CN116212000A - 一种环（l-亮氨酸-d-脯氨酸）二肽的应用及其水产抑菌剂 - Google Patents

一种环（l-亮氨酸-d-脯氨酸）二肽的应用及其水产抑菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种环(L‑亮氨酸‑D‑脯氨酸)二肽的应用及其水产抑菌剂，所述应用为作为水产抑菌剂。本发明所述的一种环(L‑亮氨酸‑D‑脯氨酸)二肽的应用，具体为按一定的比例将其与水产养殖用投入品混合均匀，将其制备为水产抑菌剂；接着再按一定的频率投入使用，即可以实现在水产养殖过程中有效抑制水体中鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的滋生，有效防治水产生物感染鳗弧菌和金黄色葡萄球菌，进而实现有效避免鳗弧菌对水产产量的影响，有效避免水产原料感染金黄色葡萄球菌导致的后续加工成本的提高。

Description

一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用及其水产抑菌剂
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，特别是涉及一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用及其水产抑菌剂。
背景技术
鳗弧菌为有鞭毛的革兰氏阴性细菌，无荚膜，不形成芽孢，能运动，氧化酶阳性，对O/129敏感，其感染途径有多种，主要包括皮肤、鳃、侧线以及肠道等，具体地，鳗弧菌是条件致病菌，当水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇不利刺激或是受伤时，会诱发疾病的产生，影响水产养殖的产量。
金黄色葡萄球菌也称“金葡菌”，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌代表，为一种常见的食源性致病微生物，其几乎无处不在，可以存在于水产养殖、加工、运输、销售等整个水产的产品周期中，在适当的条件下，金黄色葡萄球菌能够产生肠毒素，引起食物中毒，因此做好金黄色葡萄球菌的抑制工作对于水产产品非常重要。
目前防治水产动物细菌性疾病的方法主要是使用抗生素，但是长时间的使用抗生素使得耐药病株的产生，并破坏了水体微生态平衡，因此，有必要寻找一种更为有效，且绿色安全的防治鳗弧菌的化合物。
根据现有研究，环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽在1×10－5mol·L时能够有效地抑制MPP+诱导的PC12-syn细胞损伤，关于环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽在水产抑菌上的作用尚无报道。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，具体为按一定的比例将其与水产养殖用投入品混合均匀，将其制备为水产抑菌剂；接着再按一定的频率投入使用，即可以实现在水产养殖过程中有效抑制水体中鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的滋生，有效防治水产生物感染鳗弧菌和金黄色葡萄球菌，进而实现有效避免鳗弧菌对水产产量的影响，有效避免水产原料感染金黄色葡萄球菌导致的后续加工成本的提高。
一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，所述应用为制备水产抑菌剂。
本发明所述的一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，通过环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的抑菌作用，避免水产遭受细菌的感染，保障水产的质量。
进一步地，所述应用方法包括以下步骤：直接将所述环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽加入到水产养殖用投入品中，混合均匀制备成水产抑菌剂。
进一步地，所述环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的含量为50-100mg/kg。
进一步地，所述水产是鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、大菱鲆、牙鲆、黄鱼和虾中的一种或几种。
进一步地，所述水产养殖用投入品包括水产饲料、添加剂、水体改良剂和水中的一种。
进一步地，所述应用方法包括，使用所述水产抑菌剂的频率为3次/天。
进一步地，所述菌为鳗弧菌和金黄色葡萄球菌。
本发明还提供一种水产抑菌剂，包括环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽。
进一步地，环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽在所述水产抑菌剂中的含量是50～100mg/kg。
为了更好地理解和实施，下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例仅用于说明本发明，不用于限制本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
附图说明
图1为环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的结构式示意图；
图2为环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的色谱结果示意图；
图3为环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的ESI-MS结果示意图；
图4为鳗弧菌的抑菌活性实验结果示意图；
图5为金黄色葡萄球菌的抑菌活性实验结果示意图；
其中，CK：甲醇；P：Amp；DL：环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽；DD：环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽；环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽；环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽。
具体实施方式
本发明的环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽是通过化学合成得到，其结构式如图1所示，并且还对合成得到的环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽粗品进行了HPLC纯化和鉴定，对纯化后的环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽进行了ESI-MS分析。
HPLC纯化和鉴定的过程和结果为：对化学合成的环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽粗品进行HPLC层析，其中溶剂A相为0.1％(v/v)三氟乙酸，溶剂为色谱纯水；溶剂B相为三氟乙酸，溶剂为色谱纯乙腈；洗脱程序为15％B相洗脱0.01min后，40％B相洗脱到25min，然后100％B相洗脱到40min，最后用15％B相洗脱到50min停止，全程1mL/min。其中环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的色谱结果如图2所示，在12～14min时有单一的峰，环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的纯度达到98.451％。
ESI-MS分析的过程和结果为：将纯化后的环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽溶解于5％乙酸+8％乙腈+87％纯水的混合溶液中并过滤，进行ESI-MS分析。分析结果如图3所示，环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的相对分子质量为210.28，与理论符合。
实施例1
本实施例提供了环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽作为南美白对虾养殖过程中的水产抑菌剂的应用实例。
本实施例的实施地点为中山市三角镇养殖基地，该养殖基地在重复饲养南美白对虾后，饲养的南美白对虾出现了严重的细菌性疾病，经过微生物技术，水中鳗弧菌达到3×103cfu/ml，目前虾的成活率在50％左右，本实施例选取了其中一亩虾塘进行应用。
养殖方法为：投苗前对水体进行消毒处理，然后投苗，每亩投入虾苗30000只，共120000只，进行常规养殖，养殖过程中以3次/天的频率投喂的水产饲料与环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的混合物，其中环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的含量为50mg/kg，养殖时间为3个月。
3个月后，计算南美白对虾的成活率，观察其外观并称量其质量，其中成活率的计算公式为：成活率＝存活虾只数/总只数×100％。
本实施例的南美白对虾成活率为65.3％，具有虾体通透，虾线细长，虾足洁净，虾须粗壮的外观特征，且其弹跳力强，单只虾体质量相对提高，达到24头/斤。随机抽取10只对虾，进行PCR检测，均未检出金黄色葡萄球菌。
实施例2
本实施例提供了环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽作为南美白对虾养殖过程中的水产抑菌剂的应用实例。
本实施例的实施地点为中山市三角镇养殖基地，该养殖基地在重复饲养南美白对虾后，饲养的南美白对虾出现了严重的细菌性疾病，经过微生物技术，水中鳗弧菌达到3×103cfu/ml，目前虾的成活率在50％左右，本实施例选取了其中一亩虾塘进行应用。
养殖方法为：投苗前对水体进行消毒处理，然后投苗，每亩投入虾苗30000只，共120000只，进行常规养殖，养殖过程中以3次/天的频率投喂的水产饲料与环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的混合物，其中环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的含量为100mg/kg，养殖时间为3个月。
3个月后，计算南美白对虾的成活率，观察其外观并称量其质量，其中成活率的计算公式为：成活率＝存活虾只数/总只数×100％。
本实施例的南美白对虾成活率为85.2％，具有虾体通透，虾线细长，虾足洁净，虾须粗壮的外观特征，且其弹跳力强，单只虾体质量相对提高，达到24头/斤。随机抽取10只对虾，进行PCR检测，均未检出金黄色葡萄球菌。
对比例1
本实施例提供了不采用抑菌剂时水产养殖的实施例。
本实施例的实施地点为中山市三角镇养殖基地，该养殖基地在重复饲养南美白对虾后，饲养的南美白对虾出现了严重的细菌性疾病，经过微生物技术，水中鳗弧菌达到3×103cfu/ml，目前虾的成活率在50％左右，本实施例选取了其中1亩与实施例1的虾塘环境条件相似的虾塘进行应用。
对照组的养殖方法为：投苗前对水体进行消毒处理，然后投苗，每亩投入虾苗30000只，共120000只，进行常规养殖，养殖过程中以3次/天的频率投喂的水产饲料，养殖时间为3个月。
3个月后，计算南美白对虾的成活率，观察期外观并称量其质量，其中成活率的计算公式为：成活率＝存活虾只数/总只数×100％；成活率、外观以及质量的统计结果如下表2所示。
本实施例的南美白对虾成活率为55％，具有虾体偏黑，虾线粗黑的外观特征，且其弹跳力弱，单只虾体质量轻，为35头/斤。随机抽取10只对虾，进行PCR检测，其中2只对虾金黄色葡萄球菌PCR检测阳性。
对比例2
本实施例对无菌甲醇、Amp(氨苄青霉素)溶液、环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽、环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽、环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽和环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽等物质进行了鳗弧菌的抑菌活性实验。
实验方法为：
分别将环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽、环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽、环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽和环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽溶于甲醇当中，配制成100mg/L的环二肽甲醇溶液，通过0.22μm滤膜过滤除菌；
培养鳗弧菌至OD600＝1.5，将鳗弧菌溶液涂布在LB培养基上，在培养基中间等距离放置6个滤纸片(直径6mm)，共形成6个点样区。其中，LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠7g，加蒸馏水配制成1L；固体LB培养基再加1.5％琼脂。
分别向6个点样区加入10uL无菌甲醇、10mg/mLAmp(氨苄青霉素)溶液、100mg/L环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽、100mg/L环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽、100mg/L环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽、100mg/L环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽；放入30℃培养箱培养1天后观察，测量抑菌圈直径。
鳗弧菌的抑菌活性实验结果如图4所示，CK对应的物质为甲醇；P对应的物质为10mg/mLAmp(氨苄青霉素)，抑菌圈直径为8mm；DL对应的物质为100mg/L环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽，抑菌圈直径为5.5mm；DD对应的物质为100mg/L环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽，抑菌圈直径为5mm；LL对应的物质为100mg/L环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽，无抑菌圈；LD对应的物质为100mg/L环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽，抑菌圈直径为8mm。不难看出，环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽对鳗弧菌具有显著的抑菌作用，其抑菌圈直径为8mm，与传统抗生素氨苄青霉素(Amp)的抑菌效果相当，因此可以将环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽用于防治由鳗弧菌引起的鱼虾水产疾病。
对比例3
本实施例对无菌甲醇、Amp(氨苄青霉素)溶液、环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽、环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽、环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽和环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽等物质进行了金黄色葡萄球菌的抑菌活性实验。
实验方法为：
分别将环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽、环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽、环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽和环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽溶于甲醇当中，配制成100mg/L的环二肽甲醇溶液，通过0.22μm滤膜过滤除菌；
培养金黄色葡萄球菌至OD600＝1.5，将金黄色葡萄球菌溶液涂布在LB培养基上，在培养基中间等距离放置6个滤纸片(直径6mm)，共形成6个点样区。其中，LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠7g，加蒸馏水配制成1L；固体LB培养基再加1.5％琼脂。
分别向6个点样区加入10μL无菌甲醇、10mg/mLAmp(氨苄青霉素)溶液、100mg/L环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽、100mg/L环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽、100mg/L环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽、100mg/L环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽；放入30℃培养箱培养1天后观察，测量抑菌圈直径。
金黄色葡萄球菌的抑菌活性实验结果如图5所示，CK对应的物质为甲醇；P对应的物质为10mg/mLAmp(氨苄青霉素)，抑菌圈直径为12mm；DL对应的物质为100mg/L环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽，抑菌圈直径为5mm；DD对应的物质为100mg/L环(D-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽，抑菌圈直径为2.5mm；LL对应的物质为100mg/L环(L-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽，抑菌圈直径为2mm；LD对应的物质为100mg/L环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽，抑菌圈直径为8mm。不难看出，环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽对金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌作用，其抑菌圈直径为8mm，为传统抗生素氨苄青霉素(Amp)的三分之二，因此可以将环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽用于防治水产养殖过程中金黄色葡萄球菌的滋生，影响水产的质量，提高后续水产加工成本。
通过对比实施例1、实施例2和对比例1的结果可知，环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的使用，提高了虾的成活率，降低了虾的病死率，提高了其活力与质量；特别地，当环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的含量为100mg/kg时，虾的成活率高达85.2％，大大提高了虾的成活率。
本发明首次发现环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌有显著抑制作用并将其应用于水产抑菌剂，具体地，对虾的偷死病、黄鳃病等有显著抑制作用，为水产由鳗弧菌引起的疾病提供新的防治方法，降低了水产中含有的金黄色葡萄球菌含量，有利于保障水产的食品安全。另外本发明的环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽可以从红树林来源的芽孢杆菌B1032中分离得到，这使本发明的水产抑菌剂可以从天然植物中提取，对环境无污染，对人畜无害，其中，芽孢杆菌B1032保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M 2020498。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (9)

1.一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，其特征在于，所述应用为制备水产抑菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，其特征在于，所述应用方法包括以下步骤：直接将所述环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽加入到水产养殖用投入品中，混合均匀制备成水产抑菌剂。
3.根据权利要求2所述的一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，其特征在于，所述环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的含量为50-100mg/kg。
4.根据权利要求1所述的一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，其特征在于，所述水产是鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、大菱鲆、牙鲆、黄鱼和虾中的一种或几种。
5.根据权利要求2-3所述的一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，其特征在于，所述水产养殖用投入品包括水产饲料、添加剂、水体改良剂和水中的一种。
6.根据权利要求2所述的一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，其特征在于，所述应用方法包括，使用所述水产抑菌剂的频率为3次/天。
7.根据权利要求1所述的一种环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽的应用，其特征在于，所述菌为鳗弧菌和金黄色葡萄球菌。
8.一种水产抑菌剂，其特征在于，包括环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽。
9.根据权利要求8所述的水产抑菌剂，其特征在于，环(L-亮氨酸-D-脯氨酸)二肽在所述水产抑菌剂中的含量是50～100mg/kg。
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