CN116209455A - 用于在细胞中表达多肽的核酸构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子从5’到3’包含第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列；所述第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；所述第二核苷酸序列编码FOXP3；所述第三核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)；特别地，其中所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列由编码自剪切序列的核苷酸序列分开。还提供了包含所述核酸分子的构建体、载体和细胞，以及在细胞中(特别是在用于过继性细胞疗法(ACT)的免疫细胞中)表达编码的多肽的方法和用途。

Description

用于在细胞中表达多肽的核酸构建体
技术领域
本公开和本发明涉及包括分子和构建体的核酸，该核酸用于在细胞中表达多肽，特别是在用于过继性细胞疗法(ACT)的免疫细胞中表达多肽。该核酸在单分子中编码三种组分，即自杀部分、转录因子FOXP3和嵌合抗原受体(CAR)，使得当该核酸在细胞中表达时，自杀部分、FOXP3以及CAR在细胞中或细胞上分别作为单独的多肽表达。
背景技术
过继性细胞疗法(ACT)已经越来越多地在临床应用中针对一系列不同的病症进行使用和测试，包括已经施用了细胞毒性细胞的最显著的恶性疾病和感染性疾病，并且最近已提出使用调节性T细胞(Treg)基于其免疫抑制作用来控制不需要的免疫应答。
经基因工程化以识别CD19的T细胞已被用于治疗滤泡性淋巴瘤，而使用经基因修饰以表达抗肿瘤T细胞受体的自体淋巴细胞的ACT已被用于治疗转移性黑色素瘤。ACT在黑色素瘤和EBV相关的恶性肿瘤中的成功激发了人们为重靶向效应T细胞以治疗其他肿瘤而努力，并且T细胞已经被工程化来表达具有新特异性的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
CAR修饰的T淋巴细胞已被报道用于B系恶性肿瘤、成人淋巴瘤和播散性黑色素瘤的免疫治疗。
其他类型的免疫细胞也被用于或被建议用于ACT，包括例如NK细胞，包括被工程化以表达CAR的NK细胞。最近，已经开发出了用于ACT的调节性T细胞(Treg)。Treg具有免疫抑制功能。它们的作用是控制细胞病变的免疫应答，并且其对维持免疫耐受性至关重要。Treg的抑制特性可以在治疗上被用于例如改善和/或预防炎症性疾病、自身免疫性或过敏性疾病或病症以及移植中的免疫介导的器官损伤。至于效应免疫细胞，Treg可以类似地进行遗传工程化以靶向细胞上表达的预定分子，例如经由CAR靶向的抗原。事实上，抗原特异性Treg具有提供靶向免疫抑制的优势，并且几个小组已报告，与多克隆Treg相比，抑制能力增加。
因此，对于ACT而言，在许多情况下期望在细胞中表达异源受体或靶向分子，特别是嵌合受体或CAR。
然而，过继性免疫疗法不断提高的疗效一直与严重不良事件的报告联系在一起。已有输注工程化效应T细胞后的急性不良事件报告，比如细胞因子风暴。另外，已经发生了慢性不良事件，并且已通过动物模型预测到了其他不良事件。例如，由于碳酸酐酶IX(CAIX)(由肾癌表达的抗原)在胆道上皮上的意外表达，重定向到CAIX的效应T细胞在数名患者中产生了肝毒性。由于目标抗原在皮肤和虹膜上的表达，抗黑色素瘤的初始T细胞受体转移研究已导致患者出现白癜风和虹膜炎。在初始TCR转移后，小鼠中已有由于TCR交叉配对引起的移植物抗宿主病(GvHD)样综合征的报告。在用一些含有共刺激的CAR过继转移后，动物模型中已有淋巴增生性疾病的报告。最后，载体插入诱变的风险始终存在。虽然急性毒性可以通过谨慎给药来解决，但慢性毒性可能就与细胞剂量无关。
工程化和施用的T细胞可以在施用后扩增并持续数年，并且进一步地，Treg细胞可以在某些环境中失去其抑制表型并变成T效应细胞。鉴于此以及患者在施用任何免疫疗法后始终存在的不良事件的风险，因此，希望在一些情况下针对特定的疾病病症纳入一种安全机制，以允许在遭遇毒性时或者在这些细胞实际上已发挥治疗效果后选择性地删除过继输注的T细胞及其他免疫细胞。
自杀基因能够在体内选择性地删除转导的细胞。典型地，自杀基因对自杀部分进行编码，该自杀部分作为一种安全措施使细胞能够被消除或靶向消除，从而充当细胞的安全开关。两个自杀基因/部分已接受了临床测试：HSV-TK和iCasp9。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)在T细胞中的表达赋予了对更昔洛韦的易感性。HSV-TK的使用仅限于深度免疫抑制的临床环境，比如单倍体相合骨髓移植，因为这种病毒蛋白具有高度免疫原性。进一步地，该病毒蛋白排除了使用更昔洛韦来治疗巨细胞病毒。诱导型Caspase 9(iCasp9)可以通过施用小分子药物(AP20187)来激活。iCasp9的使用取决于临床级AP20187的可用性。另外，除了基因工程细胞产物外，使用实验性小分子可能会导致监管问题。
正在开发其他安全开关，并且WO2013/15339已经报告了基于抗原CD20的最小表位的多肽构建体，该构建体由裂解抗体利妥昔单抗识别。利妥昔单抗是一种针对CD20蛋白的免疫治疗嵌合单克隆抗体，CD20蛋白主要存在于B细胞表面。当利妥昔单抗与CD20结合时，会触发细胞死亡，因此利妥昔单抗可以被用来靶向并杀伤在其细胞表面表达CD20的细胞。已经开发出了模仿利妥昔单抗识别的表位的多肽(所谓的模拟表位)，并且这些多肽在WO2013/15339中被用作联合自杀-标记多肽构建体中的自杀部分，该构建体还包含CD34最小表位作为标记部分。具体地，WO2013/15339公开了一种称为RQR8的多肽，该多肽具有SEQID NO.1所示的序列，其包含两个CD20最小表位，这两个表位通过间隔序列和中间的CD34标记序列彼此分开，并进一步地被连接到允许多肽从表达其的细胞表面伸出的茎序列。
因此，通常进一步希望在被工程化以表达用于ACT的CAR的细胞中包括安全开关。
如上所述，Treg细胞鉴于其抑制功能代表了一类对ACT有用的细胞。Treg细胞表达FOXP3，而常规T细胞(Tcon细胞)可以通过在这些细胞中表达FOXP3而在体外向调节表型分化。FOXP3表达缺失与调节性T细胞的抑制功能的丧失和可能恢复到效应表型有关。因此，FOXP3的表达似乎对Treg功能和维持Treg表型很重要，并且本文进一步提出在预期用于ACT的免疫细胞，特别是Treg细胞中表达FOXP3。
发明内容
本发明人已开发了用于在细胞，特别是在用于ACT的免疫细胞，更特别是在Treg细胞或其前体中共表达CAR、安全开关和FOXP3的核酸分子和构建体。如上所述，建议将FOXP3与CAR和安全开关一起表达，以便特别地为Treg细胞提供稳定的Treg表型或赋予该细胞Treg表型。
核酸分子和构建体被设计为在单个核酸分子或构建体中编码这三种组分，使得编码的多肽可以在细胞中作为单个组分，即作为离散实体产生。因此，由核酸分子编码的三种表达的组分可以作为单独的和不同的或离散的功能性多肽分别位于细胞内或细胞上。这可以通过在核酸分子中在编码各自组分的核苷酸序列之间编码剪切序列，特别是自剪切序列来实现。
本发明人惊奇地发现，三种组分在核酸分子中编码的顺序很重要。特别是，已经发现CAR、FOXP3和安全开关作为单独和单个多肽的表达可以通过在核酸构建体中按以下顺序从5’到3’对其编码来提高：安全开关多肽—FOXP3多肽—CAR。当在比较核酸构建体中以不同顺序编码组分时，已发现与安全开关—FOXP3—CAR的顺序相比，各个组分的水平降低。最值得注意的是，在构建体使用安全开关—FOXP3—CAR的情况下，FOXP3的生产水平出乎意料地且不可预测地非常高。如下面的实施例所示，本文中的构建体比可比构建体或对照构建体显著提高了转导细胞中FOXP3蛋白的水平。转导的FOXP3赋予了Treg细胞稳定性，细胞保持了其Treg表型，并且更进一步地，FOXP3水平升高不会对扩增或细胞存活产生负面影响。更进一步地，观察到的极高的FOXP3产生水平被证明可以用不同的病毒载体获得。
因此，在第一方面，本文提供了一种核酸分子，该核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)。
特别地，所述安全开关多肽、FOXP3和CAR可以作为单独的多肽实体由核酸分子表达。
在这方面，本文提供了一种核酸分子，该核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)；
其中，所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列由编码自剪切序列的核苷酸序列分开。
所述自剪切序列允许将所述安全开关多肽、所述FOXP3和所述CAR作为单独的多肽表达或产生。
在一个实施方案中，所述自剪切序列(其可以替代性地称为自剪切肽)是2A或类2A剪切序列(或换言之，是2A肽或类2A肽)。
在一个实施方案中，所述安全开关是具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或其变体的多肽RQR8，或如下文进一步描述的类似多肽。
所述CAR可以指任何所需的靶分子，特别是在靶细胞上表达的靶分子。下面讨论了合适的CAR。在一个实施方案中，所述CAR针对HLA抗原，例如HLA-A2。在一个进一步的实施方案中，所述CAR可以不针对MHC II。
所述核酸分子可以被视为核酸构建体，该核酸构建体包含所述第一编码核苷酸序列、第二编码核苷酸序列和第三编码核苷酸序列。在一个特定的实施方案中，所述核酸分子可以不编码任何其他多肽序列(即在一个实施方案中，其不包含除上述(i)、(ii)和(iii)部分中的第一编码核苷酸序列、第二编码核苷酸序列和第三编码核苷酸序列外的任何编码核苷酸序列)。换言之，在一个实施方案中，(i)、(ii)和(iiii)中的核苷酸序列是核酸分子中存在的仅有的或唯独的编码序列。因此，替代地看，所述核酸分子可以仅编码安全开关多肽、FOXP3和CAR。所述核酸分子可以可操作地连接到启动子，以允许表达编码的多肽。因此，所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可以可操作地连接到同一启动子。通过这种方式，三种编码的多肽组分可以作为单个组分和单独的组分由同一启动子表达。特别地，所述启动子可以是SFFV启动子。
因此，在另一方面，本文提供了一种包含如本文所定义的核酸分子的表达构建体，其中，所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列可操作地连接到同一启动子。
替代性地，所述表达构建体可以被定义为包含如上所定义的第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列由编码剪切序列的核苷酸序列分开，并且其中所述第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列可操作地连接到同一启动子。剪切序列允许将安全开关多肽、FOXP3和CAR作为单独的多肽表达。
第三方面提供了一种包含如本文所定义的核酸分子或表达构建体的载体。
在一个实施方案中，所述载体是病毒载体。
在第四方面，本文提供了一种包含如本文所定义的核酸分子、表达构建体或载体的细胞。
因此，所述细胞是工程化细胞，或者替代性地看，是已被修饰以引入本文所定义的核酸分子、构建体或载体的细胞。所述细胞重组表达所述核酸分子。所述细胞可以是用于产生多肽的细胞，或者用于产生核酸分子、构建体或载体(例如用于产生载体)的细胞。因此，所述细胞可以是生产宿主细胞。替代性地，所述细胞可以是预期用于治疗，特别是ACT的细胞。因此，所述细胞可以是免疫细胞，特别是T细胞，更特别是Treg细胞，例如CD45RA+Treg细胞或其祖细胞或前体，包括例如干细胞，例如诱导性多能干细胞(iPSC)。CAR在预期用于治疗用途的细胞表面表达或定位。根据安全开关多肽的性质和类型，安全开关多肽可以在细胞中或细胞表面表达或定位。在一个实施方案中，安全开关多肽在细胞表面(与CAR分开)表达或定位。FOXP3在细胞内部表达或定位。特别地，FOXP3在细胞核和/或细胞质中表达。
本发明进一步提供了一种包含本文所定义的细胞的细胞群。
在第五方面，本文提供了一种包含本文所定义的细胞、细胞群或载体的药物组合物。在一个实施方案中，所述细胞在其细胞表面上表达CAR和安全开关。本文所定义的细胞、细胞群和药物组合物可以用于治疗，特别是ACT或基因治疗(其中，该组合物包含载体)。
因此，第六方面提供了一种用于治疗的如本文所定义的细胞、细胞群或药物组合物。
第七方面提供了一种用于过继性细胞转移治疗(ACT)或基因治疗的如本文所定义的细胞、细胞群或药物组合物。
第八方面提供了一种用于治疗传染性、神经退行性或炎症性疾病或用于诱导免疫抑制的如本文所定义的细胞、细胞群或药物组合物。该用途或免疫抑制可以是为了抑制不想要的或有害的免疫应答。该用途可以是治疗炎症、炎症性病症或者涉及炎症或与炎症相关的病症。
第九方面提供了如本文所定义的细胞或细胞群在制造用于过继性细胞转移治疗(ACT)或用于治疗传染性、神经退行性或炎症性疾病或用于诱导免疫抑制的药物中的用途。
第十方面提供了一种治疗的方法，特别是ACT，更特别是用于治疗传染性、神经退行性或炎症性疾病或者用于诱导免疫抑制的方法，其中所述方法包括向受试者，特别是需要的受试者施用如本文所定义的细胞或细胞群，特别是施用其治疗有效量。
在一个实施方案中，本文提供了用于诱导对移植物的耐受性，治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病，促进组织修复和/或组织再生，或改善炎症的细胞、细胞群或药物组合物。特别地，在这样的实施方案中，所述细胞可以是Treg细胞。
类似地，还提供了一种诱导对移植物的耐受性，治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病，或促进组织修复和/或组织再生，或改善炎症的方法，该方法包括向所述受试者施用细胞(例如，Treg)、细胞群或如本文所定义的包含细胞(例如，Treg细胞)的药物组合物的步骤。
这样的方法可以包括：
(i)从受试者中分离或提供富集Treg的细胞样品；
(ii)将本文所定义的核酸分子、表达构建体或载体引入到Treg细胞中；以及
(iii)将来自(ii)的Treg细胞施用于受试者。
本文还进一步提供了本文所定义的细胞(例如，Treg细胞)或细胞群在制造用于诱导对移植物的耐受性，治疗和/或预防细胞性和/或体液性移植排斥反应，治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病，或促进组织修复和/或组织再生，或改善炎症的药物中的用途。
为了治疗这些病症和疾病，CAR可以针对HLA抗原，例如HLA-A2。
第十一方面提供了一种制作本文所定义的细胞的方法，该方法包括将本文所定义的核酸分子、表达构建体或载体引入到细胞(例如，转导或转染细胞)(例如，Treg细胞)中的步骤。
这种方法还可以进一步包括分离、富集、提供或生成要在该方法中使用的细胞的先前步骤。进一步地，可以在引入核酸分子的步骤之后分离、富集或生成细胞。例如，可以将核酸分子引入到前体细胞或祖细胞中，例如干细胞，然后可以诱导或使细胞分化或改变为所需的细胞类型。例如，iPSC细胞可以分化为免疫效应细胞(例如，Treg细胞或其他T细胞)或Tcon细胞可以转化为Treg细胞等。
在第十二方面，提供了一种用于删除根据第四方面的细胞的方法，该方法包括将所述细胞暴露于具有利妥昔单抗结合特异性的抗体的步骤。在一个方面，该方法可以是一种体外方法。
替代地看，这方面可以包括具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体，用于治疗施用了本文所定义的第四方面的细胞的受试者，以删除所述细胞。
更进一步地，根据这方面，提供了一种试剂盒或组合产品，该试剂盒或组合产品包括(a)本文所定义的核酸分子、构建体、载体或细胞以及(b)具有利妥昔单抗结合特异性的抗体。所述试剂盒或产品可以用于ACT或基因治疗。特别地，所述试剂盒或产品可以用于通过ACT使用细胞或制造本发明用途的细胞，然后从受试者删除所述细胞来治疗受试者。替代性地，所述试剂盒可以使用载体在受试者的细胞中体内表达编码的多肽来用于基因治疗。在施用细胞或载体后(例如，在一段时间后)或者如果受试者对细胞或基因治疗表现出不想要的或有害的症状或效果，可以向所述受试者施用所述抗体。
在一个实施方案中，所述抗体是利妥昔单抗。
本发明还可以提供一种用于增加细胞的稳定性和/或抑制功能的方法，该方法包括将本文所提供的核酸分子、表达构建体或载体引入到所述细胞中的步骤。
在另一方面，本发明提供了一种增强来自在细胞中编码嵌合抗原受体(CAR)、安全开关和FOXP3的核酸分子的FOXP3的表达的方法，所述方法包括选择从5’到3’包含如下的核酸分子：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码CAR，
并且将所述核酸分子引入到所述细胞中。
如上文所讨论的，来自编码FOXP3、CAR和安全开关的核酸分子的FOXP3的表达可以通过在核酸分子内以安全开关、FOXP3和CAR的顺序定位编码核苷酸序列来增强。特别地，与来自编码CAR、安全开关和FOXP3(优选地，相同的CAR、安全开关和FOXP3)的核酸分子的表达相比，来自所述核酸分子的FOXP3的表达可以被增强，其中，上文所定义的(i)、(ii)和(iii)以不同的顺序定位，例如与包含从5’到3’的(iii)、(ii)和(i)或包含从5’到3’的(ii)、(iii)、(i)的核酸分子相比。
在另一方面，本发明另外提供了一种增强来自在细胞中编码嵌合抗原受体(CAR)、安全开关和FOXP3的核酸分子的FOXP3和嵌合抗原受体的表达的方法，所述方法包括选择从5’到3’包含如下的核酸分子：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码CAR，
并且将所述表达构建体引入到所述细胞中。
关于这方面，与来自编码CAR、安全开关和FOXP3(优选地，相同的CAR、安全开关和FOXP3)的核酸分子的表达相比，来自所述核酸分子的FOXP3和CAR的表达被增强，其中，上文所定义的(i)、(ii)和(iii)以不同的顺序定位，例如与包含从5’到3’的(iii)、(ii)和(i)或包含从5’到3’的(ii)、(iii)、(i)的核酸分子相比。
在另一方面，本发明提供了核酸分子的用途，所述核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，用于在细胞内表达自杀部分、FOXP3和CAR，其中FOXP3的表达被增强。
关于该方面，本发明进一步提供了核酸分子的用途，所述核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，用于在细胞内表达自杀部分、FOXP3和CAR，其中FOXP3和CAR的表达被增强。
替代性地看，本发明提供了核酸分子的用途，所述核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，用于在细胞内表达自杀部分和CAR以及增强FOXP3的表达。
在一个特定的实施方案中，所述CAR的表达被另外增强。
附图说明
图1示出了如以下实施例中所描述的制作和测试的核酸构建体的设计。构建体I-VI是实验构建体，其中构建体I是根据本发明和本公开的构建体，构建体II-VI是比较构建体，而构建体VII至X是仅包含实验(测试)构建体的3个组分中的2个的对照构建体。R＝安全开关多肽；F＝FOXP3；C＝CAR。
图2示出了实验构建体和对照构建体在效应T(Teff)中的表达。收集未转导(mock)的细胞和转导的细胞，并用可固定细胞活力染料和抗CD4、CD3、Dextramer、RQR8及FOXP3的抗体进行流式细胞术染色。顶部分图是活/CD3+CD4+细胞上设门。这些分图示出了Dextramer的表达(x轴)。底部分图在活/CD3+CD4+Dextramer+细胞上设门，并示出了RQR8(y轴)和FOXP3(x轴)的表达。下部分图仅代表转导的细胞中的表达。构建体名称参考基因顺序，R＝RQR8，F＝FOXP3，C＝CAR。
图3A和图3B示出了实验构建体在用γ逆转录病毒转导的Treg中的表达。扩增15天后，收集转导的细胞，并用可固定细胞活力染料和抗CD4、CD3、Dextramer、RQR8及FOXP3的抗体进行流式细胞术染色。图3A中的FACS图示出了代表性的染色轮廓图。顶部分图示出了活/CD3+CD4+细胞。这些分图示出了Dextramer(x轴)的表达。底部分图是活/CD3+CD4+Dextramer+细胞上设门，并示出了RQR8(y轴)和FOXP3(x轴)的表达。图3B中的图是使用Flowjo软件对每个构建体进行布尔分析的结果，其描述了表达CAR、FOXP3及RQR8、表达CAR和FOXP3但不表达RQR8、表达CAR和RQR8但不表达FOXP3、以及表达CAR但不表达FOXP3或RQR8的细胞的比例。代表3个独立供体。
图4示出了在用慢病毒载体转导的细胞中的模块表达。激活Treg 48小时，并用未浓缩的慢病毒上清液进行转导。4天后，收集转导的细胞和激活的未转导的细胞(mock)，并用可固定细胞活力染料和抗CD4、CD3、Dextramer、RQR8及FOXP3的抗体进行流式细胞术染色。上部分图是活/CD3+CD4+细胞上设门，并示出了Dextramer(x轴)的表达。下部分图是活/CD3+CD4+Dextramer+细胞上设门，并示出了RQR8(y轴)和FOXP3(x轴)的表达。代表n＝3-4个供体。下部分图仅代表转导的细胞中的表达。构建体名称参考基因顺序，R＝RQR8，F＝FOXP3，C＝CAR。
图5在A和B中示出了慢病毒载体或逆转录病毒载体转导用于构建体I(图5A)和构建体IV(图5B)的直接比较。将来自同一供体的Treg激活48小时，并用包装有构建体I的慢病毒或逆转录病毒上清液转导。4天后，收集细胞，并用可固定细胞活力染料和抗CD4、CD3、Dextramer、RQR8及FOXP3的抗体进行流式细胞术染色。表示出了活CD4+群内表达转基因的细胞的比例和平均荧光强度(MFI)。Dextramer和FOXP3的MFI取自Dextramer+细胞。RQR8的MFI取自RQR8+细胞。
图6示出了含有FOXP3的实验构建体(构建体I和构建体VI)和不含FOXP3的对照构建体(CVIII)在CAR阴性细胞(浅灰色-未转导)和CAR+细胞(深灰色-转导)中的FOXP3表达。图6A示出了FACS图，而图6B呈现了示出FOXP3表达的直方图。对于构建体I和构建体VI直方图，浅灰色的峰值可以被可视化为左侧峰值，深灰色的峰值可以被可视化为右侧峰值。对于构建体VIII，峰值是重叠的。
图7示出了外源性FOXP3表达阻止了FOXP3-CAR+Treg的积累。用指示构建体的逆转录病毒上清液转导Treg。收集Treg，并用可固定细胞活力染料和抗CD4、CD3、Dextramer、RQR8及FOXP3的抗体进行流式细胞术染色。顶部分图示出了转导7天后FOXP3(x轴)和RQR8(y轴)在Dextramer+细胞上的表达。下部分图示出了FOXP3(x轴)和RQR8(y轴)在转导11天后用抗CD3/28珠再刺激之后在Dextramer+细胞上的表达。
图8示出了激活48小时并用未浓缩的慢病毒上清液转导的Treg。7天后，收集转导的细胞和激活的未转导的细胞(mock)，并用可固定细胞活力染料和抗CD4、CD3、Dextramer、RQR8及FOXP3的抗体进行流式细胞术染色。在活/CD3+CD4+细胞上设门的上部分图示出了Dextramer(x轴)的表达。下部分图是在活/CD3+CD4+Dextramer+细胞上设门。这些图示出了RQR8(y轴)和FOXP3(x轴)的表达。代表n＝7个供体。构建体名称参考基因顺序，R＝RQR8，F＝FOXP3，C＝CAR。
图9示出了激活48小时并用浓缩的慢病毒上清液转导的Treg。7天后，收集转导的(Td)细胞和激活的未转导的(ntd)细胞(mock)，并用可固定细胞活力染料和抗CD4、CD3、Dextramer、RQR8及FOXP3的抗体进行流式细胞术染色。在活/CD3+CD4+细胞上设门。如所示，顶部分图示出了Dextramer(x轴)的表达，中部分图示出了FOXP3(x轴)和RQR8(x轴)的表达。直方图示出了未转导的Treg(浅灰色)和Dextramer+Treg(深灰色)在同一样品中的FOXP3表达。浅灰色峰值可以被视为每个直方图的左侧峰值，而深灰色峰值可以被视为每个直方图的右侧峰值，但mock细胞的第一直方图除外，其仅具有浅灰色峰值。
图10A和图10B示出了含有用CAR+FOXP3转导或仅用CAR转导的细胞的Treg培养物的总体扩增和存活相似。激活CD45RA+Treg，用逆转录病毒或慢病毒转导，并按照材料和方法中概述的方案生长。在第5天、第7天、第9天、第12天和第14天，使用多孔一次性血细胞计数器对细胞计数。图10A中的曲线图示出了未转导的Treg细胞培养物(mock)和那些用含有FOXP3的构建体(CI和CVI)和不含FOXP3的构建体(CVIII和CX)转导的Treg细胞培养物从第0天起的倍数扩增。n＝3-4。误差条示出了标准差。在培养的第16天，使用磁珠分离富集RQR8+细胞，并在降低浓度的IL-2存在下用磁珠1:1培养7天。用可固定细胞活力染料和Dextramer对细胞染色。图10B中的曲线图示出了用含有FOXP3的构建体(CI)和不含FOXP3的构建体(CVIII)转导的Treg。左y轴指示由活力染料确定的活细胞百分比(带圆形标记值的蓝色线)，而右y轴指示Dextramer+细胞百分比(带方形标记值的黑色线)。代表来自逆转录病毒转导的Treg的3个实验。
图11示出了转导的Treg维持Treg表型。通过流式细胞术检测外源性转导集群和CD45RA+Treg的指示标记表达。在每个样品中，转导的(TD)细胞被识别为Dextramer+，而其余细胞被视为未转导的(NTD)；每个标记的平均荧光强度(MFI)在TD和NTD细胞中进行测定。20表示无变化，21表示表达增加了两倍。图中的条表示平均值，而误差条表示标准差(n＝3-4)。
图12示出了当用CI或CVIII转导时Treg的转导效率，其中EFS或SFFV被用作启动子。对细胞进行Qbend(RQR8)和Dextramer(CAR)染色。EFS和SFFV两者的转导效率相似。在用CVIII而不是CI转导的细胞中观察到了更高水平的转导，表明转导效率更依赖于构建体的大小(2个基因而不是3个基因)。
图13示出了CAR Treg的激活检测，其中对使用表达HLA A1或HLA A2的K562细胞或使用抗CD3/CD28珠对细胞的激活进行了研究。当使用EFS或SFFV启动子时，表达HLA A2(即表达由本实验中使用的CAR识别的抗原)的K562细胞能够在用CI和CVIII两者转导的细胞中激活CAR(通过CD69测量)。然而，用SFFV启动子的激活水平更高。所有细胞都能够使用CD3/CD28珠来激活，其作为阳性对照并使用内源性TCR来激活细胞。
图14示出了用CI转导的Treg的CAR激活和增殖，其中EFS或SFFV启动子被用于对照表达。通过用K562 A1、K562 A2或用抗CD3/CD28珠孵育细胞来研究激活。数据示出CAR-Treg能够在抗原特异性刺激后增殖，并且SFFV在CAR激活后使增殖增强。
图15示出了当对小鼠模型施药以耗竭肝脏中表达RQR8安全开关的细胞时，用CI转导的Treg的体内评估和利妥昔单抗的能力。第15天，在没用利妥昔单抗治疗的小鼠的血液、脾脏和肝脏中可以清楚地观察到转导细胞。然而，在用利妥昔单抗治疗的小鼠中，细胞被有效耗竭。
图16示出了利妥昔单抗滴定实验，其中将转导的Treg与兔血清和增加剂量的利妥昔单抗一起孵育4小时。用于表达RQR8的启动子是EFS或SFFV。数据示出利妥昔单抗能够以剂量依赖的方式触发CAR Treg的细胞死亡，并且SFFV增加了对利妥昔单抗介导的耗竭的敏感性。
具体实施方式
本发明提供了一种核酸分子或构建体，该核酸分子或构建体编码可用于在细胞中表达用于ACT的多肽，具体地在修饰细胞以表达CAR的的情况下，并且该核酸分子或构建体允许多肽由单个核酸分子编码，其可以进一步编码自剪切序列，从而允许多肽作为分开的或离散的组分表达和/或产生。由此，这意味着，尽管多肽是由单个核酸分子编码的，但通过在编码的剪切位点翻译期间或之后“剪切”，这些多肽可以作为单独的多肽表达或产生，因此在细胞中蛋白质生产过程结束时，这些多肽可以作为单独的实体或单独的多肽链存在于细胞中。如下文将进一步描述的，可以使用自剪切肽序列，特别地包括2A和类2A肽。尽管被描述为“自剪切”，但这样的肽被认为是通过允许核糖体跳过发挥功能的，核糖体跳过使得在2A序列的C末端不形成(跳过)肽键，从而导致2A序列与其下游的下一个多肽分离。因此，本文所使用的术语“剪切”包括跳过肽键的形成。
“离散”或“分离”的多肽是指多肽彼此不连接，并且在物理上是不同的。换言之，这些多肽作为单独的实体在细胞中表达或产生。事实上，表达后，这些多肽位于不同的或分离的细胞位置。因此，CAR、FOXP3和安全开关多肽最终被表达为单个和单独的组分。CAR被表达为细胞表面分子。安全开关多肽可以在细胞内或细胞表面上进行表达。在一个特定的实施方案中，安全开关多肽和CAR在预期用于ACT的细胞表面上进行表达。FOXP3在细胞内表达，其中，如下文进一步描述的，FOXP3能够作为转录因子发挥作用以调控细胞发育和/或活性。
安全开关多肽提供了一种细胞，在该细胞中或该细胞上安全开关多肽表达有自杀部分。这可以用作安全机制，该安全机制允许在需要时或者实际上更一般地，根据期望或需要(例如一旦细胞已经执行或完成其治疗效果)，删除已经施用给受试者的细胞。
自杀部分拥有导致细胞死亡，或者更一般地消除或删除细胞的诱导能力。自杀部分的实例为由自杀基因编码的自杀蛋白，该自杀蛋白可以与所需转基因(在这种情况下为CAR)一起在细胞中或细胞上表达，该自杀蛋白当被表达时允许细胞被删除以关闭转基因(CAR)的表达。本文中的自杀部分是自杀多肽，该自杀多肽是在允许条件下(即在被诱导或开启的条件下)能够使细胞被删除的多肽。
自杀部分可以是多肽或氨基酸序列，该自杀部分可以由施用给受试者的激活剂激活以执行细胞删除活动，或者该自杀部分是激活的以在施用给受试者的底物存在下执行细胞删除活动。在一个特定的实施方案中，自杀部分可以代表施用给受试者的单独的细胞删除剂的靶标。通过与自杀部分结合，细胞删除剂可以靶向要删除的细胞。特别地，自杀部分可以由抗体识别，并且当在细胞表面表达时，抗体与安全开关多肽结合使细胞被消除或删除。
如上文所讨论的，自杀部分可以是HSV-TK或iCasp9。然而，优选自杀部分是或包含表位，该表位由细胞删除抗体或能够引发细胞删除的其他结合分子识别。在这种实施方案中，安全开关多肽在细胞表面表达。
本文中使用的术语“删除”在细胞删除的上下文中与“去除”或“消融”或“消除”同义。该术语用于涵盖细胞杀伤或细胞增殖的抑制，使得受试者中的细胞数量可以减少。100％完全去除可能是期望的但并不一定能实现。减少受试者体内的细胞数量或抑制其增殖可能已足以产生有益的效果。
特别是，自杀部分可以是由抗体利妥昔单抗识别的CD20表位。在安全开关多肽中，自杀部分可以包含基于由抗体利妥昔单抗识别的CD20的表位的最小表位。更具体地，该多肽可以包含由接头L隔开的两个CD20表位R1和R2。
因此，在一个实施方案中，所述安全开关多肽包含具有下式的序列：
R1-L-R2-St
其中R1和R2是利妥昔单抗结合表位；
St是茎序列，当多肽在细胞的表面表达时，该茎序列使R1表位和R2表位从细胞表面伸出；以及
L是接头序列。
表达包含该序列的安全开关多肽的细胞可以使用抗体利妥昔单抗或具有利妥昔单抗结合特异性的抗体选择性地杀伤。安全开关多肽在细胞表面表达，当所表达的多肽暴露于或接触利妥昔单抗或具有相同结合特异性的抗体时，细胞死亡随之发生。
利妥昔单抗结合表位是与利妥昔单抗抗体或具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体结合的氨基酸序列，换言之，具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体是与利妥昔单抗一样结合相同的天然表位的抗体。利妥昔单抗是一种与人CD20结合的嵌合小鼠/人IgG1κ单克隆抗体。来自CD20的利妥昔单抗结合表位序列是CEPANPSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO.33)。利妥昔单抗在EP0669836(杂交瘤)中被首次描述，而重链序列和轻链序列在EP2000149中给出(另见Wang等，Analyst，2013，138，3058，在其图1中给出了重链序列和轻链序列以及利妥昔单抗——CAS 17422-31-7，目录号：B0084-061043，BOC Sciences)。也可以参考US 2009/0285795 A1，EP 1633398 A2和WO 2005/000898。利妥昔单抗及其生物仿制药是从世界各地的各种商业来源可广泛获得的。
因此，R1和R2可以是与利妥昔单抗结合的，或者换言之，是能够与利妥昔单抗结合的任何肽。除了CD20背景下的天然表位外，已知并报告了与利妥昔单抗结合的各种肽，或者更具体地说，模仿该天然表位的各种肽。因此，R1和R2可以是利妥昔单抗表位的模拟表位。
例如，Perosa等(2007,J.Immunol 179:7967-7974)描述了这样的模拟表位，其公开了一系列半胱氨酸约束的7-mer环状肽，该环状肽具有利妥昔单抗识别的抗原基序，但有不同的基序周围氨基酸。Perosa描述了具有如下表1中所示的SEQ ID NO.34至44的十一种肽。在表中，基序两侧的氨基酸以小写示出，而基序则以大写示出。已确定，可以从肽中去除首位氨基酸“a”，并且可以保留功能性表位(或模拟表位)。缺失初始“a”的SEQ ID NO.45至55的肽也如表1中所示。
表1
Perosa肽的名称 序列 修饰的序列
R15-C acPYANPSLc(SEQ ID No.34) cPYANPSLc(SEQ ID No.45)
R3-C acPYSNPSLc(SEQ ID No.35 cPYSNPSLc(SEQ ID No.46)
R7-C acPFANPSTc(SEQ ID No.36) cPFANPSTc(SEQ ID No.47
R8-、R12-、R18-C acNFSNPSLc(SEQ ID No.37 cNFSNPSLc(SEQ ID No.48)
R14-C acPFSNPSMc(SEQ ID No.38) cPFSNPSMc(SEQ ID No.49)
R16-C acSWANPSQc(SEQ ID No.39) cSWANPSQc(SEQ ID No.50)
R17-C acMFSNPSLc(SEQ ID No.40) cMFSNPSLc(SEQ ID No.51)
R19-C acPFANPSMc(SEQ ID No.41) cPFANPSMc(SEQ ID No.52)
R2-C acWASNPSLc(SEQ ID NO.42) cWASNPSLc(SEQ ID NO.53)
R10-C acEHSNPSLc(SEQ ID No.43) cEHSNPSLc(SEQ ID No.54)
R13-C acWAANPSMc(SEQ ID No.44) cWAANPSMc(SEQ ID No.55)
可以用作根据本发明的R1和/或R2的利妥昔单抗表位的圆环状(或环状)模拟表位可以用SEQ ID NO.56的共有氨基酸序列表示：
X1-C-X2-X3-(A/S)-N-P-S-X4-C
其中X1是A或不存在，并且X2、X3和X4是任意氨基酸。
更具体地，X2可以是选自P、N、S、M、W或E的氨基酸；X3可以是选自Y、F、W、A或H的氨基酸；而X4可以是选自L、T、M或Q的氨基酸。
还开发了利妥昔单抗表位的非圆环状(或非环状)肽模拟表位。Li等(2006CellImmunol239：136-43)也描述了利妥昔单抗的模拟表位，包括序列为QDKLTQWPKWLE(SEQ IDNO.57)的肽。
多肽可以包含利妥昔单抗结合表位R1和R2，该表位各自独立地包含选自由SEQIDNO.34至57组成的组的氨基酸序列、或其保留了利妥昔单抗结合活性的变体。
这两个表位R1和R2可以是相同或不同的，但在一个优选的实施方案中，其是相同的。
在一个实施方案中，R1和R2各自基本上或者各自替代地由选自由SEQ ID NO.33至57组成的组的氨基酸序列或其保留了利妥昔单抗结合活性的变体组成。
在一个代表性的实施方案中，所述多肽可以包含利妥昔单抗结合表位R1和R2，该表位包含、基本上由或由SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列或其保留了利妥昔单抗结合活性的变体组成。
利妥昔单抗结合表位变体可以基于选自由SEQ ID NO.33至55或57组成的组的序列，但包含一个或多个氨基酸突变(比如相对于序列的氨基酸插入、取代或删除)，前提是表位保留了利妥昔单抗结合活性。特别地，所述序列可以在一个或两个末端被截短例如一个或两个氨基酸。
只要保留表位的利妥昔单抗结合活性，就可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行有意的氨基酸取代。例如，带负电氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
可以进行保守取代，例如根据下表2进行保守取代：
表2
Figure BDA0004128369980000121
第二列中同一表块中的氨基酸和第三列中同一行中的氨基酸可以相互取代：
与选自由SEQ ID NO.33至57组成的组中的序列相比，利妥昔单抗结合表位可以例如包含3个或更少、2个或更少或1个氨基酸突变。
利妥昔单抗结合表位的变体可以包含或由与SEQ ID NO.33至55或57中的任何一个具有至少75％的序列同一性的氨基酸序列，更具体地，与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列组成。
在使用两个相同(或相似)的利妥昔单抗结合氨基酸序列的条件下，使用不同的核苷酸序列来编码两个R表位可能是有利的。在许多表达系统中，同源序列可能导致不期望的重组事件。利用遗传密码的简并性，替代密码子可以用于实现核苷酸序列变异而不改变蛋白质序列，从而防止同源重组事件。
接头序列L可以是任何氨基酸序列，其功能是将两个“R”表位链接或连接在一起，使得这些表位可以被抗体识别和结合。特别地，R表位被间隔开，使得这些表位各自被单独的抗体分子结合。因此，接头序列L的长度不允许两个R表位同时与同一抗体分子结合，或者换言之，接头L太长，安全开关多肽不能同时与利妥昔单抗分子的两个抗原结合位点结合。接头L的长度使得两个R表位能够各自与单独的利妥昔单抗分子结合。
接头序列可以简单地执行连接和间隔开R表位的功能。替代性地或另外地，接头序列可以包含其他功能结构域或序列。例如，接头序列可以包含标记序列。标记序列可以是抗体识别的表位(在这种情况下，应当理解这是与利妥昔单抗识别的表位不同的表位)。标记序列本身可以用作间隔序列，因此除了标记序列之外，可以不需要单独的间隔序列。
如上所述，WO2013/15339的自杀构建体包含由接头隔开的最小CD20表位(具体基于如上所示的SEQ ID NO.34至44和57)，该接头包含被进一步连接到茎序列的CD34标记序列。特别地，WO2013/15339的自杀多肽在其中被定义为具有通式St-R1-S1-Q-S2-R2，其中R1和R2是利妥昔单抗结合表位，St是茎序列，S1和S2是间隔序列；而Q是具有SEQ ID NO.58(ELPTQGTFSNVSTNVS)序列的CD34表位或其变体。
SEQ ID NO.58的表位由单克隆抗体QBEnd10识别。这很重要，因为QBEnd10抗体用于Miltenyi CliniMACS磁性细胞选择系统，该系统被广泛用于临床环境中的细胞分离。因此，包含作为标记的Q表位允许使用常用的选择系统轻松地选择已经过修饰来表达该多肽的细胞。
在一个实施方案中，安全开关多肽可以包含或由WO2013/15339中公开的多肽组成。在这种实施方案中，上式R1-L-R2-St中的L可以被定义为：
S1-Q-S2，
其中Q包含(例如，是)具有SEQ ID NO.58序列的CD34表位，或其具有QBEnd10结合活性的变体；以及
S1和S2是任选间隔序列，其可以是相同的或不同的。
如上所述，接头L的作用是将两个R表位隔开，使得这些表位能够以引发利妥昔单抗作为细胞删除剂的作用的方式结合利妥昔单抗，即这些表位能够各自与单独的利妥昔单抗分子结合。因此，S1-Q-S2的长度或R1与R2之间的距离使得安全开关多肽不能同时与利妥昔单抗分子的两个抗原结合位点结合。
间隔序列S1和S2的组合长度可以至少约为10个氨基酸。
R1与R2之间的距离可以大于76.57A。例如，间隔序列的长度和构型可以使得R1与R2之间的距离至少为78、80或
Figure BDA0004128369980000131
出于本次计算的目的，线性骨架中单独的氨基酸之间的分子距离可以被假设为每个氨基酸约3A。间隔序列可以是基本线性的。间隔序列可以具有如下定义的柔性接头序列的序列，特别是包含或由下文进一步描述的丝氨酸和甘氨酸残基组成的的序列。间隔序列可以具有通式S-(G)n-S，其中S是丝氨酸，G是甘氨酸，而n是2至8之间的数字。接头或每个接头可以包含或由序列SGGGS(SEQ ID NO.62)组成。然而，也可以使用其他间隔序列。间隔子的氨基酸序列不是关键的。Q表位和间隔子的组合长度(即S1-Q-S2接头序列的长度)可以是至少28个氨基酸。
保留了QBEnd10结合活性的SEQ ID NO.58的变体可以是与SEQ ID NO.58具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO.58具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
SEQ ID NO.58的QBEnd10结合变体可以包含一个或多个氨基酸序列修饰，例如氨基酸取代、添加、缺失或插入，包括如上讨论的保守取代。
抗体QBEnd10可以从各种来源获得，包括Abcam、ThermoFisher、SantaCruzBiotechnology和Bio-Rad。该抗体的详细信息可从EP3243838A1和Chia-Yu Fan等(Biochem Biophys Rep.2017年3月；9:51–60)获得。用于确定QBEnd10的结合活性的方法可以根据本领域公知的技术容易地进行。
在其他实施方案中，接头序列L不含标记序列。在一个实施方案中，所述接头序列不包含上文所定义和描述的QBEnd10结合表位。
在这样的实施方案中，如上所述，接头序列可以是任何氨基酸序列，该任何氨基酸序列的作用是分隔R表位，从而允许这些表位各自与单独的利妥昔单抗抗体分子结合。就序列的氨基酸组成和/或氨基酸序列而言，该序列的性质可以变化并且不受限制。然而，在一个实施方案中，所述接头可以是柔性接头。因此，接头可以包含或由已知赋予接头柔性特征的氨基酸组成(与刚性接头相反)。
柔性接头是本领域公知和描述的一类接头序列。接头序列一般被称为序列，其可以用来连接蛋白质或蛋白质结构域或者将蛋白质或蛋白质结构域连在一起，以产生例如融合蛋白或嵌合蛋白、或多功能蛋白或多肽。它们可以具有不同的特性，并且例如可以是柔性的、刚性的或可剪切的。例如，Chen等(2013，Advanced Drug Delivery Reviews 65，1357-1369)对蛋白接头进行了综述，该综述比较了柔性接头的类别与刚性及可剪切接头的类别。Klein等(2014，Protein Engineering Design and Selection，27(10)，325-330)；vanRosmalen等(2017，Biochemistry，56,6565-6574)；以及Chichili等(2013，ProteinScience，22，153-167)也对柔性接头进行了描述。
柔性接头是允许连接的结构域或成分之间有一定程度移动的接头。柔性接头一般由小的非极性氨基酸残基(例如，甘氨酸)或极性氨基酸残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)组成。氨基酸的小尺寸提供了灵活性，并且允许连接部分(结构域或成分)的活动性。极性氨基酸的掺入可以通过与水分子形成氢键来维持接头在水相环境中的稳定性。
最常用的柔性接头具有主要由丝氨酸残基和甘氨酸残基组成的序列(所谓的“GS接头”)。然而，许多其他柔性接头也被描述过(例如，参见Chen等，2013，上文)，这些接头可以包含额外的氨基酸，比如苏氨酸和/或丙氨酸，和/或可以提高溶解度的赖氨酸和/或谷氨酸。可以使用本领域中已知和报告过的任何柔性接头。
使用GS接头或者更具体地在接头中使用GS(“甘氨酸-丝氨酸”)结构域可以允许通过改变GS结构域重复的数量来容易地改变接头的长度，因此，这样的接头代表一类适合选的接头。然而，柔性接头不限于基于“GS”重复的接头，并且已报导过(包括在Chen等，上文)分散在整个接头序列中的包含丝氨酸残基和甘氨酸残基的其他接头。
在一个实施方案中，所述接头序列包含至少一个仅由丝氨酸残基和甘氨酸残基组成的甘氨酸-丝氨酸结构域。在这样的实施方案中，所述接头序列可以包含不超过15个其他氨基酸残基，优选地不超过14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、6个、7个、5个或4个其他氨基酸残基。
甘氨酸-丝氨酸结构域可以具有下式：
(S)q-[(G)m-(S)m]n-(G)p
其中q是0或1；m是1到8之间的整数；n是至少为1的整数(例如1-8或更具体地1-6)；p是0或者1到3之间的整数。
更具体地，甘氨酸-丝氨酸结构域可以具有下式：
(i)S-[(G)m-S]n；
(ii)[(G)m-S]n；或
(iii)[(G)m-S]n-(G)p，
其中m是2到8(例如3到4)之间的整数；n是至少为1的整数(例如，1-8或更具体地1-6)；并且p是0或者1到3之间的整数。
在一个代表性实例中，甘氨酸-丝氨酸结构域可以具有下式：
S-[G-G-G-G-S]n
其中n是至少为1的整数(优选地1-8、或1-6、1-5、1-4、或1-3)。上式中，序列GGGGS是SEQ ID NO.63。
下面列出了代表性的示例性接头序列：
ETSGGGGSRL(SEQ ID NO.90)
SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO.91)
S(GGGGS)1-5(其中，GGGGS是SEQ ID NO.63)
在其他实施方案中，接头序列不是柔性接头序列。
在安全开关多肽中，接头L的功能是将R1连接到R2。接头可以直接连接R1和R2，即将R1的C末端连接到R2的N末端。因此，除接头序列L外，多肽在R1和R2之间可以不包含任何其他成分或序列。将会理解，由于多肽要表达在细胞表面上，并且由于R1连接到R2，所以R1和R2都要表达在细胞表面上，因此接头L不是可剪切接头。
虽然接头的长度并不是关键的，但在一些实施方案中，可能希望具有较短的接头序列。例如，接头序列的长度可以不超过25个氨基酸，优选地不超过24个、23个、22个或21个氨基酸。
在其他实施方案中，可能需要更长的接头序列，例如由GS结构域的多个重复组成或包含GS结构域的多个重复，和/或包含标记序列，比如上文所讨论的表位。
在一些实施方案中，接头的长度可以是2个、3个、4个、5个或6个氨基酸中的任何一个到24个、23个、22个或21个氨基酸中的任何一个。在其他实施方案中，接头的长度可以是2个、3个、4个、5个或6个氨基酸中的任何一个到21个、20个、19个、18个、17个、16个或15个氨基酸中的任何一个。在其他实施方案中，接头的长度可以在这些范围之间，例如6-21、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、8-18、9-18、10-18、9-17、10-17、9-16、10-16等。因此，接头的长度可以在由上文列出的任何整数组成的范围内。
安全开关多肽可以包含茎序列(St)，当多肽在靶细胞的表面表达时，使R表位从该靶细胞表面伸出。
茎序列使R表位与细胞表面保持足够距离，以促进例如利妥昔单抗或等效抗体的结合。茎序列从细胞表面提升表位。
茎序列可以是基本上线性的氨基酸序列。茎序列可以足够长，以拉开R表位与靶细胞表面的距离，但不能太长，以免茎序列的编码序列影响载体包装和转导效率。茎序列的长度可以例如在30个到100个氨基酸之间。
茎序列的长度可以约为40-50个氨基酸。茎序列可以被高度糖基化。
茎序列可以包括一个接头序列，该接头序列将茎序列联结或连接到上述式中的表位R2。
已知有许多各种不同的蛋白质，这些蛋白质在哺乳动物细胞的表面表达，并且可以用于提供本文的茎序列或用作其基础。这样的表面表达的蛋白质包含能够用作茎序列或能够衍生茎序列的天然序列。例如，这种蛋白质的胞外结构域(ECD)可以用作茎序列、或胞外结构域和跨膜(TM)结构域、或具有胞内结构域(ICD)的胞外结构域和跨膜结构域(ECD和TMD)，该胞内结构域可以用作细胞内锚以将茎保持在膜中并允许茎从细胞表面伸出。
这样的蛋白质包括CD27、CD28、CD3ε、CD3z、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD18、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、CD278、CD279、IgG1或IgG2。
因此，茎序列St可以包含将其连接到R2的任选接头序列、胞外结构域、任选跨膜结构域和任选胞内结构域。
在一个实施方案中，茎序列可以包含将其连接到R2的接头序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
茎序列或其胞外结构域可以包含以下序列或长度约等于以下序列：
PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO.59)，
该序列是CD8的胞外序列。
如上文提到的，茎序列可以另外包含跨膜结构域、任选地连同胞内结构域一起，这些结构域可以用作胞内锚定序列。跨膜结构域和胞内结构域可以衍生自与胞外结构域相同的蛋白质，或者它或它们可以衍生自不同的蛋白质。跨膜结构域和胞内结构域可以是可从CD8衍生的。
茎序列St可以包含胞外茎序列、跨膜结构域和衍生自CD8的胞内结构域。
包含跨膜结构域和胞内锚的CD8茎序列可以具有以下序列：
PAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ ID NO.60)，
或与其具有至少75％，特别地至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在这个序列中，下划线部分对应于胞外CD8a茎；中段部分对应于跨膜结构域；而粗体部分对应于胞内结构域。
茎序列中的接头序列可以是上文所描述的接头。特别地，该接头序列可以是包含或由丝氨酸(S)残基和/或甘氨酸(G)残基组成的接头序列。接头序列可以是基本线性的。在茎的情况下，接头序列可以是较短的序列。例如，接头序列可以具有以下通式：
S-(G)n-S
其中n是2至8之间的数字。
接头可以包含或由序列SGGGGS(SEQ ID NO.61)组成。
安全开关多肽的代表性示例性实施方案包括包含SEQ ID NO.46和/或SEQ IDNO.35的利妥昔单抗结合表位的多肽或者与其具有至少80％序列同一性的序列，该多肽经由接头连接到包含衍生自CD8的胞外序列、跨膜序列和胞内序列的茎序列。特别地，茎序列可以具有SEQ ID NO.60的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列。R1与R2之间的接头L可以是上文所讨论的接头中的任何一个。例如，该接头可以是如上文所描述的柔性接头，也可以是包含如上文所讨论的QBEnd表位的接头。在一个实施方案中，该接头可以具有以下序列：
SGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTA(SEQ ID NO.63)，
或与其具有至少80％序列同一性的序列。表位Q在上面的序列中用粗体表示，而侧翼序列分别代表间隔子S1和S2。茎序列可以包含连接到R2的接头序列。茎中的接头序列可以是SGGGS(SEQ ID NO.62)。
因此，安全开关多肽可以包含或由以下序列组成：SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或与其具有至少75％，特别地至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98或99％序列同一性的序列。
在其他实施方案中，安全开关多肽可以包含或由以下序列组成：SEQ ID NO.92或SEQ ID NO.93所示的氨基酸序列，或与其具有至少75％，特别地至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98或99％序列同一性的序列。
ACPYSNPSLCETSGGGGSRLCPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ ID NO.92)
ACPYSNPSLCSGGGGSGGGGSGGGGSCPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ ID NO.93)
SEQ ID NO.92和93各自分别包含经由SEQ ID NO.90或91的接头分别连接到SEQIDNO.46的利妥昔单抗结合表位的SEQ ID NO.35的利妥昔单抗结合表位。
多肽还可以包含氨基末端的信号肽(也称为前导序列)或与氨基末端的信号肽一起表达。本领域已知并报导了许多不同的信号序列，而选择信号肽将成为常规事项。信号肽可以例如包含或由SEQ ID NO.65所示的序列(MGTSLLCWMALCLLGADHAD)组成。
包含这种信号肽和SEQ ID NO.1的氨基酸序列的多肽由SEQ ID NO.10表示。包含这种信号肽和SEQ ID NO.92的氨基酸序列的多肽由SEQ ID NO.94表示。包含这种信号肽和SEQ ID NO.93的氨基酸序列的多肽由SEQ ID NO.95表示。
当多肽由靶细胞(即引入核酸分子的细胞，该核酸分子包含编码引入的多肽的核苷酸序列)表达，多肽在细胞中被加工以易位到细胞表面，并且信号肽被剪切，从而产生成熟的安全开关多肽产物。
安全开关多肽可以包含或由SEQ ID NO.1、92或93所示序列的变体组成，该变体与SEQ ID NO.1、92或93所示序列具有至少75％(例如，至少80％或90％)的同一性，只要该变体保留了SEQ ID NO.1、92或93多肽的功能活性。例如，变体序列应当(i)结合利妥昔单抗和(ii)当在细胞的表面表达时，在利妥昔单抗存在下诱导细胞杀伤。进一步地，在SEQ IDNO.1的变体的情况下，该变体序列应当与抗体QBEnd10结合。
序列同一性比较可以通过肉眼或借助现成的序列比较程序(比如GCG WisconsinBestfit软件包)进行。
在一个实施方案中，安全开关多肽仅由上文所列的和所描述的元件R1、L、R2和St组成。然而，在其他实施方案中，该多肽可以另外包含其他序列或结构域。例如，如果接头L不包含标记序列，或者如果需要一个以上的标记，则可以在其他地方包含单独的标记序列，例如标记序列可以包含在茎序列中，或者可以在茎与R2之间引入。
PCT/EP2021/064053中描述了安全开关多肽，其内容通过引用并入本文。该文献中描述的任何安全开关多肽均可以用于本文。
核酸分子被设计为通过将编码FOXP3的核苷酸序列(第二核苷酸序列)引入到细胞中来增加FOXP3在细胞(例如，Treg)中的表达，术语FOXP3与术语“FOXP3多肽”同义。因此，核酸分子以及含有该核酸分子的构建体和载体提供了一种在细胞中(例如，Treg或CD4+细胞中)增加FOXP3的手段。进一步地，如先前所描述的，本发明核酸分子内编码安全开关、FOXP3和CAR的核苷酸序列的顺序另外还使来自核酸分子的细胞内的FOXP3的表达增强。因此，本发明的核酸分子提供了FOXP3(以及安全开关和CAR)的表达，并因此使FOXP3在细胞内的表达水平增加，但核苷酸序列的顺序进一步使FOXP3的表达比其他核酸分子增强，这些其他核酸分子编码相同的三种多肽产物但来自在核酸分子内呈现出不同顺序的核苷酸序列。因此，在本发明核酸分子内编码安全开关、FOXP3和CAR的核苷酸序列的顺序使FOXP3在引入了核酸分子的细胞内的表达水平得到最优增长。
“FOXP3”是叉头框蛋白P3的缩写名称。FOXP3是FOX蛋白转录因子家族的成员，并且在调节性T细胞的发育和功能中作为调节途径的主调节因子起作用。本文所使用的“FOXP3”涵盖FOXP3的变体、同种型和功能片段。
“增加FOXP3表达”意指与未通过引入核酸分子、构建体或载体修饰的相应细胞(或细胞群)相比，增加了FOXP3 mRNA和/或蛋白质在细胞(或细胞群)中的水平。例如，FOXP3mRNA和/或蛋白质在根据本发明修饰的细胞(或这样的细胞群)中的水平可以增加到比在未根据本发明修饰的相应细胞((或这样的细胞群)中的水平高至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍。优选地，细胞是Treg，或细胞群是Treg群。合适地，FOXP3 mRNA和/或蛋白质在经修饰的细胞(或这样的细胞群)中的水平可以增加到比未进行这样修饰的相应细胞(或这样的细胞群)中的水平高至少1.5倍、至少2倍或至少5倍。优选地，细胞是Treg，或细胞群是Treg群。
“增强来自核酸分子(或替代性地看，增加或改善)的FOXP3表达”意指与通过引入包含以下的核酸分子、构建体或载体修饰的相应细胞(或细胞群)相比，增加了FOXP3 mRNA和/或蛋白质在包含核酸分子(外源性核酸分子)(或构建体或载体)(即本发明的核酸分子)的细胞(或细胞群)(例如，Treg或CD45RA+Treg)中的水平：
(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列；
(ii)编码FOXP3的核苷酸序列；以及
(iii)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，其中，(i)、(ii)和(iii)不按(i)、(ii)、(iii)的顺序从5’到3’定位。
如先前所讨论的，来自核酸分子的增强、增加或改善的FOXP3的表达与在核酸分子内对安全开关多肽、FOXP3和CAR编码的核苷酸序列的顺序有关，因此，与包含其中核苷酸序列以不同的顺序在核酸分子内排列的核酸分子的相同细胞类型相比，包含本发明的核酸分子的细胞的FOXP3 mRNA和/或蛋白质水平增强。
特别地，被引入到比较的相应细胞中的核酸、构建体或载体可以从5’至3’包含：
1)(ii)编码FOXP3的核苷酸序列、(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列以及(iii)编码CAR的核苷酸序列
2)(ii)编码FOXP3的核苷酸序列、(iii)编码CAR的核苷酸序列以及(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列
3)(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列、(iii)编码CAR的核苷酸序列以及ii)编码FOXP3的核苷酸序列
4)(iii)编码CAR的核苷酸序列、(ii)编码FOXP3的核苷酸序列以及(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列
5)(iii)编码CAR的核苷酸序列、(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列以及(ii)编码FOXP3的核苷酸序列。
特别地，被引入到比较的相应细胞中的核酸分子、构建体或载体可以与被引入到本发明细胞中的核酸分子、构建体或载体一样编码相同的安全开关、FOXP3和CAR多肽。
例如，FOXP3 mRNA和/或蛋白质在根据本发明修饰的细胞(或这样的细胞群)中的水平可以增加到比在通过引入包含以下的核酸分子、构建体或载体修饰的相应细胞(或这样的细胞群)中的水平高至少1.5倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍：
(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列；
(ii)编码FOXP3的核苷酸序列；以及
(iii)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，其中，(i)、(ii)和(iii)不按(i)、(ii)、(iii)的顺序从5’到3’进行定位。优选地，细胞是Treg，或细胞群是Treg群。合适地，FOXP3 mRNA和/或蛋白质在经修饰的细胞(或这样的细胞群)中的水平可以增加到比在通过引入包含以下的核酸分子、构建体或载体修饰的相应细胞(或这类细胞的群)中的水平高至少1.5倍、至少2倍或至少5倍：
(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列；
(ii)编码FOXP3的核苷酸序列；以及
(iii)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，其中，(i)、(ii)和(iii)不按(i)、(ii)、(iii)的顺序从5’到3’进行定位。优选地，细胞是Treg，或细胞群是Treg群。
用于测量特定的mRNA和蛋白质的水平的技术是本领域公知的。细胞群(比如Treg)中的mRNA水平可以通过比如Affymetrix ebioscience prime flow RNA检测、Northern印迹、基因表达系列分析(SAGE)或定量聚合酶链式反应(qPCR)等技术来测量。细胞群中的蛋白质水平可以通过比如流式细胞术、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱(LC/MS)、Western印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)等技术来测量。
“FOXP3多肽”是具有FOXP3活性的多肽，即能够与FOXP3靶DNA结合并作为调节Treg发育和功能的转录因子起作用的多肽。特别地，FOXP3多肽可以具有与野生型FOXP3(SEQ IDNO.2)相同或相似的活性，例如，可以具有野生型FOXP3多肽至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％的活性。因此，与野生型FOXP3相比，由本文所描述的核酸、构建体或载体中的第二核苷酸序列编码的FOXP3多肽的活性可以增加或减少。用于测量转录因子活性的技术是本领域公知的。例如，转录因子DNA结合活性可以通过ChIP来测量。转录因子的转录调节活性可以通过量化其调控的基因的表达水平来测量。基因表达可以通过使用比如Northern印迹、SAGE、qPCR、HPLC、LC/MS、Western印迹或ELISA等技术测量该基因产生的mRNA和/或蛋白质的水平来进行量化。由FOXP3调控的基因包括细胞因子，比如IL-2、IL-4和IFN-γ(Siegler等，Annu.Rev.Immunol.2006,24:209-26，其通过引用并入本文)。如下文详细讨论的，FOXP3或FOXP3多肽包括其(例如SEQ IDNO.2的)功能片段、变体和同种型。
“FOXP3的功能片段”可以指对具有与全长FOXP3蛋白或多核苷酸相同或相似活性的FOXP3多肽进行编码的FOXP3多肽或多核苷酸(即核苷酸序列)的部分或区域。功能片段可以具有全长FOXP3多肽或多核苷酸至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的活性。本领域技术人员将能够基于FOXP3的已知结构和功能特征生成功能片段。这些在例如Song,X.等,2012.Cell reports,1(6),第665-675页；Lopes,J.E.等,2006.The Journal of Immunology,177(5),第3133-3142页；以及Lozano,T.等，2013.Frontiers in oncology,3,第294页中有描述。进一步地，在WO2019/241549(通过引用并入本文)中描述了N和C末端截短的FOXP3片段，例如，具有如下所讨论的序列SEQ IDNO.6。
“FOXP3变体”可以包括氨基酸序列或核苷酸序列，该氨基酸序列或核苷酸序列可以与FOXP3多肽或编码FOXP3多肽的多核苷酸(例如，与SEQ ID NO.2)至少50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％，优选地至少95％、至少97％或至少99％相同。FOXP3变体可以具有与野生型FOXP3多肽或多核苷酸相同或相似的活性，例如，可以具有野生型FOXP3多肽或多核苷酸至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％的活性。本领域技术人员将能够基于FOXP3的已知结构和功能特征和/或使用保守取代生成FOXP3变体。与野生型FOXP3相比，FOXP3变体在Treg细胞内的周转时间(或降解速率)可以相似或相同，例如是野生型FOXP3在Treg中周转时间(或降解速率)的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。与野生型FOXP3相比，一些FOXP3变体的周转时间(或降解速率)可以减少，例如，在SEQ ID NO.2第418位和/或第422位氨基酸进行氨基酸取代的FOXP3变体，例如，如WO2019/241549(通过引用并入本文)中所描述并在SEQ ID NO.3至5中示出的S418E和/或S422A，其分别代表aa418突变体、aa422突变体、以及aa418和aa422突变体。
合适地，由本文所描述的核酸分子、构建体或载体编码的FOXP3多肽可以包含或由人FOXP3的多肽序列组成，比如UniProtKB登录号Q9BZS1(SEQ ID NO.2)或者其功能片段或变体。
在本发明的一些实施方案中，FOXP3多肽包含或由与SEQ ID NO.2至少70％相同的氨基酸序列或其功能片段组成。合适地，FOXP3多肽包含或由与SEQ ID NO.2至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列或其功能片段组成。在一些实施方案中，FOXP3多肽包含或由SEQ ID NO.2或其功能片段组成。
在一些实施方案中，如上文所讨论的，FOXP3多肽可以包含SEQ ID NO.2的第418位和/或第422位残基的突变，如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。
在本发明的一些实施方案中，FOXP3多肽可以在N和/或C末端被截短，从而产生功能片段。特别地，FOXP3的N和C末端截短的功能片段可以包含或由SEQ ID NO.6的氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的其功能变体组成。
合适地，FOXP3多肽可以是SEQ ID NO.2的变体，例如天然变体。合适地，FOXP3多肽是SEQ ID NO.2的同种型。例如，FOXP3多肽可以相对于SEQ ID NO.2缺失第72至106位的氨基酸。替代性地，FOXP3多肽可以相对于SEQ ID NO.2缺失第246至272位的氨基酸。
合适地，FOXP3多肽包含SEQ ID NO.7或其功能片段。SEQ ID NO.7代表一种说明性的FOXP3多肽。
合适地，FOXP3多肽包含或由与SEQ ID NO.7至少70％相同的氨基酸序列或其功能片段组成。合适地，FOXP3多肽包含与SEQ ID NO.7至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列或其功能片段。在一些实施方案中，FOXP3多肽包含或由SEQ ID NO.7或其功能片段组成。
合适地，FOXP3多肽可以是SEQ ID NO.7的变体，例如天然变体。合适地，FOXP3多肽是SEQ ID NO.7的同种型或其功能片段。例如，FOXP3多肽可以相对于SEQ ID NO.7缺失第72至106位的氨基酸。替代性地，FOXP3多肽可以相对于SEQ ID NO.7缺失第246至272位的氨基酸。
合适地，编码FOXP3多肽的多核苷酸包含或由SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列组成，该核苷酸序列代表说明性FOXP3核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与SEQ IDNO.8至少70％相同的核苷酸序列或其编码功能性FOXP3多肽的片段。合适地，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与SEQ ID NO.8至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的核苷酸序列或其编码功能性FOXP3多肽的片段。在本发明的一些实施方案中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含或由SEQ ID NO.8或其编码功能性FOXP3多肽的片段组成。
合适地，编码FOXP3多肽的多核苷酸包含或由SEQ ID NO.9所示的多核苷酸序列组成，该多核苷酸序列代表另一说明性FOXP3核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与SEQ IDNO.9至少70％相同的核苷酸序列或其编码功能性FOXP3多肽的片段。合适地，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含与SEQ ID NO.9至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列或其编码功能性FOXP3多肽的片段。在本发明的一些实施方案中，编码FOXP3多肽或变体的多核苷酸包含或由SEQ ID NO.9或其编码功能性FOXP3多肽的片段组成。
合适地，编码FOXP3多肽或其功能片段或变体的多核苷酸可以进行密码子优化。合适地，编码FOXP3多肽或其功能片段或变体的多核苷酸可以进行密码子优化，以在人细胞中表达。
由第三核苷酸序列编码的第三组分是CAR。本文中所使用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指能够赋予细胞(例如，Treg)抗原特异性的工程化受体。CAR也被称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。CAR典型地包含胞外结构域、跨膜结构域、胞内域和细胞内信号转导结构域，该胞外结构域包含在本文中被称为抗原结合结构域的抗原特异性靶向区域，该胞内域任选地包含一个或多个共刺激结构域。抗原结合结构域典型地通过铰链结构域连接到跨膜结构域。CAR的设计及其可能包含的各种结构域在本领域中是公知的。
当CAR与其靶抗原结合时，这将使激活信号传递到该靶抗原在其中表达的细胞。因此，CAR将工程化细胞的特异性导向靶抗原，特别地导向表达该靶抗原的细胞。
CAR的抗原结合结构域可以从与所需靶抗原或更通常地与所需靶分子结合(即具有亲和力)的任何蛋白质或多肽中衍生或获得。这可以是例如配体或受体、或靶分子的生理结合蛋白或其部分、或合成蛋白或衍生蛋白。靶分子通常可以在细胞表面表达，例如靶细胞或靶细胞附近的细胞(用于旁观者效应)，但不是必须的。根据抗原结合结构域的性质和特异性，CAR可以识别可溶性分子，例如在抗原结合结构域基于或衍生自细胞受体时。
抗原结合结构域最常衍生自抗体可变链(例如，其通常采用scFv的形式)，但也可以由T细胞受体可变结构域或如上所提到的其他分子(比如配体或其他结合分子的受体)产生。
CAR典型地被表达为多肽，该多肽还包含信号序列(也称为前导序列)，特别是将CAR靶向到细胞质膜的信号序列。这通常位于抗原结合结构域旁边或附近，一般在抗原结合结构域的上游。因此，CAR的胞外结构域或胞外域可以包含信号序列和抗原结合结构域。
抗原结合结构域为CAR提供了结合预定目标抗原的能力。抗原结合结构域优选地靶向临床目标抗原或疾病部位的抗原。
如上所述，抗原结合结构域可以是具有特异性识别和结合生物分子(例如，细胞表面受体或其组分)的能力的任何蛋白质或肽。抗原结合结构域包括目标生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合配偶体。说明性抗原特异性靶向结构域包括抗体或抗体片段或衍生物、受体的胞外结构域、细胞表面分子/受体的配体或其受体结合结构域、以及肿瘤结合蛋白。尽管如下面所讨论的，抗原特异性靶向结构域可以优选为抗体或衍生自抗体，但也涵盖其他抗原特异性靶向结构域，例如由抗原肽/MHC或HLA组合形成的抗原特异性靶向结构域，其能够与在移植、炎症或疾病部位有活性的Tcon细胞的TCR结合。
在一个实施方案中，抗原结合结构域是或衍生自抗体。抗体衍生的结合结构域可以是抗体的片段或抗体的一个或多个片段的基因工程产物，该片段参与与抗原的结合。实例包括可变区(Fv)、互补决定区(CDR)、Fab或F(ab’)2，或者轻链和重链可变区可以以单链(例如，作为ScFv)和以任意取向(例如，VL-VH或VH-VL)连接在一起。VL和/或VH序列可以被修饰。特别地，框架区可以被修饰(例如取代，例如使抗原结合结构域人源化)。其他实例包括重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、骆驼科抗体(VHH)和单域抗体(sAb)。
在一个优选的实施方案中，结合结构域为单链抗体(scFv)。scFv可以是鼠、人或人源化的scFv。
关于抗体或其抗原结合片段的“互补决定区”或“CDR”是指抗体的重链或轻链可变区中的高度可变环区。CDR可以与抗原构象相互作用，并在很大程度上决定与抗原的结合(尽管已知一些框架区参与结合)。重链可变区和轻链可变区各自含有3个CDR。“重链可变区”或“VH”是指抗体的重链的片段，该重链片段包含插入在被称为框架区的侧翼序列之间的三个CDR，该框架区比CDR更高度保守，并形成支持CDR的支架。“轻链可变区”或“VL”是指抗体的轻链的片段，该片段包含插入在框架区之间的三个CDR。
“Fv”是指带有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由结合到单个重链可变区的单个轻链可变区组成。“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区和重链可变区以任意取向直接或经由肽接头序列彼此连接组成的工程化抗体。
特异性结合预定抗原的抗体可以使用本领域公知的方法制备。这样的方法包括噬菌体展示、生成人抗体或人源化抗体的方法、或使用工程化以产生人抗体的转基因动物或植物的方法。部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库是可用的，并且可以筛选出能够与靶分子结合的抗体或其片段。人抗体的噬菌体展示文库也是可用的。一旦被识别出，就可以分离和/或确定抗体的氨基酸序列或编码该抗体的多核苷酸序列。
CAR可以针对任何所需的靶抗原或靶分子。这可以根据预期治疗和所需治疗的病症进行选择。例如，抗原或分子可以是与特定病症相关的抗原或分子，也可以是与治疗病症所需靶向的细胞相关的抗原或分子。典型地，该抗原或分子是细胞表面抗原或分子。
术语“针对”与“特异于”或“抗”同义。换言之，CAR识别靶分子。因此，这意味着CAR能够与指定或给定的抗原或靶标特异性结合。特别地，CAR的抗原结合结构域能够与靶分子或抗原特异性结合(尤其是当CAR在细胞表面，特别是免疫效应细胞表面表达时)。特异性结合可以区别于与非靶分子或抗原的非特异性结合。因此，表达CAR的细胞被定向或重定向，以特异性结合到表达靶分子或抗原的靶细胞，特别是在其细胞表面表达靶抗原或分子的靶细胞。
可以由本发明的CAR靶向的抗原包括但不限于在与移植的器官、自身免疫性疾病、过敏性疾病和炎症性疾病(例如神经退行性疾病)相关的细胞上表达的抗原。技术人员将理解，当被工程化以表达核酸分子的细胞是Treg细胞或其前体时，由于Treg细胞的旁观者效应，抗原可以简单地在移植、炎症或疾病部位存在和/或表达。
在与神经退行性疾病相关的细胞上表达的抗原包括在神经胶质细胞上表达的抗原，例如MOG。
与器官移植相关的抗原和/或与移植的器官相关的细胞包括但不限于存在于移植的器官中但不存在于患者中的HLA抗原、或在移植排斥反应期间表达上调的抗原，比如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11。
在一个实施方案中，CAR针对HLA抗原，特别是HLA-A2抗原。
在一个实施方案中，CAR不针对MHC II。
抗这样的抗原的抗体是本领域已知的，并且scFv可以基于已知或可用的抗体方便地获得或生成。就这点而言，VH和VL以及CDR序列可公开获得以帮助制备这种抗体结合结构域，例如在WO 2020/044055中，其公开通过引用并入本文。WO 2020/044055中公开的任何抗原结合结构域或CDR、VH和/或VL均可以使用。
举例来说，CAR可以包含能够结合HLA-A2(HLA-A2在本文中也可称为HLA-A*02、HLA-A02和HLA-A*2)的抗原结合结构域。HLA-A*02是HLA-A基因座上一个特殊的I类主要组织相容性复合体(MHC)等位基因组。
抗原识别结构域可以结合、合适地特异性结合HLA-A2内的一个或多个区域或表位。表位也称为抗原决定簇，是由抗原识别结构域(例如，抗体)识别的抗原部分。换言之，表位是与抗体结合的抗原的特定片段。合适地，抗原识别结构域结合、合适地特异性结合到HLA-A2内的一个区域或表位。
抗原识别结构域可以包含至少一个CDR(例如，CDR3)，其可以从与例如HLA-A2的抗原结合的抗体进行预测(或这种预测的CDR的变体(例如，具有一个、两个或三个氨基酸取代的变体))。会理解，含有三个或更少CDR区(例如，单个CDR或甚至其部分)的分子可能能够保留衍生CDR的抗体的抗原结合活性。含有两个CDR区的分子在本领域中被描述为能够与靶抗原结合，例如以微抗体的形式(Vaughan和Sollazzo,2001,Combinational Chemistry&HighThroughput Screening,4,417-430)。已经描述了含单个CDR的分子，其能够显示出对靶标的强结合活性(Nicaise等,2004,Protein Science,13:1882-91)。
在这方面，抗原结合结构域可以包含一个或多个可变重链CDR，例如一个、两个或三个可变重链CDR。替代性地或另外地，抗原结合结构域可以包含一个或多个可变轻链CDR，例如一个、两个或三个可变轻链CDR。抗原结合结构域可以包含三个重链CDR和/或三个轻链CDR(更具体地，包含三个CDR的重链可变区和/或包含三个CDR的轻链可变区)，其中，至少一个CDR、优选所有CDR可以来自与抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体，或者可以选自WO 2020/044055中公开的CDR序列中的一个。
抗原结合结构域可以包含可变重链CDR和可变轻链CDR的任意组合，例如一个可变重链CDR与一个可变轻链CDR、两个可变重链CDR与一个可变轻链CDR、两个可变重链CDR与两个可变轻链CDR、三个可变重链CDR与一个或两个可变轻链CDR、一个可变重链CDR与两个或三个可变轻链CDR、或者三个可变重链CDR与三个可变轻链CDR。优选地，抗原结合结构域包含三个可变重链CDR(CDR1、CDR2和CDR3)和/或三个可变轻链CDR(CDR1、CDR3和CDR2)。
抗原结合结构域内存在的一个或多个CDR可以不都来自同一抗体，只要该结构域具有所需的结合活性。因此，一个CDR可以从与抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体的重链或轻链进行预测，而另一个存在的CDR可以从与相同抗原(例如，HLA-A2)结合的不同抗体进行预测。在这种情况下，可能优选从与抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体对CDR3进行预测。然而，特别地，如果抗原结合结构域中存在多于一个的CDR，则优选从与相同抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体对CDR进行预测。CDR的组合可以来自不同的抗体，特别是来自与相同所需区域或所需表位结合的抗体。
在一个特别优选的实施方案中，抗原结合结构域包含从与抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体的可变重链序列预测的三个CDR和/或从与抗原(例如，HLA-A2)结合的抗体(优选相同的抗体)的可变轻链序列预测的三个CDR。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含分别如SEQ ID NO.11、12和13所示的VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3序列以及分别如SEQ ID NO.14、15和16所示的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列，或者CDR可以含有SEQ ID NO.11、12、13、14、15或16中任何一个或多个所示的CDR序列的1至3个，或更特别地1个或2个氨基酸序列的修饰。
更具体地，在这样的实施方案中，CAR的抗原结合结构域包含：VH结构域，该VH结构域包含SEQ ID NO.17所示的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列，以及VL结构域，该VL结构域包含SEQ ID NO.18所示的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含分别如SEQ ID NO.20、21和22所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO.23、24和25所示的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3序列，或者CDR可以含有SEQ ID NO.20、21、22、23、24或25中任何一个或多个中所示的CDR序列的1至3个，或更特别地1个或2个氨基酸序列的修饰。
如果CDR确实含有氨基酸序列修饰，则这可能是上述SEQ ID NO中所示的CDR序列的氨基酸残基的缺失、添加或取代。更具体地，修饰可以是氨基酸取代，例如保守氨基酸取代，例如，如上文所示。较长的CDR可以耐受更多的氨基酸残基修饰。在长度为5个或7个氨基酸残基的CDR的情况下，修饰可以是或对1或2个残基的修饰，例如1个残基。通常，对任何特定的CDR序列可能有0个、1个、2个或3个修饰。进一步地，在一个实施方案中，CDR1和CDR2可以被修饰，而CDR3可以不修饰。在另一个实施方案中，所有3个CDR都可以被修饰。在另一个实施方案中，CDR不被修饰。
更具体地，在这样的实施方案中，CAR的抗原结合结构域包含：VH结构域，该VH结构域包含如SEQ ID NO.26所示的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列，以及VL结构域，该VL结构域包含如SEQ ID NO.27所示的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。
抗原结合结构域可以是scFV的形式，scFV包含如上所示的任意顺序(例如，VH-VL)的VH结构域序列和VL结构域序列。VH序列和VL序列可以通过接头序列连接。
合适的接头能够容易地选择并且可以是任何合适的长度，比如从1个氨基酸(例如Gly)到30个氨基酸，例如从2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一个到12个、15个、18个、20个、21个、25个、30个氨基酸中的任何一个，例如5至30、5至25、6至25、10至15、12至25、15至20等。
接头可以是例如上文所讨论的与安全开关多肽相关的接头。示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)、甘氨酸-丝氨酸聚合物(其中，n是至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和如上文所讨论的本领域已知的其他柔性接头。如上文所讨论的，接头可以包含1个或多个“GS”结构域。
因此，在一个实施方案中，抗原结合结构域可以包含或由SEQ ID NO.19所示的序列组成，该序列包含经由序列(X)n的接头与SEQ ID NO.18的VL序列连接的SEQ ID NO.17的VH序列，其中，X是任意氨基酸，并且n是15至25之间的整数。在一个特定的实施方案中，抗原结合结构域包含或由SEQ ID NO.88所示的序列组成，该序列对应于SEQ IDNO.19的序列，其中，接头具有SEQ ID NO.89的序列(LVTVSSGGGGSGGGGSGGGGST)。抗原结合结构域可以包含或由SEQ ID NO.19或88的变体的序列组成，该变体与其具有至少70％的序列同一性。
在另一个实施方案中，抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO.28所示的序列或其变体，该变体与其具有至少70％序列同一性。
本文公开和描述的变体序列(包括变体VH、VL和抗原结合结构域序列)可以与指定的SEQ ID NO具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
CAR还优选包含铰链结构域和跨膜结构域，该铰链结构域支持细胞外结构域，特别是抗原结合结构域远离细胞表面。铰链结构域和跨膜结构域可以包含来自任何具有铰链结构域和/或跨膜结构域的蛋白质的铰链序列和跨膜序列，包括I型、II型或III型跨膜蛋白质中的任何一种。典型地，铰链可以衍生自CD8，特别是CD8α。
CAR的跨膜结构域也可以包含人工疏水序列。可以选择CAR的跨膜结构域，以便不发生二聚化。其他跨膜结构域对于本领域技术人员来说将是显而易见的。CAR构建体中使用的跨膜(TM)区的实例有:1)CD28 TM区(Pule等,Mol Ther,2005,11月；12(5):933-41；Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35；Casucci等,Blood,2013,11月14日；122(20):3461-72)；2)OX40 TM区(Pule等,Mol Ther,2005,11月；12(5):933-41)；3)41BB TM区(Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35)；4)CD3ζTM区(Pule等,Mol Ther,2005,11月；12(5):933-41；Savoldo B,Blood,2009,6月18日；113(25):6392-402)；5)CD8αTM区(Maher等,Nat Biotechnol,2002,1月；20(1):70-5.；Imai C,Leukemia,2004,4月；18(4):676-84；Brentjens等,CCR,2007,9月15日；13(18Pt 1):5426-35；Milone等,Mol Ther,2009,8月；17(8):1453-64.)。其他可以使用的跨膜结构域包括来自CD4、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86或CD154的跨膜结构域。
铰链结构域可以方便地从与跨膜结构域相同的蛋白质中获得，但这不是必需的。
举例来说，跨膜结构域可以衍生自CD28跨膜结构域，并且可以包含SEQ ID NO.73所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.73至少80％相同的变体。该变体可以与SEQ ID NO.73至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
替代性地，CAR可以包含衍生自CD8α跨膜结构域的结构域。因此，跨膜结构域可以包含如表示人CD8α的第183至203位氨基酸的SEQ ID NO.67所示的氨基酸序列、或与SEQ IDNO.67至少80％相同的变体。合适地，变体可以与SEQ ID NO.67至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
CD8α跨膜结构域可以与CD8α铰链结构域组合。在一个实施方案中，CAR包含如SEQID NO.68所示的组合的CD8α铰链和跨膜结构域序列、或与其具有至少80％序列同一性的变体。该变体可以与SEQ ID NO.68至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。SEQ IDNO.68包含经修饰的铰链结构域，该经修饰的铰链结构域包含相对于野生型CD8α铰链序列的半胱氨酸残基的2个氨基酸取代。经修饰的CD8α铰链结构域序列如SEQ ID NO.69所示。野生型CD8α铰链结构域序列如SEQ ID NO.70所示。可以使用与SEQ ID NO.69或70具有至少80％序列同一性的这样的铰链序列的变体。
可以使用的CD28铰链和跨膜序列的实例是SEQ ID NO.74或其变体，该变体与SEQIDNO.74至少80％相同。该变体可以与SEQ ID NO.74至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
进一步举例来说，CAR可以包含天然或修饰的CD8α铰链结构域和CD28跨膜结构域、或CD28铰链结构域和CD8α跨膜结构域，例如基于上文给出的序列。
可以使用的其他铰链结构域包括来自CD4、CD7、或免疫球蛋白或其部分或变体的铰链结构域。
CAR可以进一步地包含将其靶向到内质网途径以在细胞表面表达的信号(或者替代性地称为前导)序列。说明性信号/前导序列是如SEQ ID NO.66所示的MALPVTALLLPLALLLHAAAP。与SEQ ID NO.75所示的野生型CD8α序列MALPVTALLLPLALLLHAARP相比，这包含了单个氨基酸取代。可以使用序列或与其具有至少70％序列同一性的变体序列。
本文所描述的CAR的胞内域包含转导效应功能信号并引导表达CAR的细胞在抗原结合时执行其特定功能所必需的基序。特别地，胞内域可以包含一个或多个(例如两个或三个)免疫受体酪氨酸激活基序(ITAMs)，该免疫受体酪氨酸激活基序典型地包含YXXL/I的氨基酸序列，其中X可以是任何氨基酸。细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体的ζ链胞内域或其任何同源物(例如，η链、FcεR1γ和β链、MB1(Igα)链、B29(Igβ)链等)、CD3多肽结构域(Δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)、以及其他参与T细胞转导的分子，比如CD2、CD5和CD28。细胞内信号转导结构域可以包含人CD3ζ链胞内域、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾区、携带细胞质受体的免疫受体酪氨酸基激活基序((ITAM)或其组合。
通常，细胞内信号转导结构域包含人CD3ζ链的细胞内信号转导结构域。人CD3ζ链的细胞内信号转导结构域的序列如SEQ ID NO.76所示。包含相对于野生型缺失的氨基酸的经修饰的人CD3ζ细胞内结构域序列如SEQ ID NO.72所示。CAR可以包含CD3ζ信号转导结构域，该信号转导结构域包含或由SEQ ID NO.72或76所示的序列或与SEQ ID NO.72或76至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的序列组成。在一个实施方案中，信号转导结构域包含或由SEQ ID NO.72组成。
可以使用的其他信号转导结构域包括CD28或CD27或其变体的信号转导结构域。其他细胞内信号转导结构域对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且可以与本发明的替代实施方案结合使用。在一个实施方案中，本发明的CAR可以不包含衍生自胞内域内的41BB的共刺激结构域。
本发明的CAR可以包含复合胞内域，该复合胞内域包含T细胞共刺激分子的细胞内部分与例如CD3ζ的细胞内部分融合。这样的复合胞内域可以被称为第二代CAR，其可以在抗原识别后同时传递激活和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最有效的共刺激信号，即触发T细胞增殖的免疫信号2。CAR胞内域还可以包含一个或多个TNF受体家族信号转导结构域，比如OX40、4-1BB、ICOS或TNFRSF25的信号转导结构域，但优选CAR可以不包含含有CD28和41BB二者的信号转导结构域的胞内域。
可以用作共刺激结构域的CD28的细胞内信号转导结构域如SEQ ID NO.77所示。SEQ ID NO.71示出了一种在N末端包含另外2个氨基酸(WV)的变体CD28共刺激结构域，衍生自CD28的跨膜结构域。OX40、4-1BB、ICOS和TNFRSF25信号转导结构域的说明性序列分别如SEQ ID NO.79至81所示。CAR可以包含一个或多个共刺激结构域，该一个或多个共刺激结构域包含或由SEQ ID NO.71、77或79至81中任意一个中的序列或其变体组成，该变体与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，CAR包含共刺激结构域，该共刺激结构域包含或由SEQ IDNO.71组成。
在一个实施方案中，CAR包含人CD8铰链结构域或其变体和人CD8跨膜结构域。替代性地或另外地，CAR包含胞内域，该胞内域包含人CD28共刺激结构域和人CD3ζ信号转导结构域。
在一个优选的实施方案中，CAR包含铰链结构域、跨膜结构域和胞内结构域(或胞内域)，如下所示：
(i)CD8α铰链和跨膜结构域序列，该CD8α铰链和跨膜结构域序列包含或由SEQ IDNO.68所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(ii)CD28共刺激结构域，该CD28共刺激结构域包含或由SEQ ID NO.71所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(iii)CD3ζ信号转导结构域，该CD3ζ信号转导结构域包含或由SEQ ID NO.72所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成。
编码和表达的CAR可以进一步包含前导序列，该前导序列包含或由SEQ ID NO.66所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成。
CAR的抗原结合结构域可以包含或由SEQ ID NO.19、88或28所示的序列或能够与HLA-A2结合的与其具有至少80％序列同一性的序列组成。
因此，从总体上看，一个优选的代表性CAR可以包含：
(i)前导序列，该前导序列包含或由SEQ ID NO.66所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(ii)抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含或由SEQ ID NO.19或88所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(iv)CD8α铰链和跨膜结构域序列，该CD8α铰链和跨膜结构域序列包含或由SEQ IDNO.68所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(v)CD28共刺激结构域，该CD28共刺激结构域包含或由SEQ ID NO.71所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(vi)CD3ζ信号转导结构域，该CD3ζ信号转导结构域包含或由SEQ ID NO.72所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成。CAR应当能够与HLA-A2结合，并且能够将信号传导到表达该CAR的细胞中。
本文中CAR的胞内域可以包含其他结构域。例如，该胞内域可以包含结构域，该结构域包含STAT5关联基序、JAK1和/或JAK2结合基序以及任选的JAK3结合基序。在这样的实施方案中，胞内域可以包含来自细胞因子受体(例如，白细胞介素(IL)受体)的胞内域中的一个或多个序列。这样的CAR在WO 2020/044055(也通过引用并入本文)中进行了描述。包含这样的结构域赋予了CAR以抗原特异性方式向表达其的细胞提供生产性IL信号的能力，而无需施用外源性IL。例如，IL-2对Treg细胞的存活、增殖和持久性很重要，但IL2水平在需要治疗的患者中可能经常较低或受损。因此，CAR可以包含对应于IL受体或其变体(比如IL2受体)的β链胞内域的全部或部分，任选地与IL受体或其变体(例如，IL2受体)的γ链胞内域结合。
举例来说，CAR胞内域可以包含结构域，该结构域包含人IL-2受体β链序列或其变体，如下所示：
SEQ ID NO.84所示的序列，其代表人IL-2受体β链(NCBI REFSEQ:NP_000869.1)的第266至551位氨基酸，或与SEQ ID NO.84具有至少80％序列同一性的序列；或
SEQ ID NO.85所示的序列，其代表SEQ ID NO.84的截短型和序列修饰变体(取代Y510)，或与SEQ ID NO.85具有至少80％序列同一性的序列；或
SEQ ID NO.86所示的序列，其代表SEQ ID NO.84的截短型和序列修饰变体(取代Y510和Y392)，或与SEQ ID NO.86具有至少80％序列同一性的序列。
核酸分子可以在三种编码的多肽之间包含编码自剪切序列的核苷酸序列。特别地，该自剪切序列是自剪切肽。这样的序列在蛋白质生产期间自动剪切。可以使用的自剪切肽是本领域已知且描述的2A肽或类2A肽，例如Donnelly等，Journal of GeneralVirology，2001，82，1027-1041，其通过引用并入本文。如上所述，2A和类2A肽被认为会导致核糖体跳跃，并以剪切的形式使核糖体跳过2A肽末端与下游氨基酸序列之间的肽键形成。“剪切”发生在2A肽C末端的甘氨酸和脯氨酸残基之间，这意味着上游顺反子将在末端添加几个额外的残基，而下游顺反子将从脯氨酸开始。
合适的自剪切结构域包括分别如SEQ ID NO.29-32所示的P2A、T2A、E2A和F2A序列。这些序列可以经修饰以在2A肽的N末端包含氨基酸GSG。因此，作为可能的选择，还包括对应于SEQ ID NO.29-32但在其N末端具有GSG的序列。这种修饰的替代2A序列是本领域已知且报道过的。可以使用的替代的类2A序列如Donnelly等(上文)所示，例如TaV序列。
核酸分子中包含的自剪切序列可以相同或不同。在一个实施方案中，这些自剪切序列都是2A序列，特别是P2A和/或T2A序列。在一个实施方案中，安全开关多肽与FOXP3之间的自剪切序列是P2A序列，并且FOXP3与CAR之间的自剪切序列是T2A序列。
自剪切序列可以包括额外的切割位点，其可以被细胞中存在的常见酶切割。这可以有助于在翻译后实现2A序列的完全移除。这种额外切割位点可以例如包括Furin切割位点RXXR(SEQ ID NO.82)，例如RRKR(SEQ ID NO.83)。
在一个代表性的实施方案中，核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码安全开关多肽，安全开关多肽包含SEQ ID NO.10的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.29的序列的P2A剪切序列；
(iii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3多肽，FOXP3多肽包含SEQ IDNO.2的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列；
(iv)核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.30的序列的T2A剪切序列；以及
(vi)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码针对HLA-A2的CAR。
在这个实施方案中，CAR可以包含：
(a)前导序列，该前导序列包含或由SEQ ID NO.66所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(b)抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含或由SEQ ID NO.19或88所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(c)CD8α铰链和跨膜结构域序列，该CD8α铰链和跨膜结构域序列包含或由SEQIDNO.68所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(d)C28共刺激结构域，该C28共刺激结构域包含或由SEQ ID NO.71所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(e)CD3ζ信号转导结构域，该CD3ζ信号转导结构域包含或由SEQ ID NO.72所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成。
从以上描述清楚的是，除本文提到的特定多肽和核苷酸序列外，还涵盖变体或其衍生物和片段的使用。
在本文中可互换使用的与本发明的蛋白质或多肽相关的术语“衍生物”或“变体”包括对序列中的一个(或多个)氨基酸残基的取代、变异、修饰、置换、缺失和/或添加，前提是所得到的蛋白质或多肽保留了所需功能(例如，在衍生物或变体是抗原结合结构域的情况下，所需功能可以是抗原结合结构域结合其靶抗原的能力(例如，与HLA-A2结合的抗原结合结构域的变体保留了结合HLA-A2的能力))，其中，衍生物或变体是信号转导结构域，所需功能可以是该结构域发出信号(例如，激活或灭活下游分子)的能力，其中，该衍生物或变体是转录因子(例如，FOXP3)，所需功能可以是转录因子与靶DNA结合和/或诱导转录的能力，或者在衍生物或变体是安全开关多肽的情况下，所需功能可能是该多肽诱导细胞死亡(例如，在分子与其结合时)的能力。替代性地看，本文所指的变体或衍生物是功能变体或衍生物。例如，与对应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的功能。与对应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有类似或相同的功能水平，也可以具有增加的功能水平(例如，增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
典型地，可以进行氨基酸取代，例如取代1个、2个、3至10个或20个，前提是经修饰的序列保留了所需的活性或能力。氨基酸取代可以包括使用非天然存在的类似物。例如，与对应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的活性或能力。与对应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有类似或相同的活性或能力水平，也可以具有增加的活性或能力水平(例如，增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
蛋白质或肽也可能存在氨基酸残基的缺失、插入或取代，从而引起沉默变化并产生功能等同的蛋白质。只要保留了内源性功能，就可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
可以进行保守取代，例如根据上面的表2进行。
衍生物可以是同源物。本文中使用的术语“同源物”是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。
同源或变体序列可以包括与目标序列至少70％、75％、85％或90％相同、优选地至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。典型地，变体将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。虽然同源性也可以从相似性方面考虑(即具有类似化学性质/功能的氨基酸残基)，但在本文的上下文中，优选依据序列同一性来表达同源性。
同源性比较可以通过肉眼进行，或者更常见的是，借助现成的序列比较程序进行。这些市售的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的百分比同源性或同一性。
可以在连续序列上计算百分比同源性或序列同一性，即一个序列与另一个序列比对，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的对应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“无空位”比对。典型地，这样的无空位比对仅在相对较短的残基上进行。
尽管这是一种非常简单且一致的方法，但它没有考虑到，例如，在另一个相同的序列对中，插入或缺失一个核苷酸序列可能使后面的密码子失配，因此在进行全局比对时，可能导致百分比同源性大幅降低。因此，大多数序列比较方法都被设计为产生最佳比对，该最佳比对考虑了可能的插入和缺失，而不会过度罚分整体同源性分数。这是通过在序列比对中插入“空位”以尽量使局部同源性最大化来实现的。
然而，这些更复杂的方法将“空位罚分”分配给比对中出现的每个空位，因此，对于相同数量的相同的氨基酸，尽可能少空位的序列比对(反映了两个比较序列之间更高相关性)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。“仿射空位成本”典型地用于对空位的存在收取相对较高的成本，并对空位中的每一个后续的残基进行较小的罚分。这是最常用的空位计分系统。当然，高空位罚分将产生具有较少空位的优化比对。大多数比对程序都允许修改空位罚分。然而，当使用这种软件进行序列比较时，优选使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分为一个空位-12，并且每个延伸-4。
因此，考虑到空位罚分，计算最大百分比同源性/序列同一性首先需要产生最佳比对。进行这种比对的适合的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University ofWisconsin，美国；Devereux等(1984)Nucleic Acids Res.12：387)。可以执行序列比对的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(见Ausubel等(1999)同上，第18章)、FASTA(Atschul等(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比对工具套件。BLAST和FASTA都可用于离线和在线搜索(见Ausubel等(1999)同上，第7-58页至第7-60页)。然而，对于某些应用，优选使用GCG Bestfit程序。另一种被称为BLAST 2序列的工具也可用于比对蛋白质和核苷酸序列(见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174：247-50；FEMS Microbiol.Lett.(1999)177：187-8)。
虽然最终的百分比同源性能够用同一性来衡量，但比对过程本身典型地并不基于全或无配对比较。相反，通常使用缩比相似性分数矩阵，该矩阵基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配分数。这种矩阵的常用实例是BLOSUM62矩阵——BLAST程序套件的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供)(更多详细信息，请参阅用户手册)。对于某些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，比如BLOSUM62。适当地，在整个参考和/或查询序列中确定百分比同一性。一旦软件产生了最佳比对，就可以计算百分比同源性、优选地百分比序列同一性。软件典型地将此作为序列比较的一部分，并生成数值结果。
“片段”典型地是指具有目标功能(例如，功能性)或编码功能片段的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分(或部分)的氨基酸或核酸序列。
这样的变体、衍生物和片段可以使用比如定点突变的标准重组DNA技术进行制备。在要插入的情况下，可以制作编码插入片段的合成DNA以及对应于插入位点任一侧的天然存在的序列的5'和3'侧翼区。侧翼区将包含对应于天然存在的序列中的位点的方便的限制性位点，使得可以用合适的酶剪切序列，并且使合成的DNA连接到酶切位点上。然后，根据本发明表达DNA，以制作编码的蛋白。这些方法仅说明了本领域已知的用于操纵DNA序列的许多标准技术，也可以使用其他已知的技术。
本文所定义的核酸分子和多核苷酸/核酸序列可以包括DNA或RNA。其可以是单链或双链的。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子/多核苷酸可以对同一多肽进行编码。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响由本文所定义的核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达本发明多肽的任何特定宿主生物的密码子使用。
核酸分子/多核苷酸可以通过本领域中可用的任何方法进行修饰。可以进行这样的修饰，以增强本文所定义的核酸分子/多核苷酸的体内活性或寿命。
比如DNA核酸分子/多核苷酸/序列的核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列可以重组、合成或通过本领域技术人员可用的任何手段生产。也可以通过标准技术克隆。
较长的核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列通常将使用重组手段，例如使用聚合酶链式反应(PCR)克隆技术来生产。这将涉及在需要克隆的靶序列两侧制作一对引物(例如，约15至30个核苷酸)，使引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在引起所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如，通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。引物可以被设计为包含合适的限制性酶识别位点，使得扩增的DNA可以被克隆到合适的载体中。
本发明的核酸分子/多核苷酸可以进一步包含编码选择标记的核酸序列。合适的选择标记是本领域公知的，并且包括但不限于荧光蛋白，比如GFP。合适地，选择标记可以是荧光蛋白，例如GFP、YFP、RFP、tdTomato、dsRed或其变体。在一些实施方案中，荧光蛋白是GFP或GFP变体。编码选择标记的核酸序列可以与本文中的核酸分子结合以核酸构建体的形式提供。这种核酸构建体可以在载体中提供。
合适地，选择标记/报告子结构域可以是基于荧光素酶的报告子、PET报告子(例如，钠/碘同向转运体(NIS))或膜蛋白(例如，CD34、低亲和力神经生长因子受体(LNGFR))。
编码一种或多种选择标记的核酸序列可以通过一个或多个共表达位点与本发明的核酸分子分离和/或彼此分离，该一个或多个共表达位点能够将每个多肽表达为离散实体。合适的共表达位点是本领域中已知的，并且包括例如内部核糖体进入位点(IRES)和自剪切位点，比如本发明的核酸分子中所包含以及如上文所定义的位点。在一个实施方案中，这可以是2A剪切位点，如上文所讨论的。
使用选择标记是有利的，因为它允许使用常用方法(例如，流式细胞术)从起始细胞群中选择和分离其中已成功引入了本发明的核酸分子、构建体或载体(使得编码的安全开关多肽、FOXP3和CAR被表达)的细胞(例如，Treg)。
本发明中使用的核酸分子/多核苷酸可以是经密码子优化的。密码子优化先前已在WO 1999/41397和WO 2001/79518中进行了描述。不同的细胞在特定密码子的使用上是不同。这种密码子偏好性对应于细胞类型中特定tRNA的相对丰度的偏差。通过改变序列中的密码子使其与相应tRNA的相对丰度相匹配可能会使表达增加。同样地，通过有意地选择已知相应tRNA在特定细胞类型中罕见的密码子来减少表达。因此，可获得额外程度的翻译控制。
第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可以在其可操作地连接到同一启动子的构建体中提供。“启动子”是使基因转录起始的DNA区域。启动子位于基因转录起始位点附近、DNA上游(朝向正义链的5'区)。可以使用任何合适的启动子，其选择可以由技术人员容易地进行。启动子可以来自任何来源，并且可以是病毒启动子或真核生物启动子，包括哺乳动物或人类启动子(即生理启动子)。在一个实施方案中，启动子是病毒启动子。特定启动子包括LTR启动子、EFS(或其功能性截短体)、SFFV、PGK和CMV。在一个实施方案中，启动子是SFFV或病毒LTR启动子。特别地，SFFV启动子可以在本发明的核酸分子、构建体或载体内使用，以允许起始转录(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列；
(ii)编码FOXP3的核苷酸序列；以及
(iii)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列。因此，替代性地看，(i)编码包含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列；
(ii)编码FOXP3的核苷酸序列；以及
(iii)编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列，可以可操作地连接到SFFV启动子。SFFV启动子可以包含SEQ ID NO.87所示的核苷酸序列。“可操作地连接到同一启动子”是指多核苷酸序列的转录可以从同一启动子起始(例如，第一多核苷酸序列、第二多核苷酸序列和第三多核苷酸序列从同一启动子起始转录)，并且核苷酸序列被定位和取向使得从启动子起始转录。与启动子可操作连接的多核苷酸受启动子的转录调节。
载体是一种允许或促进实体从一个环境转运到另一个环境的工具。如本文所使用的并且作为例子，在重组核酸技术中使用的一些载体允许比如核酸片段(例如，异源DNA片段，比如异源cDNA片段)的实体被转运到靶细胞中。载体可以是非病毒载体或病毒载体。在重组核酸技术中使用的载体的实例包括但不限于质粒、mRNA分子(例如，体外转录的mRNA)、染色体、人工染色体和病毒。载体也可以是例如裸核酸(例如，DNA)。在其最简单的形式中，载体本身可以是目标核苷酸。
本文所使用的载体可以是例如质粒、mRNA或病毒载体，并且可以包括用于表达核酸分子/多核苷酸的启动子(如上文所描述的)以及任选地启动子的调节子。
在一个实施方案中，载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体或γ逆转录病毒载体)。
载体可以进一步包含其他启动子，例如，在一个实施方案中，启动子可以是LTR，例如逆转录病毒LTR或慢病毒LTR。长末端重复序列(LTR)是在逆转录转座子或逆转录病毒RNA逆转录形成的前病毒DNA的两端发现的重复数百或数千次的相同DNA序列。这些序列被病毒用来将其遗传物质插入到宿主基因组中。基因表达的信号在LTR中被发现：增强子、启动子(可以具有转录增强子或调控元件)、转录起始(如加帽)、转录终止子和多腺苷酸化信号。
合适地，载体可以包括5’LTR和3’LTR。
载体可以包含一个或多个附加的调控序列，该一个或多个附加的调控序列可以在转录前或转录后起作用。“调控序列”是促进多肽表达，例如用于增加转录本的表达或增强mRNA的稳定性的任何序列。合适的调控序列包括例如增强子元件、转录后调控元件和多腺苷酸化位点。合适地，附加的调控序列可以存在于LTR中。
合适地，载体可以包含例如可操作地连接到启动子的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
包含本发明的核酸分子/多核苷酸的载体可以使用本领域已知的各种技术(比如转化和转导)引入细胞中。本领域已知几种技术例如有使用比如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯疱疹病毒载体的重组病毒载体感染，直接注射核酸以及基因枪转化。
非病毒传递系统包括但不限于DNA转染方法。此时，转染包括使用非病毒载体将基因传递到靶细胞的过程。非病毒传递系统可以包括脂质体或两亲性细胞穿透肽，优选地与核酸分子或构建体复合。
典型的转染方法包括电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、致密DNA介导的转染、脂质体(liposome)、免疫脂质体、lipofectin、阳离子试剂介导的转染、阳离子表面两性分子(CFA)(Nat.Biotechnol.(1996)14:556)及其组合。
尽管本发明的核酸分子被设计为用作单个构建体，并且这将包含在单个载体中，但并不排除核酸分子与其他载体共同被引入到细胞中，例如其他载体编码可能也需要引入细胞中的其他多肽。
工程化细胞可以通过包括病毒载体转导、DNA转染或RNA转染在内的多种手段中的一种通过引入本文所定义的核酸分子、构建体或载体来生成。
本发明的细胞可以通过以下方式制作：将本文所定义的核酸分子/多核苷酸、构建体或载体引入到细胞(例如，通过转导或转染)中。
合适的细胞将在下面做进一步讨论，但该细胞可以来自分离自受试者的样品。受试者可以是供体受试者或治疗受试者(即，细胞可以是自体细胞、或用于引入另一受体的供体细胞，例如同种异体细胞)。
该细胞可以通过包括以下步骤的方法生成：
(i)从受试者分离含细胞的样品或提供含细胞的样品；以及
(ii)将本文所定义的核酸分子、构建体或载体引入到(例如，通过转导或转染)所述含细胞的样品中，以提供工程化细胞群。
富集靶细胞的样品可以在该方法的步骤(ii)之前和/或之后从含细胞样品中分离、富集和/或生成。例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行Treg(或其他靶细胞)的分离、富集和/或生成，以分离、富集或生成富集Treg的样品。含细胞样品的分离和/或富集可以在步骤(ii)之后进行，以富集包含本文所描述的CAR、核酸分子/多核苷酸、构建体和/或载体的细胞和/或Treg(或其他靶细胞)。
富集Treg的样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法分离或富集，例如通过FACS和/或磁珠分选。富集Treg的样品可以通过本领域技术人员已知的任何方法从含细胞的样品中生成，例如通过引入编码FOXP3的DNA或RNA从Tcon细胞和/或从诱导祖细胞或胚胎祖细胞的体外分化中生成。分离和/或富集其他靶细胞的方法是本领域已知的。
合适地，工程化靶细胞可以通过包括以下步骤的方法生成：
(i)从受试者分离富集靶细胞的样品或提供富集靶细胞的样品；以及
(ii)将本文所定义的核酸分子、构建体或载体引入到(例如，通过转导或转染)富集靶细胞的样品中，以提供工程化靶细胞群。
该靶细胞可以是Treg细胞或其前体或祖细胞。
“工程化细胞”意指经修饰以包含或表达不由细胞天然编码的多核苷酸的细胞。用于工程化细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于细胞的基因修饰，例如通过转导(比如逆转录病毒或慢病毒转导)和转染(比如基于DNA或RNA的瞬时转染)进行，转染包括如上文所讨论的lipofectin、聚乙二醇、磷酸钙和电穿孔。任何合适的方法都可以用来将核酸序列引入到细胞中。比如两亲性细胞穿透肽的非病毒技术就可以用于引入核酸。
因此，本文所描述的核酸分子不是由相应的未修饰细胞天然表达的。事实上，编码CAR的核酸分子是人工构建体，并且在一个实施方案中，安全开关多肽是人工构建体，因此这些安全开关多肽无法天然地存在或表达。适合地，工程化细胞是例如通过转导或转染修饰的细胞。适合地，工程化细胞是已被修饰或其基因组已被修饰的细胞，例如通过转导或转染。适合地，工程化细胞是已通过逆转录病毒转导修饰或其基因组已被修饰的细胞。适合地，工程化细胞是已通过慢病毒转导修饰或其基因组已被修饰的细胞。
如本文所使用的，术语“引入”是指将外源核酸(例如，DNA或RNA)插入细胞的方法。如本文所使用的，术语引入包括转导和转染这两种方法。转染是通过非病毒方法将核酸引入到细胞中的过程。转导是经由病毒载体将外来DNA或RNA引入到细胞中的过程。工程化细胞可以使用包括病毒载体转导、DNA转染或RNA转染在内的多种手段中的一种通过引入本文所描述的核酸来生成。可以在引入本文所描述的核酸之前或之后激活和/或扩增细胞，例如通过用抗CD3单克隆抗体或抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体两者来处理。也可以在抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体存在下结合IL-2来扩增细胞。适当地，IL-2可以由IL-15代替。可以用于细胞(例如，Treg)扩增方案的其他成分包括但不限于雷帕霉素、全反式维甲酸(ATRA)和TGFβ。如本文所使用的，“激活”意指细胞受到刺激，导致细胞增殖。如本文所使用的，“扩增”意指细胞或细胞群已被诱导增殖。细胞群的扩增可以例如通过计数群中存在的细胞数量来测量。细胞的表型可以通过本领域已知的比如流式细胞术等方法来确定。
该细胞可以是免疫细胞或其前体。前体细胞可以是祖细胞。因此，代表性免疫细胞包括T细胞，特别是细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、辅助性T细胞(HTL；CD4+T细胞)和调节性T细胞(Treg)。其他T细胞群也可用于本文，例如初始T细胞和记忆性T细胞。其他免疫细胞包括NK细胞、NKT细胞、树突状细胞、MDSC、中性粒细胞和巨噬细胞。免疫细胞的前体包括例如诱导性PSC(iPSC)的多能干细胞、或包括多能干细胞在内的更多定向祖细胞、或定向谱系的细胞。前体细胞能够在体内或体外被诱导分化成免疫细胞。在一个方面，前体细胞可以是能够被转分化为目标免疫细胞的体细胞。
最值得注意的是，免疫细胞可以是NK细胞、树突状细胞、MDSC或T细胞，比如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或Treg细胞。
在一个优选的实施方案中，免疫细胞是Treg细胞。“调节性T细胞(Treg)或T调节细胞”是具有控制细胞病变免疫应答的免疫抑制功能的免疫细胞，并且对维持免疫耐受性至关重要。如本文所使用的，术语Treg是指具有免疫抑制功能的T细胞。
本文所使用的T细胞是淋巴细胞，包括任何类型的T细胞，比如αβT细胞(例如，CD8或CD4+)、γδT细胞、记忆性T细胞和Treg细胞。
适当地，免疫抑制功能可以是指Treg减少或抑制免疫系统响应如病原体、同种抗原或自身抗原等的刺激而促进的多种生理和细胞效应中的一种或多种的能力。这样的效应的实例包括常规T细胞(Tconv)的增殖增强和促炎性细胞因子的分泌。任何这样的效应都可以用作免疫应答强度的指标。在Treg存在下Tconv相对较弱的免疫应答表明Treg抑制免疫应答的能力。例如，细胞因子分泌相对减少表明免疫应答较弱，从而表明Treg抑制免疫应答的能力。Treg还可以通过调节共刺激分子在如B细胞、树突状细胞和巨噬细胞等抗原呈递细胞(APC)上的表达来抑制免疫应答。CD80和CD86的表达水平可以用来评估体外共培养后活化的Treg的抑制效力。
本领域已知用于测量免疫应答强度的指标的试验，从而测量Treg的抑制能力。特别地，抗原特异性Tconv细胞可以与Treg共培养，并且在共培养物中加入相应抗原的肽以刺激Tconv细胞的应答。Tconv细胞响应于添加肽的增殖程度和/或Tconv细胞响应于添加肽而分泌的细胞因子IL-2的数量可以用作共培养Treg的抑制能力的指标。
与本文所公开的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞可能比在没有Treg存在下培养的相同Tconv细胞少增殖5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、95％或99％。例如，与本发明的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞可以比在存在非工程化Treg的情况下培养的相同Tconv细胞少增殖5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、95％或99％。与非工程化Treg或包含核酸构建体(具有编码三种多肽(即安全开关多肽、FOXP3和CAR)的不同排列的三种多核苷酸序列)的Treg相比，例如与包含从5’到3’编码FOXP3、安全开关多肽和CAR的多核苷酸的构建体相比，包含本文所定义的核酸、表达构建体或载体(例如，Treg)的细胞的抑制活性增加(例如，抑制活性增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。与在没有Treg存在下(例如，在非工程化Treg或包含核酸构建体的Treg的存在下，其中该核酸构建体具有编码三种多肽(即安全开关多肽、FOXP3和CAR)的不同排列的三种多核苷酸序列；例如与包含从5’到3’编码FOXP3、安全开关多肽和CAR的多核苷酸的构建体相比)培养的相应Tconv细胞相比，用本文中的Treg共培养的抗原特异性Tconv细胞可以少表达至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的效应细胞因子。效应细胞因子可以选自IL-2、IL-17、TNFα、GM-CSF、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13。合适地，效应细胞因子可以选自IL-2，IL-17，TNFα，GM-CSF和IFN-γ。
已识别出几种不同的Treg亚群，这些Treg亚群可以表达不同的特定标记或不同水平的特定标记。Treg通常是表达CD4、CD25和FOXP3(CD4+CD25+FOXP3+)标记的T细胞。
Treg也可以表达CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关分子-4)或GITR(糖皮质激素诱导的TNF受体)。
Treg细胞存在于外周血、淋巴结和组织中，并且本文中使用的Treg包括胸腺源性天然型Treg(nTreg)细胞、外周生成的Treg细胞和诱导型Treg(iTreg)细胞。
Treg可以在没有表面蛋白CD127或结合低水平表达的表面蛋白CD127(CD4+CD25+CD127-或CD4+CD25+CD127low)的情况下使用细胞表面标记CD4和CD25来识别。使用这样的标记来识别Treg是本领域已知的，并且在例如Liu等(JEM；2006；203；7(10)；1701-1711)中有描述。
Treg可以是CD4+CD25+FOXP3+T细胞、CD4+CD25+CD127-T细胞或CD4+CD25+FOXP3+CD127-/low T细胞。
适合地，Treg可以是天然型Treg(nTreg)。如本文所使用的，术语“天然型Treg”意指胸腺衍生的Treg。天然型Treg是CD4+CD25+FOXP3+Helios+神经纤毛蛋白1+。与iTreg相比，nTreg的PD-1(程序性细胞死亡-1，pdcd1)、神经纤毛蛋白1(Nrp1)、Helios(Ikzf2)和CD73表达更高。nTreg可以基于Helios蛋白或神经纤毛蛋白1(Nrp1)各自的表达与iTreg区分开。
Treg可以具有去甲基化的Treg特异性去甲基化区域(TSDR)。TSDR是调节Foxp3表达的重要甲基化敏感元件(Polansky，J.K.等，2008.European journal of immunology,38(6),第1654-1663页)。
其他合适的Treg包括但不限于Tr1细胞(其不表达Foxp3，并且IL-10的产量高)、CD8+FOXP3+T细胞和γδFOXP3+T细胞。
已知存在不同的Treg亚群，包括初始Treg(CD45RA+FoxP3low)、效应性Treg/记忆性Treg(CD45RA-FoxP3high)和产生细胞因子的Treg(CD45RA-FoxP3low)。“记忆Treg”是表达CD45RO并且被认为是CD45RO+的Treg。与初始Treg相比，这些细胞的CD45RO水平增加(例如，增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％以上的CD45RO)，并且与初始Treg相比，这些细胞优选地不表达或具有低水平的CD45RA(mRNA和/或蛋白质)(例如，与初始Treg相比，至少少80％、90％或95％的CD45RA)。“产生细胞因子的Treg”是指与初始Treg相比，不表达或具有非常低水平的CD45RA(mRNA和/或蛋白质)的Treg(例如，与初始Treg相比，至少少80％、90％或95％的CD45RA)，并且与记忆性Treg相比，具有低水平的FOXP3(例如，与记忆性Treg相比，少50％、60％、70％、80％或90％的FOXP3)。产生细胞因子的Treg可以产生干扰素γ，并且与初始Treg相比，体外抑制率可能较低(例如，抑制率比初始Treg低50％、60％、70％、80％或90％)。本文中引用的表达水平可以指mRNA或蛋白质表达。特别地，对于比如CD45RA、CD25、CD4、CD45RO等的细胞表面标记，表达可以是指细胞表面表达，即蛋白标记在细胞表面表达的量或相对量。表达水平可以通过本领域任何已知的方法来确定。例如，mRNA表达水平可以通过Northern印迹/阵列分析来确定，并且蛋白质表达可以通过Western印迹、或者优选地通过FACS使用针对细胞表面表达的抗体染色来确定。
特别地，Treg可以是初始Treg。如本文中可互换使用的“初始调节性T细胞、初始T调节性细胞或初始Treg”是指表达CD45RA(特别是在细胞表面上表达CD45RA)的Treg细胞。因此，初始Treg被描述为CD45RA+。初始Treg通常表示通过其内源性TCR未被肽/MHC激活的Treg，而效应性Treg/记忆性Treg则与通过其内源性TCR被激活的Treg有关。典型地，初始Treg可以比非初始Treg细胞(例如，记忆性Treg细胞)多表达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的CD45RA。替代地看，与非初始Treg细胞(例如，记忆Treg细胞)相比，初始Treg细胞可以表达至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍或100倍的量的CD45RA。CD45RA的表达水平可以很容易地通过本领域的方法(例如，使用市售抗体通过流式细胞仪)来确定。典型地，非初始Treg细胞不表达CD45RA或表达低水平的CD45RA。
特别地，初始Treg可以不表达CD45RO，并且可以被认为是CD45RO-。因此，初始Treg可以比记忆性Treg至少少表达10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的CD45RO，或者替代地看，比记忆Treg细胞至少少表达2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍或100倍的CD45RO。
虽然初始Treg表达如上文所讨论的CD25，但是根据初始Treg的来源，CD25的表达水平可能低于在记忆性Treg中的表达水平。例如，对于从外周血中分离的初始Treg，CD25的表达水平可能比记忆性Treg至少低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。这样的初始Treg可以被认为是表达中等水平至低水平的CD25。然而，技术人员会明白，从脐带血中分离出来的初始Treg可能不会显示出这种差异。
典型地，如本文所定义的初始Treg可以是CD4+、CD25+、FOXP3+、CD127low、CD45RA+。
本文所使用的CD127的低表达是指与来自同一受试者或供体的CD4+非调节性或Tcon细胞相比，CD127的表达水平较低。特别地，与来自同一受试者或供体的CD4+非调节性或Tcon细胞相比，初始Treg可以表达少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的CD127。CD127的水平可以通过本领域的标准方法来评估，包括通过用抗CD127抗体染色的细胞的流式细胞术来评估。
典型地，初始Treg不表达或表达低水平的CCR4、HLA-DR、CXCR3和/或CCR6。特别地，初始Treg可以表达比记忆性Treg更低水平的CCR4、HLA-DR、CXCR3和CCR6，例如表达水平至少低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
初始Treg可以进一步表达其他标记，包括CCR7+和CD31+。
分离的初始Treg可以通过本领域已知的方法来识别，包括通过确定在分离的细胞的细胞表面上是否存在上文所讨论的标记中的任何一种或多种的标记组。例如，CD45RA、CD4、CD25和CD127low可以用来确定细胞是否是初始Treg。确定分离的细胞是否是初始Treg或者是否具有所需表型的方法可以如下文关于可以进行的附加步骤的讨论进行，并且用于确定细胞标记的存在和/或表达水平的方法是本领域公知的，并且包括例如使用市售抗体的流式细胞术。
合适地，从受试者获得的外周血单核细胞(PBMC)中分离细胞，比如Treg。合适地，PBMC从其获得的受试者是哺乳动物，优选是人。合适地，细胞对于要施用工程化细胞的受试者是匹配的(例如，HLA匹配)或自体的。合适地，要被治疗的受试者是哺乳动物，优选是人。细胞可以从患者自身的外周血体外产生(第1方)，也可以在造血干细胞移植的情况下从供体外周血中产生(第2方)或从无关供体的外周血中产生((第3方)。合适地，细胞对于要施用工程细胞的受试者是自体的。
合适地，Treg是细胞群的一部分。合适地，Treg群包含至少70％的Treg，比如至少75％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的Treg。这样的群可以被称为“富集Treg群”。
在一些方面，Treg可以源自诱导型祖细胞(例如，iPSC)或胚胎祖细胞向Treg的离体分化。本文所描述的核酸分子或载体可以在分化为Treg之前或之后被引入到诱导型祖细胞或胚胎祖细胞中。合适的分化方法是本领域已知的，并且包括在Haque等.J Vis Exp.，2016，117，54720(通过引用并入本文)中公开的方法。
如本文所使用的，术语“常规T细胞”、Tcon或Tconv(本文可互换使用)意指表达αβT细胞受体(TCR)以及可能是分化簇4(CD4)或分化簇8(CD8)且不具有免疫抑制功能的共受体的T淋巴细胞。常规T细胞存在于外周血、淋巴结和组织中。适合地，工程化Treg可以通过引入核酸从Tcon中生成，该核酸包含编码FOXP3的序列。替代性地，工程化Treg可以在IL-2和TGF-β存在下通过体外培养CD4+CD25-FOXP3-细胞从Tcon中生成。
与不含外源性FOXP3的Treg细胞相比，本文的Treg的持久性可以增加。本文所使用的“持久性”定义了Treg在特定环境中存活的时间长度，例如在体内(例如，在人类患者或动物模型中)。与不含本文的核酸分子的Treg相比，本文所公开的Treg的持久性可以增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在另一个实施方案中，引入了核酸分子、构建体或载体的靶细胞不是预期用于治疗的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是生产宿主细胞。该细胞可以用于生产(例如，克隆)核酸或者生产载体或多肽。
本发明还提供了一种包含本文所定义或描述的细胞的细胞群。应当理解，细胞群可以包括含本文所定义的核酸分子、表达构建体或载体的本发明的细胞以及不含本发明的核酸分子、表达构建体或载体的细胞，例如未转导或未转染的细胞。尽管在一个优选的实施方案中，群中的所有细胞都可以包含本发明的核酸、表达构建体或载体，但提供了具有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞包含本发明的核酸、表达建构体或载体的细胞群。
还提供了一种包含本文所定义或描述的细胞或细胞群、本文所定义的载体的药物组合物。该载体可用于基因治疗。因此，可以施用载体而不是施用细胞来修饰受试者的内源性细胞以表达引入的核酸分子。适用于基因治疗的载体是本领域已知的，并且包括病毒载体。
药物组合物是包含或由治疗有效量的药物活性剂(即细胞(例如，Treg)、细胞群或载体)组成的组合物。该药物组合物优选包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药学领域公知的，并且是例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro，1985版)中所描述的。药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期施用途径和标准药物实践进行选择。药物组合物可以包含作为或除载体、赋形剂或稀释剂外的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂。
“药学上可接受的”包括无菌和无热原的制剂。从与细胞或载体相容且对其受体无害的意义上来说，载体、稀释剂和/或赋形剂必须是“可接受的”。典型地，载体、稀释剂和赋形剂将是无菌和无热原的盐水或输注介质，但也可以使用其他可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
药学上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯和二甘油酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
细胞、细胞群或药物组合物可以以适合治疗和/或预防所需疾病或病症的方式进行施用。尽管可以通过临床试验确定合适的剂量，但是施用的数量和频率将由受试者的病症、受试者疾病或病症的类型和严重程度等因素决定。药物组合物可以进行相应地配制。
本文所描述的细胞、细胞群或药物组合物可以经肠外施用，例如静脉内施用，或者可以通过输注技术施用。该细胞、细胞群或药物组合物可以以无菌水溶液的形式施用，该无菌水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。水溶液可以适当缓冲(优选地，pH为3至9)。药物组合物可以进行相应地配制。在无菌条件下制备合适的肠外制剂可通过本领域技术人员公知的标准药物技术容易地完成。
药物组合物可以包含输注介质中的细胞，例如无菌等渗溶液。药物组合物可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量瓶中。
细胞、细胞群或药物组合物可以单剂量或多剂量施用。特别地，细胞、细胞群或药物组合物可以单剂量、一次性施用。药物组合物可以进行相应地配制。
药物组合物可进一步包含一种或多种活性剂。药物组合物可以进一步包含一种或多种其他治疗剂，比如淋巴细胞耗竭剂(例如，抗胸腺细胞球蛋白、坎帕斯-1H、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、环磷酰胺、氟达拉滨)、mTOR的抑制剂(例如，西罗莫司、依维莫司)、抑制共刺激途径的药物(例如，抗CD40/CD40L、CTAL4Ig)和/或抑制特定细胞因子(IL-6、IL-17、TNFα、IL18)的药物。
依据要治疗的疾病/病症和受试者以及施用途径，细胞、细胞群或药物组合物可以以不同的剂量施用(例如，按细胞/kg或细胞/受试者测量)。在任何情况下，医生都会确定最适合任何个体受试者的实际剂量，并且该剂量会随着特定受试者的年龄、体重和反应而变化。然而，典型地，对于本文中的细胞，每个受试者可以施用5×107至3×109或108至2×109个细胞的剂量。
该细胞可以被适当地修饰以用于药物组合物中。例如，在将细胞注入受试者之前，可以在适当的时间冷冻和解冻细胞。
本发明进一步包括含本文中的细胞、细胞群和/或药物组合物的试剂盒的用途。优选地，试剂盒用于本文所描述的方法和用途，例如本文所描述的治疗方法。优选地，试剂盒包括试剂盒组分的使用说明。
本文中的细胞、细胞群、组合物和载体可以用于治疗或预防疾病或病症，尤其是可以通过或使用CAR治疗的疾病或病症。细胞和含有细胞的组合物用于过继性细胞治疗(ACT)。各种病症都可以通过施用细胞(特别包括根据本公开表达CAR的Treg细胞)来治疗。如上所述，这可能是对免疫抑制，特别是Treg细胞的免疫抑制作用有反应的病症。因此，本文所描述的细胞、细胞群、组合物和载体可以用于在受试者中诱导或实现免疫抑制。体内施用或修饰的Treg细胞可以通过表达CAR来靶向。适合这种治疗的病症包括传染性、神经退行性或炎症性疾病，或者更广泛地，与任何不期望的、不想要的或有害的免疫应答相关的病症。
要治疗或预防的病症包括炎症，或者替代性地，与炎症相关或涉及炎症的病症。炎症可以是慢性或急性的。此外，炎症可以是低水平或全身性炎症。例如，炎症可以是在代谢紊乱(例如，代谢综合征)的情况下发生的炎症，或者在胰岛素抵抗或II型糖尿病或肥胖症等的情况下发生的炎症。
特别地，细胞、细胞群、载体和药物组合物提供了一种用于诱导对移植物的耐受性，治疗和/或预防细胞性和/或体液性移植排斥反应，治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病，或促进组织修复和/或组织再生，或改善炎症的手段。细胞、细胞群、载体和药物组合物可以用于包括向受试者施用本文所描述的细胞、细胞群、载体或药物组合物的步骤的方法。
如本文所使用的，“诱导对移植物的耐受性”是指诱导受体对移植的器官的耐受性。换言之，诱导对移植物的耐受性意味着降低受体对供体移植器官的免疫应答水平。诱导对移植的器官的耐受性可以减少移植受体所需的免疫抑制药物的量，也可以使免疫抑制药物停用。
例如，可以向患有疾病的受试者施用工程化细胞(例如，Treg)，以减轻、减少或改善疾病的至少一种症状，比如黄疸、尿赤、瘙痒、腹胀或压痛、疲劳、恶心或呕吐和/或食欲不振。该至少一种症状可以减轻、减少或改善至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者该至少一种症状可以完全缓解。
可以向患有疾病的受试者施用工程化细胞(例如，Treg)，以减缓、降低或阻断疾病的进程。与未施用工程细胞的受试者相比，疾病的进程可以减缓、降低或阻断至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者疾病的进程可以完全停止。
在一个实施方案中，受试者是接受免疫抑制治疗的移植物受体。
合适地，受试者是哺乳动物。合适地，受试者是人。
移植物可以选自肝脏、肾脏、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、血管化复合组织移植物和皮肤移植物。
合适地，CAR可以包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域能够与存在于移植(移植物)供体中但不存在于移植(移植物)受体中的HLA抗原特异性结合。
合适地，该移植物是肝脏移植物。在移植物是肝脏移植物的实施方案中，抗原可以是存在于移植肝脏中但不存在于患者中的HLA抗原、肝脏特异性抗原(比如NTCP)、或在排斥反应期间表达上调的抗原(比如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11)。
如上文所讨论的，在一个代表性和优选的实施方案中，抗原是HLA-A2。
一种用于治疗疾病或病症的方法涉及本文中的细胞的治疗用途。在这方面，可以向患现有疾病或病症的受试者施用细胞，以便减轻、减少或改善与该疾病或病症相关的至少一种症状和/或减缓、降低或阻断该疾病的进程。
合适地，治疗和/或预防细胞性和/或体液性移植排斥反应可以指施用有效量的细胞(例如，Treg)，使得移植物受体所需的免疫抑制药物的量减少或者让免疫抑制药物停用。
预防疾病或病症涉及本文中的细胞的预防性用途。在这方面，可以将细胞施用给尚未感染或发展该疾病或病症的受试者和/或未表现出该疾病或病症的任何症状的受试者，以预防该疾病或病症，或者减少或预防与该疾病或病症相关的至少一种症状的发展。受试者可能有患该疾病或病症的倾向，或被认为有发展成该疾病或状况的风险。
自身免疫性或过敏性疾病可以选自炎症性皮肤疾病，包括银屑病和皮炎(例如，特应性皮炎)；与炎症性肠道疾病关联的反应(比如克罗恩病和溃疡性结肠炎)；皮炎；过敏性病症，比如食物过敏、湿疹和哮喘；类风湿关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)(包括狼疮性肾炎和皮肤狼疮)；糖尿病(例如，1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；多发性硬化症；神经退行性疾病，例如肌萎缩侧索硬化症(ALS)；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)；以及幼年型糖尿病。
本文的医疗用途或方法可以包括以下步骤：
(i)分离含细胞的样品或提供含细胞的样品；
(ii)将本文所定义的核酸分子、构建体或载体引入到细胞中；以及
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
该细胞可以是如本文所定义的Treg。富集Treg的群可以在该方法的步骤(ii)之前和/或之后从含细胞的样品中分离和/或生成。例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行分离和/或生成，以分离和/或生成富集Treg的样品。富集可以在步骤(ii)之后进行，以富集包含本文所描述的CAR、多核苷酸和/或载体的细胞和/或Treg。
合适地，细胞可以是自体的。合适地，细胞可以是同种异体的。合适地，细胞(例如，工程化Treg)可以与比如淋巴细胞耗竭剂(例如，如上文所讨论的)的一种或多种其他治疗剂组合施用。工程化细胞(例如，Treg)可以与该一种或多种其他治疗剂同时或顺序地(即，在之前或之后)施用。
合适地，受试者是哺乳动物。合适地，受试者是人。
细胞(例如，Treg)可以在引入本文所描述的核酸分子之前或之后激活和/或扩增，例如通过用抗CD3单克隆抗体或抗CD3单克隆抗和抗CD28单克隆抗体两者来处理。扩增方案在上文进行了讨论。
细胞(例如，Treg)可以在该方法的每个步骤之后，特别是在扩增之后洗涤。
工程化细胞(例如，Treg细胞)群可以进一步通过本领域技术人员已知的任何方法富集，例如通过FACS和/或磁珠分选。
生产方法的步骤可以在封闭和无菌的细胞培养系统中进行。
本发明还提供了一种用于删除表达(例如，在细胞表面的)本文所定义的安全开关多肽的细胞的方法或手段。该细胞可以是包含本文定义或描述的核酸分子或载体或重组构建体的细胞，即核酸分子或载体或构建体已被引入其中的细胞，例如由本文中的载体转导的细胞。
通常，该方法包括将靶细胞暴露于允许安全开关多肽引发其效应的条件或试剂中。这样的条件是本文所提及的许可条件。这可能涉及细胞与试剂的接触，包括向受试者施用试剂；该试剂与安全开关多肽一起作用以使细胞删除。例如，试剂可以是用于安全开关多肽的活化分子或底物。在含有上文所描述的开关的利妥昔单抗表位的情况下，该方法包括将细胞暴露于利妥昔单抗或具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体(即等效抗体)的步骤。
典型地，利妥昔单抗通过补体介导的细胞杀伤发挥其作用，但可能会涉及其他机制，例如ADCC。因此，在一个实施方案中，细胞可以暴露于补体和利妥昔单抗或等效抗体。
该方法包括在体外进行的删除细胞的方法，例如在培养物中。然而，主要用途是在体内删除细胞，即删除先前被施用给受试者的细胞。
应当理解，在体内，这可以通过将利妥昔单抗或等效抗体施用给先前已施用过该细胞的受试者来实现，换言之，先前已用本文所定义的表达安全开关多肽的细胞或用于修饰内源性细胞以表达多肽安全性的载体接受ACT的受试者。补体可以内源性地存在于受试者中。
因此，可以提供利妥昔单抗或具有其结合特异性的抗体与本发明的细胞结合用于ACT。细胞或用于生产该细胞的核酸或载体或构建体和利妥昔单抗或等效抗体可以提供在试剂盒中，或作为组合产品提供。
当安全开关多肽在细胞表面表达时，利妥昔单抗或等效抗体与多肽的R表位的结合引起细胞裂解。
具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体是与利妥昔单抗一样能够与相同的天然表位结合的抗体。特别地，该抗体能够与表位R1和表位R2结合。
具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体可以包含利妥昔单抗的抗原结合结构域或来自利妥昔单抗的抗原结合结构域。更具体地，该抗体可以包含来自利妥昔单抗的VL和VH结构域或利妥昔单抗的CDR。进一步地，只要保留了利妥昔单抗的结合特异性，就可以修饰利妥昔单抗的抗原结合结构域(例如，通过氨基酸取代、缺失或插入)。
如上所述，利妥昔单抗的生物仿制药是可获得并且可以使用的。本领域技术人员能够很容易地使用常规方法利用可获得的其氨基酸序列来制备具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体。
在一个实施方案中，具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体是常规免疫球蛋白形式的。也就说抗体可以包含轻链和重链以及恒定区和可变区两者。抗体可以是二价的，即该抗体可以包含两个抗原结合位点。也可以使用其他抗体形式，包括例如单链形式或单价形式。因此，抗体可以是任何类别或类型的，也可以是任何形式的。
每个在细胞表面表达的安全开关多肽可以结合一个以上的利妥昔单抗分子或等效抗体分子。多肽的每个R表位可以结合单独的利妥昔单抗分子或等效抗体分子。
删除转移细胞的决定可能是由于在受试者中检测到可归因于该转移细胞的不良影响。例如，可能检测到不可接受的毒性水平。
表达CD20的细胞可以通过用利妥昔单抗抗体治疗选择性地消融。由于浆细胞中没有CD20表达，因此尽管删除了B细胞区室，但利妥昔单抗治疗后仍保留了体液免疫。
本发明还可以提供一种用于增加细胞稳定性和/或抑制功能的方法，该方法包括将本文所提供的核酸分子、表达构建体或载体引入到细胞中的步骤。抑制功能的增加可以如上文所讨论进行测量，例如通过将激活的抗原特异性Tconv细胞与本发明的细胞共培养，并且例如测量由Tconv细胞产生的细胞因子的水平。与非工程化Treg或含核酸构建体(具有编码三种多肽(即安全开关多肽、FOXP3和CAR)的不同排列的三种多核苷酸序列)的Treg相比，抑制功能的增加可以增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如，与包含从5’到3’编码FOXP3、安全开关多肽和CAR的多核苷酸的构建体相比。
细胞(例如，本文所定义的Treg)的稳定性增加是指与非工程化Treg或包含核酸构建体(具有编码三种多肽(即安全开关多肽、FOXP3和CAR)的不同排列的三种多核苷酸序列)的Treg相比，那些细胞的持久性或存活率增加，或者在一段时期内保留Treg表型的细胞(例如，保留比如FOXP3和Helios等Treg标记的细胞)的比例增加，例如，与包含从5’到3’编码FOXP3、安全开关多肽和CAR的多核苷酸的构建体相比。稳定性的增加可以是稳定性增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，并且可以通过本领域已知的技术来测量，例如在细胞群中进行Treg细胞标记染色和通过FACS进行分析。
本发明还可以提供一种增强来自在细胞中编码嵌合抗原受体(CAR)、安全开关和FOXP3的核酸分子的FOXP3的表达的方法，该方法包括选择从5’到3’包含以下序列的核酸分子：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码CAR，
并且将所述核酸分子引入到所述细胞中。
该方法可以进一步包括产生核酸分子的步骤(例如，将编码FOXP3的核苷酸序列定位在编码含自杀部分的安全开关多肽的核苷酸序列下游和编码CAR的核苷酸序列上游)。因此，在将核酸分子引入到细胞中后，是核酸分子内的如上所示的(i)、(ii)和(iii)的从5’到3’的顺序提供了FOXP3的增强表达。如先前所讨论的，特别是CAR可以靶向HLA A2。另外地或替代性地，核酸分子可以包含SFFV启动子，其中(i)、(ii)和(ii)可以可操作地连接到所述启动子。
在另一方面，本发明提供了核酸分子的用途，该核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，该第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，该第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，该第三核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，用于在细胞内表达自杀部分、FOXP3和CAR，其中，FOXP3的表达被增强。
该方法或用途涉及“增强”来自编码安全开关、CAR和FOXP3的核酸分子的FOXP3的表达。在这方面，“增加”或“改善”可以与“增强”互换使用，并且如先前所讨论的，与使用核酸分子(其中，(i)、(ii)和(iii)以与本发明的核酸分子不同的顺序(即不是从5’到3’(i)、(ii)、(iii)的顺序)放置)转导的细胞中获得的FOXP3 mRNA或蛋白质的表达水平相比，涉及转导的细胞内mRNA或FOXP3蛋白质的水平增加。因此，与包含编码安全开关多肽、FOXP3和CAR的相同核苷酸序列但以不同基因顺序存在的其他比较核酸分子相比，本发明的核酸分子可以用于增强FOXP3在细胞中的表达。
在另一方面，本发明人已经进一步表明，当编码安全开关多肽的核苷酸序列可操作地连接到SFFV启动子时，用表达安全开关多肽(包含由利妥昔单抗识别的至少一个CD20表位的自杀部分)的核酸分子(例如，本发明的核酸分子)转导的细胞对利妥昔单抗的敏感性可能增加。在这方面，本发明另外提供了一种增加表达安全开关多肽的细胞对利妥昔单抗的敏感性的方法，该安全开关多肽包含被利妥昔单抗识别的至少一个CD20表位的自杀部分，该方法包括将包含编码所述安全开关多肽的核苷酸序列的核酸分子引入到所述细胞中，其中所述核苷酸序列可操作地连接到SFFV启动子。
替代性地看，本发明提供了一种增加表达安全开关多肽的细胞对利妥昔单抗的敏感性的方法，该安全开关多肽包含被利妥昔单抗识别的至少一个CD20表位的自杀部分，该方法包括从与SFFV启动子可操作地连接的核苷酸序列中表达所述安全开关多肽。包含被利妥昔单抗识别的CD20表位的特定安全开关多肽如先前上文描述的。
本发明进一步提供了包含可操作地连接到SFFV启动子的核苷酸序列的核酸分子的用途，其中所述核苷酸序列编码包含被利妥昔单抗识别的至少一个CD20表位的自杀部分的安全开关多肽，用于增加细胞对利妥昔单抗的敏感性。
本文所使用的“增加细胞对利妥昔单抗的敏感性”意指提高细胞被利妥昔单抗删除或耗竭的能力。因此，在一个方面，增加对利妥昔单抗的敏感性可以指特定浓度的利妥昔单抗删除或耗竭细胞的能力增加(例如，删除或耗竭的细胞数量或百分比增加，或在更短的时间段内删除或耗竭特定数量或百分比的细胞)。替代性地看，增加对利妥昔单抗的敏感性可以指降低浓度的利妥昔单抗删除或耗竭细胞的能力。细胞对利妥昔单抗删除或耗竭的敏感性增加典型地是与用核酸分子转导的细胞比较，该核酸分子包含编码安全开关多肽的核苷酸序列(特别是与上文所描述的核酸相同的核苷酸序列)，该安全开关多肽包含被利妥昔单抗识别的至少一个CD20表位的自杀部分，其中，所述核苷酸序列可操作地连接到非SFFV的启动子，例如连接到EFS或PGS的启动子。因此，特别地，敏感性增加可以指与用特定浓度的利妥昔单抗治疗后、在非SFFV(例如，EFS或PGS)的启动子控制下表达安全开关多肽的细胞群中获得的删除或耗竭百分比相比，用相同浓度的利妥昔单抗治疗后、在SFFV启动子控制下表达安全开关多肽的细胞群中获得的删除或耗竭百分比增加。典型地，增加的删除或耗竭百分比可以是至少10％、20％、30％、40％、50％或60％。替代性地，对利妥昔单抗的敏感性增加可以指与在非SFFV(例如，EFS或PGS)的启动子控制下表达安全开关多肽的细胞群中实现相同水平(例如，相同量)的删除或耗竭所需的利妥昔单抗的浓度相比，降低浓度的利妥昔单抗(例如，利妥昔单抗降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)在SFFV启动子控制下删除或耗竭表达安全开关多肽的细胞群中的细胞的能力。
细胞的删除或耗竭可以如先前上文所描述的来确定和测量。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料都可以用于本公开的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义该范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列都以5'到3'的方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。
在提供了值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限与下限之间的至下限单位的十分之一的每个居中值。在规定范围内的任何规定值或居中值与该规定范围内任何其他规定值或居中值之间的每个较小范围都涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或不包括在该范围内，并且在规定范围内有任何具体排除的限值的前提下，在较小范围内包括任何一个限值、任何两个限值没有一个或两者的每个范围也涵盖在本公开中。如果规定范围包括一个或两个限值，则不包括这些限值中的任何一个或两者的范围也包括在该公开中。必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则本文和所附权利要求中所使用的单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代。
本文所使用的术语“包括(comprising、comprises和comprised of)”与“包含(including和includes)”或“含有(containing和contains)”同义，并且是包含性或开放式的，不排除另外的、未列举的成员、元件或方法步骤。术语“包括(comprising、comprises和comprised of)”也包括术语“由……组成(consisting of)”。
本文所讨论的出版物仅提供了其在本申请提交日期之前的公开。本文中的任何内容均不得解释为承认这样的出版物构成了本文所附权利要求的现有技术。现在将通过实施例对本发明做进一步描述，这些实施例是为了帮助本领域普通技术人员实施本发明，而无意以任何方式限制本发明的范围。
现在将通过实施例对本发明做进一步描述，这些实施例是为了帮助本领域普通技术人员实施本发明，而无意以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
材料和方法
克隆:
内部设计了10个构建体(图1)，并且对整个序列进行密码子优化以在人类细胞中表达并进行制造。将构建体克隆到pMP71骨架中，并用质粒转化D5a高效细菌以及用选择试剂氨苄青霉素生长。使用Miniprep试剂盒(Qiagen)提取DNA。通过PCR克隆将插入片段转移到慢病毒骨架中。构建体1代表本文要求保护的本公开的构建体。构建体II-VI是比较构建体，并且构建体VII-X是对照构建体。
PBMC的收集：
白细胞锥由NHS血液与移植提供。使用密度离心方案分离PBMC。简言之，用1×PBS按1:1稀释血液，并在Ficoll-Paque(GE Healthcare)上分层。将样品离心，并取出白细胞层，在PBS中洗涤。
Treg和Tconv分离方案：
将来自HLA-A*02阴性供体的血锥用来衍生Treg和Teff群。使用RosetteSepTM人CD4+T细胞富集鸡尾酒经由阴性选择对血锥进行CD4富集。随后，使用密度离心分离CD4+细胞。然后，使用CD25微珠II(Miltenyi)经由阳性选择分离CD4+CD25+T细胞。保留CD4+CD25-细胞部分作为常规T细胞(Tconv)群。在FACS分选前，通过流式细胞术使用抗体CD4 FITC(OKT4，Biolegend)、CD25 PE-Cy7(BC96，Biolegend)、CD127 BV421(A019D5，Biolegend)、CD45RABV510(HI100，Biolegend)和LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色剂(Thermofisher)对CD4+CD25+部分染色。如果有说明，分选并使用CD4+CD25+CD127low(Treg集群)或CD4+CD25+CD127lowCD45RA+(CD45RA+Treg)。
Phoenix细胞
逆转录病毒包装系Phoenix GP(稳定表达Gag Pol)购自ATCC并培养。
Tconv培养基：
使人Tconv在补充有10％热灭活胎牛血清的RPMI-1640(Gibco)、盘尼西林、链霉素、L-谷氨酰胺(Gibco)中生长。
Treg培养基和扩增：
在补充有IL-2的Texmacs培养基(Miltenyi)中培养人调节性T细胞，并用人T激活剂CD3/CD28 DynabeadsTM(Gibco)激活。每2至3天用补充有IL-2的Treg培养基再饲喂细胞。使用DynabeadsTM执行第二轮刺激以促进Treg细胞进一步扩增。
转染和病毒颗粒的生产
逆转录病毒：
接种Phoenix-GP细胞并培养24小时。第1天，在用相关质粒DNA和包膜质粒转染之前更换培养基。将转染混合物滴加到贴壁Phoenix细胞的整个表面上，并进一步孵育24小时。第2天，更换培养基并进一步孵育24小时。第3天，从Phoenix细胞中取出含逆转录病毒的上清液，并离心以移除任何细胞碎片。
慢病毒：
将HEK293T细胞接种在DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基)+10％胎牛血清(FBS)中并培养24小时。将转染试剂置于室温，并与目标DNA构建体/质粒、包装质粒(pD8.91)和病毒包膜(pVSV-G)混合。将PEI加入到稀释的DNA中并混合，然后加入到HEK293T中。转染后48小时，收获上清液，过滤并浓缩病毒。
T细胞的转导
用抗CD3和抗CD28 Dynabeads(Gibco)激活Tconv，并重悬于T细胞培养基中。通过用Retronectin(Takahara bio–Otsu，日本)涂覆来制备未经组织培养处理的24孔板，将细胞悬液与逆转录病毒/慢病毒上清液一起加入。孵育细胞，隔天进行培养基更换。转导后7天，将细胞用于实验。
流式细胞术染色以测定CAR和RQR8表达
从培养物中取出T细胞，在FACS缓冲液中洗涤，并在FACS缓冲液中使用HLA-A*02特异性Dextramer(WB2720-APC，Immudex)对HLA-A*02特异性CAR染色。随后，首先在PBS中用LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色剂(Thermofisher)对细胞染色，然后在FACS染色缓冲液中用抗CD4 AF700(RPA-T4，BD)、抗CD34 FITC(QBEND/10，Thermofisher)和抗CD3 PE-Cy7染色。对于FOXP3的细胞内染色，将细胞固定并透化，并用抗Foxp3 PE(150D/E4，Thermofisher)抗体染色。在BD LSRII流式细胞仪上分析细胞。
转导的细胞的流式细胞术表型分析
从培养物中取出T细胞，并如上文所描述的使用Dextramer和LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色剂对CAR和活细胞染色。使用抗CD4 AF700、抗CD25 PE-Cy7(BC96，Biolegend)、抗CD39 PerCPCy5.5(A1，Biolegend)、抗-CD62L PE-CF594(DREG-56，BD)、抗TIM3 BV786(7D3，BD)、抗TIGIT BV605(A15153G，Biolegend)、抗CD45RO BUV395(UCHL1，BD)、抗CD279 BUV737(EH12.1，BD)和抗CD223 BV711(11C3C65，Biolegend)对细胞进行表面染色。将细胞透化并用抗Foxp3 PE(150D/E4，Thermofish)染色。
IL-2饥饿试验
将在培养物中扩增至第15天的转导的Treg细胞从培养物中取出，并使用磁激活细胞分选(Miltenyi)富集。简言之，首先用抗CD34(QBEND/10)–FITC对细胞染色，随后用抗FITC微珠(Miltenyi)染色。然后沿octoMACS磁铁(Miltenyi)使细胞穿过MS柱(Miltenyi)以分离表达RQR8的细胞。用含有不同浓度IL-2的人T-激活剂CD3/CD28DynabeadsTM培养这些富集的T细胞。测试的IL-2浓度为300IU/ml、150IU/ml、75IU/ml、30IU/ml、10IU/ml和1IU/ml。孵育后，如上文所描述的，取出细胞并染色以测定CAR和RQR8的表达。使用如所描述的死细胞染色剂识别死细胞。
CAR特异性Treg激活试验
在培养物中扩增转导的Treg 14天并静置24小时，然后用抗CD3/28珠、表达HLA-A1(A1)或HLA-A2(A2)的K562细胞再培养18小时。用可固定细胞活力染料、CD4、RQR8和CD69对细胞染色。
CAR特异性激活和增殖试验
分离Treg，用构建体I转导并扩增14天。为了进行该试验，静置细胞24小时，然后用Cell Trace Violet(CTV)染色，并用抗CD3/28珠、表达HLA-A1(A1)或HLA-A2(A2)的K562细胞培养5天。用可固定细胞活力染料、CD4和RQR8对细胞染色。
RQR8功能评估
从CD45.1小鼠的脾脏和淋巴结中分离CD3+淋巴细胞，并用表达RQR8的构建体转导。照射雄性CD45.2小鼠，24小时后经由静脉注射转移10×10-6个转导的细胞。在转移后第7天，通过尾静脉出血从小鼠收集血液。随后，在第8天、第11天和第13天用小鼠aCD20抗体(150ug/小鼠)处理一半的小鼠。第15天，处死所有小鼠，并收获肝脏、脾脏和血液组织。将组织处理成单细胞悬液，并通过用CD45.1和RQR8(Qbend)染色为流式细胞术分析做准备。
利妥昔单抗介导的CAR-Treg耗竭
扩增14天后，用补体和浓度减少的利妥昔单抗抗体孵育用SFFV或EFS转导的Treg4小时。用可固定活/死细胞染料、CD4和RQR8对细胞染色。
数据分析
使用流式细胞术分析软件FlowJo(Flowjo，LLC)分析流式细胞术数据。所有统计分析均使用Graphpad Prism v.5(Graphpad，软件)进行。
结果
图2示出了通过每个构建体的编码组分的表达来检测的，由图1的实验和对照构建体编码的组分在T效应细胞(用γ-逆转录病毒(γRV)转导)中的差异表达。Dextramer的检测(即存在)确认了CAR的表达，并且FOXP3和安全开关多肽(RQR8)的表达被示出。构建体I显示出了CAR(Dextramer的检测)、安全开关多肽和FOXP3的表达。与构建体II和构建体IV相比，构建体I的Dextramer水平特别高，并且构建体I的FOXP3水平显著增加。
图3A和图3B示出了表达模式在用γRV低转导的Treg中保持不变。如图2所示并如图3中所确认的，与其他构建体相比，来自构建体I的安全开关表达并且特别是FOXP3的表达增加。特别地，构建体I显示出C+F+R+(即所有3种所需组分)的强表达，而无不期望的变体(比如C+F+R-)的相关表达，如图3B所示。所需表达模式的表达在构建体I中增加。对于以不同顺序编码组分的其他构建体，所需表达模式减少，并且可能看到不需要的表达模式增加。
在下一步骤中，对转导效率进行了研究。图4示出了用慢病毒载体转导后的表达结果。显示出了良好的表达水平，特别是来自构建体I的FOXP3表达。与其他实验构建体相比，可以看到构建体I的Dextramer非常高。图5列出了γRV与慢病毒性能之间的比较(示出了慢病毒与γRV载体之间在构建体I(图5A)和构建体IV(图5B)中的并排比较)。这表明慢病毒载体提供了有效的细胞转导和基因表达。结果进一步表明，转导的组分的差异表达依赖于构建体基因顺序，而不依赖于所使用的病毒载体。特别地，与构建体IV相比，构建体I内的基因顺序使得所有三种组分的表达更高。
图6示出了含FOXP3的构建体提高了转导的细胞中FOXP3蛋白的水平，这在图6B的构建体I中特别可见，与未转导的细胞(仅表达内源性FOXP3)相比，该构建体显示出转导的细胞中的FOXP3(外源性和内源性FOXP3)更高，如与构建体VI和VIII(对照构建体VIII不编码FOXP3)相比转导峰值向右移动所展示的那样。
图7示出了外源性FOXP3在谱系不稳定下在转导的Treg细胞中的表达以及该转导的FOXP3赋予了Treg稳定性。构建体I特别赋予了独立于内源性FOXP3表达的持续性FOXP3表达。在第11天仍然能够观察到表达。
图8呈现了γRV表达构建体(Phoenix GP生产/pMP71骨架/RD114a包膜/LTR启动子)的进一步验证研究结果。这再次示出了构建体之间的模块(编码的组分)的差异表达。构建体I是基于可以观察到的表达水平的改进和模块收敛性来选择的。用构建体I获得的FOXP3表达水平显著高于其他实验构建体。
图9确认了模块在使用慢病毒载体(HEK293T生产/pLNT骨架/VSVg包膜/SFFV启动子)的构建体中的表达模式。再次示出了差异表达，并且示出最佳表达是用构建体I实现的。
研究了构建体I赋予的高FOXP3表达水平对Treg内稳态的可能影响。图10示出了FOXP3表达似乎不影响扩增和细胞存活；表达CAR和FOXP3或仅表达CAR的细胞在IL-2饥饿时的总体扩增和存活相似。因此，由构建体I实现的高FOXP3表达水平对细胞无害。
研究了各种标记(CD25、CD62L、TIGIT、LAG3、CTLA4和CD45RO)的表达，以研究FOXP3表达对Treg表型的影响。结果如图11所示。这表明用构建体I转导的Treg细胞保持了Treg表型谱系，同时展现出FOXP3表达增强。除了提高FOXP3的表达外，对Treg表型没有影响。
图12示出了当将不同的启动子与构建体I或构建体VIII一起使用时所见到的转导效率。FACS图示出了CD4+细胞上的RQR8表达(y轴)和Dextramer表达(x轴)(构建体I显示在左侧，构建体VIII显示在右侧)。数据表明使用EFS或SFFV启动子表达每种构建体时获得的转导效率相似。当观察构建体I与构建体VIII之间的转导水平时，构建体VIII表现出更高的转导，这显示出了转导效率是如何受构建体大小影响的(构建体VIII有2个基因，而不是构建体I中的3个基因)。
当表达受EFS或SFFV启动子控制时，研究了表达CAR的构建体I或构建体VIII的Treg激活情况。图13示出了当使用EFS启动子或SFFV启动子时，用构建体I或VIII转导的Treg通过HLA-A2抗原的CAR被激活。然而，当使用SFFV启动子时，Treg激活要高得多。对转导的Treg(构建体I)进行了增殖评估，结果可以在图14看到。代表性FACS图示出了CTV和RQR8对EFS转导的细胞(顶部分图)和SFFV转导的细胞(底部分图)共染色。图示出了5天后RQR8+细胞的频率和RQR8细胞的总数。灰色条示出了EFS转导的细胞，黑色条示出了SFFV转导的细胞。点代表单个供体，并且误差条示出了标准偏差(n＝4-5)。数据显示CAR Treg可以在抗原特异性刺激后增殖，并且SFFV启动子的使用增强了增殖。
RQR8在构建体I中被用作安全开关。为了证明其在肝脏中的有效性，用表达RQR8的构建体转导小鼠T细胞，并在CD45.2小鼠中进行跟踪。FACS图(图15)示出了在不存在aCD20(顶部分图)和存在aCD20(底部分图)的情况下，在第7天和第15天用RQR8抗体在指示组织中染色。图示出了血液在第7天和第15天以及脾脏和淋巴结在第15天在CD45.1设门内的Qbend部分的累积数据。点指示单个小鼠。因此，可以看出，在没有利妥昔单抗的情况下，在第15天可以在肝脏中检测到细胞，但是在加入利妥昔单抗后，细胞被成功地从肝脏中删除。
进一步地，使用由构建体I(带有EFS或SFFV启动子)转导的细胞的体外检测表明，利妥昔单抗可以有效地耗竭细胞，但是当构建体I由SFFV启动子表达时，敏感性增加(图16)。FACS图示出了EFS转导的细胞(顶部分图)和SFFV转导的细胞(底部分图)在指示浓度的利妥昔单抗下活RQR8(Qbend+)细胞的百分比。曲线图示出了基于每种病症中活RQR8+细胞相对于仅用补体治疗的细胞的比例来计算的杀伤百分比。曲线图示出了4个单独实验的平均值±标准差。
结论
总之，图2至图16中所呈现的结果证实，与以不同顺序编码组分的构建体(比如构建体IV(F-C-R)或构建体II(F-R-C))相比，使用以R-F-C顺序编码组分的构建体I可以获得所需组分CAR(C)、安全开关(R)和FOXP3(F)的表达改善，并且减少了不需要的表达模式的发生率，其中例如，组分中的一个的表达显著减少或不存在。FOXP3的表达达到了不同寻常且令人惊讶的高水平，并且这些被证明对Treg的扩增和存活无害。
进一步地，数据表明使用SFFV启动子进行构建体表达有明显的额外优势，包括CAR在抗原存在下的激活意外得到改善、转导的Treg的增殖增加以及转导的细胞对利妥昔单抗介导的耗竭的敏感性增加。
序列表
<110> 圭尔医疗有限公司
<120> 用于在细胞中表达多肽的核酸构建体
<130> FSP1V230244ZX
<150> GB2013477.1
<151> 2020-08-27
<160> 95
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> RQR8
<400> 1
Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser
20 25 30
Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu
35 40 45
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
50 55 60
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
65 70 75 80
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
85 90 95
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
100 105 110
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg
115 120 125
Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
130 135
<210> 2
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FOXP3，UniProtKB登录号：Q9BZS1
<400> 2
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Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
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Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
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Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val
260 265 270
Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser
290 295 300
Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met
325 330 335
Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu
340 345 350
Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr
355 360 365
Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala
370 375 380
Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
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<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FOXP3, aa418突变体
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Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
385 390 395 400
Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys
405 410 415
Arg Glu Gln Arg Pro Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro
420 425 430
<210> 4
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FOXP3, aa422突变体
<400> 4
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met
50 55 60
Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
85 90 95
Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His
100 105 110
Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met
115 120 125
Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
165 170 175
Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu
210 215 220
Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val
260 265 270
Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser
290 295 300
Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met
325 330 335
Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu
340 345 350
Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr
355 360 365
Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala
370 375 380
Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
385 390 395 400
Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys
405 410 415
Arg Ser Gln Arg Pro Ala Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro
420 425 430
<210> 5
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FOXP3, aa418和422突变体
<400> 5
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met
50 55 60
Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
85 90 95
Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His
100 105 110
Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met
115 120 125
Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
165 170 175
Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu
210 215 220
Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met
245 250 255
Gln Ala His Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val
260 265 270
Ala Ser Ser Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln
275 280 285
Gly Pro Val Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser
290 295 300
Leu Phe Ala Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Pro Glu Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met
325 330 335
Arg Pro Pro Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu
340 345 350
Ala Pro Glu Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr
355 360 365
Arg Met Phe Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala
370 375 380
Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser
385 390 395 400
Glu Lys Gly Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys
405 410 415
Arg Glu Gln Arg Pro Ala Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro
420 425 430
<210> 6
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FOXP3，截短型变体
<400> 6
Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met Pro Pro Ser
1 5 10 15
Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala Pro Ser Gly
20 25 30
Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu Gln Asp Arg
35 40 45
Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His Ala Arg Thr
50 55 60
Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met Ile Ser Leu
65 70 75 80
Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys Ala Arg Pro
85 90 95
Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp Val Ser Arg
100 105 110
Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala Pro Arg Lys
115 120 125
Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro Leu Leu Ala
130 135 140
Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe Glu Glu Pro
145 150 155 160
Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu Asp Glu Lys
165 170 175
Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln Ser Leu Glu
180 185 190
Gln Gln Leu Val Leu Glu Lys Glu Lys Leu Ser Ala Met Gln Ala His
195 200 205
Leu Ala Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser
210 215 220
Asp Lys Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val
225 230 235 240
Val Pro Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala
245 250 255
Val Arg Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu
260 265 270
Phe Leu His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met Arg Pro Pro
275 280 285
Phe Thr Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu
290 295 300
Lys Gln Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe
305 310 315 320
Ala Phe Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala Ile Arg His
325 330 335
Asn Leu Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly
340 345 350
Ala Val Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe
355 360
<210> 7
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FOXP3，说明性变体
<400> 7
Met Pro Asn Pro Arg Pro Gly Lys Pro Ser Ala Pro Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ser Pro Ser Trp Arg Ala Ala Pro Lys Ala
20 25 30
Ser Asp Leu Leu Gly Ala Arg Gly Pro Gly Gly Thr Phe Gln Gly Arg
35 40 45
Asp Leu Arg Gly Gly Ala His Ala Ser Ser Ser Ser Leu Asn Pro Met
50 55 60
Pro Pro Ser Gln Leu Gln Leu Pro Thr Leu Pro Leu Val Met Val Ala
65 70 75 80
Pro Ser Gly Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro His Leu Gln Ala Leu Leu
85 90 95
Gln Asp Arg Pro His Phe Met His Gln Leu Ser Thr Val Asp Ala His
100 105 110
Ala Arg Thr Pro Val Leu Gln Val His Pro Leu Glu Ser Pro Ala Met
115 120 125
Ile Ser Leu Thr Pro Pro Thr Thr Ala Thr Gly Val Phe Ser Leu Lys
130 135 140
Ala Arg Pro Gly Leu Pro Pro Gly Ile Asn Val Ala Ser Leu Glu Trp
145 150 155 160
Val Ser Arg Glu Pro Ala Leu Leu Cys Thr Phe Pro Asn Pro Ser Ala
165 170 175
Pro Arg Lys Asp Ser Thr Leu Ser Ala Val Pro Gln Ser Ser Tyr Pro
180 185 190
Leu Leu Ala Asn Gly Val Cys Lys Trp Pro Gly Cys Glu Lys Val Phe
195 200 205
Glu Glu Pro Glu Asp Phe Leu Lys His Cys Gln Ala Asp His Leu Leu
210 215 220
Asp Glu Lys Gly Arg Ala Gln Cys Leu Leu Gln Arg Glu Met Val Gln
225 230 235 240
Ser Leu Glu Gln Val Glu Glu Leu Ser Ala Met Gln Ala His Leu Ala
245 250 255
Gly Lys Met Ala Leu Thr Lys Ala Ser Ser Val Ala Ser Ser Asp Lys
260 265 270
Gly Ser Cys Cys Ile Val Ala Ala Gly Ser Gln Gly Pro Val Val Pro
275 280 285
Ala Trp Ser Gly Pro Arg Glu Ala Pro Asp Ser Leu Phe Ala Val Arg
290 295 300
Arg His Leu Trp Gly Ser His Gly Asn Ser Thr Phe Pro Glu Phe Leu
305 310 315 320
His Asn Met Asp Tyr Phe Lys Phe His Asn Met Arg Pro Pro Phe Thr
325 330 335
Tyr Ala Thr Leu Ile Arg Trp Ala Ile Leu Glu Ala Pro Glu Lys Gln
340 345 350
Arg Thr Leu Asn Glu Ile Tyr His Trp Phe Thr Arg Met Phe Ala Phe
355 360 365
Phe Arg Asn His Pro Ala Thr Trp Lys Asn Ala Ile Arg His Asn Leu
370 375 380
Ser Leu His Lys Cys Phe Val Arg Val Glu Ser Glu Lys Gly Ala Val
385 390 395 400
Trp Thr Val Asp Glu Leu Glu Phe Arg Lys Lys Arg Ser Gln Arg Pro
405 410 415
Ser Arg Cys Ser Asn Pro Thr Pro Gly Pro Glu Gly Arg Gly Ser Leu
420 425 430
Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
435 440
<210> 8
<211> 1296
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FOXP3，说明性FOXP3多核苷酸
<400> 8
atgcccaacc ccaggcctgg caagccctcg gccccttcct tggcccttgg cccatcccca 60
ggagcctcgc ccagctggag ggctgcaccc aaagcctcag acctgctggg ggcccggggc 120
ccagggggaa ccttccaggg ccgagatctt cgaggcgggg cccatgcctc ctcttcttcc 180
ttgaacccca tgccaccatc gcagctgcag ctgcccacac tgcccctagt catggtggca 240
ccctccgggg cacggctggg ccccttgccc cacttacagg cactcctcca ggacaggcca 300
catttcatgc accagctctc aacggtggat gcccacgccc ggacccctgt gctgcaggtg 360
caccccctgg agagcccagc catgatcagc ctcacaccac ccaccaccgc cactggggtc 420
ttctccctca aggcccggcc tggcctccca cctgggatca acgtggccag cctggaatgg 480
gtgtccaggg agccggcact gctctgcacc ttcccaaatc ccagtgcacc caggaaggac 540
agcacccttt cggctgtgcc ccagagctcc tacccactgc tggcaaatgg tgtctgcaag 600
tggcccggat gtgagaaggt cttcgaagag ccagaggact tcctcaagca ctgccaggcg 660
gaccatcttc tggatgagaa gggcagggca caatgtctcc tccagagaga gatggtacag 720
tctctggagc agcagctggt gctggagaag gagaagctga gtgccatgca ggcccacctg 780
gctgggaaaa tggcactgac caaggcttca tctgtggcat catccgacaa gggctcctgc 840
tgcatcgtag ctgctggcag ccaaggccct gtcgtcccag cctggtctgg cccccgggag 900
gcccctgaca gcctgtttgc tgtccggagg cacctgtggg gtagccatgg aaacagcaca 960
ttcccagagt tcctccacaa catggactac ttcaagttcc acaacatgcg accccctttc 1020
acctacgcca cgctcatccg ctgggccatc ctggaggctc cagagaagca gcggacactc 1080
aatgagatct accactggtt cacacgcatg tttgccttct tcagaaacca tcctgccacc 1140
tggaagaacg ccatccgcca caacctgagt ctgcacaagt gctttgtgcg ggtggagagc 1200
gagaaggggg ctgtgtggac cgtggatgag ctggagttcc gcaagaaacg gagccagagg 1260
cccagcaggt gttccaaccc tacacctggc ccctga 1296
<210> 9
<211> 1352
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FOXP3，说明性FOXP3多核苷酸
<400> 9
gaattcgtcg acatgcccaa ccccagaccc ggcaagcctt ctgccccttc tctggccctg 60
ggaccatctc ctggcgcctc cccatcttgg agagccgccc ctaaagccag cgatctgctg 120
ggagctagag gccctggcgg cacattccag ggcagagatc tgagaggcgg agcccacgcc 180
tctagcagca gcctgaatcc catgccccct agccagctgc agctgcctac actgcctctc 240
gtgatggtgg cccctagcgg agctagactg ggccctctgc ctcatctgca ggctctgctg 300
caggaccggc cccactttat gcaccagctg agcaccgtgg acgcccacgc cagaacacct 360
gtgctgcagg tgcaccccct ggaaagccct gccatgatca gcctgacccc tccaaccaca 420
gccaccggcg tgttcagcct gaaggccaga cctggactgc cccctggcat caatgtggcc 480
agcctggaat gggtgtcccg cgaacctgcc ctgctgtgca ccttccccaa tcctagcgcc 540
cccagaaagg acagcacact gtctgccgtg ccccagagca gctatcccct gctggctaac 600
ggcgtgtgca agtggcctgg ctgcgagaag gtgttcgagg aacccgagga cttcctgaag 660
cactgccagg ccgaccatct gctggacgag aaaggcagag cccagtgcct gctgcagcgc 720
gagatggtgc agtccctgga acagcagctg gtgctggaaa aagaaaagct gagcgccatg 780
caggcccacc tggccggaaa gatggccctg acaaaagcca gcagcgtggc cagctccgac 840
aagggcagct gttgtatcgt ggccgctggc agccagggac ctgtggtgcc tgcttggagc 900
ggacctagag aggcccccga tagcctgttt gccgtgcgga gacacctgtg gggcagccac 960
ggcaactcta ccttccccga gttcctgcac aacatggact acttcaagtt ccacaacatg 1020
aggcccccct tcacctacgc caccctgatc agatgggcca ttctggaagc ccccgagaag 1080
cagcggaccc tgaacgagat ctaccactgg tttacccgga tgttcgcctt cttccggaac 1140
caccccgcca cctggaagaa cgccatccgg cacaatctga gcctgcacaa gtgcttcgtg 1200
cgggtggaaa gcgagaaggg cgccgtgtgg acagtggacg agctggaatt tcggaagaag 1260
cggtcccaga ggcccagccg gtgtagcaat cctacacctg gccctgaggg cagaggaagt 1320
ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat cc 1352
<210> 10
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 具有信号肽的RQR8
<400> 10
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser
35 40 45
Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro
65 70 75 80
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
85 90 95
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
100 105 110
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
115 120 125
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
130 135 140
Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
145 150 155
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PB2 VH CDR1
<400> 11
Asp Tyr Gly Met His
1 5
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PB2 VH CDR2
<400> 12
Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PB2 VH CDR3
<400> 13
Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PB2 VL CDR1
<400> 14
Gln Ser Ser Leu Asp Ile Ser His Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PB2 VL CDR2
<400> 15
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PB2 VH CDR3
<400> 16
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH 3PB2
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr
115
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL 3PB2
<400> 18
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Leu Asp Ile Ser His Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ScFv 3PB2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (118)..(118)
<223> Xaa代表X(n)，其中，X是任意氨基酸，并且n为15-25。
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Xaa Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
115 120 125
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser
130 135 140
Leu Asp Ile Ser His Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
145 150 155 160
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val
165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
195 200 205
Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
210 215 220
Lys
225
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PF12 VH CDR1
<400> 20
Asp Tyr Gly Met His
1 5
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PF12 VH CDR2
<400> 21
Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PF12 VH CDR3
<400> 22
Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B11 VL CDR1
<400> 23
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B11 VL CDR2
<400> 24
Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B11 VH CDR3
<400> 25
Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 26
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VH 3PF12
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr
115
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VL B11
<400> 27
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105
<210> 28
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ScFv
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu
180 185 190
Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Val Leu Gly
245
<210> 29
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> P2A肽——剪切结构域
<400> 29
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 30
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> T2A肽——剪切结构域
<400> 30
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> E2A肽——剪切结构域
<400> 31
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 32
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F2A肽——剪切结构域
<400> 32
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 来自CD20的利妥昔单抗结合表位
<400> 33
Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr
1 5 10 15
Cys
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 34
Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 35
Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 36
Ala Cys Pro Phe Ala Asn Pro Ser Thr Cys
1 5 10
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 37
Ala Cys Asn Phe Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 38
Ala Cys Pro Phe Ser Asn Pro Ser Met Cys
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 39
Ala Cys Ser Trp Ala Asn Pro Ser Gln Cys
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 40
Ala Cys Met Phe Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 41
Ala Cys Pro Phe Ala Asn Pro Ser Met Cys
1 5 10
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 42
Ala Cys Trp Ala Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 43
Ala Cys Glu His Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5 10
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 44
Ala Cys Trp Ala Ala Asn Pro Ser Met Cys
1 5 10
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 45
Cys Pro Tyr Ala Asn Pro Ser Leu Cys
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 46
Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 47
Cys Pro Phe Ala Asn Pro Ser Thr Cys
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 48
Cys Asn Phe Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 49
Cys Pro Phe Ser Asn Pro Ser Met Cys
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 50
Cys Ser Trp Ala Asn Pro Ser Gln Cys
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 51
Cys Met Phe Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 52
Cys Pro Phe Ala Asn Pro Ser Met Cys
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 53
Cys Trp Ala Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 54
Cys Glu His Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 利妥昔单抗模拟表位
<400> 55
Cys Trp Ala Ala Asn Pro Ser Met Cys
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 环状利妥昔单抗模拟表位共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是Ala或Ser
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 56
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Asn Pro Ser Xaa Cys
1 5 10
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 非圆环状利妥昔单抗模拟表位
<400> 57
Gln Asp Lys Leu Thr Gln Trp Pro Lys Trp Leu Glu
1 5 10
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> QBend表位序列
<400> 58
Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser
1 5 10 15
<210> 59
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8胞外茎序列
<400> 59
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
1 5 10 15
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
20 25 30
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40
<210> 60
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8茎、胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域
<400> 60
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
1 5 10 15
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
20 25 30
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
35 40 45
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
50 55 60
Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro
65 70 75 80
Val Val
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头序列
<400> 61
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头序列
<400> 62
Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头结构域
<400> 63
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 64
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 来自RQR8的S1-Q-S2接头序列
<400> 64
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn
1 5 10 15
Val Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala
20 25 30
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 信号肽（安全开关多肽）
<400> 65
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp
20
<210> 66
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR的前导/信号序列 (经修饰的CD8a前导)
<400> 66
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Ala Pro
20
<210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8a跨膜结构域
<400> 67
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 68
<211> 81
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR的经修饰的CD8a铰链结构域和CD8a跨膜结构域
<400> 68
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
50 55 60
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
65 70 75 80
Arg
<210> 69
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 经修饰的CD8a铰链
<400> 69
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Asp
50
<210> 70
<211> 82
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 野生型CD8a铰链
<400> 70
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70 75 80
His Arg
<210> 71
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28胞内域（2AA跨膜——WV）
<400> 71
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
1 5 10 15
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 72
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ 胞内域相比于野生型1个氨基酸缺失
<400> 72
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
Ser Gln Leu
115
<210> 73
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28跨膜结构域
<400> 73
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 74
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD28铰链和跨膜
<400> 74
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 75
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 野生型CD8a前导/信号序列
<400> 75
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 76
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 野生型 hCD3ζ胞内域
<400> 76
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 77
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 野生型CD28胞内域
<400> 77
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 78
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> OX40信号转导结构域
<400> 78
Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
1 5 10 15
Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln
20 25 30
Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
35 40
<210> 79
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 41BB信号转导结构域
<400> 79
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 80
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ICOS信号转导结构域
<400> 80
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 81
<211> 197
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TNFRSF25信号转导结构域
<400> 81
Thr Tyr Thr Tyr Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala
1 5 10 15
Asp Glu Ala Gly Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Asp Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser
35 40 45
Glu Lys Ile Cys Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly
50 55 60
Tyr Pro Glu Thr Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp
65 70 75 80
Asp Gln Leu Pro Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu
85 90 95
Ser Pro Glu Ser Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly
100 105 110
Pro Gln Leu Tyr Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys
115 120 125
Glu Phe Val Arg Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val
130 135 140
Glu Val Glu Ile Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys
145 150 155 160
Arg Trp Arg Gln Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala
165 170 175
Leu Glu Arg Met Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg
180 185 190
Leu Gln Arg Gly Pro
195
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Furin切割位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 82
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 83
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Furin切割位点
<400> 83
Arg Arg Lys Arg
1
<210> 84
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL2RB
<400> 84
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 85
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL2RB截短型——Y510
<400> 85
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
85 90
<210> 86
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IL2RB截短型——Y510和Y392
<400> 86
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser
65 70 75 80
Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser
85 90 95
Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met
100 105 110
Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro
115 120 125
Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro
130 135 140
Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala
145 150 155 160
Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln
165 170 175
Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala
180 185 190
Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
195 200 205
<210> 87
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SFFV启动子
<400> 87
Gly Thr Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly Cys Ala
1 5 10 15
Ala Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Cys
20 25 30
Cys Ala Ala Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly
50 55 60
Cys Gly Gly Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Ala
65 70 75 80
Gly Cys Thr Ala Ala Cys Gly Thr Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala
85 90 95
Ala Cys Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Cys Gly Gly Thr
100 105 110
Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr Thr Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys
115 120 125
Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala
130 135 140
Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys Ala Gly
145 150 155 160
Thr Thr Thr Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly
165 170 175
Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Thr Gly
180 185 190
Gly Thr Cys Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala Thr Gly Gly Cys Cys
195 200 205
Cys Ala Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr Thr
210 215 220
Cys Thr Thr Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Cys
245 250 255
Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Gly Ala
260 265 270
Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Thr Ala Thr Thr Thr Gly
275 280 285
Ala Ala Thr Thr Ala Ala Cys Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys Cys
290 295 300
Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Thr
305 310 315 320
Thr Cys Gly Cys Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Thr
325 330 335
Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Thr Cys Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala
340 345 350
Gly Ala Gly Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Thr Cys
355 360 365
Ala Cys Thr Cys Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys
370 375 380
Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Thr
385 390 395 400
Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly
405
<210> 88
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 3PB2 scFv
<400> 88
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Leu Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Asn Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Lys Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asn Gly Glu Ser Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Val Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gln Ser Ser Leu Asp Ile Ser His Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn
180 185 190
Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
His Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 89
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 接头序列
<400> 89
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Thr
20
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SGGGGS小接头
<400> 90
Glu Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu
1 5 10
<210> 91
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> SGGGGS大接头
<400> 91
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 92
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 安全开关多肽
<400> 92
Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Glu Thr Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Arg Leu Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
35 40 45
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
50 55 60
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
65 70 75 80
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
85 90 95
Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Arg Pro Val Val
115
<210> 93
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 安全开关多肽
<400> 93
Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro
20 25 30
Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
35 40 45
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
50 55 60
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
85 90 95
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg
100 105 110
Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
115 120
<210> 94
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 含有信号肽及SEQ ID NO. 92的氨基酸序列的多肽（含前导的1×SGGGGS）
<400> 94
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Glu Thr
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Leu Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu
35 40 45
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
50 55 60
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
65 70 75 80
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
85 90 95
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
100 105 110
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg
115 120 125
Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
130 135
<210> 95
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 含有信号肽及SEQ ID NO. 93的氨基酸序列的多肽（含前导的3×SGGGGS）
<400> 95
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro
35 40 45
Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro
50 55 60
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
65 70 75 80
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
85 90 95
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
100 105 110
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
115 120 125
His Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
130 135 140

Claims (47)

1.一种核酸分子，所述核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码包含自杀部分的安全开关多肽；
(ii)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码FOXP3；以及
(iii)第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)。
2.如权利要求1所述的核酸分子，所述安全开关多肽、所述FOXP3和所述CAR能够作为单独的多肽实体由所述核酸分子表达。
3.如权利要求1或权利要求2所述的核酸分子，其中所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列由编码自剪切序列的核苷酸序列分开。
4.如权利要求1至3任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子不含任何其他编码核苷酸序列。
5.如权利要求1至4任一项所述的核酸分子，其中所述安全开关多肽包含被抗体识别的自杀部分，并且其中当所述安全开关多肽在细胞的表面表达时，所述抗体与所述安全开关多肽结合使所述细胞被清除，任选地其中所述自杀部分是被抗体利妥昔单抗识别的CD20表位。
6.如权利要求1至5任一项所述的核酸部分，其中所述安全开关多肽包含具有下式的序列：
R1-L-R2-St
其中R1和R2是利妥昔单抗结合表位；
St是茎序列，当所述多肽在细胞的表面表达时，所述茎序列使R1表位和R2表位从所述细胞表面伸出；以及
L是接头序列。
7.如权利要求6所述的核酸分子，其中所述安全开关多肽是：
(i)RQR8多肽，其具有SEQ ID NO.1的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列；或者
(ii)多肽，其具有SEQ ID NO.92或93的序列或与SEQ ID NO.92或93具有至少80％序列同一性的序列。
8.如权利要求3至7任一项所述的核酸分子，其中所述自剪切序列是2A序列，任选地其中所述安全开关多肽与FOXP3之间的自剪切序列为P2A序列，并且所述FOXP3与所述CAR之间的自剪切序列为T2A序列。
9.如权利要求1至8任一项所述的核酸分子，其中所述FOXP3是包含与SEQ ID NO.2或7具有至少70％序列同一性的氨基酸序列的多肽、或包含相对于SEQ ID NO.2或7缺失第72-106位或第246-272位氨基酸的氨基酸序列的多肽，优选地其中所述FOXP3是包含或由SEQID NO.2组成的多肽。
10.如权利要求1至9任一项所述的核酸分子，其中所述CAR针对HLA分子，任选地其中所述HLA分子是HLA-A2。
11.如权利要求1至9任一项所述的核酸分子，其中所述CAR不针对MHC II类。
12.如权利要求1至11任一项所述的核酸分子，其中：
(i)所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含分别如SEQ ID NO.11、12和13所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO.14、15、16所示的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；或者
(ii)所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含分别如SEQ ID NO.20、21和22所示的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列，以及分别如SEQ ID NO.23、24和25所示的VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3序列；
其中，(i)或(ii)的所述CDR序列中的一个或多个可以任选地包含相对于前述CDR序列的1至3个氨基酸修饰，特别地其中所述CDR序列中的一个或多个可以任选地通过取代、添加或缺失1至3个氨基酸来修饰。
13.如权利要求12所述的核酸分子，其中：
(i)所述CAR的所述抗原结合结构域包含VH结构域，所述VH结构域包含如SEQ IDNO.17所示的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列，以及VL结构域，所述VL结构域包含如SEQ ID NO.18所示的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列；或者
(ii)所述CAR的所述抗原结合结构域包含VH结构域，所述VH结构域包含如SEQ IDNO.26所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列，以及VL结构域，所述VL结构域包含如SEQ ID NO.27所示的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。
14.如权利要求1至13任一项所述的核酸分子，其中所述CAR包含scFv形式的抗原结合结构域。
15.如权利要求10至14任一项所述的核酸分子，其中所述CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)如SEQ ID NO.19或88所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列；或者
(ii)如SEQ ID NO.28所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列。
16.如权利要求1至15任一项所述的核酸分子，其中所述CAR包含：
(i)铰链结构域，所述铰链结构域选自CD8、CD28、CD4、CD7或免疫球蛋白的铰链区或其一部分或变体；
(ii)跨膜结构域，所述跨膜结构域选自CD8α、CD28、CD4、CD3ζ、CD45、CD9、CD16、CD22、CD33、CD64、CD80、CD86、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)或CD154的跨膜结构域或其部分或其变体；
(iii)任选的共刺激结构域，所述共刺激结构域选自CD28、OX40、41BB、ICOS或TNFRSF25的胞内结构域，以及
(iv)细胞内信号转导结构域，所述细胞内信号转导结构域选自T细胞受体的ζ链或其任何同源物的胞内域、CD3多肽胞内域、syk家族酪氨酸激酶)、src家族酪氨酸激酶CD2、CD5和CD28、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的胞质尾区、携带细胞质受体的免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)或其组合。
17.如权利要求1至16任一项所述的核酸分子，其中：
(i)所述CAR包含人CD8铰链结构域或其变体和人CD8跨膜结构域；和/或
(ii)所述CAR包含胞内域，所述胞内域包含人CD28共刺激结构域和人CD3ζ信号转导结构域；和/或
(iii)所述CAR包含胞内域，所述胞内域包含STAT5关联基序、JAK1和/或JAK2结合基序和任选的JAK3结合基序，优选地其中所述CAR的胞内域包含来自白细胞介素(IL)受体的胞内域的一个或多个序列。
18.如权利要求1至17任一项所述的核酸，其中所述核酸分子从5’到3’包含：
(i)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码安全开关多肽，所述安全开关多肽包含SEQ ID NO.10、94或95的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)核苷酸序列，所述核苷酸序列编码P2A剪切序列；
(iii)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码FOXP3多肽，所述FOXP3多肽包含SEQID NO.2的序列或与其具有至少70％序列同一性的序列；
(iv)核苷酸序列，所述核苷酸序列编码T2A剪切序列；以及
(vi)第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列编码针对HLA-A2的CAR，其中，所述CAR包含：
(a)前导序列，所述前导序列包含或由SEQ ID NO.66所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(b)抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含或由SEQ ID NO.19或88所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(c)CD8α铰链和跨膜结构域序列，所述CD8α铰链和跨膜结构域序列包含或由SEQ IDNO.68所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(d)CD28共刺激结构域，所述CD28共刺激结构域包含或由SEQ ID NO.71所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成；
(e)CD3ζ信号转导结构域，所述CD3ζ信号转导结构域包含或由SEQ ID NO.72所示的序列或与其具有至少80％序列同一性的序列组成。
19.一种表达构建体，所述表达构建体包含如权利要求1至18任一项所述的核酸分子，其中所述第一多核苷酸序列、所述第二多核苷酸序列和所述第三多核苷酸序列可操作地连接到启动子，任选地其中所述启动子是病毒启动子、任选地是LTR启动子。
20.如权利要求19所述的表达构建体，其中所述启动子是启动子SFFV。
21.一种载体，所述载体包含如权利要求1至18任一项所述的核酸分子或如权利要求19或权利要求20所述的表达构建体。
22.如权利要求21所述的载体，其中所述载体是病毒载体，任选地是慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
23.一种细胞，所述细胞包含如权利要求1至18任一项所述的核酸分子、如权利要求19或权利要求20所述的表达构建体或如权利要求21或权利要求22所述的载体，任选地其中所述细胞是生产宿主细胞。
24.如权利要求23所述的细胞，其中所述细胞在细胞表面共表达所述安全开关多肽和所述CAR。
25.如权利要求23或权利要求24所述的细胞，其中所述细胞是：
(i)免疫细胞或其祖细胞或前体，优选T细胞或其前体，更优选Treg或Tcon细胞或其前体；或者
(ii)干细胞、优选iPSC细胞。
26.如权利要求23至25任一项所述的细胞，其中所述细胞是Treg细胞。
27.一种细胞群，所述细胞群包含如权利要求23至26任一项所述的细胞。
28.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求23至26任一项所述的细胞、如权利要求27所述的细胞群或如权利要求21或权利要求22所述的载体。
29.一种用于治疗的如权利要求23至26任一项所述的细胞、如权利要求27所述的细胞群或如权利要求28所述的药物组合物。
30.一种用于过继性细胞转移疗法的如权利要求23至26任一项所述的细胞、如权利要求27所述的细胞群或如权利要求28所述的药物组合物。
31.一种用于治疗传染性、神经退行性或炎症性疾病或用于诱导免疫抑制的如权利要求23至26任一项所述的细胞、如权利要求27所述的细胞群或如权利要求28所述的药物组合物。
32.如权利要求23至26任一项所述的细胞、如权利要求27所述的细胞群或如权利要求28所述的药物组合物，用于诱导对移植物的耐受性，治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病，促进组织修复和/或组织再生，或改善受试者的炎症；特别地其中所述细胞是Treg细胞。
33.一种诱导对移植物的耐受性，治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病，或促进组织修复和/或组织再生，或改善炎症的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求23至26任一项所定义的细胞(特别地，Treg细胞)、如权利要求27所述的细胞群或如权利要求28所定义的药物组合物(特别地，包含Treg细胞)的步骤。
34.根据权利要求33所述的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)任选地从受试者分离或提供富集Treg的细胞样品；
(ii)将如权利要求1至18任一项所述的核酸分子、如权利要求19或权利要求20所述的表达构建体或如权利要求21或权利要求22所述的载体引入到所述Treg细胞中；以及
(iii)将来自(ii)的所述Treg细胞施用于所述受试者。
35.如权利要求23至26任一项所定义的细胞或如权利要求27所述的细胞群在制造用于诱导对移植物的耐受性，治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥反应，治疗和/或预防移植物抗宿主病(GvHD)、自身免疫性或过敏性疾病，或促进组织修复和/或组织再生，或改善受试者的炎症的药物中的用途；特别地其中所述细胞是Treg细胞。
36.根据权利要求32所述用途的细胞、细胞群或药物组合物，根据权利要求33或权利要求34所述的方法或根据权利要求35所述的用途，其中所述受试者是接受免疫抑制治疗的移植物受体，任选地其中所述移植物选自肝脏、肾脏、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、血管化复合组织移植物和皮肤移植物，特别地其中所述移植物是肝脏移植物。
37.根据权利要求36所述的用途的细胞、细胞群或药物组合物、方法或用途，其中：
(i)所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合域能够与选自以下的抗原特异性结合：存在于移植肝脏中但不存在于受体中的HLA抗原、肝脏特异性抗原(比如NTCP)、或在排斥反应或组织炎症期间表达上调的抗原(比如CCL19、MMP9、SLC1A3、MMP7、HMMR、TOP2A、GPNMB、PLA2G7、CXCL9、FABP5、GBP2、CD74、CXCL10、UBD、CD27、CD48、CXCL11)；和/或
(ii)所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够与存在于移植供体中但不存在于移植物受体中的HLA抗原特异性结合，特别地其中所述抗原是HLA-A2；和/或
(iii)所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含如SEQ ID NO.19、88或28所示的序列或与SEQ ID NO.19、88或28具有至少80％同一性的序列。
38.根据权利要求32至37任一项所述的用途的细胞、细胞群或药物组合物、方法或用途，其中所述自身免疫性或过敏性疾病选自炎症性皮肤疾病，包括银屑病和皮炎；与炎症性肠道疾病关联的反应，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎；皮炎；过敏性病症，包括食物过敏、湿疹和哮喘；类风湿关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)，包括狼疮性肾炎和皮肤狼疮；糖尿病，包括1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病；CIPD、多发性硬化症、神经退行性疾病，包括ALS；以及幼年型糖尿病。
39.用于制作根据权利要求23至26任一项所述的细胞的方法，所述方法包括将如权利要求1至18任一项所述的核酸分子、如权利要求19或权利要求20所述的表达构建体或如权利要求21或权利要求22所述的载体引入到所述细胞中的步骤。
40.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞是Treg细胞，并且所述方法包括分离或提供包含Treg的含细胞样品，和/或在将所述核酸分子、所述表达构建体或所述载体引入到所述细胞中的步骤之前或之后从所述含细胞样品中富集和/或生成Treg。
41.一种增强来自核酸分子的FOXP3的表达的方法，所述核酸分子在细胞中编码嵌合抗原受体(CAR)、安全开关和FOXP3，所述方法包括选择如权利要求1至18任一项所定义的核酸分子，并且将所述核酸分子引入到所述细胞中。
42.如权利要求41所述的方法，其中来自所述核酸分子的所述CAR的表达也在所述细胞中增强。
43.如权利要求1至18任一项所定义的核酸分子在细胞内表达自杀部分、FOXP3和CAR的用途，其中FOXP3的表达被增强。
44.如权利要求43所述的用途，其中所述CAR在所述细胞中的表达也被增强。
45.如权利要求41或权利要求42所述的方法或如权利要求43或权利要求44所述的用途，其中所述方法或所述用途包括产生核酸分子，所述核酸分子包含特定顺序的所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列。
46.一种增加表达安全开关多肽的细胞对利妥昔单抗的敏感性的方法，所述安全开关多肽包含被利妥昔单抗识别的至少一个CD20表位的自杀部分，所述方法包括将核酸分子引入到所述细胞中，所述核酸分子包含编码所述安全开关多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地连接到SFFV启动子。
47.核酸分子的用途，所述核酸分子包含可操作地连接到SFFV启动子的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码包含被利妥昔单抗识别的至少一个CD20表位的自杀部分的安全开关多肽，用于增加细胞对利妥昔单抗的敏感性。
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