD复合物的晶体结构揭示了K378对于VHH72结合的重要性(如本文和参考文献10所述)。为了测试RBD K378对于VHH3.38和VHH3.83的结合也很重要，我们在SARS-CoV-1刺突蛋白的表达载体中将378位的Lys替换为Asn(K378N)，其中RBD被替换为SARS-CoV-2的Asn，如Letko等人11所述。与细胞表面表达的亲本SARS-CoV-2 RBD相比，VHH3.38和VHH3.83与K378N突变体的结合严重受损(图58A和B)。这与VHH3.83和VHH3.38对Rf1沙贝病毒的RBD显示低结合或无结合的观察结果一致。该RBD在对应于SARS-CoV-2 RBD中K378的位置具有Asn。结合这些VHH与VHH72对RBD结合的竞争，这有力地证明了VHH3.38和VHH3.83在VHH72表位结合。
实施例32.所选VHH的SARS-CoV-1和-2中和潜力
为了测试VHH(如VHH72)是否可以中和SARS-CoV-2和SARS-CoV-1感染，测试了VHH中和用SARS-CoV-2或SARS-CoV-1(VSV-delG-SARS-CoV-2-S,VSV-delG-SARS-CoV-1-S)的刺突蛋白假型化的假型VSV-delG病毒的能力。图59和60表明了所有VHH都可以有效中和VSV-delG-SARS-CoV-2-S和VSV-delG-SARS-CoV-1-S假型病毒。
此外，我们测试了所选VHH的结合，类似于VHH72与SARS-CoV-2 RBD的结合，是否可以阻止RBD与表达ACE2的VeroE6细胞的结合。SARS-CoV-2的病毒附着由与靶细胞表面的ACE2结合的刺突RBD介导。大多数RBD特异性抗体或纳米抗体(如VHH72)对SARS-CoV-2的中和作用与其阻止RBD与其在靶细胞表面的ACE2受体结合的能力有关。为了研究VHH是否能够抑制RBD与ACE2受体的结合，我们测试了所选择的VHH和VHH72(VHH72_h1-S56A)是否能够阻止与小鼠Fc融合的SARS-CoV-2 RBD与Vero细胞的结合。图61说明了所有的VHH都能阻止SARS-CoV-2 RBD与VeroE6细胞的相互作用。这表明测试的VHH，像VHH72一样，可以有效地阻止SARS-CoV-2 RBD与其ACE2受体结合。
实施例33.通过深度突变扫描鉴定VHH3.38、VHH3.83和VHH3.55的表位
为了描绘VHH3.38、VHH3.83和VHH3.55的表位，我们进行了深度突变扫描以鉴定对所选VHH结合重要的RBD氨基酸。VHH72(VHH72_h1_S56A)包括在内作为参考，其晶体结构与相关的SARS-CoV-1 RBD复合。我们利用了Starr等人开发的酵母展示平台72，该平台由2个独立产生的酿酒酵母细胞库组成，每个库表达一个用独特条形码和myc-tag标记的单个RBD变体72,92。这2个RBD变体库是通过基于PCR的诱变产生的，以产生RBD变体的全面集合，其中每个位置都被所有其他氨基酸取代。RBD变体平均含有2.7个氨基酸取代。为了仅保留功能性RBD变体，酵母RBD展示库通过FACS基于其结合重组ACE2的能力进行预分类(数据未示出)。为了鉴定以敏感的方式表达对测试的VHH亲和力降低的RBD变体的酵母细胞，我们为每个VHH定义了结合刚好低于饱和的浓度。对于每种测试的VHH，该浓度首先通过用系列稀释的VHH对表达野生型SARS-CoV-2 RBD的酵母细胞进行染色来确定(图62A)。使用这种方法，我们为VHH72_h1_S56A(VHH72)选择400ng/mL，为VHH3.38、VHH3.55和VHH3.83选择10ng/mL。达到类似“刚好低于饱和”浓度的这种浓度差异反映了与VHH72相比，SARS-CoV-2 RBD对VHH3.38(以及VHH3.55和VHH3.83)的亲和力更高，如上所示(图53)。为了鉴定表达对测试的VHH亲和力降低的RBD变体的酵母细胞，用VHH和抗myc-tag抗体对预分选的库进行染色(图62B)。对显示低VHH染色的RBD表达细胞进行分类、生长并用于对其各自的条形码进行测序。为了鉴定与VHH结合显著相关的RBD氨基酸，如Greane等人92所述确定了在分选群体中富集的取代基。
图63B示出了每种测试的VHH在RBD中的位置的总体概况，其中取代导致VHH结合减少。显然，VHH3.38、VHH3.55和VHH3.83的轮廓与VHH72_h1_S56A的轮廓在很大程度上重叠。逃逸谱分析将A363、Y365、S366、Y369、N370、S371、F374、S375、T379、K378、P384和Y508鉴定为(基于两个库的平均值)参与VHH72_h1_S56A结合的氨基酸位置92。除了前3个位置之外，所有位置都落在RBD上VHH72的足迹范围内，这是根据VHH72与SARS-CoV-1 RBD复合物的晶体结构建模所定义的10,14(图64A和B)。位置A363、Y365和S366位于VHH72足迹之外。对SARS-CoV-2RBD结构的检查表明，它们与VHH72表位相邻，并且各个氨基酸的侧链主要朝向RBD内部。因此，该位置上的取代导致的VHH72结合的减少很可能是由变构影响引起的。
对于VHH3.38，通过深度突变扫描鉴定的位置(C336、V341、A363、Y365、S366、L368、Y369、S373-K378、P384、R408、A435、N437、V503和Y508)与针对VHH72_h1_S56A鉴定的位置高度重叠。将RBD K378鉴定为与VHH3.38结合的关键残基与观察结果一致，即VHH3.38与表达SARS-CoV-2 RBD K378N突变体的哺乳动物细胞的结合与野生型SARS-CoV-2 RBD的结合相比被严重削弱(图58A)。位置L368、S373、F377、N437和V503，尽管在VHH72的扫描中没有被鉴定，但是清楚地位于VHH72足迹内。三个额外的氨基酸位置(C336、V341和A435)位于VHH72足迹之外。C336位于VHH72表位的下侧附近，并与C336形成二硫键。这个二硫键的破坏很可能对VHH72表位的折叠有相当大的影响。V341和A435也位于VHH72足迹的水平，但在RBD的对侧。因此，这些位置的突变也会对VHH与VHH72表位的结合产生变构影响(图64)。
同样对于VHH3.55，通过深度突变扫描鉴定的位置(A363、Y365、S366、Y369、S373-K378、P384、C391、F392、T393和Y508)与VHH72_h1_S56A鉴定的位置大部分重叠。位置C391、F392、T393位于VHH72足迹之外。C391位于VHH72表位的下侧附近，并与C525形成二硫键。这种二硫键的破坏可能对邻近VHH72表位的折叠产生相当大的影响。F392和T393也位于VHH72表位的下部附近。因此，这些位置上的取代也会对VHH在VHH72表位上的结合产生变构影响。
在对VHH3.83的扫描中，仅鉴定了RBD的两个氨基酸位置(K378和P384)。重要的是，这两个位置也在包括VHH72_h1_S56A在内的其他测试的VHH中得到鉴定，并且它们位于VHH72表位内。RBD K378残基对于VHH3.83结合的重要性与以下观察结果一致，即与野生型SARS-CoV-2 RBD的结合相比，该VHH与表达SARS-CoV-2RBD K378N突变体的哺乳动物细胞的结合被显著削弱(图58B)。
实施例34.与VHH3.38结合的SARS-CoV2刺突蛋白的Cryo-EM结构
为了获得关于SARS-CoV2刺突蛋白(SC2)的VHH3.38结合模式和结合表位的视图，我们确定了SC2与纳米抗体复合物的的3D cryoEM结构。将纯化的SC2和VHH3.38以1:1的化学计量比混合至终浓度为0.2mg/mL，并在室温下孵育1小时。SC2-VHH复合物被放置在覆盖有单层氧化石墨烯的Quantifoil R2/1EM网格上，然后被闪冷成液态乙烷。在配备在线能量过滤器和Gatan3直接电子检测器的300kV JEOL CryoARM300低温电子显微镜上收集数据。共收集了22,000张放大倍数为60K的图像，从中提取了24,000个单颗粒的最终集合，用于复合物的2D分类和3D重建。在整个重建过程中采用了三重旋转对称(C3)平均，最终得到
Figure GDA0004045908510000831
的电子势图。cryoEM图显示了SC2原聚体的三个拷贝的密度(见图65)。在每个原聚体中，发现受体结合结构域(RBD(残基334至527)处于直立位置，其构象与1-RBD向上构象中所见的构象相似，例如在PDB 6zgg中报告的(图65和66)。在没有VHH的情况下，发现SC2蛋白处于封闭构象，其中所有三个RBD结构域都处于向下的方向(数据未示出)。因此，VHH的结合诱导SC2蛋白从封闭状态转变为完全开放状态，所有三个RBD结构域都处于直立构象(见图66)。除了对应于SC2的密度之外，沿着RBD的侧面可以看到残余密度，对应于纳米抗体的结合。SC2-VHH3.38复合物的最终模型通过对SC2和VHH的单个区域进行自动刚体图拟合而获得。模型和电子势图显示，VHH3.38结合RBD的侧面，靶向由残基368至380以及残基408、503和509形成的SC2表面(见图65)。SC2中的结合VHH3.38结合表位在封闭构象中不可及，只有在RBD向上旋转至开放构象时才暴露出来。VHH3.38与1-RBD向上构象的结合导致与相邻原体的封闭RBD构象的空间冲突，从而诱导3-RBD向上构象。我们观察到cryoEM网格上的SC2-VHH3.38复合物的颗粒密度与同等浓度的载脂蛋白SC2相比显著降低(约100倍)，表明VHH结合导致复合物的不稳定。与此相一致的是，在SC2-VHH3.38复合物的图像中可以看到看似非结构化的颗粒聚集体。这些观察表明，VHH3.38结合SC2的部分作用模式是诱导的刺突蛋白结构完整性的丧失。此外，当SC2-VHH3.38复合物的结构与SARS-CoV2 RBD与人ACE2受体复合物的晶体结构重叠时，可以看到VHH与ACE2受体的空间冲突，这表明VHH和ACE2与RBD的结合是相互排斥的。这些观察结果与竞争结合试验一致，该试验示出VHH与SC2的结合与ACE2的结合相竞争(见上文)。
方法
SARS VHH-72与SARS-CoV-2 RBD相互作用的分子模拟
分子动力学模拟使用VHH72(来自PDB-entry 6WAQ的链C)和变体的模型复合物，以及来自SARS-CoV-2融合前刺突糖蛋白(链A，残基335-528)的cryo-EM结构pdb-entry 6VSB的外向定位的RBD和变体。cryo-EM RBD中残基444-448、455-490和501-502处缺失的环由I-TASSER SARS-CoV-2 RBD模型20重建，缺失的残基由Swiss-PDBViewer21添加。模拟是用Gromacs版本2020.122，使用Amber ff99SB-ILDN力场42，运行5纳秒。在将轨迹转换成PDB格式后，每0.5纳秒提取快照，并提交给FastContact2.0服务器14。
SARS-CoV-2刺突序列变异分析
源自人类宿主的SARS-CoV-2基因组序列从GISAID下载。删除了具有无效DNA字符代码的基因组。通过将基因组与NC_045512.2(NCBI RefSeq)中注释的参考刺突序列进行比对来检索刺突编码序列。为此，使用R package Biostrings 2.54.0版本进行了成对比对，这是一种“重叠”模式下的固定替换矩阵，根据Bio strings文档具有以下参数：匹配和错配替换分数为1和-3；5和2分别作为空位开放和空位扩大处罚。去除没有刺突编码序列的不完整基因组，或产生非常短或没有比对的基因组。具有框架干扰缺失的编码序列也被排除，剩余的开放阅读框架使用Biostrings选项进行计算机内翻译，以解决含有未确定核苷酸的“模糊”密码子。在下一步中，从不良测序结果(Ns)中提取的带有未确定氨基酸序列的预测刺突蛋白序列(表示为X)被去除，尽管允许被可信氨基酸序列包围的单个X字符。此外，保留了具有单个终止密码子或缺乏终止信号(由于可能的C末端延伸)的全长序列，而排除了具有过早终止密码子的蛋白质。
使用具有默认参数的ClustalOmega算法和R package msa 1.18.0版本和BLOSUM65替换矩阵对得到的质量受控的刺突蛋白序列进行校准。多重序列比对用于生成蛋白质序列标志(WebLogo 3.0)并得出每个氨基酸位置的保守性百分比和变异性百分比值。随后，生成了自定义pyMol脚本，以将保守性分数可视化为与我们的纳米抗体复杂建模的RBD链PDB结构上的α碳的B因子。R packages seqinr 3.6-1和BALCONY 0.2.10用于计算数据集中至少出现一次的所有突变的氨基酸频率。分配了主要和次要等位基因频率和计数，并补充了相应样品的地理信息和收集时间。单个突变对刺突表达和ACE2结合的影响来自Starr等人19。使用ggplot2版本3.3.0对收集的全长刺突蛋白数据以及聚焦于RBD(333-516位)的数据进行可视化。
菌株
大肠杆菌(E.coli)MC1061或DH5α用于标准分子生物学操作。用于VHH-Fc筛选的毕赤酵母(syn.Komagataella phaffi)NRRL-Y 11430OCH1敲除菌株(P.pastoris OCH1)是通过用CRISPR-Cas943缺失OCH1基因中编码E151的3bp获得的。如前所述，敲除OCH1编码的α-1,6-甘露糖基转移酶，导致分泌更均一的糖基化蛋白，主要携带Man8聚糖结构44。
酵母中的重组蛋白生产
酵母菌培养物在液体YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖)或固体YPD-琼脂(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％D-葡萄糖，2％琼脂)中生长，选择用100μg/mL
Figure GDA0004045908510000851
或100μg/mL
Figure GDA0004045908510000853
和500μg/mL G418(InvivoGen)。对于蛋白表达，培养物在BMDY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mM KH2PO4/K2HPO4，1.34％ YNB，2％ D-葡萄糖，pH 6)或BMGY(相同组成，但用1％甘油代替2％ D-葡萄糖)中，置于振荡培养箱(28℃，225rpm)中生长。
表达质粒的模块化生成
所有VHH72-XXX-hFc突变蛋白的表达载体都是使用基于Golden Gate组装的酵母模块化克隆工具包的改编版本生成的。简而言之，酿酒酵母α-交配因子减去EA-重复(P3a_ScMF-EAEAdeleted)、SARS-VHH72突变体(P3b_SARS_VHH72-xxx)和人IgG1铰链-人IgG1 Fc(有或没有C-末端(G4S)2接头)(P4a_hIgG1.Hinge-hIgG1.Fc)的编码序列使用GeneArt(赛默飞世尔科技)专有算法进行密码子优化以在毕赤酵母中表达，并在IDT(Integrated DNATechnologies BVBA，鲁汶，比利时)以gBlocks的形式订购。每个编码序列的两侧都有独特的部分特异性的上游和下游BsaI生成的突出端。通过BsmBI组装将gblocks插入通用进入载体，产生不同的“部分”质粒，包含氯霉素抗性盒。通过Golden Gate BsaI组件组装部分质粒以形成表达质粒(pX-VHH72-xxx-hIgGhinge-hIgGFc)。每个表达质粒由9个部分组成：P1_ConLS、P2_pGAP、P3a-001_-ScMF-EAEAdeleted、P3b-002_-VHH72-xxx、P4a-hIgG1.Hinge-hIgG1.Fc(或P4a-(GGGGS)×2hIgG1.Hinge-hIgG1.Fc)、P4b_AOX1tt、P5_ConR1、P6-7Lox71-Zeo、P8 AmpR-ColE1-Lox66。在添加了50μg/mL羧苄青霉素和50μg/mL
Figure GDA0004045908510000852
的LB中选择正确组装的表达质粒。所有部分和表达质粒都经过序列验证。如前所述，使用醋酸锂电穿孔方案进行线性化表达质粒(AvrII)的转化46。
蛋白质表达和纯化
为了进行小规模的表达筛选，将2-3个用pX-VHH72-xxx-hIgGhinge-hIgGFc转化的毕赤酵母OCH1单菌落接种在24深孔区的2mL BMDY或BMGY中。在振荡培养箱(28℃，225rpm)中表达50小时后，通过在1,500g、4℃离心5分钟收集培养基。在粗上清液的考马斯染色的SDS-PAGE上评估蛋白质表达水平。将粗上清液立即用于分析目的(生物膜层干涉测量法和质谱法，见下文)或储存在-20℃。
对于蛋白质纯化，将用pX-VHH72-xxx-hIgGhinge-hIgGFc转化的毕赤酵母OCH1的过夜培养物在125mL BMDY中稀释至0.1OD600在2升带挡板的摇瓶中。50-60小时后，通过在1.500g、4℃离心10分钟收集培养基。在加载到HiTrap MabSelect SuRe5mL柱(GEHealthcare)之前，用0.22μm瓶顶过滤器(Millipore)过滤培养基，用pH7.2的McIlvaine缓冲液(174mM Na2HPO4，13mM柠檬酸)平衡。用pH 3的McIlvaine缓冲液(40mM Na2HPO4，79mM柠檬酸)洗脱该柱。用4℃饱和的Na3PO4将收集的馏分中和至pH 6.5。将含有目的蛋白质的洗脱馏分(在SDS-PAGE上评估)汇集并注入Hiprep 26-10脱盐柱(GE-Healthcare)，用25mM L-His、125mM NaCl、pH 6洗脱。在光谱蛋白质浓度测定(280nM最小缓冲液空白吸光度)后，如果需要，使用Amicon 10kDa MWCO旋转柱浓缩纯化的蛋白质浓度，在液氮中速冻，并储存在-80℃。
毕赤酵母表达的VHH72-hFc亲和突变体的生物膜层干涉测量法筛选
在Octet RED96系统(FortéBio)上通过生物膜层干涉测量法评估了毕赤酵母上清液中VHH72-hFc亲和突变体的SARS-CoV-2 RBD结合动力学。将抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器(FortéBio)浸泡在动力学缓冲液(10mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl，1mg/mL牛血清白蛋白，0.05％吐温-20和3mM EDTA)中20分钟。将5-15μg/mL的小鼠IgG1 Fc融合的SARS-CoV-2 RBD(Sino Biological)固定在这些AMC生物传感器上，信号为0.3-0.8nM。与纯化的VHH-hFc蛋白相比，基于考马斯蓝染色的SDS-PAGE上的条带强度，估计表达毕赤酵母OCH1的VHH72-hFc的粗细胞上清液中的重组蛋白浓度。粗制上清液在动力学缓冲液中稀释20至100倍至表观VHH72-hFc亲和突变体浓度为5-10nM，并测量180秒的缔合度。在动力学缓冲液中等稀释度的未转化毕赤酵母OCH培养物的粗上清液中测量解离(480秒)。在分析期间，生物传感器通过暴露于再生缓冲液(10mM甘氨酸pH 1.7)三次20秒进行再生。使用ForteBioData Analysis9.0软件，对数据进行双重参考减去，并确定解离过程中响应信号的降低。
生物膜层干涉测量法动力学
在Octet RED96系统(FortéBio)上通过生物膜层干涉测量法评估纯化的VHH72-hFc变体的RBD结合动力学。将抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器(FortéBio)浸泡在动力学缓冲液中20分钟。将15μg/mL的小鼠IgG1 Fc融合的SARS-CoV-2 RBD(Sino Biological)固定在这些AMC生物传感器上，信号为0.4-0.6nM。在30℃下测量动力学缓冲液中30nMVHH72-hFc变体的两倍稀释系列的缔合度(120秒)和解离度(480秒)。为了测量单价VHH72变体对RBD的亲和力，将抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(FortéBio)在动力学缓冲液中浸泡20分钟。将15μg/mL的单体人Fc-融合的SARS-CoV-2_RBD-SD123固定在这些AHC生物传感器上，信号为0.35-0.5nM。在30℃下测量动力学缓冲液中200nM VHH72变体样品的两倍稀释系列的缔合度(120秒)和解离度(480秒)。
在分析期间，AHC和AMC生物传感器通过暴露于再生缓冲液(10mM甘氨酸pH1.7)三次20秒进行再生。基于非相关VHH-IgG1 Fc融合蛋白(用于VHH72-hFc变体的动力学)或动力学缓冲液(用于单价VHH的动力学)的基线测量，在Octet数据分析软件v9.0(FortéBio)中对数据进行双重参考减去并相互对齐。非饱和曲线的缔合和解离在整体1:1模型中拟合。
完整蛋白质的质谱分析
VHH72-Fc蛋白(10μg)首先用三(2-羧乙基)膦(TCEP；10mM)在37℃下还原30分钟，然后在与LTQ Orbitrap XL质谱仪(赛默飞世尔科技)在线连接的Ultimate3000HPLC系统(赛默飞世尔科技，德国不来梅)上分离还原的蛋白质。简而言之，将大约8μg蛋白质注入Zorbax 300SB-C18色谱柱(5μm，
Figure GDA0004045908510000871
1×250mm IDxL；Agilent Technologies)并使用30分钟梯度从5％到80％溶剂B以100μL/min流速进行分离(溶剂A：0.1％甲酸和0.05％三氟乙酸的水溶液；溶剂B：0.1％甲酸和0.05％三氟乙酸的乙腈溶液)。柱温保持在60℃。使用以下参数将洗脱的蛋白质直接喷射到带有ESI源的质谱仪中：喷射电压4.2kV，表面诱导解离30V，毛细管温度325℃，毛细管电压35V，鞘层气体流速7(任意单位)。质谱仪使用轨道探测器分析仪在MS1模式下操作，分辨率为100,000(m/z 400)，在剖面模式下的质量范围为600-4000m/z，。用BioPharma FinderTM 3.0软件(赛默飞世尔科技)使用Xtract去卷积算法(同位素解析光谱)对所得MS光谱进行去卷积。手动注释去卷积的光谱。
热稳定性
为了评估VHH72-hFc变体的热稳定性，进行了差示扫描荧光测定法(thermofluor测定法)49。简言之，将在PBS中的10μM VHH72-hFc溶液与10×SYPRO Orange染料(LifeTechnologies)混合，并在Roche LightCycler 480qPCR机器中，在20℃至98℃的0.01℃/s温度梯度下，测量染料与熔融小球解折叠蛋白的结合。减去空白的数据归一化为0-100％。在熔解曲线的三次样条插值之后，绘制一阶导数以确定每个熔融温度(Tm)作为这些一阶导数的峰值。
物理和化学稳定性测试
使用Uncle仪器(Unchained Labs；Pleasanton,CA,USA)进行动态光散射。简而言之，将10μL的1mg/mL样品添加到样品比色皿中。激光和衰减器控制设置为自动，每个数据点进行10次采集，每次采集时间为10秒。在Uncle仪器(Unchained Labs；Pleasanton,CA,USA)中监测温度诱导的蛋白质展开后的内在色氨酸荧光。同样在此处，将10μL浓度为1mg/mL的样品加到样品比色皿中，并以0.5℃/min的速率从25℃开始线性升温至95℃，预培养180秒。将重心平均值(BCM)和静态光散射(266nM和473nM处的SLS)信号对温度作图，以便分别获得熔解温度(Tm)和聚集起始温度(Tagg)。通过将1mg/mL蛋白质样品在-80℃下冷冻和在室温下解冻连续五个循环来评估冻融稳定性。随后，通过目测、多角度光散射结合尺寸排阻色谱、动态光散射和OD500nm测量来检查这些样品的蛋白质浓度并测量蛋白质的任何损失。根据制造商的说明，通过向1mg/mL蛋白质样品中添加过氧化氢至10mM终浓度，然后在37℃下孵育3小时，最后使用PD MidiTrap G-25柱(GE Healthcare；芝加哥，伊利诺伊州，美国)将缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行强制蛋氨酸氧化，并在-80℃下储存，直至进行质谱分析。
Vero E6细胞的RBD竞争测定
将终浓度为0.4μg/mL的与鼠IgG Fc(Sino Biological)融合的SARS-CoV-2 RBD与1μg/mL单价VHH一起在室温孵育20分钟，，然后在冰上再孵育10分钟。通过细胞解离缓冲液(Sigma)和胰蛋白酶处理分离在亚融合处生长的VeroE6细胞。用PBS洗涤一次后，在冰上用PBS中的1％ BSA封闭细胞。所有剩余的步骤也在冰上进行。向细胞中加入含有RBD和VHH或VHH-Fc融合体的混合物，并孵育1小时。随后，用含有0.5％ BSA的PBS洗涤细胞3次，并用AF647缀合的驴抗小鼠IgG抗体(Invitrogen)染色1小时。用含有0.5％ BSA的PBS再洗涤3次后，使用BD LSRII流式细胞术(BD Biosciences)通过流式细胞术分析细胞。
CoV假病毒中和测定
为了产生复制缺陷型VSV假型病毒，用含有eGFP和萤火虫荧光素酶表达盒的复制缺陷型VSV载体接种转染SARS-CoV-1S或SARS-CoV-2 S的HEK293T细胞(Berger和Zimmer，PloS One 6，e25858(2011))76,77。在37℃下孵育1小时后，去除接种物，用PBS洗涤细胞，并在添加了抗VSV G mAb抗体(ATCC)的培养基中孵育16小时。然后收集假型化颗粒，并通过离心进行澄清，如文献(Wrapp等人，2020 Cell May 28181(5):1004-1015.e15)13所述。对于VSV假型中和试验，假病毒与不同稀释度的纯化VHH或GFP结合蛋白(GBP:GFP特异性VHH)在37℃孵育30分钟。随后，将孵育的假病毒加入到VeroE6细胞的亚融合单层中。16小时后，通过使用Tecan infinite 200pro读板仪测量细胞裂解物中的GFP荧光来量化转导效率。如图例所示，使用非感染细胞和用PBS处理的感染细胞的GFP荧光或每个稀释系列的最低和最高GFP荧光值来标准化GFP荧光。通过非线性回归曲线拟合、log(抑制剂)对响应(四个参数)计算IC50。
SARS-CoV-2噬斑减少中和试验(PRNT)
为了进行真正的SARS-CoV-2中和试验，如所述13，使用在VeroE6细胞上生长的P6代的SARS-CoV-2菌株BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020(EPI ISL 407976|2020-02-03)。使用20μg/mL的起始浓度，将VHH-Fc构建体连续稀释三倍，与100PFU SARS-CoV-2混合，并在37℃孵育1小时。然后将VHH-Fc-病毒复合物加入12孔板中的Vero E6细胞单层中，并在37℃孵育1小时。随后，用添加了2％ FBS的DMEM中的0.8％(w/v)甲基纤维素代替接种物混合物。在37℃孵育3天后，除去覆盖层，用3.7％ PFA固定细胞，随后用0.5％结晶紫染色。半最大中和滴度(PRNT50)定义为导致噬斑减少50％的VHH-Fc浓度。
实施例9中使用的动物
野生型叙利亚仓鼠(Mesocricetus auratus)购自Janvier Laboratories。使用6-8周大的野生型仓鼠。将动物单独圈养在单独通风的隔离笼(IsoCage N BiocontainmentSystem，Tecniplast)中，可随意获取食物和水，并进行笼内强化(木块)。根据欧洲实验动物科学协会联合会(FELASA)批准的机构指南，鲁汶大学伦理委员会批准了饲养条件和实验程序(许可证P015-2020)。通过腹腔注射500μL Dolethal(200mg/mL戊巴比妥钠，VétoquinolSA)对动物实施安乐死。每天监测动物的疾病迹象(嗜睡、呼吸沉重或皮毛起皱)。在感染之前，通过腹膜内注射甲苯噻嗪(16mg/kg，
Figure GDA0004045908510000891
V.M.D.)、氯胺酮(40mg/kg，Nimatek，EuroVet)和阿托品(0.2mg/kg，Sterop)溶液对动物进行麻醉。通过在每只动物的两个鼻孔轻轻加入50μL含有2×106TCID50(P6病毒)的病毒原液液滴，对每只动物进行鼻内接种。未感染的动物没有接受任何病毒或基质。
实施例9和21至23中使用的病毒株
实施例9和23应用了SARS-CoV-2菌株BetaCov/Belgium/GHB-03021/2020(EPI ISL407976 2020-02-03)，该菌株从鼻咽拭子中回收，并在MinION平台(Oxford Nanopore)上直接测序62。通过在HuH7和Vero E6细胞13上连续传代，添加青霉素/链霉素、庆大霉素和两性霉素B，分离出传染性病毒。用于动物实验的病毒来自P6代。在动物接种之前，按照已建立的宏基因组学流程，通过在MiSeq平台(Illumina)上进行深度测序，确认病毒库存不含支原体(PlasmoTest、InvivoGen)和其他外来试剂63,64。通过在实施例9中使用的
Figure GDA0004045908510000901
方法或在实施例23中使用的Reed和Muench方法71对Vero E6细胞进行滴定来确定病毒原种的感染性含量。根据机构指南，所有病毒相关工作均在鲁汶雷加大学(3CAPS)的高防护BSL3+设施中进行，许可证号为AMV 30112018 SBB 219 2018 0892和AMV 23102017 SBB 2192017 0589。
细胞
Vero E6细胞(非洲绿猴肾，ATCC CRL-1586)在添加了10％胎牛血清(Integro)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)和1％碳酸氢盐(Gibco)的基本培养基(Gibco)中培养。用含2％胎牛血清而不是10％的培养基进行终点滴定。
实施例9中使用的血清
人类恢复期血浆(2号患者)获自Biobank Rode Kruis-Vlaanderen，根据比利时法律注册为Biobank BB190034。在SARS-CoV-2出现之前取样的健康志愿者捐赠的血浆用作阴性对照(NC供体)。血清/血浆通过腹腔内给药。感染前1天，每只仓鼠1000μL。在感染前1天，以20mg/kg的浓度腹膜内给药VHH-72-Fc抗体。VHH-72-Fc在ExpiCHO细胞(赛默飞世尔科技)中表达，并从培养基中纯化，如文献10所述。简而言之，在用pcDNA3.3-VHH-72-Fc质粒DNA转染后，随后，在32℃和5％ CO2下孵育6-7天，在5mL MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)上捕获澄清的细胞培养基中的VHH-72-Fc蛋白，用pH 3的McIlvaine缓冲液洗脱，用饱和Na3PO4缓冲液中和，并将缓冲液换成储存缓冲液(25mM L-组氨酸，125mM NaCl)。通过蛋白质和肽水平的质谱分析验证了抗体的身份。
如实施例9的实验中进行的RNA提取和RT-qPCR
在感染后4天对动物实施安乐死，取出器官，用杵和12倍的细胞培养基(DMEM/2％FCS)手工匀浆肺组织。根据制造商的说明，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从4mg肺组织的匀浆中提取RNA，或者使用NucleoSpin试剂盒(Macherey-Nagel)从50μL血清中提取RNA。在RNALater(Qiagen)中收集其它器官，并在提取前在珠磨机(Precellys)中匀浆。在100μL洗脱液中，4μL用作RT-qPCR反应的模板。RT-qPCR在LightCycler96平台(Roche)上进行，使用iTaq Universal Probes One-Step RT-qPCR试剂盒(BioRad)，该试剂盒具有特异于SARS-CoV-2和仓鼠β-肌动蛋白(ACTB)、ACE2、MX2和IP-10(IDT)的引物和探针(表7)。对于每个数据点，重复进行qPCR反应。SARS-CoV-2cDNA(IDT)和传染性病毒的标准分别用于将RNA的量表示为每毫克组织的标准化病毒基因组当量(vge)拷贝数，或每毫升血清的TCID50当量。管家基因β-肌动蛋白的平均值用于标准化。使用2-ΔΔCt方法计算相对倍数变化65。
表7用于RT-qPCR的引物
Figure GDA0004045908510000911
如实施例22中进行的叙利亚仓鼠体内实验(攻击研究图37)
在仓鼠攻击模型中评估了二价和四价SARS-CoV-2特异性纳米抗体作为针对SARS-CoV-2感染的治疗性或预防性处理的功效。评价治疗效果的主要终点是呼吸道中的病毒载量。在研究的第0天，雄性金黄叙利亚仓鼠通过鼻内(i.n.)途径感染了104TCID50 SARS-CoV-2(菌株BetaCoV/Munich/BavPat1/2020，p3，该菌株携带刺突蛋白中的D614G突变，这提供了病毒快速进入的优势，现在是主要的疫情形式36)。动物通过腹腔(i.p.)途径接受不同剂量的不同化合物的预防性(感染前24小时)或治疗性(感染后4小时[p.i.])治疗，每组6只动物。在感染后第4天对动物实施安乐死，以进行尸检。在研究过程中，每天对动物称重并从喉咙取样，以监测体重变化并评估呼吸道中的病毒脱落。安乐死后评估肺、支气管肺泡灌洗液(BAL)和鼻甲组织中的病毒载量以及所选组织中的组织病理学变化。
尸检后，进行支气管肺泡灌洗，收集组织样本，并储存在10％福尔马林中用于组织病理学和免疫组化，并冷冻用于病毒学分析。用10％福尔马林固定后，将左肺和左鼻甲的切片包埋在石蜡中，并将组织切片染色用于组织学检查。
为了进行病毒学分析，将组织样本称重，在感染培养基中匀浆，并在滴定前短暂离心。收集感染后第4天的血清样品用于PK分析。咽拭子、BAL和组织匀浆用于检测病毒RNA。
为此目的，分离RNA(SOP VC-M098；在MagNA Pure 96上进行核酸纯化)，并使用对β冠状病毒E基因的特异性引物和探针进行Taqman PCR(SOP VC-M052；在7500实时PCR系统上进行测定(通用方法))。不同样本中的病毒拷贝数是根据每次运行中包含的标准病毒的斜率、截距、检测上限和下限，使用样本所得Ct值进行计算得出的，。
复制型病毒的检测：一式四份的10倍系列稀释液来测定Vero E6细胞融合层中的病毒滴度。为此，制备了样品(咽拭子、BAL和组织匀浆)的系列稀释液，并在37℃下在VeroE6单层上孵育1小时。清洗Vero E6单层膜，并在37℃下孵育4-6天，之后使用活力标记WST8(色度读数)对平板进行染色和评分。使用Spearman-Karber方法计算病毒滴度(TCID50/mL或/g)。
如实施例23中进行的叙利亚仓鼠体内实验
之前已经描述过SARS-CoV-2的仓鼠感染模型13,69。简而言之，野生型叙利亚金黄仓鼠(Mesocricetus auratus)购自Janvier Laboratories，每两只饲养在通风隔离笼(IsoCage N Biocontainment System,Tecniplast)中，可随意获取食物和水以及笼子内强化(木块)。在研究开始前，使动物适应4天。饲养条件和实验程序经鲁汶大学动物实验伦理委员会批准(许可证P065-2020)。用氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品麻醉6-8周龄的雌性仓鼠，并鼻内接种50μL含2×106TCID50 SARS-CoV-2(第0天)。
根据表4中的方案，在治疗环境中对动物进行治疗：即仓鼠在感染后24小时，通过腹腔内给药用D72-53(PB9683)(4mg/kg)、前导蛋白(D72-58)(4mg/kg)或对照进行治疗。监测仓鼠的外观、行为和体重。在感染后第4天(pi)，通过腹腔注射500μL Dolethal(200mg/mL戊巴比妥钠，vétoquilor SA)对仓鼠实施安乐死。收集肺，分别通过RT-qPCR和终点病毒滴定来量化病毒RNA和感染性病毒。在终点处死时采集血样，并获取血清用于PK分析。
处死后收集仓鼠肺组织，在350μL RLT缓冲液(RNeasy Mini试剂盒，Qiagen)中使用珠破碎(Precellys)匀浆，并离心(10,000rpm，5分钟)以沉淀细胞碎片。根据制造商的说明提取RNA。在50μL洗脱液中，4μL用作RT-qPCR反应的模板。RT-qPCR在LightCycler96平台(Roche)上使用iTaq Universal Probes One-Step RT-qPCR试剂盒(BioRad)进行，该试剂盒具有N2引物和靶向核衣壳13的探针。SARS-CoV-2cDNA(IDT)标准用于表达每毫克组织或每毫升血清的病毒基因组拷贝数。
在350μL最小基本培养基中使用珠破碎(Precellys)将肺组织匀浆，并离心(10,000rpm，5min，4℃)以沉淀细胞碎片。为了量化传染性SARS-CoV-2颗粒，在96孔板中对融合的Vero E6细胞进行终点滴定。使用Lindenbach计算器通过Reed和Muench方法71计算病毒滴度，并表示为每毫克组织的50％组织培养感染剂量(TCID50)。
为了进行组织学检查，将肺在4％甲醛中固定过夜，并包埋在石蜡中。在用苏木精和伊红染色后分析组织切片(5μM)，并由专业病理学家对肺损伤进行盲法评分。评分参数(累积评分为1至3分)如下：充血、肺泡内出血、支气管壁凋亡小体、坏死性细支气管炎、血管周围水肿、支气管肺炎、血管周围炎症、支气管周围炎症和血管炎。
仓鼠的PK/PD分析(实施例29)
所有仓鼠血清和BALF样本的生物分析均采用竞争AlphaLISA(放大发光邻近均相检测)方法进行。该测定检测SARS-CoV-2 RBD蛋白与捕获在供体和受体珠上的单价VHH72_h1(S56A)纳米抗体相互作用的抑制，导致产生荧光信号的珠之间的能量转移。这种在封闭系统中无需洗涤步骤的同质测定被认为有利于测试来自受病毒攻击的动物的样本(Boudewijns等人，2020(参考文献13))。从一项攻击研究(图37，实施例23；慕尼黑分离物)中，血清和BALF样本通过在56℃加热30分钟而失活，导致传染性病毒减少4log倍。该测定在白色低结合384孔微量滴定板(F-底部，Greiner目录号781904)中进行。以两种稀释度(300倍和900倍)对仓鼠血清样本进行重复分析。分别以1:3和1:5的稀释度对BALF样本进行重复的分析。相应的VHH72-h1 S56A-Fc的校准标准曲线通过在测定缓冲液(含0.5％ BSA和0.05％吐温20的PBS)中稀释的仓鼠血清中从50nM开始的系列稀释(1.7倍)产生。QC是在测定当天从不同的工作储备液中用稀释的仓鼠血清在测定缓冲液中新鲜制备的。在用参考材料确认缺乏基质效应后，在缓冲液中分析BALF样本。向每个孔中，将5μL标准/QC/样品与5μL3nm纳米抗体(VHH72_h1(S56A)-Flag3-His6)和5μL 2.5nm生物素化SARS-CoV-2 RBD蛋白混合。在室温下孵育1小时后，加入5μL链霉亲和素包被的α供体珠(Perkin Elmer，目录号6760002)和5μL抗Flag AlphaLISA受体珠(Perkin Elmer，目录号AL112C)(终浓度为20μg/mL)，最终体积为25μL，室温避光孵育1小时。在Ensight仪器上在680nm处照射并在615nm处读数后，评估珠子之间的相互作用。通过4PL分析将样本浓度反算为标准校准曲线。
统计分析
GraphPad Prism第8版(GraphPad软件公司)用于所有统计评估。进行的动物和独立实验的数量在附图的图例中显示。除非另有说明，否则使用非参数Mann Whitney U-test确定统计显著性。当P值≤0.05时，这些值被认为有显著差异。
展示在酿酒酵母表面的与沙贝病毒RBD结合的抗体的流式细胞术分析
Jesse Bloom博士慷慨地提供了基于pETcon酵母表面展示表达载体的质粒池，其编码一组SARS-CoV2同源物的RBD(Starr等人，Cell 2020Sep 3；182(5):1295-1310.e20)38。通过10ng规模的电穿孔将该池转化至大肠杆菌TOP10细胞，并接种在添加了羧苄青霉素的低盐LB琼脂板上。选择单个克隆，在添加羧苄青霉素的液体低盐LB中生长，并进行微量制备。用覆盖整个RBD CDS的引物对选择的质粒进行Sanger测序，并重复该过程，直到每个所需的RBD同源物作为序列验证的单克隆被挑选出来。此外，SARS-cov 2 RBD的CDS被排序为酵母密码子优化的gBlock，并通过Gibson组装克隆到pETcon载体中。将质粒转化到大肠杆菌中，如上所述进行制备和序列验证。根据Gietz和Schiestl的方案((Nat.Protoc.2,31-34,2007)79，将选择的pETcon RBD质粒的DNA转化到酿酒酵母菌株EBY100中，并接种在酵母脱离培养基(SD agar-trp-ura)上。选择单个克隆，并通过菌落PCR验证正确的插入长度。选择每个RBD同源物的单个克隆，并在28℃下在10mL液体抑制培养基(SRaf-ura-trp)中生长过夜。然后，将这些预培养物以0.67/mL的OD600反稀释至50mL液体诱导培养基(SRaf/Gal-ura-Trp)，并在收获前生长16小时。在PBS中洗涤后，将细胞固定在1％ PFA中，用PBS洗涤两次，用1％BSA封闭，并用不同浓度的VHH染色。使用Alexa fluor 633缀合的抗人IgG抗体(Invitrogen)检测抗体的结合。使用FITC缀合的鸡抗myc抗体(Immunology ConsultantsLaboratory，Inc.)检测表面展示的myc标记的RBD的表达。用含0.5％ BSA的PBS洗涤3次后，使用BD LSRII流式细胞术(BD Biosciences)通过流式细胞术分析细胞。结合计算为RBD+(FITC+)细胞的AF647 MFI与RBD-(FITC)细胞的AF647 MFI之比。
通过毕赤酵母和大肠杆菌生产VHH(实施例30)
参考文献10描述了毕赤酵母中VHH的小规模生产。为了在大肠杆菌中生产VHH，将含有目的VHH的pMECS载体转化到WK6细胞(非抑制型大肠杆菌菌株)中，并铺在含有氨苄青霉素的LB平板上。第二天，挑取克隆，在2mL含100μg/mL氨苄青霉素和1％葡萄糖的LB中于37℃生长过夜，同时以200rpm摇动。1mL这种预培养物用于接种25mL添加了100μg/mL氨苄青霉素、2mM MgCl2和0.1％葡萄糖的TB(极品肉汤)，并在37℃下振荡培养(200-250rpm)直到达到0.6-0.9的OD600。通过添加IPTG至1mM终浓度，诱导VHH产生。这些诱导的培养物在28℃下培养过夜，同时以200rpm摇动。如参考文献10所述，从周质中提取产生的VHH并纯化。简而言之，使用Ni琼脂糖珠(GE Healthcare)从溶液中纯化VHH。使用500mM咪唑洗脱后，将含有VHH的流通馏分用具有Vivaspin柱(5kDa截留值，GE Healthcare)的PBS进行缓冲液交换。通过SDS-PAGE和考马斯染色以及完整的质谱分析纯化的VHH。
酶联免疫吸附测定(实施例30)
用100ng重组SARS-CoV S-2P蛋白(具有foldon)、SARS-CoV-1S-2P蛋白(具有foldon)、小鼠Fc-标记的SARS-CoV-2 RBD(Sinobiologicals)或BSA在4℃下包被微量滴定板(II型，F96 Maxisorp，Nuc)的孔过夜。用PBS中的5％的奶粉封闭包被的板。将VHH的稀释系列添加到孔中。通过将板依次与HRP缀合的兔抗骆驼VHH抗体(Genscript)一起孵育来检测结合。洗涤后，将50μL TMB底物(四甲基联苯胺，BD OptETA)加入板中，并通过加入50μL1M H2SO4终止反应。用iMark酶标仪(Bio Rad)测量450nM处的吸光度。使用非线性回归(Graphpad 8.0)进行曲线拟合。
对于测试VHH与VHH72-Fc或人S309单克隆抗体捕获的单价RBD的结合的竞争测定，ELISA板在4℃下用PBS中的50ng VHH 72-Fc或S309包被16小时。用PBS洗涤后，然后用含0.1％吐温-20的PBS洗涤，用含5％奶粉的PBS在室温下封闭孔1小时。然后向孔中加入20ng单体RBD(内部生产的RBD-SD1-Avi)，并在室温下孵育1小时。随后，将0.5μg/mL的VHH(对于VHH72_h1_S56为10μg/mL)加入孔中，并在室温下孵育1小时。在用PBS洗涤2次和用含有2％牛奶和0.05％吐温-20的PBS洗涤3次后，使用小鼠抗HIS-tag抗体(Biorad)和HRP缀合的羊抗小鼠IgG抗体(GE healthcare)检测结合VHH。
如实施例30中进行的生物膜层干涉测量法
在Octet RED96系统(FortéBio)上通过生物膜层干涉测量法评估了VHH变体的SARS-CoV-2 RBD结合动力学。为了测量单价VHH变体对RBD的亲和力，将15μg/mL的单体人Fc融合SARS-CoV-2_RBD-SD1(Wrapp等人，2020年5月28日；181(5)：1004-1015)固定在抗人IgGFc捕获(AHC)生物传感器(FortéBio)上，信号为0.35-0.5nm。在动力学缓冲液中测量重复的200nM VHH的缔合(120s)和解离(480s)。在分析期间，生物传感器通过暴露于再生缓冲液(10mM甘氨酸pH 1.7)三次20秒进行再生。在Octet数据分析软件v9.0(FortéBio)中对数据进行双重参考减去并相互对齐。Offrates(kdis)拟合为1:1模型。
在Octet RED96系统(FortéBio)上通过生物膜层干涉测量法评估了VHH变体之间对SARS-CoV-2 RBD结合的竞争。将二价VHH72-hFc(50nM)固定在抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(FortéBio)上，随后捕获抗原RBD-SD1_mFc(200nM)至饱和。然后，测量与1μM VHH变体的竞争(通过Trinean DropSense机器、Lunatic芯片计算的蛋白质浓度，减去从320-400nM处的吸光度光谱推断的浊度曲线)600s。在分析期间，生物传感器通过暴露于再生缓冲液(10mM甘氨酸pH 1.7)中三次20秒以再生。在Octet数据分析软件v9.0(FortéBio)中对数据进行双重参考减去并相互对齐。
与表达SARS-CoV刺突蛋白的HEK293细胞结合的流式细胞术分析(实施例31)
为了通过流式细胞术研究VHH与哺乳动物细胞表面刺突蛋白的结合，我们使用了含有SARS-CoV-1刺突蛋白编码序列的表达质粒，其中，RBD被SARS-CoV-2取代，如Letko等人(Nature Microbiology,2020,Apr；5(4):562-569)所述。后者用作模板，根据制造商的说明，通过QuickChange定点诱变(Agilent)生成K378N刺突变体的表达质粒。在用各自与GFP表达质粒组合的刺突表达质粒转染HEK293T细胞或HEKS细胞两天后，收集细胞，用PBS洗涤一次，并用1％ PFA固定30分钟。使用小鼠抗HIS标签抗体(Biorad)和AF647缀合的驴抗小鼠IgG抗体(Invitrogen)检测VHH的结合。用含0.5％ BSA的PBS洗涤3次后，使用BD LSRII流式细胞术仪(BD Biosciences)通过流式细胞术分析细胞。结合计算为GFP表达细胞(GFP+)的平均AF647荧光强度(MFI)除以GFP阴性细胞(GFP-)的MFI。使用非线性回归(Graphpad 8.0)拟合结合曲线。
深度突变扫描(实施例33)
深度突变的SARS-CoV2 RBD库转化到大肠杆菌
Jesse Bloom博士慷慨地提供了pETcon载体中两个独立产生的深度突变SARS-CoV2 RBD库的质粒制备物(Starr等人，2020，Cell 182，1295-1310.e20)。将10ng这些制备物通过电穿孔转化到大肠杆菌TOP10菌株中，并在37℃下在SOC培养基中恢复1小时。将转化混合物分开并铺在10个24.5cm×24.5cm大的生物测定皿上，所述皿含有添加了羧苄青霉素的低盐LB培养基，预期密度为每皿100,000个克隆。生长过夜后，从皿上刮下所有菌落并重新悬浮在添加了羧苄青霉素的300mL低盐LB中。在造粒之前，培养物生长2个半小时。细胞沉淀用无菌MQ洗涤一次，并根据制造商的说明通过QIAfilter质粒Giga制备试剂盒(Qiagen)提取质粒。
深度突变的SARS-CoV2 RBD库转化到酿酒酵母
根据Gietz和Schiestl(Gietz等人，Nature Protocols 2007，231-345)的大规模方案，将10μg所得质粒制剂转化到酿酒酵母菌株EBY100。在100mL液体酵母脱除培养基(SD-trp-ura)中筛选转化体16小时。然后将培养物以1OD600反稀释回100mL新鲜SD-trp-ura中，再传代9小时。之后，将培养物快速冷冻在1×108细胞中，等分加入15％甘油，并在-80℃下储存。
SARS-CoV2的WT RBD的克隆和转化
SARS-cov 2 RBD的CDS被排序为酵母密码子优化的gBlock，并通过Gibson组装克隆到pETcon载体中。将克隆混合物同样电穿孔到大肠杆菌TOP10细胞中，并根据制造商的说明通过Miniprep试剂盒(Promega)提取质粒。使用覆盖整个RBD CDS的引物对质粒进行Sanger测序。最后，根据Gietz和Schiestl(Gietz等人，Nature Protocols 2007，2，31-34)的小规模方案，将质粒转化到酿酒酵母菌株EBY100。通过酵母菌落PCR选择转化子。
ACE2上深度突变SARS-CoV2 RBD库的预分类
将每个库的一份等分样本解冻，并在28℃的10mL液体抑制培养基(SRaf-ura-trp)中生长过夜。此外，将含有表达来自SARS-CoV2的WT RBD的pETcon质粒的对照EBY100菌株接种于10mL液体抑制培养基中，并在28℃下生长过夜。然后，将这些预培养物以0.67/mL的OD600反稀释至50mL液体诱导培养基(SRaf/Gal-ura-trp)，并在收获前生长16小时。
细胞颗粒用洗涤缓冲液(1×PBS+1mM EDTA，每50mL缓冲液pH 7.2+1片不含完全抑制剂EDTA的片剂(Roche))洗涤三次，并在染色缓冲液(洗涤缓冲液+0.5mg/mL牛血清白蛋白)中用9.09nM hACE2 muFc(Sino Biological)以8/mL的OD600在旋转轮上于4℃染色1小时。用染色缓冲液洗涤细胞三次，并用1:100anti-cmyc-FITC(Immunology ConsultantsLab)、1:1000抗小鼠IgG-AF568(分子探针)和1:200L/D eFluor506(赛默飞世尔科技)在4℃的旋转轮上染色一小时。细胞用染色缓冲液洗涤三次，并在FACS Melody(BD Biosciences)上分类之前，用35μm细胞过滤器过滤。绘制了捕获ACE2+细胞的选择门，使得补偿后，未染色和单染色对照以最多0.1％的细胞出现在背景上。每个库收集了大约250万个ACE2+细胞，每个细胞在涂有2×YPAD+1％BSA的5mL聚丙烯管中。
通过在含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(赛默飞世尔科技)的液体SD-trp-ura培养基中在28℃下生长72小时来回收分选的细胞，并在-80℃下，在等分的15％甘油中以9OD600单位快速冷冻。
ACE2分类的深突变SARS-CoV2 RBD库上的纳米抗体逃逸突变体分类
将每个库的一个ACE2分选的等分样本解冻，并在28℃的10mL液体抑制培养基(SRaf-ura-trp)中生长过夜。此外，将含有表达来自SARS-CoV2的WT RBD的pETcon质粒的对照EBY100菌株接种于10mL液体抑制培养基中，并在28℃下生长过夜。然后，将这些预培养物以0.67/mL的OD600反稀释至50mL液体诱导培养基(SRaf/Gal--ura-trp)，并在收获前生长16小时。
细胞颗粒用洗涤缓冲液(1×PBS+1mM EDTA，每50mL缓冲液pH 7.2+1片不含完全抑制剂EDTA的片剂(Roche)，新鲜制备并过滤无菌)洗涤三次，并在染色缓冲液(洗涤缓冲液+0.5mg/mL牛血清白蛋白)中以8/mL的OD600对每个染色纳米抗体的特定浓度在旋转轮上于4℃染色1小时。具体来说，我们对VHH72h1 S56A以400ng/mL染色，对VHH3.38、VHH3.55和VHH3.83以10ng/mL染色。用染色缓冲液洗涤细胞三次，并用1:2000小鼠抗His(Biorad)在旋转轮上于4℃染色1小时30分钟。用染色缓冲液洗涤细胞三次，并用1:100anti-c-myc-FITC(Immunology Consultants Lab)、1:1000抗小鼠IgG-AF568(分子探针)和1:200L/DeFluor506(赛默飞世尔科技)在4℃的旋转轮上染色一小时。细胞用染色缓冲液洗涤三次，并在FACS Melody(BD Biosciences)上分类之前，用35μm细胞过滤器过滤。选择选通方式，使得补偿后，最多0.1％的完全染色WT RBD对照细胞出现在选择门中。每个库收集了150,000至350,000个逃逸细胞，每个细胞在涂有2×YPAD+1％ BSA的5mL聚丙烯管中。
通过在添加了100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(赛默飞世尔科技)的液体SD-trp-ura培养基中在28℃下生长16小时，回收分选细胞。
纳米抗体逃逸分选深度突变SARS-CoV2 RBD库的DNA提取和Illumina测序
根据制造商的说明，使用Zymoprep酵母质粒miniprep II试剂盒(Zymo Research)从分选的细胞中提取质粒，但不同的是与酵母裂解酶一起进行更长时间(2小时)的孵育，并且在酵母裂解酶孵育后增加液氮中的冻融循环。
使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix对提取的质粒进行PCR，以使用NEBNext UDI引物(20个循环)添加样本指数和剩余的Illumina适配器序列。PCR样本使用CleanNGS磁珠(CleanNA)纯化一次，使用Ampure磁珠(Beckman Coulter)纯化一次。片段在15μL 0.1×TE缓冲液中洗脱。使用高灵敏度NGS试剂盒(DNF-474，高级分析)在12毛细管碎片分析仪(高级分析)上评估大小分布。VIB核组学核心(比利时，鲁汶)在NovaSeq 6000上进行了100bp单端测序。
使用突变逃逸谱分析测序数据和表位计算
如Greaney等人(Greaney等人，2021，Cell Host Microbe)所述，使用可从https://github.com/jbloomlab/SARS-CoV-2-RBD_MAP_Crowe_antibodies获得的代码处理深度测序读数，并进行调整。简而言之，使用dms_variants包(0.8.6)对核苷酸条形码及其相应的突变进行计数。每个条形码的逃逸分数定义为富集后的读取分数除以逃逸变体富集之前的读取分数。过滤所得变体以去除不可靠的低计数，并保留具有足够RBD表达和ACE2结合的变体(基于公开的数据(Starr等人，2020，Cell182，1295-1310.e20)。对于具有多个突变的变体，使用全局上位性模型估计单个突变的影响，不包括在至少一个单一突变变体和两个整体变体中未观察到的突变。由此产生的逃逸测量值在重复实验和跨库平均值之间具有很好的相关性，因此，用于进一步分析。为了确定每个纳米抗体最突出的逃逸位点，确定了RBD位置，其中总逃逸位点大于所有位点中值的10倍，并且也是给定纳米抗体所有位置的最大总位点逃逸的至少10％。
序列表
SEQ ID NO:1：VHH-72氨基酸序列
SEQ ID NO:2：VHH-72氨基酸序列的VHH72-h1人源化变体1
SEQ ID NO:3：VHH-72氨基酸序列的VHH72-h1(E1D)人源化变体1(E1D)SEQ ID NO:4：VHH72-S56A变体氨基酸序列
SEQ ID NO:5:VHH72-S56A氨基酸序列的VHH72_h1(S56A)人源化变体1
SEQ ID NO:6:VHH72-S56A氨基酸序列的VHH72_h1(E1D)(S56A)人源化变体1(E1D)
SEQ ID NO:7:VHH-72(或VHH72-S56A)氨基酸序列的CDR1(根据Kabat注释)
SEQ ID NO:8:VHH-72氨基酸序列的CDR2(根据Kabat注释)
SEQ ID NO:9:VHH-72(或VHH72-S56A)氨基酸序列的CDR3(根据Kabat注释)
SEQ ID NO:10:VHH-72-S56A氨基酸序列的CDR2(根据Kabat注释)
SEQ ID NO:11:VHH72氨基酸序列的VHH72_h2人源化变体2
SEQ ID NO:12:VHH-72与(Gly4Ser)3-接头的二价融合
SEQ ID NO:13:VHH-72与人IgG1 Fc融合，中间有一个甘氨酸-丝氨酸接头
SEQ ID NO:14:小鼠VH信号序列-VHH72-GSGGGGSGGGGS-hIgG1Hinge-hIgG1Fc(VHH72与人IgG1Hinge区域融合，随后是人IgG1Fc区域，在VHH72和IgG1Hinge区域之间有GSGGGGSGGGGS接头)
SEQ ID NO:15:小鼠VH信号序列-VHH72-GSGGGGSGGGGS-hIgG1Hinge-hIgG2Fc(VHH72与人IgG1Hinge区域融合，随后是人IgG1Fc区域)
SEQ ID NO:16:小鼠VH信号序列-VHH72-GSGGGGSGGGGS-hIgG2Hinge_ERKCCdel-hIgG2Fc(VHH72与人IgG2Hinge区域融合(ERKCC氨基酸缺失)，然后是人IgG2Fc区域，在VHH72和人IgG2Hinge区域之间具有GSGGGGSGGGGS接头)
SEQ ID NO:17:D72-58[VHH72_h1(E1D)_10GS_IgG1_LALA；前导蛋白]
SEQ ID NO:18:D72-1[VHH72-GS(G4S)2-hIgG1hinge-hIgG1Fc；Wrapp等人中使用的原型。]
SEQ ID NO:19:VHH72_h1_S56A-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc_LALAPG(D72-23)氨基酸序列
SEQ ID NO:20:VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALAPG_Kdel(D72-52；PB9590)
SEQ ID NO:21:VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)3-VHH72_h3_S56A-GS-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALAPG_Kdel(D72-55)
SEQ ID NO:22:VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALA_Kdel(361AA；PB9683批次，D72-53构建体)
SEQ ID NO:23:Sars-Cov2刺突蛋白。GenBank登录号：QHQ82464，版本QHQ82464.1。
SEQ ID NO:24:Sars-Cov1刺突蛋白或冠状病毒SARS刺突蛋白(对应于GenBank登录号NP_828851.1)
SEQ ID NO:25:SARS-CoV-2刺突蛋白RBD结构域(对应于描绘SARS-Cov-2刺突的SEQ ID NO:23的330-518位)氨基酸序列
SEQ ID NO:26:来自SARS-CoV-1刺突蛋白的受体结合结构域(RBD),对应于SEQ IDNO:24的氨基酸残基320-502或衍生自GenBank ID：NP_828851.1。
SEQ ID NO:27-61:其它VHH72突变变体
SEQ ID NO:62:S309抗体轻链
SEQ ID NO:63:S309抗体重链
SEQ ID NO:64:CB6轻链序列
SEQ ID NO:65:CB6重链序列
SEQ ID NO:66-81：来自不同菌株的刺突蛋白RBD序列，缺失RBM环，如图42所示
SEQ ID NO:82-91:寡核苷酸DNA序列(参见表7方法)。
SEQ ID NO:92-105+SEQ ID NO:111-140：见表6。
SEQ ID NO:106-110:VHH3.39、VHH3.89、VHH3.141、VHH3.151、VHH3BD9
SEQ ID NO:141:VHH-72-S52A-S56A突变氨基酸序列的CDR2
政府权利
本发明(部分)是在国家卫生研究院授予的合同号为R01 AI127521的政府支持下完成的。
公开的方面
-一种特异性结合冠状病毒刺突蛋白的结合剂，所述冠状病毒刺突蛋白包含如SEQID NO:24所示的氨基酸残基Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366和Y494。
-一种特异性结合如上定义的冠状病毒刺突蛋白的结合剂，其还包含如SEQ IDNO:24所示的氨基酸残基R426。
-所述结合剂，其中，所述结合剂为小分子化合物、化学品、肽、肽模拟物、抗体模拟物、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)、抗体或抗体片段。
-所述结合剂，其中，所述结合剂是根据下式(1)的包含4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)的ISVD：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；并且其中CDR1由如SEQ IDNO:7所示的序列组成；CDR2由如SEQ ID NO:8所示的序列组成；以及CDR3由如SEQ ID NO:9所示的序列组成。
-所述ISVD包含如SEQ ID NO:1所示的序列，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％氨基酸同一性的序列，或其人源化变体序列如SEQ ID NO:2和11所示。
-用作药物的任何上述结合剂。
-上述任何一种用于治疗SARS-冠状病毒感染，更具体地，用于治疗SARS-CoV-2病毒感染的结合剂。
-一种结合剂，其包含特异性结合冠状病毒刺突蛋白的ISVD，该病毒刺突蛋白包含根据下式(1)的4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；并且其中CDR1由如SEQ ID NO:7所示的序列组成；CDR2由如SEQ ID NO:8所示的序列组成；以及CDR3由如SEQ ID NO:9所示的序列组成，用作药物。
-所述用作药物的结合剂，其包含如SEQ ID NO:1所示的序列，或与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少90％氨基酸同一性的序列，或其人源化变体。
-所述用作药物的结合剂，其包含IgG Fc融合体。
-所述用作药物的结合剂，其包含IgG1 Fc融合体，优选如SEQ ID NO:13所示的序列。
-所述结合剂用于治疗SARS-冠状病毒感染，更具体地，用于治疗SARS-CoV-2病毒感染。
-所述结合剂用于预防性处理SARS-冠状病毒感染，更具体地，用于治疗SARS-CoV-2病毒感染。
-所述结合剂用于预防性处理SARS-冠状病毒感染，更具体地，用于治疗SARS-CoV-2病毒感染，给药剂量为0.5mg/kg-25mg/kg。
-所述结合剂用于治疗性处理SARS-冠状病毒感染，更具体地，用于治疗SARS-CoV-2病毒感染。
-一种复合物，其包含如SEQ ID NO:26所示序列的SARS-冠状病毒的RBD和任何上述结合剂。
-所述复合物，其中，所述复合物为晶体。
-一种晶体，其包含如SEQ ID NO:26所示序列的SARS-Corona RBD和如SEQ ID NO:1所示序列的结合剂，其特征在于该晶体为：空间群P3121为介于如SEQ ID NO:26所示序列和如SEQ ID NO:1所示序列之间的晶体，具有以下晶格常数：
Figure GDA0004045908510001021
Figure GDA0004045908510001022
α＝90°，β＝90°，γ＝120°。
-所述晶体具有三维结构，其中，晶体i)包含由数据库条目PDB 6WAQ的坐标或PBD6WAQ的原子坐标子集表征的原子结构。
-一种结合位点，其存在于如上定义的晶体i)中的由原子坐标的子集组成，其中，所述结合位点由以下氨基酸残基组成：如SEQ ID NO:24所示序列中的Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366和Y494，或Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366、Y494和R426，其中，所述氨基酸残基代表结合剂的SARS-Corona病毒RB蛋白，尤其是2019-nCoV RBP。
-一种鉴定、设计或筛选冠状病毒RBP结构域中和剂的计算机辅助方法，其中，所述中和剂是选自小分子化合物、化学物质、肽、肽模拟物、抗体模拟物、ISVD、抗体或抗体片段的结合剂，并且包括：
·将定义上述结合位点三维结构的参数引入合适的计算机程序中，
·在所述计算机程序中创建测试化合物的三维结构；
·在结合位点的三维模型上显示所述测试化合物的叠加模型；和
·评估所述测试化合物模型是否在空间和化学上适合结合位点。
-一种包含ISVD的SARS-CoV-2结合剂，所述ISVD包含如SEQ ID NO:4、11或SEQ IDNO:27-61所示序列中的任一序列，或与其具有至少90％氨基酸同一性的序列，或其人源化变体。
-所述SARS-CoV-2结合剂包含ISVD，所述ISVD包含选自如SEQ ID NO:4、28或36所示的序列，或与其具有至少90％氨基酸同一性的序列，或其人源化变体。
-所述SARS-CoV-2结合剂，其中，所述ISVD融合至IgG Fc结构域，例如IgG1或IgG2Fc结构域。
-一种编码任何所述SARS-CoV-2结合剂的核酸分子。
-一种包含所述核酸分子的重组载体。
-一种药物组合物，其包含所述SARS-CoV-2结合剂、所述核酸分子或所述重组载体中的任一种。
-所述SARS-CoV-2结合剂、核酸分子或重组载体用作药物。
-所述SARS-CoV-2结合剂、核酸分子或重组载体用于治疗感染SARS-CoV-2病毒的患者。
-一种包含ISVD的SARS-CoV-2结合剂，其中，所述ISVD包含以下结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，并且其中3个互补决定区(CDR)选自如SEQ ID NO:6所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3区域，其中，CDR区域根据Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia进行注释。
-所述SARS-CoV-2结合剂，其中，所述ISVD包含序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:10所示的CDR2和序列如SEQ ID NO:9所示的CDR3。
-所述SARS-CoV-2结合剂，其中，所述ISVD包含如SEQ ID NO:4、5或6所示的氨基酸序列，或其人源化变体。
-所述SARS-CoV-2结合剂包含任何所述ISVD，其中，所述ISVD融合至IgG Fc结构域。
-所述SARS-CoV-2结合剂，其中，所述IgG Fc结构域为IgG1 Fc结构域或其人源化衍生物。
-所述SARS-CoV-2结合剂，其包含如SEQ ID NO:19-22所示的氨基酸序列。
-一种编码任何所述SARS-CoV-2结合剂的核酸分子。
-一种包含任何所述SARS-Cov-2结合剂或所述核酸分子的宿主细胞。
-一种药物组合物，其包含任何所述SARS-CoV-2结合剂或所述核酸分子。
-所述SARS-CoV-2结合剂、核酸分子或药物组合物，用作药物。
-所述的SARS-CoV-2结合剂、核酸分子或药物组合物，用于治疗或预防SARS-CoV-2病毒感染或COVID19疾病。
-所述SARS-CoV-2结合剂，其包含与包含SEQ ID NO:17、18或22所示的氨基酸序列的IgG1 Fc结构域融合的免疫球蛋白单可变结构域，或其进一步人源化变体。
-所述SARS-CoV-2结合剂，其包含如SEQ ID NO:22所示的序列。
-一种药物组合物，其包含任何所述的SARS-CoV-2结合剂。
-所述SARS-CoV-2结合剂或药物组合物，用作药物。
-所述SARS-CoV-2结合剂或药物组合物，用于预防或治疗冠状病毒感染。
-所述SARS-CoV-2结合剂或药物组合物，用于预防或治疗SARS-Cov或SARS-Cov-2病毒感染。
-所述SARS-CoV-2结合剂或药物组合物，用于预防或治疗Covid19。
-一种特异性结合冠状病毒刺突蛋白RBD结构域的结合剂，其包含特异性结合表位的免疫球蛋白单可变结构域，所述表位包含如SEQ ID NO:23所示序列中的残基L368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508。
-所述含有ISVD的结合剂，其包含作为CDR1的如SEQ ID NO:7所示的序列、作为CDR2的如SEQ ID NO:10所示的序列和作为CDR3的如SEQ ID NO:9所示的序列。
-所述含有ISVD的结合剂，其包含如SEQ ID NO:6所示的序列，或与其具有至少90％同一性的变体，和/或其任何一种的人源化变体。
-所述含有ISVD的结合剂，其包含如SEQ ID NO:22所示的序列，或与其具有至少90％同一性的变体，和/或其任何一种的人源化变体。
-一种药物组合物，其包含任何所述的含有ISVD的结合剂。
-所述含有ISVD的结合剂或所述药物组合物，用于治疗人冠状病毒感染。
-所述含有ISVD的结合剂或所述药物组合物，用于治疗β冠状病毒感染。
-所述含有ISVD的结合剂或所述药物组合物，用于治疗沙贝病毒感染。
-所述含有ISVD的结合剂或所述药物组合物，用于治疗SARS-Cov-2病毒或其突变体的感染。
-所述含有ISVD的结合剂或所述药物组合物，用于治疗SARS-Cov-2病毒或其突变体的感染，其中，所述突变体包含刺突蛋白RBD结构域中的突变。
-所述含有ISVD的结合剂或所述药物组合物，用于治疗SARS-Cov-2病毒或其突变体的感染，其中，所述RBD突变包含如SEQ ID NO:23所示序列中的N439K、S477N、E484K和N501Y。
-所述含有ISVD的结合剂或所述药物组合物，用于治疗COVID19。
-所述含有ISVD的结合剂或其标记形式的用途，用于检测病毒颗粒或用于检测衍生自病毒的病毒刺突蛋白，所述病毒选自属于蝙蝠SARS相关的沙贝病毒的进化枝1a、1b、2和/或3的沙贝病毒的组。
-所述含有ISVD的结合剂或其标记形式的用途，用于检测病毒颗粒或用于检测衍生自病毒的病毒刺突蛋白，所述病毒选自SARS-Cov-2、GD-Pangolin、RaTG13、WIV1、LYRa11、RsSHC014、Rs7327、SARS-CoV-1、Rs4231、Rs4084、Rp3、HKU3-1或BM48-31病毒组成的组。
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92.Greaney.et al.Cell Host and Microbe,29-1,p 44-57(2021).
SEQUENCE LISTING
<110> VIB研究所
根特大学
美国卫生和公众服务部
德克萨斯州立大学董事会
达特茅斯学院理事会
勒芬天主教大学, 荷语鲁汶大学技术移转办公室
艾塞韦生物有限公司
荷语布鲁塞尔自由大学
<120> 冠状病毒结合剂
<130> P22115363WP
<150> US62/971013
<151> 2020-02-06
<150> US62/988610
<151> 2020-03-12
<150> US63/041240
<151> 2020-06-19
<150> US62/991408
<151> 2020-03-18
<150> PCT/EP2020/077004
<151> 2020-09-25
<150> GB 2020508.4
<151> 2020-12-23
<150> EP 21151356.9
<151> 2021-01-13
<160> 141
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72的VHH72-h1人源化变体1
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72的VHH72-h1(E1D)人源化变体1(E1D)
<400> 3
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-S56A变体
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 5
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-S56A的VHH72_h1（S56A）人源化变体1
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-S56A的VHH72_h1(E1D)（S56A）人源化变体1(E1D)
<400> 6
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72 (或VHH72-S56A)的CDR1
<400> 7
Glu Tyr Ala Met Gly
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72的CDR2
<400> 8
Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72 (或 VHH72-S56A)的CDR3
<400> 9
Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72-S56A的CDR2
<400> 10
Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72的VHH72_h2人源化变体2
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 12
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72与(Gly4Ser)3-接头的二价融合
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr Ala Met Gly Trp
165 170 175
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser
180 185 190
Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly
225 230 235 240
Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 13
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72与人IgG1 Fc融合，中间有一个甘氨酸-丝氨酸接头
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
130 135 140
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165 170 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195 200 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
210 215 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
275 280 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 14
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠VH信号序列-VHH72-GSGGGGSGGGGS-hIgG1Hinge-hIgG1Fc
<400> 14
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
35 40 45
Ser Glu Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
50 55 60
Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp
115 120 125
Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser
145 150 155 160
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
165 170 175
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
180 185 190
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
195 200 205
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
210 215 220
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
225 230 235 240
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
245 250 255
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
260 265 270
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
275 280 285
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
290 295 300
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
305 310 315 320
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
325 330 335
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
340 345 350
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
355 360 365
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
370 375 380
Ser Pro Gly Lys
385
<210> 15
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠VH信号序列-VHH72-GSGGGGSGGGGS-hIgG1Hinge-hIgG2Fc
<400> 15
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
35 40 45
Ser Glu Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
50 55 60
Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp
115 120 125
Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser
145 150 155 160
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
165 170 175
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
180 185 190
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
195 200 205
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
210 215 220
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
225 230 235 240
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
245 250 255
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
260 265 270
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
275 280 285
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
290 295 300
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
305 310 315 320
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
325 330 335
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
340 345 350
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
355 360 365
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
370 375 380
Ser Pro Gly Lys
385
<210> 16
<211> 379
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠VH信号序列-
VHH72-GSGGGGSGGGGS-hIgG2Hinge_ERKCCdel-hIgG2Fc
<400> 16
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
35 40 45
Ser Glu Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
50 55 60
Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp
115 120 125
Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Cys Pro
145 150 155 160
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
165 170 175
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
180 185 190
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
195 200 205
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
210 215 220
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
225 230 235 240
Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
245 250 255
Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
260 265 270
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
275 280 285
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
290 295 300
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
305 310 315 320
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
325 330 335
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
340 345 350
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
355 360 365
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 17
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D72-58 [VHH72_h1(E1D)_10GS_IgG1_LALA]
<400> 17
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
260 265 270
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360
<210> 18
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D72-1 [VHH72-GS(G4S)2-hIgG1hinge-hIgG1Fc]
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
130 135 140
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165 170 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195 200 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
210 215 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
275 280 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 19
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72_h1_S56A-GS-hIgG1hinge-hIgG1Fc_LALAPG (D72-23)
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu
115 120 125
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
130 135 140
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
165 170 175
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
180 185 190
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
195 200 205
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
210 215 220
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
245 250 255
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
260 265 270
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
275 280 285
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
290 295 300
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
325 330 335
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355
<210> 20
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALAPG_Kdel
(D72-52)
<400> 20
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
260 265 270
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360
<210> 21
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72_ h1_E1D
_S56A-(G4S)3-VHH72_h3_S56A-GS-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALAPG_
Kdel (D72-55)
<400> 21
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu
130 135 140
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
145 150 155 160
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr Ala Met Gly Trp
165 170 175
Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Thr Ile Ser
180 185 190
Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn
210 215 220
Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly
225 230 235 240
Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly
245 250 255
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr
260 265 270
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
275 280 285
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
290 295 300
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
305 310 315 320
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
325 330 335
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
340 345 350
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
355 360 365
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
370 375 380
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
385 390 395 400
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
420 425 430
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
435 440 445
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
450 455 460
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
465 470 475 480
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
485 490
<210> 22
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72_h1_E1D_S56A-(G4S)2-hIgG1hinge_EPKSCdel-hIgG1Fc_LALA_Kdel
(361AA; D72-53 构建体)
<400> 22
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
130 135 140
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
145 150 155 160
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
165 170 175
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
180 185 190
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
195 200 205
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
210 215 220
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
225 230 235 240
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
245 250 255
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
260 265 270
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
275 280 285
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
290 295 300
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
305 310 315 320
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
325 330 335
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
340 345 350
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360
<210> 23
<211> 1273
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2）
<400> 23
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 24
<211> 1255
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（Severe acute respiratory syndromecoronavirus）
<400> 24
Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu
1 5 10 15
Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln
20 25 30
His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg
35 40 45
Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser
50 55 60
Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Gly Asn Pro Val
65 70 75 80
Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn
85 90 95
Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln
100 105 110
Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys
115 120 125
Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met
130 135 140
Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr
145 150 155 160
Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser
165 170 175
Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly
180 185 190
Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp
195 200 205
Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu
210 215 220
Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro
225 230 235 240
Ala Gln Asp Ile Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys
275 280 285
Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser
420 425 430
Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu
435 440 445
Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly
450 455 460
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465 470 475 480
Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
485 490 495
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu
625 630 635 640
His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile
645 650 655
Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys
660 665 670
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675 680 685
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Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys
705 710 715 720
Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu
725 730 735
Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile
740 745 750
Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys
755 760 765
Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe
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Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met
805 810 815
Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile
820 825 830
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr
835 840 845
Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala
850 855 860
Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe
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Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn
885 890 895
Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala
900 905 910
Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly
915 920 925
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Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn
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Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser
1130 1135 1140
Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val
1145 1150 1155
Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys
1160 1165 1170
Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr
1175 1180 1185
Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Gly Phe Ile
1190 1195 1200
Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys
1205 1210 1215
Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Ala Cys Ser Cys Gly
1220 1225 1230
Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys
1235 1240 1245
Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1250 1255
<210> 25
<211> 189
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2）
<400> 25
Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr
1 5 10 15
Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys
20 25 30
Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe
35 40 45
Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr
50 55 60
Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln
65 70 75 80
Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu
85 90 95
Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu
100 105 110
Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg
115 120 125
Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr
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Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr
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Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr
165 170 175
Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
180 185
<210> 26
<211> 183
<212> PRT
<213> 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（Severe acute respiratory syndromecoronavirus）
<400> 26
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro
1 5 10 15
Ser Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
20 25 30
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
35 40 45
Gly Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro
65 70 75 80
Gly Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
85 90 95
Phe Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr
100 105 110
Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys
115 120 125
Leu Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp
130 135 140
Gly Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn
145 150 155 160
Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
165 170 175
Val Val Val Leu Ser Phe Glu
180
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-V100L
<400> 27
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Leu Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 28
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-D61Q
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Gln Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-G55S
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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<210> 30
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-S52A
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 31
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-W52aF
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Phe Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 32
<211> 125
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Thr Ile Ser His Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<210> 33
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-V100A
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Ala Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
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<210> 34
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-W52aH-S56A
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Thr Ile Ser His Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-W52aF-S56A
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-MDoptA-T60W氨基酸序列- MDoptB: 指由分子动力学软件获得的第二高变体
<400> 36
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
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Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Trp Asp Ser Val
50 55 60
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 37
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-MDoptA-T57Y
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Tyr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<210> 38
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-MDoptA-T57W
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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65 70 75 80
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100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 39
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-MDoptA-Y100fW
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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115 120 125
<210> 40
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-MDoptA-T57L
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
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<220>
<223> VHH72-MDoptC-F47H
<400> 58
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-MDoptC-T50Q
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-MDoptC-T60Y
<400> 60
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
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<210> 61
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH72-MDoptC-T60R
<400> 61
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Tyr
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 62
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S309抗体轻链
<400> 62
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Val Ser Ser Thr
20 25 30
Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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50 55 60
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100 105 110
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 63
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S309抗体重链
<400> 63
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Thr Thr Gly Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Thr Arg Gly Ala Trp Phe Gly Glu Ser Leu Ile Gly
100 105 110
Gly Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120 125
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
145 150 155 160
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
165 170 175
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
180 185 190
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
195 200 205
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245 250 255
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305 310 315 320
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325 330 335
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455
<210> 64
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CB6轻链序列
<400> 64
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 65
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CB6重链序列
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Met Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Leu Pro Met Tyr Gly Asp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 66
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cov2_武汉刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 66
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Pro Thr Asn Gly
65 70 75 80
Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 67
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GD-穿山甲刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 67
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Val Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Arg Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Pro Thr Asn Gly
65 70 75 80
Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 68
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RaTG13刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 68
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Ile Thr Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Lys His Ile Asp Pro Thr Asp Gly
65 70 75 80
Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 69
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> WIV1刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 69
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ile Thr Asn Gly
65 70 75 80
Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 70
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LYRa11刺突蛋白RBD,缺失RBM环
<400> 70
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Ala Ile Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met
50 55 60
Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Thr Thr Asn Gly
65 70 75 80
Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 71
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RsSHC014 刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 71
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Leu
50 55 60
Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Asn Ser Lys Asp Thr Thr Ala Gly
65 70 75 80
Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 72
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rs7327刺突蛋白RBD域，缺失RBM环
<400> 72
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met
50 55 60
Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Thr Thr Asn Gly
65 70 75 80
Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 73
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-1刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 73
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met
50 55 60
Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Thr Thr Thr Gly
65 70 75 80
Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 74
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rs4231刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 74
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Leu
50 55 60
Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Asn Ser Lys Asp Thr Thr Ala Gly
65 70 75 80
Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 75
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rs4084刺突蛋白RBD,缺失RBM环
<400> 75
Ile Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Leu
50 55 60
Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Asn Ser Lys Asp Thr Thr Ala Gly
65 70 75 80
Val Gly His Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 76
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rp3刺突蛋白RBD,缺失RBM环
<400> 76
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Pro Ser Lys Leu Ile Asp Leu Cys Phe Thr Ser Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Thr Phe Leu Ile Arg Ser Ser Glu Val Arg Gln Val Ala Pro Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Thr Ala Lys Gln Asp Pro Ser Val Pro
65 70 75 80
Val Ala Tyr Gln Ala Thr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 77
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HKU3-1刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 77
Val Leu Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Pro Ser Lys Leu Ile Asp Leu Cys Phe Thr Ser Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Thr Phe Leu Ile Arg Ser Ser Glu Val Arg Gln Val Ala Pro Gly Glu
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Thr Ala Lys His Asp Pro Asn Val Pro
65 70 75 80
Val Ala Tyr Gln Ala Thr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 78
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZXC21刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 78
Val Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Pro Ser Lys Leu Ile Asp Leu Cys Phe Thr Ser Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Thr Phe Leu Ile Arg Phe Ser Glu Val Arg Gln Val Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Thr Ala Lys Gln Asp Pro Asn Val Pro
65 70 75 80
Leu Glu Tyr Gln Ala Thr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 79
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ZC45刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 79
Val Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Pro Ser Lys Leu Ile Asp Leu Cys Phe Thr Ser Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Thr Phe Leu Ile Arg Phe Ser Glu Val Arg Gln Val Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Thr Ala Lys Gln Asp Pro Asn Val Pro
65 70 75 80
Leu Glu Tyr Gln Ala Thr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 80
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Rf1刺突蛋白RBD, 缺失RBM环
<400> 80
Val Phe Tyr Asn Ser Thr Ser Phe Ser Thr Phe Asn Cys Tyr Gly Val
1 5 10 15
Ser Pro Ser Lys Leu Ile Asp Leu Cys Phe Thr Ser Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Thr Phe Leu Ile Arg Phe Ser Glu Val Arg Gln Val Ala Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Thr Ala Lys Gln Asp Gln Asn Val Pro
65 70 75 80
Leu Glu Tyr Gln Ala Thr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu
85 90 95
<210> 81
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BM48-31刺突蛋白 RBD,缺失RBM环
<400> 81
Val Leu Tyr Asn Ser Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Gln Cys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Ser Val Tyr Ala
20 25 30
Asp Tyr Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Ala
35 40 45
Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
50 55 60
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Thr Asn Ser Leu Asp Gln Ser Ser
65 70 75 80
Gly Ile Gly Phe Gln
85
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
ttacaaacat tggccgcaaa 20
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
gcgcgacatt ccgaagaa 18
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
ccagtaatgt ggacattgcc 20
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
catcaacgac cttgtcttca gta 23
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
gccattcatc cacagttgac a 21
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
catggtgctg acagtggagt ct 22
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
gggaactgtc aaagggtaca g 21
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 89
cccttcctac atcagtccta ct 22
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
ggccaggtca tcaccatt 18
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
gagttgaatg tagtttcgtg gatg 24
<210> 92
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH2.50
<400> 92
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Leu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 93
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.17
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Glu Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Gly Asp Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Arg Pro Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Phe Ala Glu Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 94
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.77
<400> 94
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ser Ser Gly Arg Ala Phe Gly Asn Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Arg Pro Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Phe Ala Glu Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 95
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.115
<400> 95
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Asp Ile
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Pro Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 96
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.144
<400> 96
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ala Phe Gly Asn Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 97
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3BE4
<400> 97
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ala Phe Gly Asn Gly
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 98
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.83
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Leu Ser Gly Gly Val Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Phe Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asn Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Gly Asn His Tyr Asn Pro Gln Tyr Tyr His Asp Tyr Asp
100 105 110
Lys Tyr Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 99
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.36
<400> 99
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Gly Gly Ile Ser Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Pro Lys Gly Trp Ser Glu Trp Asp Met Glu Tyr Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 100
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.47
<400> 100
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Asn Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Thr Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Glu Asn Asp Val Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Pro Lys Gly Trp Ser Glu Trp Asp Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 101
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.55
<400> 101
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Asn Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Ala Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Trp Ser Ser Ile Ser Arg Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Pro Ala Gly Trp Ser Glu Phe Gly Met Glu Tyr Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 102
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.35
<400> 102
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Arg Thr Asn Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Ala Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Arg Trp Ser Ser Ile Ser Arg Tyr Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Met Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Pro Ala Gly Trp Ser Glu Phe Gly Met Glu Tyr Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 103
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.29
<400> 103
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Gly Ile Gly Trp Ala Gly Leu Ser Ser Tyr Tyr Leu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Met Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Asp His Gly Trp Ser Ala Ala Gly Met Asp Tyr Leu Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 104
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.38
<400> 104
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Met Phe Trp Ser Gly Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Asp Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Arg Gly Trp Ser Asp Val Gly Gly Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 105
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.149
<400> 105
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Thr Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Asn Trp Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Lys Gly Trp Asp Pro Gln Asp Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.39
<400> 106
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Asp
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Leu Gly Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Ile
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ile Asp Gly Ser Ile Tyr Tyr Thr Asp Ser Ala
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu His Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ile Gly Tyr His Thr Tyr Arg Thr Asp Thr Pro Leu Tyr
100 105 110
Thr His Ser Cys Arg Glu Asn Ser Phe Pro Thr Trp Gly Arg Gly Thr
115 120 125
Gln Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 107
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.89
<400> 107
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Glu Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Leu
35 40 45
Ser Arg Ile Asp Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Ile Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Pro Ile Ile Gln Gly Arg Asn Trp Tyr Trp Thr Gly Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 108
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.141
<400> 108
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Glu Leu Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Gly Val Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Glu Gly Gly Asn Thr Asn Tyr Val Asp Asn Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Asn Leu Ser Phe Trp Ser Arg Glu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 109
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3.151
<400> 109
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Gly Cys Ile Ser Ser Ser Asp Asp Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85 90 95
Ala Thr Asp Trp Leu Arg Leu Cys Thr Ile Val Ser Gly Thr Gln Val
100 105 110
Pro Pro Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 110
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH3BD9
<400> 110
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Leu Asp
20 25 30
Arg Tyr Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Arg
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Thr Asp Trp Leu Arg Leu Cys Thr Val Val Ala Asn Thr
100 105 110
Glu Val Pro Pro Tyr Asp Leu Trp Gly Pro Gln Gly Thr Gln Val Thr
115 120 125
Val Ser Ser
130
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 111
Ser Ile Ala Met Gly
1 5
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 112
Asp Gly Ala Val Gly
1 5
<210> 113
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 113
Asn Gly Ala Val Gly
1 5
<210> 114
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 114
Asp Ile Ala Met Gly
1 5
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 115
Thr Tyr Ala Met Ala
1 5
<210> 116
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 116
Asn Tyr Gly Val Gly
1 5
<210> 117
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 117
Ser Gly Gly Met Gly
1 5
<210> 118
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 118
Asn Tyr Ala Met Ala
1 5
<210> 119
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 119
Ser Tyr Ala Leu Gly
1 5
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 120
Thr Ile Ser Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 121
Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Phe Ala Glu Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 122
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 122
Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Pro Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 123
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 123
Thr Val Ser Trp Asn Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
<210> 124
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 124
Ala Ile Thr Phe Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 125
Ala Ile Asn Trp Gly Gly Ile Ser Val Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 126
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 126
Ala Ile Ser Glu Asn Asp Val Met Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 127
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 127
Ala Ile Arg Trp Ser Ser Ile Ser Arg Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 128
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 128
Gly Ile Gly Trp Ala Gly Leu Ser Ser Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 129
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 129
Ala Met Phe Trp Ser Gly Leu Pro Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 130
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 130
Ala Ile Asn Trp Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 131
Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr Glu Tyr
1 5 10 15
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 132
Ala Gly Ala Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 133
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 133
Ala Gly Glu Gly Thr Val Val Ser Glu Trp Asp Tyr Asp Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 134
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 134
Gly Gly Asn His Tyr Asn Pro Gln Tyr Tyr His Asp Tyr Asp Lys Tyr
1 5 10 15
Asp His
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 135
Asp Pro Lys Gly Trp Ser Glu Trp Asp Met Glu Tyr
1 5 10
<210> 136
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 136
Asp Pro Lys Gly Trp Ser Glu Trp Asp Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 137
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 137
Asp Pro Ala Gly Trp Ser Glu Phe Gly Met Glu Tyr
1 5 10
<210> 138
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 138
Asp Asp His Gly Trp Ser Ala Ala Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 139
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 139
Asp Ser Arg Gly Trp Ser Asp Val Gly Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 140
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR
<400> 140
Asp Ser Lys Gly Trp Asp Pro Gln Asp Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHH-72- S52A-S56A突变体氨基酸序列的CDR2
<400> 141
Thr Ile Ala Trp Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly

Claims (30)

1.一种特异性结合冠状病毒刺突蛋白的结合剂，所述冠状病毒刺突蛋白包含如SEQ IDNO:24所示的氨基酸残基Leu355、Tyr356、Ser358、Ser362、Thr363、F364、K365、C366和Y494。
2.根据权利要求1所述的特异性结合冠状病毒刺突蛋白的结合剂，进一步包含如SEQID NO:24所示的氨基酸残基R426。
3.根据权利要求1所述的特异性结合冠状病毒刺突蛋白的结合剂，其中结合位点包含如SEQ ID NO:23中所示的残基L368、Y369、S371、S375、T376、F377、K378、C379和Y508。
4.与如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中所示的冠状病毒刺突蛋白特异性结合的结合剂，其中所述结合剂与根据权利要求1至3中任一项所述的结合剂竞争结合刺突蛋白。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的结合剂，其中，所述结合剂为小分子化合物、化学品、肽、肽模拟物、抗体模拟物、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)、抗体或活性抗体片段。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂包含ISVD，所述ISVD包含根据下式(1)的4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；
并且其中：
CDRl由SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:111-119组成，
CDR2由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:120-130或SEQ ID NO:141组成，和
CDR3由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:131-140组成。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的结合剂，其中所述结合剂包含ISVD，所述ISVD包含根据下式(1)的4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)；
并且其中3个CDR选自如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:27-61或SEQ ID NO:92-105中所示的那些CDR1、CDR2和CDR3区，其中所述CDR区根据Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia进行注释。
8.根据权利要求6或7中任一项所述的结合剂，其中，所述ISVD包含SEQ ID NO:1、4、27-61、或SEQ ID NO:92-105，或具有其至少90％氨基酸同一性的序列，或其任何一种的人源化变体，例如如SEQ ID NO:2、3、5、6或11中所示。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的结合剂，其中所述ISVD融合至Fc结构域，例如IgG、IgG1或IgG2 Fc结构域或其变体。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的结合剂，其为多价或多特异性结合剂。
11.根据权利要求10的结合剂，包含二价ISVD，例如包含SEQ ID NO:12的二价ISVD，或其人源化变体。
12.根据权利要求10或11所述的结合剂，其中所述ISVD以单价或多价形式融合到IgGFc结构域。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的结合剂，包含选自SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:22群组的序列，或其人源化变体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的结合剂，由SEQ ID NO:22组成。
15.一种编码根据权利要求6至14中任一项所述的结合剂的核酸分子。
16.一种重组载体，包含根据权利要求15所述的核酸分子。
17.一种复合物，包含如SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26中所示的SARS-冠状病毒的受体结合结构域和根据权利要求6至14中任一项所述的结合剂。
18.一种宿主细胞，包含根据权利要求6至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求17所述的复合物。
19.一种药物组合物，包含根据权利要求6至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子或根据权利要求16所述的重组载体。
20.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用作药物。
21.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用作诊断剂。
22.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用于体内成像。
23.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用于对冠状病毒感染、更具体地说是β-冠状病毒感染的受试者进行预防性或治疗性处理。
24.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用于对沙贝病毒感染、更具体地说是SARS冠状病毒感染的受试者进行预防性或治疗性处理。
25.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用于对SARS-CoV-2病毒感染或SARS-CoV-2突变病毒感染或COVID-19的受试者进行预防性或治疗性处理。
26.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用于对SARS-CoV-2突变体病毒感染的受试者进行预防性或治疗性处理，其中所述突变体包含刺突蛋白RBD结构域中的突变。
27.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用于对SARS-CoV-2突变体病毒感染的受试者进行预防性或治疗性处理，其中RBD突变包括如SEQ ID NO:23中所示的N439K、S477N、E484K和N501Y。
28.根据权利要求1至14中任一项所述的结合剂、根据权利要求15所述的核酸分子、根据权利要求16所述的重组载体或根据权利要求19所述的药物组合物，用于治疗SARS-CoV-2病毒感染的受试者，给药剂量为0.5mg/kg至25mg/kg。
29.根据权利要求1到13中任一项所述的结合剂或其标记形式的用途，用于检测来自病毒的病毒颗粒或病毒刺突蛋白，所述病毒选自属于蝙蝠SARS相关沙贝病毒的进化枝1a、1b、2和/或3的病毒的组。
30.根据权利要求1到13中任一项所述的结合剂或其标记形式的用途，用于检测来自病毒的病毒颗粒或病毒刺突蛋白，所述病毒选自SARS-Cov-2、GD-Pangolin、RaTG13、WIV1、LYRa11、RsSHC014、Rs7327、SARS-CoV-1、Rs4231、Rs4084、Rp3、HKU3-1或BM48-31病毒的组。
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