CN116218799A - 催化β-香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了催化β‑香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与应用。该蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有催化β‑香树脂醇16α位羟基化的酶活性的由a)衍生的蛋白质。本发明综合利用转录组数据分析，挖掘到催化β‑香树脂醇16α位羟基化的CYP450基因，并利用烟草瞬时表达系统验证了AcCYP716A275可催化16α‑羟基‑β‑香树脂醇的形成，不仅为七叶皂苷A的生物合成提供重要基因元件，同时本发明研究结果可为七叶树的分子设计育种提供关键基因位点。

Description

催化β-香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别地涉及催化β-香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与应用。

背景技术

娑罗子是《中国药典》收录的一味重要中药，七叶皂苷是其主要活性成分，具有消炎、消肿、抗肿瘤以及抗病毒等多种药理活性，在临床上常用于治疗慢性静脉功能不全、静脉栓塞、痔疮和术后水肿等。虽然七叶皂苷具有重要的医用价值，但有关其生物合成途径解析研究相对薄弱，迫切需要利用新技术新方法解析七叶皂苷生物合成途径。

三萜属于异戊二烯类化合物，其合成前体法尼基焦磷酸主要来源于甲羟戊酸途径(Mevalonate Pathway,MVA)，法尼基焦磷酸依次经过鲨烯合酶、角鲨烯单加氧酶催化作用形成2,3-氧化鲨烯，2,3-氧化鲨烯是三萜和固醇类化合物生物合成的共同前体物质，其在2,3-氧化鲨烯环化酶的催化作用下形成不同的三萜骨架，其中β-香树脂醇是最常见的三萜骨架。CYP450酶可催化β-香树脂醇的氧化，大量研究表明CYP716家族的酶可催化五环三萜骨架的C-28、C-16、C-22或C-12位羟基化等其他形式氧化。上述研究结果表明CYP716家族对五环三萜的羟基化修饰具有重要作用，且不同的CYP716具有不同的底物特异性和不同的催化活性。

由于七叶皂苷具有良好的抗炎、消肿、抗病毒等药理活性，在临床上供不应求，导致七叶皂苷资源供应紧张，因此迫切需要利用新技术新方法解决七叶皂苷的资源供应紧张问题。

发明内容

对植物CYP450基因的发现和鉴定，在三萜生物合成的探索中起着至关重要的作用。CYP450催化β-香树脂醇羟基化可为进一步的糖基化、酰基化提供位点，形成结构多样的三萜化合物，为三萜类药物开发提供丰富的先导化合物。解析催化β-香树脂醇C-16α位羟基化的CYP450基因不仅为七叶皂苷的合成生物学研究提供关键基因模块，同时为七叶树的新品种培育提供关键位点，而且为研究五环三萜化合物的羟基化修饰提供重要参考。

有鉴于此，本发明的主要目的是提供催化β-香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白及编码基因与应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有催化β-香树脂醇16α位羟基化的酶活性的由a)衍生的蛋白质。

所述催化β-香树脂醇16α位羟基化是催化β-香树脂醇生成16α-羟基-β-香树脂醇。

所述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

将该基因命名为AcCYP716A275，将其编码的蛋白命名为AcCYP716A275。具体信息如下：AcCYP716A275基因序列如序列表中序列1所示，其含有1407个核苷酸，其编码序列表中序列2所示的蛋白，序列2由468个氨基酸组成。

含有所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述蛋白在作为催化β-香树脂醇16α位羟基化的关键酶中的应用也属于本发明的保护范围。

所述催化β-香树脂醇16α位羟基化是催化β-香树脂醇生成16α-羟基-β-香树脂醇。

所述蛋白、所述编码基因在催化β-香树脂醇生成16α-羟基-β-香树脂醇中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明基于七叶树叶、枝、花、外果皮、种仁不同组织部位的高通量测序，挖掘出催化β-香树脂醇16α位羟基化的关键酶，不仅为七叶皂苷的合成生物学研究提供关键基因模块，而且为七叶树的分子设计育种提供关键基因位点。

本发明综合利用转录组数据分析，挖掘到催化β-香树脂醇16α位羟基化的CYP450基因，并利用烟草瞬时表达系统验证了AcCYP716A275可催化16α-羟基-β-香树脂醇的形成，不仅为七叶皂苷A的生物合成提供重要基因元件，16α-羟基-β香树脂醇和七叶皂苷A的结构式如图1所示，同时本发明研究结果可为七叶树的分子设计育种提供关键基因位点。

附图说明

为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：

图1为16α-羟基-β香树脂醇及七叶皂苷A分子结构式。

图2为AcCYP716A275基因在七叶树不同组织中的表达量(注：字母代表方差分析邓肯新复极差检验在p<0.05显著性水平下的差异显著)。

图3为pEAQ-HT-DEST-BfCYP716Y1载体示意图。

图4为AcCYP716A275基因克隆和载体构建PCR胶图。

图5为pEAQ-HT-DEST-AcCYP716A275载体示意图。

图6为目的基因农杆菌菌液PCR胶图。

图7为注射烟草产物鉴定GC-MS图。

具体实施方式

实施例1、克隆催化β-香树脂醇16α位羟基化的CYP450酶蛋白的编码基因一、基因克隆的方法和步骤

七叶皂苷A主要在七叶树种仁中富集，因此筛选在果仁中特异表达的CYP450基因。利用Illumina平台对七叶树叶、枝、花、外果皮、种仁不同组织部位进行转录组测序。对不同组织部位转录组数据进行常规生物信息学分析和基因表达量分析，发现AcCYP716A275在种仁中特异表达，结果如图2所示。AcCYP716A275在种仁中的表达量显著高于其他组织，因此选择AcCYP716A275为管家候选基因。

采集七叶树(Aesculus chinensis)成熟的种子，利用RNA提取试剂盒(艾德莱，RN38 EASYspin plus)提取七叶树种子中的RNA，RNA质量检测合格后进行反转录获得质量合格的cDNA。设计引物序列(如表1)，以cDNA为模板，利用KOD-Plus-Neo高保真酶克隆AcCYP716A275基因片段(KOD高保真酶PCR体系总体积为50μL：5μL 10XBuffer，3μL MgSO₄，5μL dNTP(2mM)，1.5μL正向引物(10μM)，1.5μL反向引物(10μM)，1μL模板，1μLKOD酶和32μL水，程序如表2)。借助pEASY-Blunt载体，成功将AcCYP716A275片段连入载体上(连接体系总体积为3μL：0.5μL pEASY-Blunt载体和2.5μL cDNA模板，25℃连接反应1h)。连接体系直接转化TransT1感受态，挑选阳性克隆测序(菌落PCR体系总体积为12.5μL：6.25μL 2×TaqPCR Mix，1μL模板，0.25μL正引物，0.25μL反引物和4.75μL水，程序如表3，PCR如图4中A所示)，与RNAseq序列比对，发现，核苷酸序列与原数据相似度100％。

将BfCYP716Y1(GeneBank ID：KC963423.1)基因的基因编码序列全长委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行基因合成，然后连接到pEAQ-HT-DEST载体(BioVectorNTCC典型培养物保藏中心)上，获得pEAQ-HT-DEST-BfCYP716Y1质粒，其示意图如图3所示，该质粒用于下一步的农杆菌转化实验。

参考Invitrogen Gateway克隆技术进行烟草瞬时表达载体构建，具体步骤如下：

(1)设计引物序列，在目标片段5’端添加attB1序列，3’端添加attB2序列(表1)，以上面获得的目标片段质粒为模板，进行KOD-PCR(KOD高保真酶PCR体系总体积为50μL：5μL10XBuffer，3μL MgSO₄，5μL dNTP(2mM)，1.5μL正向引物(10μM)，1.5μL反向引物(10μM)，1μL模板，1μLKOD酶和32μL水，程序如表2)。

(2)BP反应：取25ng的attB PCR回收产物和75ng pDONR207入门载体(BioVectorNTCC典型培养物保藏中心)，加水混匀至4μL，然后加入lμL的BP clonase II enzyme(Thermo Fisher,Gateway^TMBP Clonase^TM酶混合物)，混匀，25℃孵育l h，加入0.5μL的Proteinase K(Thermo Fisher,Gateway^TMBP Clonase^TM酶混合物)，37℃孵育10min，转入TransT1感受态(全式金)，于15mg/L Kan抗性LB固体培养基上筛选阳性克隆并PCR检测(胶图结果如图4中B所示)，测序成功的阳性克隆提取重组质粒。

(3)LR反应：取75ng的pDONR207重组质粒和75ng pEAQ-HT-DEST载体质粒(BioVector NTCC典型培养物保藏中心)，加去离子水混匀至4μL，然后加入0.4μL的LRclonase II enzyme(Thermo Fisher,Gateway^TMLR Clonase^TM酶混合物)，混匀，25℃孵育lh，加入0.5μL的Proteinase K，37℃孵育10min，转入TransT1感受态，于50mg/mL Kan抗性LB固体培养基上筛选阳性克隆并PCR检测(胶图结果如图4中C所示)，测序成功的阳性克隆保菌并提取质粒，最终将AcCYP716A275连接到pEAQ-HT-DEST载体上，质粒示意图如图5所示。

表1克隆基因所用引物序列

表注：序列中小写字母为保护碱基和BP反应重组位点。

表2 KOD高保真酶PCR反应程序

表3菌落PCR反应程序

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二、获得基因序列以及其编码的蛋白序列

测序结果表明，利用表1中的引物扩增得到的基因含有1407个核苷酸(序列表中序列1所示)，编码468个氨基酸的蛋白(序列表中序列2所示)，将该基因通过官方命名AcCYP716A275，将其编码的蛋白命名为AcCYP716A275。

三、基因功能的验证

参照全式金质粒提取试剂盒

HiPure Plasmid MiniPrep Kit的试验说明提取阳性大肠杆菌中的质粒：

(1)取2mL过夜培养的菌液，10,000g离心1分钟，去除上清(尽量吸尽)。

(2)加入250μL无色溶液RB(含RNase A)，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。

(3)加入250μL蓝色溶液LB，温和的上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液。

(4)加入350μL黄色溶液NB，轻轻混合5-6次，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2分钟。

(5)12,000g离心5分钟，小心吸取上清加入离心柱中。12,000g离心1分钟，弃流出液。

(6)加入650μL WB溶液，12,000g离心1分钟，弃流出液。

(7)12,000g离心2分钟，彻底去除残留的WB。

(8)将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入40μL去离子水，室温静置1分钟。

(9)10,000g离心1分钟，洗脱DNA，获得pEAQ-HT-DEST-AcCYP716A275质粒，用于下一步的农杆菌转化实验。

参照唯地生物EHA105农杆菌电转转化的试验说明进行农杆菌转化：

(1)将0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干乙醇，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

(2)从-80℃冰箱中取出EHA105农杆菌感受态细胞，插入冰中5分钟，待其融化加入0.01-1μg pEAQ-HT-DEST-BfCYP716Y1或pEAQ-HT-DEST-AcCYP716A275质粒(体积不大于6μl)，用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

(3)启动电转仪，将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入700μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2～3小时。

(4)6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含50mg/L Kan和50mg/L Rif抗生素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

(5)用灭菌的牙签挑取LB平板上的单菌落，于500μL含50mg/L Kan和50mg/L Rif抗生素的液体LB培养基中，28℃振荡培养8-12小时，分别选取pEAQ-HT-DEST的正向引物(表4)和目的片段的反向引物(AcCYP716A275-R见表1，BfCYP716Y1-R见表4)进行PCR鉴定(结果如图6所示)，阳性菌株进行下一步烟草瞬时表达试验。

表4菌液PCR验证引物

烟草瞬时表达和产物鉴定如下：

(1)农杆菌EHA105注射本氏烟草叶片

将含有重组质粒的EHA105接种于5ml含50mg/L Rif和50mg/L Kan抗生素的LB液体培养基中，28℃摇床培养至OD600约1.0；4000g离心5min，弃上清，收集菌沉淀，用等体积的MMA溶液(浓度为10mM MES，10Mm MgCl₂，200μM乙酰丁香酮的混合溶液)重悬至OD600为0.8～1.2，室温放置3h；选择长势好的本氏烟草(Goodin MM,Zaitlin D,Naidu RA,Lommel SA(2008):Nicotiana benthamiana:Its History and Future as a Model for Plant–Pathogen Interactions.Molecular Plant-Microbe

21:1015-1026.)，用注射器针头先在叶片表面轻轻刺破小孔，有利农杆菌MMA悬浮液的注射；暗培养1d，然后取出光照培养4d，将注射过农杆菌的烟草叶片用注射器注射β-香树脂醇溶液(CAS:559-70-6，浓度1mM，溶于0.5％乙醇溶液)，再光照培养1d后，收集注射有农杆菌和β-香树脂醇的叶片，-80℃保存。

(2)催化产物的分析和鉴定

将注射烟草叶片在液氮中研磨成粉末，取0.1g左右粉末于500μL浸提剂(提取试剂：甲醇：水：氢氧化钾＝9：1：1，v:v:w)中，65℃浸提2小时，每隔半小时震荡1次，然后加入250μL水震荡混匀，再加入500ul正己烷，震荡混匀，12000g离心1min，取100μL上层正己烷溶液，真空离心浓缩仪(Concentrator plus，Eppendor)浓缩至干燥；然后加入50μL N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酸铵(阿拉丁，中国)80℃衍生化30min，加入50μL乙酸乙酯稀释后，转移到安捷伦样品瓶中，用于GC-MS检测。

利用安捷伦7890进行GC-MS检测，气相色谱柱为hb-5(30m×0.25mm×0.25um,Aglient)，升温程序：170℃保持2min，以20℃/min升温至300℃，300℃保持10min(总共20min)；载气(He)流速1mL/min；进样量1μL；气化室温度250℃；质谱检测器为安捷伦7000C三重四级杆，质谱扫描范围为60-800u。

GC-MS分析结果如图7所示，BfCYP716Y1来自柴胡，可催化β-香树脂醇生成16α-羟基-β-香树脂醇，因此可用来辅助鉴定16α-羟基-β-香树脂醇，GC-MS检测时其碎片离子为306、279、216、201、190、73(Moses T,Pollier J,Almagro L,Buyst D,Van Montagu M,Pedreno MA,et al.Combinatorial biosynthesis of sapogenins and saponins inSaccharomyces cerevisiae using a C-16αhydroxylase from Bupleurumfalcatum.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 2014；111(4):1634-1639；Moses T,Pollier J,Faizal A,Apers S,PietersL,Thevelein JM,et al.Unraveling the triterpenoid saponin biosynthesis of theAfrican shrub Maesa lanceolata.Molecular plant 2015；8(1):122-135.)。本发明中，在烟草中共注射β-香树脂醇底物和AcCYP716A275或BfCYP716Y1，均可在12.5±0.1min处检测到β-香树脂醇，在13.773±0.1min处均可检测到碎片离子为306、279、216、201、190、73的峰，两者出峰时间和碎片信息均一致，说明七叶树中的AcCYP716A275可催化β-香树脂醇生成16α-羟基-β-香树脂醇。

上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。

Claims (8)

1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：

a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有催化β-香树脂醇16α位羟基化的酶活性的由a)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述催化β-香树脂醇16α位羟基化是催化β-香树脂醇生成16α-羟基-β-香树脂醇。

3.权利要求1或2所述蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下1)或2)或3)所示：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同源性的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组微生物。

6.权利要求1或2所述的蛋白在作为催化β-香树脂醇16α位羟基化的关键酶中的应用。

7.根据权利要求6所述的蛋白，其特征在于：所述催化β-香树脂醇16α位羟基化是催化β-香树脂醇生成16α-羟基-β-香树脂醇。

8.权利要求1或2所述的蛋白、权利要求3或4所述编码基因在催化β-香树脂醇生成16α-羟基-β-香树脂醇中的应用。

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