CN116196335A - 一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及外泌体研发技术领域，尤其是一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，包括脐带间充质干细胞的制备及细胞培养液的收集、超速离心法提取外泌体、BLM诱导肺纤维化小鼠模型的建立以及实验分析；本发明中该外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，通过设置实验组以及多组对照组，通过数据分析得到雾化吸入MSC外泌体与BLM诱导肺纤维化导致的病理程度、减轻BLM诱导肺纤维化导致的胶原沉积以及改善BLM诱导肺纤维化导致的TGF‑β1通路相关的改变之间的具体的联系。

Description

一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用
技术领域
本发明涉及外泌体研发技术领域，尤其涉及一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，尺寸为30-150nm，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。
根据现有的研究数据，还没有提出雾化吸入MSC外泌体与BLM诱导肺纤维化导致的病理程度、减轻BLM诱导肺纤维化导致的胶原沉积以及改善BLM诱导肺纤维化导致的TGF-β1通路相关的改变之间的具体的联系。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在没有提出雾化吸入MSC外泌体与BLM诱导肺纤维化导致的病理程度、减轻BLM诱导肺纤维化导致的胶原沉积以及改善BLM诱导肺纤维化导致的TGF-β1通路相关的改变之间的具体的联系的缺点，而提出的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
设计一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，具体包括如下步骤：
S1、脐带间充质干细胞的制备及细胞培养液的收集：
手术室采集脐带，用PBS冲洗干净，剥离血管和华式胶，将组织剪碎至2mm3，使用划痕法将组织均匀铺在培养皿中，添加间充质干细胞培养基后，转移至培养箱中，培养条件为5％CO2，37℃，待培养皿中贴壁细胞铺满75％-85％时，消化后收集800rpm离心10min后弃上清，使用新鲜间充质干细胞培养基重悬后得到原代间充质干细胞，即P0，继续传代培养，取P3代细胞进行实验，当细胞铺满培养皿的85％时，收集细胞培养液；
S2、超速离心法提取外泌体；
S3、BLM诱导肺纤维化小鼠模型的建立；
8周龄SPF级C57BL/6小鼠经尾静脉注射给药，实验对照组和两个治疗组按150mg/kg的剂量BLM，空白对照组注入等体积的PBS；
S4、在给予BLM后第14天，MSC外泌体14天治疗组，经雾化吸入给予20mL浓度为0.05mg/ml的外泌体雾化治疗，雾化时间为20min，连续14天；
实验对照组相同条件下给予同体积的生理盐水，连续14天；MSC外泌体7天治疗组，经雾化吸入给予20mL浓度为0.05mg/ml的外泌体雾化治疗，雾化时间为20min，连续7天后，
相同条件下给予同体积的生理盐水，继续给药7天，分别在注射BLM后的第0，7，14，21，28天，使用动物肺功能呼吸检测仪器对各组小鼠的潮气量，即TVb，呼吸频率，即F，吸气时间，即Ti，呼气时间，即Te，进行检测记录；
S5、在第28天处死小鼠，取单侧肺组织，HE染色和马松染色观察病理学改变，并进行肺组织病理学评分。
优选的，所述S2中超速离心法提取外泌体具体包括：将细胞培养液加入离心管中，4℃条件下3000g离心10min，再用0.22μm滤膜过滤上清液，再在4℃条件下10000g离心1h，将上清液加至超速离心管中，4℃条件下100000g离心70min，PBS洗脱后进行重悬，4℃条件下100000g离心70min，即得到外泌体。
优选的，所述收集的外泌体，通过透射电镜；纳米粒径示踪分析；特异性蛋白CD9,CD63和TSG101对外泌体进行鉴定。
优选的，所述针对雾化吸入MSC外泌体与关系肺纤维化，在第28天处死小鼠，取单侧肺组织的一半，测定组织中羟脯氨酸，即HYP的含量，qPCR测定胶原纤维Ⅰ和胶原纤维Ⅲ的mRNA含量，以及α-SMA蛋白和mRNA含量。
优选的，所述MSC外泌体14天治疗组小鼠的HYP含量降低，胶原纤维Ⅰ和Ⅲ的表达水平降低。
优选的，所述α-SMA的翻译和表达水平降低(P<0.05)，而MSC外泌体7天治疗组和实验对照组小鼠相比，仅胶原纤维Ⅰ和α-SMA的的mRNA含量降低。
优选的，所述针对雾化吸入MSC外泌体可改善BLM诱导肺纤维化导致的TGF-β1通路相关的改变，在第28天处死小鼠，取单侧肺组织的一半，通过qPCR法测定TGF-β1和通路相关蛋白Smad4的mRNA的表达水平，以及TGF-β1通路相关miRNA:miR-26a,miR-29a/b/c,miR-155,miR-326,let-7f的水平。
本发明提出的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，有益效果在于：该外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，通过设置实验组以及多组对照组，通过数据分析得到雾化吸入MSC外泌体与BLM诱导肺纤维化导致的病理程度、减轻BLM诱导肺纤维化导致的胶原沉积以及改善BLM诱导肺纤维化导致的TGF-β1通路相关的改变之间的具体的联系。
附图说明
图1为本发明提出的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用的透射电镜鉴定图。
图2为本发明提出的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用的雾化吸入MSC外泌体可改善BLM诱导肺纤维化导致的肺功能降低的实验数据图。
图3为本发明提出的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用的雾化吸入MSC外泌体可改善BLM诱导肺纤维化导致的病理程度的实验数据图。
图4为本发明提出的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用的雾化吸入MSC外泌体可减轻BLM诱导肺纤维化导致的胶原沉积的实验数据图。
图5为本发明提出的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用的雾化吸入MSC外泌体可改善BLM诱导肺纤维化导致的TGF-β1通路相关的改变的实验数据图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
参照图1-5，一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，脐带间充质干细胞的制备及细胞培养液的收集
手术室采集脐带，用PBS，即缓冲液，冲洗干净，剥离血管和华式胶，将组织剪碎至2mm3，使用划痕法将组织均匀铺在培养皿中，添加间充质干细胞培养基后，转移至培养箱中，培养条件为5％CO2，37℃，待培养皿中贴壁细胞铺满75％-85％时，消化后收集800rpm离心10min后弃上清，使用新鲜间充质干细胞培养基重悬后得到原代间充质干细胞，即P0，继续传代培养，取P3代细胞进行实验，当细胞铺满培养皿的85％时，收集细胞培养液。
超速离心法提取外泌体
将细胞培养液加入离心管中，4℃条件下3000g离心10min，再用0.22μm滤膜过滤上清液，再在4℃条件下10000g离心1h，将上清液加至超速离心管中，4℃条件下100000g离心70min，PBS洗脱后进行重悬，4℃条件下100000g离心70min，即得到外泌体。
外泌体的鉴定
收集的外泌体，通过透射电镜；纳米粒径示踪分析；特异性蛋白CD9,CD63和TSG101对外泌体进行鉴定。
BLM诱导肺纤维化小鼠模型的建立
8周龄SPF级C57BL/6无特定病原体小鼠经尾静脉注射给药。实验对照组和两个治疗组按150mg/kg的剂量BLM，空白对照组注入等体积的PBS。
雾化吸入MSC外泌体可改善BLM诱导肺纤维化导致的肺功能降低
在给予BLM后第14天，MSC外泌体14天治疗组，经雾化吸入给予20mL浓度为0.05mg/ml的外泌体雾化治疗，雾化时间为20min，连续14天；实验对照组相同条件下给予同体积的生理盐水，连续14天；MSC外泌体7天治疗组，经雾化吸入给予20mL浓度为0.05mg/ml的外泌体雾化治疗，雾化时间为20min。
连续7天后，相同条件下给予同体积的生理盐水；
继续给药7天，分别在注射BLM后的第0，7，14，21，28天，使用动物肺功能呼吸检测仪器对各组小鼠的潮气量(TVb)，呼吸频率(F)，吸气时间(Ti)，呼气时间(Te)进行检测记录，结果如图2所示，MSC外泌体14天治疗组可以有效改善BLM导致肺纤维化小鼠的潮气量不足，呼吸频率降低，吸气时间和呼气时间增加(P<0.05)。而MSC外泌体7天治疗组不能有效改善上述症状。
雾化吸入MSC外泌体可改善BLM诱导肺纤维化导致的病理程度；
在第28天处死小鼠，取单侧肺组织，HE染色和马松染色观察病理学改变，并进行肺组织病理学评分，结果如图3所示，MSC外泌体14天治疗组小鼠的病变明显减轻(P<0.05)，MSC外泌体7天治疗组和实验对照组小鼠的无统计学差异；
雾化吸入MSC外泌体可减轻BLM诱导肺纤维化导致的胶原沉积；
在第28天处死小鼠，取单侧肺组织的一半，测定组织中羟脯氨酸(HYP)含量，qPCR测定胶原纤维Ⅰ和胶原纤维Ⅲ的mRNA含量，以及α-SMA蛋白和mRNA含量，结果如图4所示，MSC外泌体14天治疗组小鼠的HYP含量降低，胶原纤维Ⅰ和Ⅲ的表达水平降低，α-SMA的翻译和表达水平降低(P<0.05)，而MSC外泌体7天治疗组和实验对照组小鼠相比，仅胶原纤维Ⅰ和α-SMA的的mRNA含量降低(P<0.05)；
雾化吸入MSC外泌体可改善BLM诱导肺纤维化导致的TGF-β1通路相关的改变
在第28天处死小鼠，取单侧肺组织的一半，通过qPCR法测定TGF-β1和通路相关蛋白Smad4的mRNA的表达水平，以及TGF-β1通路相关miRNA:miR-26a,miR-29a/b/c,miR-155,miR-326,let-7f的水平，结果如图5所示，与实验对照组相比，MSC外泌体7天治疗组和14天治疗组都可以有效降低TGF-β1和Smad4的mRNA水平。MSC外泌体14天治疗组可以有效提高BLM诱导肺纤维化导致的TGF-β1通路相关miRNA:miR-26a,miR-29a/b/c,miR-155,miR-326,let-7f的水平降低，而MSC外泌体7天治疗组能有效提高miR-155和miR-326的水平降低。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、脐带间充质干细胞的制备及细胞培养液的收集：
手术室采集脐带，用PBS冲洗干净，剥离血管和华式胶，将组织剪碎至2mm3，使用划痕法将组织均匀铺在培养皿中，添加间充质干细胞培养基后，转移至培养箱中，培养条件为5％CO2，37℃，待培养皿中贴壁细胞铺满75％-85％时，消化后收集800rpm离心10min后弃上清，使用新鲜间充质干细胞培养基重悬后得到原代间充质干细胞，即P0，继续传代培养，取P3代细胞进行实验，当细胞铺满培养皿的85％时，收集细胞培养液；
S2、超速离心法提取外泌体；
S3、BLM诱导肺纤维化小鼠模型的建立；
8周龄SPF级C57BL/6小鼠经尾静脉注射给药，实验对照组和两个治疗组按150mg/kg的剂量BLM，空白对照组注入等体积的PBS；
S4、在给予BLM后第14天，MSC外泌体14天治疗组，经雾化吸入给予20mL浓度为0.05mg/ml的外泌体雾化治疗，雾化时间为20min，连续14天；
实验对照组相同条件下给予同体积的生理盐水，连续14天；MSC外泌体7天治疗组，经雾化吸入给予20mL浓度为0.05mg/ml的外泌体雾化治疗，雾化时间为20min，连续7天后，相同条件下给予同体积的生理盐水，继续给药7天，分别在注射BLM后的第0，7，14，21，28天，使用动物肺功能呼吸检测仪器对各组小鼠的潮气量，即TVb，呼吸频率，即F，吸气时间，即Ti，呼气时间，即Te，进行检测记录；
S5、在第28天处死小鼠，取单侧肺组织，HE染色和马松染色观察病理学改变，并进行肺组织病理学评分。
2.根据权利要求1所述的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于，所述S2中超速离心法提取外泌体具体包括：将细胞培养液加入离心管中，4℃条件下3000g离心10min，再用0.22μm滤膜过滤上清液，再在4℃条件下10000g离心1h，将上清液加至超速离心管中，4℃条件下100000g离心70min，PBS洗脱后进行重悬，4℃条件下100000g离心70min，即得到外泌体。
3.根据权利要求2所述的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于，所述收集的外泌体，通过透射电镜；纳米粒径示踪分析；特异性蛋白CD9,CD63和TSG101对外泌体进行鉴定。
4.根据权利要求1所述的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于，所述针对雾化吸入MSC外泌体与关系肺纤维化，在第28天处死小鼠，取单侧肺组织的一半，测定组织中羟脯氨酸，即HYP的含量，qPCR测定胶原纤维Ⅰ和胶原纤维Ⅲ的mRNA含量，以及α-SMA蛋白和mRNA含量。
5.根据权利要求4所述的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于，所述α-SMA的翻译和表达水平降低，即P<0.05，而MSC外泌体7天治疗组和实验对照组小鼠相比，仅胶原纤维Ⅰ和α-SMA的的mRNA含量降低。
6.根据权利要求5所述的一种外泌体在治疗肺纤维化药物中的应用，其特征在于，所述针对雾化吸入MSC外泌体可改善BLM诱导肺纤维化导致的TGF-β1通路相关的改变，在第28天处死小鼠，取单侧肺组织的一半，通过qPCR法测定TGF-β1和通路相关蛋白Smad4的mRNA的表达水平，以及TGF-β1通路相关miRNA:miR-26a,miR-29a/b/c,miR-155,miR-326,let-7f的水平。
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