CN116200458A

CN116200458A - 一种确定dna分子正负链甲基化差异的建库测序方法

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Publication number: CN116200458A
Application number: CN202111442944.0A
Authority: CN
Inventors: 夏军; 宋喆; 史千玉; 赵霞; 杨新; 张恬颖
Original assignee: MGI Tech Co Ltd
Current assignee: MGI Tech Co Ltd
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-06-02

Abstract

本发明公开了一种确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序方法。本发明提供了确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序方法，包括如下步骤：1)使用分子标签UMI对多个DNA双链分子的正链和负链进行标记，得到标记分子标签的DNA分子库；2)重亚硫酸盐转化所述DNA分子库中的DNA分子，使所述DNA分子中未甲基化修饰的C碱基转化为U碱基，得到转化后DNA分子；3)对所述转化后DNA分子依次进行PCR扩增、构建测序文库和测序；判断同一DNA分子正负链甲基化修饰的差异。本发明相对于传统的全基因组甲基化测序，本发明能更精确的检测出DNA分子的甲基化差异，对甲基化的动态变化的检测更准确。

Description

一种确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序方法。

背景技术

DNA甲基化是表观遗传学的重要表现形式，其既能表现出环境差异所致的性状的改变，又能表现出可随DNA的复制过程遗传给子代的遗传特性。DNA甲基化能调控基因表达，在维持正常的细胞功能和遗传印记以及在胚胎发育和人类肿瘤发生中起着重要作用。广义上的DNA甲基化是指DNA链上的碱基子在DNA甲基化转移酶的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)作为甲基供体，通过共价键结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。甲基化修饰可以发生在胞嘧啶的C5位、腺嘌呤的N6位以及鸟嘌呤的N7位。目前对于DNA甲基化的研究主要还是集中在对胞嘧啶C5位甲基化的研究，目前研究人类基因组上大约有1％的甲基化胞嘧啶，是目前发现的最丰富DNA修饰。但是DNA甲基化修饰不是完全稳定的，而是在一定时间段内动态变化，例如在胚胎发育过程中，DNA会经历多次去甲基化和重新甲基化的过程。DNA甲基化是依靠DNA甲基化转移酶，而DNA去甲基化能够通过两种方式，一是DNA主动去甲基化，DNA主动去甲基化呈周期性，从5mC开始到未修饰的C结束。5mC可以被氧化为5-羟基甲基胞嘧啶(5hmC)，这一过程是由一种叫做TET(ten-eleventranslocation)的家族蛋白来完成的。5hmC可以进一步被氧化成5-醛基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶，即5fC和5caC。5fC和5caC会被胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)识别并切除，将5fC和5caC从DNA中去除，经过修复而产生一个未修饰的C。二是DNA被动去甲基化，由于缺少甲基化维持酶，甲基化的胞嘧啶在基因组中被稀释掉。在DNA被动去甲基化的过程中，DNA在缺少甲基化维持酶进行辅助，可能会造成模板链被甲基化而另一条复制链未被甲基化的转态，这就造成了DNA双链的甲基化差异，而这种差异可能是导致某些基因表达异常。而目前尚未有相关的测序方法能准确定同一条DNA分子的双链上甲基化修饰的差异。

目前存在的众多检测DNA甲基化修饰的方法中，基于二代测序的DNA甲基化检测方法被应用的最为广泛。而基于二代测序的甲基化检测方法中，基于重亚硫酸盐(Bisulfite，BS)处理的全基因组测序(WGBS)是目前最常用的方法。WGBS是使用重亚硫酸盐处理(俗称BS转化)DNA，将未甲基化C“转化”为尿嘧啶(U)，最后经PCR扩增“转化”为胸腺嘧啶(T)，而发生甲基化的5mC和5hmC则不被转换，经过分析测序数据中原有位置的碱基的C/T占比就可以得出DNA的甲基化水平。依靠这样的碱基转化，重亚硫酸盐转化的方法能够检测到每一个胞嘧啶的甲基化状态，可以提供单个位点甲基化状态信息。但是基于重亚硫酸盐(Bisulfite，BS)处理的全基因组测序在进行重亚硫酸盐进行转化后，会对使双链DNA分子正负链上的C碱基发生改变，从而使得正负链产生不同的序列，可以测序分析出不同的甲基化情况，但是不能确定正负链的差异是来自同一DNA分子还是来源与同源染色体的差异造成的。

发明内容

本发明的一个目的是提供确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)使用分子标签UMI对多个DNA双链分子的正链和负链进行标记，得到标记分子标签的DNA分子库；所述DNA分子库中，来源于同一DNA双链分子的正链和负链标记相同的分子标签UMI；

上述中，源于不同的DNA双链分子带不同的分子标签，源于相同DNA双链分子正负链带有相同的分子标签；

其中，每个DNA分子中的正链的5端和3端都带有不同的分子标签，每个DNA分子中负链的3端和正链5端具有相同的标签，每个DNA分子中负链的5端与正链的3端具有相同的标签。

2)重亚硫酸盐转化所述DNA分子库中的DNA分子，使所述DNA分子中未甲基化修饰的C碱基转化为U碱基，得到转化后DNA分子；

3)对所述转化后DNA分子依次进行PCR扩增、构建测序文库和测序；根据测序结果中分子标签相同的DNA分子的正链和负链的数据，判断同一DNA分子正负链甲基化修饰的差异。

上述方法中，所述使用分子标签UMI对多个DNA双链分子的正链和负链进行标记的方法如下：

1)将带有多个分子标签的3端接头组与多个所述DNA双链分子连接，得到连接3端接头的DNA分子；

所述带有多个分子标签的3端接头组由多个带有不同分子标签的3端接头组成，且每个3端接头的分子标签不同；

每个所述3端接头由Top链和Bottom链组成，且3端接头中C碱基为甲基化修饰的C；

所述Top链从5'端到3'端包括如下4个部分：

1)第一段固定序列，由大小为8bp-16bp的核苷酸组成；在本发明的实施例为AGTCGGAGGCCAA，

2)第二段序列，为UMI分子标签，其由6-25个不等的N组成的随机序列组成，N为A、T、C、G中任一种，且其中C为甲基化修饰的C；

3)第三段固定序列，由大小为6bp-24bp的核苷酸组成；在本发明的实施例为GCGGTCTTAGGAAGAC，作用为5端接头结合部位；

4)第四段固定序列，由大小为15bp-20bp的核苷酸组成，其用于结合测序引物；根据测序平台不同变化，在本发明的实施例中为AACAACTCCTTGGCTCACA。

所述Top链中第一段固定序列的Tm值需要低于第三段固定序列的Tm值至少10℃，且5'末端化学修饰；

所述Bottom链为能与Top链中的第一段固定序列反向互补的序列(具体与Top链中的第一段固定序列的3’端起8-12bp反向互补的序列),且在所述Bottom链的3'端进行化学修饰；在本发明的实施例中Bottom链：TTCAGCCTCC，且Bottom链的3'端进行磷酸化修饰。

所述化学修饰可以有很多种，可以是磷酸化修饰和双脱氧修饰等。

2)将5端接头延伸连接到所述连接3端接头的DNA分子，得到连接5端和3端接头的DNA分子，即为正链和负链标记相同分子标签的DNA分子，这些DNA分子组成DNA分子库；

所述5端接头由如下2段序列组成：

第一段序列是与所述3端接头的Top链第三段的固定序列完全反向互补的序列，

第二段序列为不与所述3端接头的TOP链互补的25-30bp的片段，在本发明的实施例中为GAACGACATGGCTACGATCCGACTT；

所述5端接头中的C碱基为甲基化修饰的C，且在延伸连接中的dCTP为甲基化修饰dCTP。

上述方法中，步骤1)中，所述DNA双链分子大小为100bp到2000bp；

或，步骤1)中，所述DNA双链分子大于2000bp，则在步骤1)前包括如下步骤：将所述DNA分子片段化至100bp到2000bp。

本发明还提供一种用于确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述所述3端接头、所述5端接头和重亚硫酸盐转化所需试剂。

在本发明的实施例中，重亚硫酸盐转化所需试剂为EZ DNA Methylation-GoldKit。

上述试剂盒还包括PCR扩增的引物和测序文库构建所需试剂。

上述PCR扩增采用的引物与3端接头的第四段通用序列和5端接头的第一段通用序列结合，在本发明的实施例中，具体来自MGIEasy酶切DNA文库制备试剂盒，1000005254的PCR Primer Mix。

上述测序文库构建所需试剂具体见实施例2的四所用的试剂。

本发明另一个目的是提供一种确定DNA分子正负链甲基化差异的建库的方法。

本发明提供的方法，包括权利要求1-3中步骤1)-2)和步骤3)中的PCR扩增以及构建测序文库，得到确定DNA分子正负链甲基化差异的测序文库。

上述方法或上述方法制备的测序文库在确定DNA分子正负链甲基化差异中的应用也是本发明保护的范围。

上述方法或上述方法制备的测序文库在确定来源同一DNA分子正负链甲基化差异中的应用也是本发明保护的范围。

本发明使用唯一的分子标签对DNA双链分子的正链和负链进行标记，使得来自同一DNA分子的正链和负链被相同的分子标签标记，在重亚硫酸盐对DNA分子转化，将相同的分子标签连接到DNA分子的正负链上来对其进行标记，使得重亚硫酸盐转化后正负链新生成的DNA双链也被标记，在测序后，利用分子标签将测序得到信息对应回DNA的正负链上，利用唯一的分子标签判断出来做同一DNA分子的正负链的reads，判断同一DNA分子的正负链上的胞嘧啶是否处于相同甲基化修饰状态，判断同一DNA分子正负链甲基化修饰的差异。

本发明最重要的效果是能实现全基因组范围内同一DNA分子正负链甲基化差异的检测，利用对DNA分子的正负链加上相同的分子标签，在测序后利用分子标签定位相同DNA分子正负链的数据，判断正负链DNA分子是否同时具有甲基化修饰。相对于传统的全基因组甲基化测序，本发明能更精确的检测出DNA分子的甲基化差异，对甲基化的动态变化的检测更准确。

附图说明

图1为区分DNA分子正负链甲基化差异测序方法示意图。

图2为区分DNA分子正负链甲基化差异测序方法流程图。

图3为同源染色体DNA片段甲基化差异与DNA分子双链间甲基化差异。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、判断同一DNA分子正负链甲基化差异的建库测序方法的建立

区分DNA分子正负链甲基化差异测序方法原理：1)本发明使用唯一的分子标签对DNA双链分子的正链和负链进行标记，使得来自同一DNA分子的正链和负链被相同的分子标签标记，具体标记方法如下：先将带有唯一分子标签UMI的3端接头连接到DNA分子上，再使用5端接头引物经过退火延伸再连接的方法使得DNA分子加上5端接头；2)再进行使重亚硫酸盐转化，3)PCR扩增，得到2组带相同分子标签的不同的DNA分子，4)建库测序，测到分子标签和DNA分子序列，将测到的带相同分子标签的reads联系起来分析，检测出同一DNA分子正负链上的甲基化修饰状态(图1，图2)。

上述方法具体步骤如下：

一、使用唯一的分子标签对DNA双链分子的正链和负链进行标记

1、片段化DNA分子的获得

将完整的基因组DNA进行片段化，选择物理法或酶法将长的DNA分子打断成100bp到2000bp的DNA片段，得到片段化DNA。

如果DNA样本就是100bp到2000bp片段化的DNA则不需要进行打断(包括胞外游离DNA，发生降解的DNA等)。

2、末端修复和3'端加A

对步骤1得到的片段化DNA依次进行末端修复和3'端加A反应，得到加A后DNA分子。

3、连接带有唯一分子标签的3端接头

将3端接头连接到步骤2得到的加A后DNA分子，得到连接3端接头的DNA分子，其中DNA分子正链的3’端与3端接头的Top链连接，DNA分子负链的5'端紧邻3端接头的Bottom链且不连接。

上述3端接头由Top链和Bottom链组成，且3端接头中使用的C碱基都为甲基化修饰的C；具体结构如下：

Top链从5'端到3'端包括如下4个部分，且5'末端修饰，在本发明中以磷酸化修饰为例：

1)第一段固定序列：8bp-16bp,在本发明的实施例为AGTCGGAGGCCAA(序列1)，其中部分序列与Bottom链反向互补；

2)第二段序列：为UMI分子标签，其由6-25个不等的N(N中的胞嘧啶需要使用甲基化修饰的胞嘧啶)组成的随机序列，作用为标记同一DNA分子；

3)第三段固定序列：6bp-24bp,在本发明的实施例为GCGGTCTTAGGAAGAC(序列2)，作用为5端接头结合部位；

4)第四段固定序列：大小为15bp-20bp，通用固定序列，作用是结合测序引物，根据测序平台不同变化，在本发明的实施例中为AACAACTCCTTGGCTCACA(序列3)。

其中，Top链中第一段固定序列的Tm值需要低于第三段固定序列的Tm值至少10℃。

Bottom链：为能与Top链中的第一段固定序列反向互补的序列(具体与Top链中的第一段固定序列的3’端起8-12bp反向互补的序列),且在Bottom链的3'端进行化学修饰(如磷酸化修饰或双脱氧修饰)，使其无法与DNA分子的5'端进行连接，在本发明的实施例中为TTCAGCCTCC。

4、延伸连接5端接头

将5端接头延伸连接到连接3端接头的DNA分子，得到连接5端接头和3端接头的DNA分子，其中DNA分子正链的5’端连接5端接头且3’端连接3端接头的Top链；反链是5‘端连接端接头的Top链，且3'端连接5端接头；bottom链在延伸过程中掉落。

上述5端接头为由2段序列组成单链DNA分子，5端接头中的C碱基都为甲基化修饰的C；5端接头从5'端到3’端依次为第二段序列和第一段序列：

第一段序列是与3端接头Top链的第三段固定序列完全反向互补的序列，

第二段序列不与3端的TOP链互补的25-30bp的片段，具体为GAACGACATGGCTACGATCCGACTT(序列4)。

具体延伸连接方式如下：将5端接头加入到延伸连接反应体系中进行退火，5端的接头可以与3端接头Top链的第三段的固定序列进行互补配对，再进行延伸，bottom掉落，延伸到DNA分子的5'端后，进行连接反应，将5端接头连接到DNA分子上。

反应完成后，已经使得DNA分子的正负链都加上了相同的2个分子标签，分别分别位于DNA分子的两端。

二、重亚硫酸盐处理使未甲基化修饰的C碱基转化为U碱基

使用重亚硫酸盐处理上述一的4得到的连接5端和3端接头的DNA分子，得到重亚硫酸盐转化反应后DNA分子。

上述反应是将DNA分子中的未甲基化修饰的C碱基都转化为U碱基，DNA双链会变成正负2条单链DNA分子，但是来自同一DNA双链的DNA单链分子都带有相同的分子标签。

三、PCR扩增

将上述二得到的重亚硫酸盐转化反应后DNA分子，进行PCR，得到PCR产物。

PCR采用的引物分别与3端接头的第四段通用序列和5端接头的第一段通用序列结合。

经过PCR扩增，DNA分子上的U会被转换成T，一个DNA双链分子会产生1组带有接头的DNA双链产物。

四、测序

1)illumina测序

使用illumina测序平台对上述三得到的PCR产物进行测序。使用双端测序，其中测序引物与3端接头Top链中第四段固定序列结合，每端测序100bp以上。其中DNA分子的正链的reads1与负链的reads2会有带相同的分子标签，正链的reads2与负链的reads1会带有相同的分子标签。

2)DNBSEQ测序

如果DNBSEQ测序平台，则继续将上述三得到的PCR产物进行单链环化、消化，得到单链环状测序文库。

使用DNBSEQ测序平台文库对单链环状测序文库进行测序，使用双端测序，其中测序引物与3端接头Top链中第四段固定序列结合，每端测序100bp以上。其中DNA分子的正链的reads1与负链的reads2会有带相同的分子标签，正链的reads2与负链的reads1会带有相同的分子标签。

五、确定同一DNA分子正负链甲基化差异分析

上述四得到的测序数据进行信息分析，对下机数据进行质控，去除低质量的reads，再与基因组进行比对，比对后进行统计，统计测到的分子标签，利用分子标签对reads进行分组，带相同分子标签的分成一组，将来自同一DNA分子的双端的reads分到一组，再进行甲基化的分析，根据C碱基与T碱基的比例来确定同一DNA分子正负链的甲基化水平，判断正负链在对应的位点上是否同时具有甲基化修饰。

实施例2、人血液DNA样本进行确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序

实验材料：正常人全血提取的DNA样本，实验重复2次，一次命名为T1，另一次命名为T2。

一、使用分子标签对DNA双链分子的正链和负链进行标记

1、片段化DNA分子的获得

1)准备500ng DNA样本到0.2mL PCR管中，使用NF Water补足体积到45μL，将PCR管置于冰盒上。

2)取出Frag Enzyme和Frag Buffer(MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒，1000005251)，轻轻颠倒混匀10次，瞬时离心后置于冰上待用。

3)按下表1在冰上配制打断反应液。

表1为打断反应液

组分	单个反应体积
		Frag Buffer	10μL
Frag Enzyme	5μL
		总体积	15μL

4)用移液器吸取15μL配制好的打断反应液加入PCR管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

5)当PCR仪温度降至4℃，将PCR管置于PCR仪上，按照下表2中的条件进行片段化反应。

表2为片段化反应条件

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6)瞬时离心将反应液收集至管底，全部液体转移到新的1.5mL离心管中，补TE到100μL。

7)提前取出DNA Clean Beads(MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒，1000005251)，置于室温平衡至少30min，使用前充分震荡混匀。

8)用移液器吸取70μL DNA Clean Beads到新的1.5mL离心管中，并轻轻吹打至少10次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。

9)室温孵育10min，然后短暂离心后，将离心管置于磁力架上，静置5min，至液体澄清，用移液器小心吸取上清到新的1.5mL离心管中。

10)用移液器吸取20μL DNA Clean Beads到新的1.5mL离心管中，并轻轻吹打至少10次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。

11)保持离心管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇，漂洗磁珠及管壁，静置30s，小心吸取并丢弃上清。

12)重复上一步，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。

13)保持离心管固定于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光。

14)将离心管从磁力架上取下，加入32μL TE Buffer(MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒，1000005251)洗脱DNA，用移液器轻轻吸打至少10次至完全混匀。

15)室温下孵育5min，然后瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置5min至液体澄清，将30μL上清液转移到新的0.2mL PCR管中，得到片段化的DNA。

2、末端修复和3'端加A

1)使用

ssDNA Assay Kit荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的操作说明对上述1得到的片段化的DNA进行定量。根据浓度取20ng片段化的DNA到新的0.2mL PCR管中，将PCR管置于冰盒上，并加入1/20的已有相同方式打断的Unmodified CpG-methylatedλ-DNA(用来评估亚硫酸盐转化效率，来自MGIEsay全基因组甲基化文库制备试剂盒，MGI，1000005251))。

2)根据所需反应数，按照下表3配方在冰上配制末端修复反应液(试剂来源于MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒，1000005251)。

表3为末端修复反应液

组分	单个反应体积
		ER Buffer Mix	7.3μL
ER Enzyme Mix	2.7μL
		总体积	10μL

3)用移液器吸取10μL表3所示的配制好的末端修复反应液加入PCR管中，涡旋振荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

4)将PCR管置于PCR仪上，按照下表4中的条件进行反应。

表4为末端修复反应条件(反应体系40μL)

温度	时间
		65℃热盖	On
25℃	30min
		4℃	Hold

5)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底。

6)用移液器吸取6μL ER Stop Buffer加入0.2mL PCR管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底，静置2分钟.

7)将上述0.2mL PCR管置于提前预热至75℃的PCR仪上反应20min终止反应。

8)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底。

9)在冰上配制表5所示的末端修复AT反应液(试剂来源于MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒，1000005251)。

表5为末端修复AT反应液

组分	单个反应体积
		AT Buffer Mix	3.8μL
AT Enzyme Mix	0.2μL
		总体积	4μL

10)用移液器吸取4μL配制好的表5所示的末端修复AT反应液加入PCR管中，涡旋振荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

11)将PCR管置于PCR仪上，按照下表6中的条件进行加A反应。

表6为AT反应条件(反应体系50μL)

温度	时间
		65℃热盖	On
25℃	30min
		4℃	Hold

12)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，得到加A后DNA分子。

3、连接3端接头

3端接头的具体序列如下，3端接头中的C碱基都为dmC：

Top链：/5Phos/AGTCGGAGGCCAA(第一段固定序列)NNNNNNNNNNN(第二段序列)GCGGTCTTAGGAAGAC(第三段固定序列)AACAACTCCTTGGCTCACA(第四段固定序列)；

Bottom链：TTCAGCCTCC，且Bottom链的3'端进行磷酸化修饰。

1)向PCR管中加入5μL对应的3端接头，涡旋振荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

2)根据所需反应数，按照下表7的配方在冰上配制接头连接反应液(试剂来源于MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒，1000005251)。

表7为接头连接反应液

组分	单个反应体积
		Ligation Buffer	23.4μL
DNA Ligase	1.6μL
		总体积	25μL

3)用移液器缓慢吸取25μL配制好的表7所示的接头连接反应液(3端接头在反应液中的浓度为5uM)加入PCR管中，涡旋振荡6次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

4)将上述PCR管置于PCR仪上，23℃反应30min。

5)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底。全部转移到新的1.5mL离心管中。

6)提前取出DNA Clean Beads，置于室温平衡至少30min，使用前充分震荡混匀。吸取40μL DNA Clean Beads至上一步的新的1.5mL离心管中，用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。

7)室温孵育10min。

8)将离心管瞬时离心，置于磁力架上，静置2min至液体澄清，用移液器小心吸取上清并丢弃。

9)保持离心管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取上清并丢弃。

10)重复上一步，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。

11)保持离心管置于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光。

12)将离心管从磁力架上取下，加入22μL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮。

13)室温下孵育10min。

14)将离心管瞬时离心，置于磁力架上，静置2min至液体澄清，用移液器吸取20μL上清液转移到新的200μL PCR管中，得到连接3端接头的DNA分子。

4、延伸连接5端接头

5端接头的具体序列：GAACGACATGGCTACGATCCGACTT(第二段序列)GTCTTCCTAAGACCGC(第一段序列)，5端接头中的C碱基都为dmC。

1)向上述3得到装有连接3端接头的DNA分子PCR管中加入5μL 5端接头(20μM)，短暂混匀离心后，置于冰上。

2)将PCR管放置到PCR上，58℃孵育退火5min后，立刻放置到冰上。

向PCR管中加入25μL 2X KAPA HiFi HotStartReadyMix(用于延伸，罗氏，KK2602),短暂混匀离心后，置于冰上。

1)将上述PCR管放置到PCR仪上，72℃孵育5min延伸反应,取出短暂离心后，置于冰上。

2)根据所需反应数，按照下表8配方在冰上配制接头连接反应液(试剂来源于MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒，1000005251)。

表8为接头连接反应液

3)用移液器缓慢吸取25μL配制好的表8所示的接头连接反应液加入4)得到的PCR管中，涡旋振荡6次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

4)将PCR管置于PCR仪上，23℃连接反应30min。

5)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，全部转移到新的1.5mL离心管中。

6)提前取出DNA Clean Beads，置于室温平衡至少30min，使用前充分震荡混匀。吸取35.25μL DNA Clean Beads至上一步新的1.5mL离心管中，用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。

7)室温孵育10min。

13)室温下孵育10min。

14)将离心管瞬时离心，置于磁力架上，静置2min至液体澄清，用移液器吸取19μL上清液转移到新的0.2mL PCR管中，得到连接5端和3端接头的DNA分子。

二、重亚硫酸盐处理使DNA分子中的未甲基化修饰的C碱基都转化为U碱

使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research,Cat.No.D5005/D5006)对上述4得到的连接5端和3端接头的DNA分子进行Bisulfite处理和纯化，具体如下：

1)溶液配制

依次吸取900μL NF water(Water,nuclease-free，Thermo Scientific，R0582)，300μL M-Dilution Buffer和50μL M-Dissolving Buffer到一管CT Conversion Reagent粉末(开盖前需瞬时离心)，在室温下频繁涡旋震荡10min，完成CT Conversion Reagent的配制。

CT Conversion Reagent应减少曝光，最好现配现用。CT Conversion Reagent在室温下可最多保存1天，在4℃下可最多保存1周，在-20℃下可最多保存1个月，非现配的CTConversion Reagent使用前应预热到37℃，在室温下频繁涡旋震荡10min方可使用。

M-Wash Buffer第一次开盖使用前需按照瓶子标签所示加入正确体积的无水乙醇，混匀方可使用。

2)在室温下，将以下表9所示的成分加入新的0.2mL PCR管中，其中Lambda DNA不需打断，浓度为200ng/μL。

表9为重亚硫酸盐处理反应体系

将上述0.2mL PCR管置于PCR仪上，按照表10所示的Bisulfite处理条件进行反应，得到反应产物。

表10为Bisulfite处理条件

温度	时间
		热盖	On
98℃	10min
		64℃	2.5h
4℃	Hold

3)将反应产物转移到新的1.5mL离心管中，加入600μL M-Binding Buffer，涡旋震荡6次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

4)把Zymo-Spin IC Column放入2mL Collection Tube，将混合液转移至Zymo-Spin IC Column上，13000rpm离心30s，弃废液，将Zymo-Spin IC Column放回CollectionTube。

向Zymo-Spin IC Column加入100μL M-Wash Buffer，13000rpm离心30s。

向Zymo-Spin IC Column加入200μL M-Desulphonation Buffer，迅速盖紧管盖后，室温孵育15-20min，13000rpm离心30s，弃废液，将Zymo-Spin IC Column放回Collection Tube。

向Zymo-Spin IC Column加入200μL M-Wash Buffer，13000rpm离心30s，弃废液，将Zymo-Spin IC Column放回Collection Tube。

向Zymo-Spin IC Column加入200μL M-Wash Buffer，13000rpm离心30s，弃废液，将Zymo-Spin IC Column放回Collection Tube。13000rpm空转离心30s，弃CollectionTube，用移液器将Zymo-Spin IC Column外壁液体尽量吸干，放在新的1.5mL离心管中。

打开Zymo-Spin IC Column管盖，室温干燥2min，然后将Zymo-Spin IC Column放在另一新的1.5mL离心管中。

缓慢在Zymo-Spin IC Column滤膜中央加入10μL M-Elution Buffer，静置1min，13000rpm离心30s，纯化后的Bisulfite处理后的纯化产物即被收集在1.5mL离心管中。

取全部Bisulfite处理后的纯化产物于新0.2mL PCR管中，加入分子级水将总体积补至20μL，得到重亚硫酸盐转化反应后DNA分子，该DNA分子中未甲基化修饰的C碱基都转化为U碱基。

三、PCR扩增

1)在冰上配制表11所示的PCR反应液(WGBS PCR Enzyme Mix来于MGIEasy全基因组甲基化文库制备试剂盒，1000005251；PCR Primer Mix来于MGIEasy酶切DNA文库制备试剂盒，1000005254)。其中采用的引物与3端接头的第四段通用序列和5端接头的第一段通用序列结合。

表11为PCR反应液

组分	单个反应体积
		WGBS PCR Enzyme Mix	25μL
PCR Primer Mix	5μL
		Total	30μL

2)用移液器吸取30μL配制好的PCR反应液加入上述二中装有重亚硫酸盐转化反应后DNA分子的0.2mL PCR管中，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

3)用移液器吸取30μL配制好的表11所示的PCR反应液加入PCR管中，涡旋振荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

4)将PCR管置于PCR仪上，按照下表12的条件进行PCR反应。

表12为PCR反应

5)反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底，加入50μL TE Buffer至总体系100μL，全部转移到新的1.5mL离心管中。

6)吸取60μL DNA Clean Beads至的1.5mL离心管中，用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。

室温孵育5min，然后短暂离心后，将离心管置于磁力架上，静置2～5min，至液体澄清，用移液器小心吸取上清并弃掉。

7)保持离心管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取上清并丢弃。

重复上一步，尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。

保持离心管置于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光。

将离心管从磁力架上取下，加入32μL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀。

室温下孵育5min。

将离心管瞬时离心，置于磁力架上，静置5min至液体澄清，用移液器吸取30μL上清液转移到新的1.5mL离心管中，得到扩增产物。

四、测序文库的构建及测序

1、测序文库的构建

1)退火形成单链

使用

dsDNA HS Assay Kit对上述三7)得到的扩增产物进行定量。

再取360ng上述三7)得到的扩增产物至新的0.2mL PCR管中，用TE Buffer补充至总体积48μL。

将PCR管置于PCR仪上，按照下表13的条件进行反应，得到反应产物。

表13为单链反应条件

温度	时间
		105℃热盖	On
95℃	3min

2)单链环化

上述1)的反应结束后，立即将PCR管置于冰上，静置2min后，加入单链环化反应液进行反应，具体如下：

根据反应数，按照下表14的配方在冰上配制单链环化反应液(MGIEasy环化模块，MGI,1000005260)。

表14为单链环化反应液

组分	单个反应体积
		Splint Buffer	11.6μL
DNA Rapid Ligase	0.5μL
		总体积	12.1μL

用移液器吸取12.1μL配制好的表14所示的单链环化反应液加入上述1)得到的装有反应产物的PCR管中，涡旋振荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

将PCR管置于PCR仪上，按照下表15的条件进行反应。

表15为单链环化反应条件

温度	时间
		75℃热盖	On
37℃	30min
		4℃	Hold

反应结束后，将PCR管瞬时离心并置于冰上，立即进入下步反应。

3)酶切消化

提前按照下表16的配方在冰上配制酶切消化反应液(MGIEasy环化模块，1000005260)。

表16为酶切消化反应液

组分	单个反应体积
		Digestion Buffer	1.4μL
Digestion Enzyme	2.6μL
		总体积	4μL

用移液器吸取4μL表16配制好的酶切消化反应液加入上述2)反应后的PCR管中，涡旋振荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

将PCR管置于PCR仪上，按照下表17的条件进行反应。

表17为酶切消化反应条件

温度	时间
		75℃热盖	On
37℃	30min
		4℃	Hold

反应结束后，瞬时离心将反应液收集至管底。

立即向PCR管中加入7.5μL Digestion Stop Buffer，涡旋振荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底，吸取全部反应液转移到新的1.5mL离心管中得到酶切消化产物。

4)纯化

提前取出DNA Clean Beads(来自MGIEasy环化模块，MGI,1000005260)，置于室温平衡至少30min，使用前充分震荡混匀。吸取170μL DNA Clean Beads至上述3)得到的酶切消化产物中，用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。

室温孵育10min。

将离心管瞬时离心，置于磁力架上，静置5min至液体澄清，用移液器小心吸取上清并丢弃。

保持离心管置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取上清并丢弃。

将离心管从磁力架上取下，加入22μL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮。

室温下孵育10min。

将离心管瞬时离心，置于磁力架上，静置5min至液体澄清，用移液器吸取20μL上清液转移到新的1.5mL离心管中，得到测序文库。

2、测序

使用

ssDNA Assay Kit荧光定量试剂盒，按照定量试剂盒的操作说明对上述1得到的测序文库进行定量。

采用的测序引物序列：

测序引物1GCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT测reads1

测序引物2TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT测reads2

使用MGISEQ-2000测序仪进行测序，使用MGISEQ-2000高通量测序试剂套装(PE100)(MGI,货号1000012536)，按照说明书指导进行DNB制作和测序。

五、数据分析

使用常用的甲基化分析软件Bismark对测序数据进行质控，去除低质量的reads，再与基因组进行比对，在比对完成后，对测到的分子标签进行识别统计，利用识别到的分子标签与对reads进行分组，相同分子标签的reads说明来自同一分子，以此将来自同一DNA分子的双端的reads分到一组。之后进行甲基化的分析，计算甲基化水平，确定同一DNA分子正负链的甲基化水平，判断同一DNA分子正负链在对应的位点上是否同时具体甲基化修饰。

计算甲基化水平：

测序结果与参考基因组(GRCh37(GCA_000001405.1)，2009/02/27)比对，若原来是C碱基的位置的C碱基的深度与现在变成T碱基的深度，则二者比值就是这个位点的甲基化水平；区域的甲基化水平为该区域中所有位点的甲基化水平的平均值。

结果如下:

1)建库结果

表18为建库结果

2)数据分析结果

(1)测序数据下机后对数据进行分析并进行基本数据统计如下表19：

表19为测序基本数据

样本名	T1	T2
			序列长度(bp)	100	100
过滤后序列	909,165,304	866,820,596
			比对率(％)	92.54	94.14
唯一比对率(％)	87.18	89.22
			重复率(％)	19.26	26.34
双端比对率(％)	83.56	86.81
			亚硫酸盐转化效率(％)	99.62	99.55

(2)分析T1样本中不同元件上的C的平均甲基化水平。

结果如图3所示，可以看出，a图为基因组上不同元件的C碱基的平均的甲基化水平，相同元件中不同颜色的柱代表不同链上的C的甲基化水平，可以看出在这个样本中，除了tandem_repeats(串联重复)区域外不同元件所在位置的DNA的正负链的甲基化水平没有非常明显的差异；b图为正负链甲基化不同的reads结果示意图，正负链的水平没有非常明显的差异。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大智造科技股份有限公司

<120> 一种确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

agtcggaggc caa 13

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gcggtcttag gaagac 16

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

aacaactcct tggctcaca 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gaacgacatg gctacgatcc gactt 25

Claims

1.确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述使用分子标签UMI对多个DNA双链分子的正链和负链进行标记的方法如下：

所述带有多个分子标签的3端接头组由多个带有不同分子标签的3端接头组成；

所述Top链从5'端到3'端包括如下4个部分：

1)第一段固定序列，由大小为8bp-16bp的核苷酸组成；

3)第三段固定序列，由大小为6bp-24bp的核苷酸组成；

4)第四段固定序列，由大小为15bp-20bp的核苷酸组成，其用于结合测序引物；

所述Bottom链为能与Top链中的第一段固定序列反向互补的序列,且在所述Bottom链的3'端进行化学修饰；

所述5端接头由如下2段序列组成：

第二段序列为不与所述3端的TOP链互补的25-30bp的片段；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述DNA双链分子大小为100bp到2000bp；

4.一种确定DNA分子正负链甲基化差异的建库的方法，包括权利要求1-3任一中的步骤1)-2)和步骤3)中的PCR扩增以及构建测序文库，得到确定DNA分子正负链甲基化差异的测序文库。

5.一种用于确定DNA分子正负链甲基化差异的建库测序的试剂盒，包括权利要求2-4所述方法中的所述3端接头、所述5端接头和重亚硫酸盐转化所需试剂。

6.权利要求1-4所述方法或由权利要求4所述方法制备的测序文库或权利要求5所述试剂盒在确定DNA分子正负链甲基化差异中的应用。

7.权利要求1-4所述方法或由权利要求4所述方法制备的测序文库或权利要求5所述试剂盒在确定来源统一DNA分子正负链甲基化差异中的应用。