CN116194221A - 用单一抗体阴性选择幼稚t细胞和b细胞的组合物和方法 - Google Patents

用单一抗体阴性选择幼稚t细胞和b细胞的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

公开了用于离析幼稚、未接触的目标靶细胞的组合物和方法。

Description

用单一抗体阴性选择幼稚T细胞和B细胞的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年5月28日提交的美国临时申请63/031,184的优先权，其全部公开内容通过引用的方式并入本文，如同完整阐述一样。
技术领域
本发明涉及免疫学领域以及从生物体液中磁性分离和离析未接触的免疫细胞，例如T细胞、B细胞和NK细胞。具体地，提供了组合物和方法用于从生物样品中有效分离不需要的细胞类型，使目的细胞类型处于未接触的、幼稚状态，然后可以将其离析并用于各种治疗应用。
背景技术
在整个说明书中引用了若干出版物和专利文献，以描述本发明所属领域的现有技术。这些引用中的每一个都通过引用并入本文，如同完整阐述一样。
免疫疗法涉及选择、启动、扩增和转染T淋巴细胞(T细胞)以产生嵌合抗原受体(CAR)T细胞的过程，是这一代最重要的医学进步之一。FDA批准的产品[用于大B细胞淋巴瘤(Kymriah–Novartis)和用于非霍奇金淋巴瘤(Yescarta–Gilead)]已经证明可以治愈某些白血病和淋巴瘤，CAR T细胞的许多其他应用正在探索中并且许多临床试验正在全球范围内进行(Kansagra AJ.等人,Clinical Utilization of Chimeric Antigen Receptor TCells in B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia:An Expert Opinion from theEuropean Society for Blood and Marrow Transplantation and the AmericanSociety for Blood and Marrow Transplantation.Biol Blood Marrow Transplant.25:e76-85,2019；Seif M.,等人CAR T Cells Beyond Cancer:Hope for ImmunomodulatoryTherapy of Infectious Diseases.Front Immunol.10:2711,2019)。正如最近的一篇综述中所说明的，正在做出非常重大的努力以将此类疗法应用于实体瘤(Mohanty R.,等人CART cell therapy:A new era for cancer treatment.Oncol Rep.42:2183-2195,2019)。
CART细胞(活体药物)的制造过程始于通过单采方法从患者或供体收集外周血单个核细胞(PBMC)，在同种异体CAR T的情况下，这些细胞可以(i)直接被刺激以激活和扩增，从而在后续步骤中可以处理足够数量的细胞以产生足够的产物，或(ii)进行T细胞或亚群，如CD4+和CD8+ T细胞的选择。越来越多的证据表明，作为起始制造步骤的细胞选择提供了更好的产品。此外，有令人信服的证据表明CD4+和CD8+ T细胞的起始比率对于提供更持久的疗法很重要(TurtleCJ.,等人CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+composition inadult B cell ALL patients.J Clin Invest.126:2123-38,2016)。
有多种T细胞选择方法已用于生产CAR T细胞。尽管存在很多很好的生物学理由以从“未接触”的T细胞开始，但大多数过程都涉及采用对T细胞上的CD3受体具有特异性的靶向mAb的阳性选择，或者在CD4+或CD8+ T细胞的阳性选择的情况下的合适的mAb。这些mAb可以与一些常见的捕获仪器一起使用，也可以与分离载体(如磁性纳米颗粒、具有漂浮能力的微泡、其他固体支持物)缀合，或者可以对mAb进行荧光标记，以便通过流式细胞术方法选择被标记的细胞。这些方法均不会产生未接触的T细胞。此外，当颗粒用于分离方法时，需要在开始后续制造步骤之前将其去除。如果未去除颗粒，则必须明确证明起始细胞上存在此类颗粒不会造成不利影响—这是一项繁琐且昂贵的任务。
对T细胞和T细胞亚群采用阳性选择方法具有一定的优势。例如，由于大多数阴性选择方案需要从PBMC中去除所有非T细胞种类，可用的阴性分离系统通常使用包含多达九种mAb(最少七种)的单克隆抗体(mAb)混合物。这些抗体结合特异性表面受体以去除非靶细胞，例如CD14-单核细胞、CD15-粒细胞、CD16-NK细胞和粒细胞、CD19-B细胞、CD34-干细胞、CD36-单核细胞/巨噬细胞/血小板、CD56-NK细胞、骨髓谱系的CD123-细胞和一些B细胞(当T细胞被阴性选择时)和CD235a-RBC。
请记住，根据FDA指南，接触用于治疗应用的前体细胞的任何实体(在本文情况下为mAb)必须具有与用于人体的治疗性mAb相同的品质。因此，使用大量体内使用的mAb来创建阴性选择系统的启动成本给医疗保健系统和需要此类治疗产品的患者带来了成本负担。与通过将市售的阳性选择试剂盒拼凑在一起以去除不需要的细胞来进行此类选择相关的成本总计约为处理每个Leukopak20000美元。将这些成本加入当前的CAR T生产成本中是不可接受的。
发明内容
根据本发明，公开了一种从外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析Fc受体阴性靶细胞级分的方法。在一个实施方案中，提供了基本上不含内源性或添加的IgG的PBMC制剂。引入同时与携带Fc受体的细胞和B细胞上的表位两者结合的单一免疫活性捕获剂，其中所述捕获剂可操作地连接至包含磁响应颗粒的铁磁流体，并形成携带Fc受体的细胞的磁性簇，其包括B细胞、单核细胞、粒细胞和血小板；然后在磁性分离器中从制剂中离析所述携带Fc受体的细胞和B细胞的磁性簇，并回收处于基本上幼稚的未接触的状态的靶细胞级分。
在用于离析处于未接触状态的Fc受体阴性靶细胞的另一实施方案中，将同时与携带Fc受体的细胞和B细胞上的表位两者结合的单一免疫活性捕获剂引入PBMC制剂中，其中所述捕获剂可操作地连接至特异性结合对的第一成员。然后在所述第一和第二结合对成员之间形成特异性结合对的条件下，使制剂与包含可操作地连接至第二结合成员的磁响应颗粒的铁磁流体接触，从而形成选自B细胞、单核细胞、粒细胞和血小板的携带Fc受体的细胞的磁性簇。然后在磁性分离器中从制剂中离析细胞的磁性簇，并回收处于基本上幼稚状态的靶细胞级分。用于本文公开的方法的B细胞表位包括但不限于CD19、CD20、IgG和CD32。
在用于离析处于未接触状态的Fc受体阴性靶细胞的方法的另一实施方案中，抗人IgG和包含特异性结合对的第一成员的捕获剂，其是Fab或F(ab)’μ细胞，对B细胞表位具有亲和力的所述IgG和Fab或F(ab)’2的每一个被引入具有降低的内源性IgG水平的PBMC制剂中。在所述第一和第二结合对成员之间形成特异性结合对的条件下，使PMBC制剂与包含可操作地连接至第二结合成员的磁响应颗粒的铁磁流体接触，从而形成包括IgG结合的B细胞、单核细胞、粒细胞和血小板的携带Fc受体的细胞的磁性簇。然后在磁性分离器中从所述制剂中离析细胞的磁性簇，并回收处于基本上幼稚状态的靶细胞级分。
在某些优选的实施方案中，所述靶细胞是CD3+ T细胞。在抗体的特异性被改变的其他实施方案中，上述成簇特征可用于离析B细胞。通过提供适当的结合对成员，可以离析CD34+干细胞、CD4+、CD8+和NK细胞。
在要回收未接触的T细胞的情况下，用于上述方法的捕获剂包括例如小鼠或人来源的单克隆IgG抗体，其包含被非靶细胞上的人FcγR结合的Fc区，所述抗体对B细胞上的表位具有结合亲和力。在某些优选的实施方案中，所述抗体是IgG1。在其他方法中，IgG与免疫活性抗体片段(例如，Fab)一起添加，其中所述片段可操作地连接至特异性结合对的第一成员。在要去除携带FcγR的非靶细胞的实施方案中，此类细胞包括单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和NK细胞。
虽然本文例举了使用生物素和链霉亲和素，但其他有用的结合对成员包括但不限于受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素和亚氨基生物素-亲和素。
还提供了用于从外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析幼稚CD4+或CD8+ T细胞的方法。在要离析幼稚CD4+细胞的实施方案中，同时与携带Fc受体的细胞和B细胞上的表位两者结合的第一免疫活性捕获剂以及与CD8+ T细胞结合的第二免疫活性捕获剂被引入PBMC制剂中。在这种情况下，所述第一和第二免疫活性捕获剂中的每一个都可操作地连接至存在于铁磁流体中的磁响应颗粒，这形成CD8+ T细胞、B细胞和所述携带Fc受体的细胞的磁性簇。在磁性分离器中从所述制剂中离析细胞的磁性簇，并回收处于基本上幼稚状态的CD4+T细胞。在需要离析CD8+ T细胞的情况下，用抗CD4抗体替代抗CD8抗体。
本发明还提供了一种在适合高亲和力Fc受体结合的条件下从外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析幼稚NK细胞的方法。在该实施方案中，同时与携带Fc受体的细胞和B细胞上的表位两者结合的第一免疫活性捕获剂和与CD3+ T细胞结合的第二免疫活性捕获剂在促进高亲和力FcR结合的条件下，所述第一和第二免疫活性捕获剂中的每一个可操作地连接至存在于铁磁流体中的磁响应颗粒并形成携带Fc受体的细胞、B细胞和CD3+细胞的磁性簇。然后在磁性分离器中从所述制剂中离析所述磁性簇，并回收处于基本上幼稚状态的幼稚NK细胞。
在另一方面，提供了用于从外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析幼稚CD34+干细胞的方法。示例性方法需要向PBMC制剂中引入：同时与携带Fc受体的细胞和T细胞上的表位两者结合的免疫活性捕获剂，所述免疫活性捕获剂可操作地连接至存在于铁磁流体中的磁响应颗粒；所述携带Fc受体的细胞和T细胞形成磁性簇，所述磁性簇在磁性分离器中从所述制剂中离析，从而允许回收处于基本上幼稚、未接触的状态的CD34+干细胞。在该方法的一个优选实施方案中，PBMC离析自用G-CSF处理以引起造血干细胞从骨髓迁移到外周血中的供体。
附图说明
图1是下文实施例中描述的用于幼稚、未接触的CD3细胞的阴性选择的结合伴侣的示意图。抗CD32 mAb通过Fab互补位-CD32表位相互作用与CD32表达细胞结合，并通过Fc-FcγR相互作用与其他FcγR结合。CD19和CD20是B细胞特异性受体，抗CD19和抗CD20分别通过特异性CD19和CD20表位与B细胞结合，也通过Fc-FcγR相互作用与其他细胞结合。sIg也是B细胞表面特异性受体，抗IgG mAb通过sIg表位与B细胞结合，以及通过Fc-FcγR相互作用与其他细胞结合。此外，抗IgG也可用于结合标记FcγR表达细胞的血浆游离Ig。当使用抗IgG抗体时，抗体可以是全长IgG形式或是对血浆游离Ig具有亲和力以标记FcγRC的Fab/F(ab')形式。
图2示出了用MAH-Ig-FF标记和分离细胞并进行流式细胞术分析后获得的直方图。细胞在CD45-FITC上门控，并在细胞选择后测量CD3、CD11b和CD19阳性细胞。
具体实施方式
越来越多的临床数据表明，基因工程T细胞的过继转移，例如嵌合抗原受体(CAR)T细胞介导的免疫疗法，可有效治疗癌症和自身免疫性疾病。迄今为止，免疫细胞的制造主要采用T细胞阳性选择，其是基于在这些细胞上表达的特异性受体的mAb标记。这种策略会导致不同基因表达的改变，因为阳性选择过程需要将细胞与试剂接触，这些试剂会诱导不需要的或过早的细胞活化，并在离析后介导活化诱导的细胞死亡。此外，有传闻称阳性细胞选择可在转移到接受者后不久导致抗体依赖性细胞毒性。这些缺点很可能会对采用的免疫细胞的效力和长期持久性产生不利影响。因此，另一种策略，即采用所需细胞类型例如幼稚的T、B、NK或CD34+干细胞的简化阴性选择，将具有很大的价值并减少靶细胞的不需要的活化。
PBMC/Leukopaks中白细胞的组成为：T细胞(45-60％)、B细胞(5-15％)、单核细胞(10-30％)、粒细胞(0.6-10％)和NK细胞(5-10％)。迄今为止，还没有用于在临床应用中制备CAR T细胞的阴性选择方案。然而，对于使用磁性分离的PBMC/Leukopaks，存在多种常规研究水平的阴性选择选项。例如，在Miltenyi Biotech(Bergisch Gladbach，德国)pan-T细胞选择试剂盒(#130-096-535)中，抗体混合物包含九种抗体(CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123和CD235a)，以便从PBMC中去除非T细胞；类似地，在基于Dynal珠的CD3阴性选择产品中，涉及七种抗体(CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123和CD235a)，其纯度相当(～95％及以上)(DynabeadsTMUntouchedTM人类T细胞试剂盒，#11344D)。一份使用三种抗体CD14、CD19和CD56阴性富集CD3+ T细胞的报告给出类似的结果，然而，分离前需要进行Ficoll纯化以去除粒细胞(Janssen W.,等人A simple large scale method for T cellenrichment by negative selection in preparation for viraltransduction.Cytotherapy 19:S38,2017)。
在之前关于CD3阳性T细胞选择的研究中(Liberti PA,Riter DW,Khristov TR.Anovel low cost high yield clinical scale cell separator.Cell Gene TherapyInsight.4:581-600,2018)，采用磁性标记T细胞的间接方法来实现阳性免疫磁性分离。在这些研究中，PBMC首先与抗CD3 mAb一起孵育，随后用我们的135–165nm专有高磁性纳米颗粒(也称为铁磁流体或FF)的常见捕获版本进行磁性标记(Liberti等人，美国专利号5,698,271；6,120,856)。初步研究使用普通捕获剂开始，即与FF偶联的大鼠抗小鼠Fc(RAM)mAb。该系统始终如一地产生具有出色CD3+细胞产率(>75％)的T细胞产品，但反复被不同水平的单核细胞污染(PBMC制剂中单核细胞占10-95％)。基于RAM-FF与FcR相互作用的假设，进行了重大尝试以抑制单核细胞结合，包括PBMC与热聚集人IgG(HAIG)以及FcR阻断抗体的预孵育。无论HAIG的水平如何，单核细胞结合都不能被抑制，而Fc阻断抗体是有效的。然而，使用这种阻断剂的成本阻碍了制造商业上价格合理的分离试剂盒。
对那些早期阳性选择T细胞研究中使用的许多不同RAM-FF制剂的分析表明，用于FF的缀合的RAM水平与单核细胞污染(捕获)之间存在很强的相关性。分析表明，在某种水平的RAM与FF缀合时，这些纳米颗粒亲合结合携带FcγR的细胞(FcγRC)，表明RAM的Fc部分的接近在其与FF和其他固体表面或支持物的偶联中的重要作用。通过用RAM有效饱和FF表面(4000-7000IgG/颗粒)并将其对单核细胞的亲和力与低水平缀合(500-1000IgG/颗粒)以及其他缀合的非免疫蛋白的亲和力进行比较，RAM Fc接近在固体支持物如我们的FF上的作用已在我们的实验室中通过实验证明。用高缀合水平的RAM制备的FF能够从单采产品的等分试样中完全除尽单核细胞。此外，这种除尽可以使用与mAb靶向细胞分离中使用的相同浓度的FF进行。注意RAM是IgG1亚型。此外，当PBMC与缀合有牛或人血清白蛋白(BSA、HSA)的FF一起孵育时，无论缀合水平如何，都无法磁性地去除单核细胞。
为确定单核细胞是否在摄入RAM-FF而不是RAMFc:FcγR结合相互作用以产生磁响应细胞，实验在0℃进行并产生与在室温下完成的结果相同的结果。当用与FF缀合的较低水平的RAM进行实验时，回收到较低水平的单核细胞。所有这些发现表明RAM-FF:单核细胞相互作用在很大程度上具有结合性质，并且需要RAM Fc区的紧密接近或因RAM Fc区的紧密接近而增强。
上述发现促使我们研究以下假设：当单一抗体与固体支持物的缀合水平足够高时，应该有可能用IgG亚类的单一抗体进行有效的CD3+ T细胞阴性选择，因为在这样的水平时，此类抗体的Fc部分将足够紧密接近以充当FcγR的亲合结合物，并且同时该抗体的特异性可用于结合至少一种其他细胞特异性，即B细胞。因此，Fc在固体支持物上的接近通过多价附着到近邻的FcγR而增强了亲合力。为了进一步研究，使用单一mAb的T细胞阴性选择，IgG1同种型的小鼠抗人IgG抗体以高水平(4000-7000mAb/颗粒)与FF缀合。该实验的工作假设是Fab可变结构域会与B细胞结合，因为B细胞表达表面IgG，并且该抗体的Fc区紧密接近表面会与在单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、粒细胞、自然杀伤(NK)细胞以及B细胞上表达的FcγR结合，因为B细胞表达FcγRIIB。
用许多排列和对照进行的实验证明了所述假设，并表明了通过这种策略，我们可以以95％及以上的纯度反复阴性离析幼稚CD3+ T细胞。对于某些实验，PBMC制剂基本上不含内源性IgG，因为它们通过三个离心循环洗涤以避免明显会与抗人IgG抗体反应的内源性IgG。当人IgG以大于约4至10μg/mL的水平添加到此类PBMC制剂中时，T细胞回收率降低，而B细胞污染增加。鉴于在那些实验中使用抗人IgG标记B细胞，我们推断内源性IgG将有效地中和抗人IgG抗体的细胞标记能力。在实施方案中，当使用通过二硫化物连接的Fab或Fab样片段时，例如，F(ab’)2，低水平的内源性IgG会有助于选择，即生物素化Fab或F(ab’)2会与B细胞表面IgG结合以标记B细胞，而Fab/F(ab’)2也可以与游离血浆IgG结合形成F(ab’)2-IgG复合物并标记FcγRC用于移除(图1)。使样品“基本上不含IgG”需要至少3次洗涤和重悬。当使用Fab/F(ab’)2时，细胞仅洗涤1次或2次，从而保留样品中残留的血浆IgG。
由于抗-人IgG抗体可以与细胞产物中的内源性IgG以及结合FcγRC的Ig结合，为了简化模型，将抗CD19 mAb以高水平缀合(4000-7000mAb/颗粒)与FF偶联，并用于不缺乏内源性IgG的PBMC的阴性选择。该实验还导致产生高纯度(>92％)的幼稚T细胞。根据这个概念上简单的实验与上述的抗人Ig实验比较，我们推测，一种成分与B细胞特异性反应，另一种成分通过最有可能聚集的Fc与FcγRC反应，足以产生幼稚T细胞。
使用单一抗体以富集靶细胞显著简化了细胞标记程序，显著降低了在传统方案中涉及许多抗体的成本，并导致出乎意料地快速的过程。这个概念的吸引力，在下文公开的实验数据的支持下，将大大加速转化为临床相关产品。同样的策略也可以用来简化CD4+或CD8+T细胞、B细胞和NK细胞的阴性选择，这如下所述可以通过向系统添加一种其他的mAb来完成。
如上所述，我们最初的从PBMC阳性选择T细胞是通过间接磁性标记方法进行的，所述方法使用以下步骤：(i)抗CD3 mAb孵育，(ii)去除未结合的mAb，以及(iii)与RAM-FF孵育。这些选择方案中的单核细胞污染是完全不能接受的。如果，替代地，对于类似的阳性选择实验，T细胞用生物素化抗CD3 mAb标记，然后去除未结合的mAb、进行SA-FF孵育和磁性分离，观察到单核细胞污染的显著改善，但仍以不可接受的水平存在。这个问题通过首先将基本上不含内源性IgG的PBMC与仅1.0mg/mL的人IgG孵育，然后与生物素-抗CD3抗体孵育，去除未结合的mAb并随后用SA-FF进行磁性标记来解决。这些实验导致T细胞制剂基本上没有单核细胞污染。这些结果表明，生物素化抗CD3 mAb与FcR，尤其是高亲和力受体的相互作用可能在没有添加IgG的情况下在单核细胞污染中发挥作用。重要的是要记住，在上述实验中需要1mg/mL的人IgG才能防止单核细胞污染，即相对于标记mAb为约1000比1。
然后我们考虑了在没有其他Ig的情况下与PBMC孵育的生物素-抗CD3mAb可能与结合FcγR的内源性IgG交换的可能性，或者存在足够数量的“空”FcR，使得添加的标记mAb可以占据这种位点，从而导致用于标记FcγRC的可靶向锚点的可能性。由于不同FcγR与单体IgG的结合反应的Kd范围为10-6至10-9M，IgG应以足够的能量结合以用作标记剂。此外，由于我们的SA-FF具有多价性，因此有机会通过多价附着至FcγRC上的生物素化mAb来增强FcγRC和SA-FF的结合能量，使得mAb的Fc–FcγR相互作用可以成为一个促进因素。
这些发现与任何阴性分离实验特别相关。优选方案是在添加普通捕获剂之前在反应混合物中保留未结合的标记mAb。这为此类试剂(在本文情况下为SA-FF)提供了与mAb标记的B细胞以及任何其他携带生物素的成分发生反应的机会。例如，在使用生物素-抗CD19mAb的情况下，将mAb与PBMC孵育可导致mAb标记的B细胞和FcγRC上的FcγR的mAb标记。在添加如SA-FF的普通捕获剂后，可能会发生多种反应，包括后者与mAb标记的B细胞结合，与任何携带生物素的FcγRC结合以及与未结合的生物素-抗CD19结合。因此，在磁性标记孵育期间，除了与B细胞的标记反应外，还会形成新种类，即SA-FF与结合的抗体的复合物。基于RAM-FF数据，如上所述，我们预测该复合物会与FcγRC亲合结合。因此，在间接选择方案中使用对B细胞有特异性的mAb(如CD19、CD20或IgG)可能涉及许多复杂的反应，其中普通捕获剂可以发挥多种有利作用。例如，纳米颗粒或表面上的SA多价性可以通过与该FcRC结合的生物素-抗体促进标记FcRC，在这种情况下，SA-FF的多价性将结合强度提高到可以捕获此类FcRC的程度。SA-FF的相同多价性及其与未结合的生物素-mAb的反应产生了可以与未填充的FcR反应的种类，从而产生了另一种标记FcR细胞(FcRC)以用于后续移除的机制。
根据我们对使用SA-FF进行的阳性选择T细胞的研究和添加的人IgG对减少单核细胞污染的影响，似乎添加的IgG可能会抵消多价SA-FF结合与FcγR结合的生物素化mAb，因为在添加的IgG的浓度足够高时，这些mAb有望与FcγR竞争，尤其是在那些实验中去除未结合的生物素-抗CD3 mAb之后。
为了获得一些对FcγRC去除中涉及的可能机制的了解，进行了以下阴性T细胞选择实验：在没有IgG的情况下，将生物素化抗CD19 mAb与PBMC一起孵育，然后与SA-FF孵育并进行磁性分离。获得了>92％的T细胞纯度，其中T细胞级分几乎没有单核细胞污染。正如预期的那样，IgG(0.125-1mg/mL)的存在并未显著改变单核细胞除尽效果。此外，随着生物素化抗CD19 mAb量的增加，单核细胞的去除变得更加完全(例如，2-4μg/mL优于<2μg/mL)，并且CD3纯度更高。基于这些结果，似乎与能够以封闭堆积方式与生物素-mAb结合的表面复合的生物素-mAb能够亲合结合FcRC。
这些公开内容表明，存在多种方式可以使FcγR以非常积极的方式参与细胞分离，从而创建多种途径以通过简单、节省试剂的方式离析幼稚、未接触的细胞。
定义：
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如在本申请中使用的，除非本文另有明确规定，以下术语的每一个都应具有下述含义。在整个申请中示出了另外的定义。
术语“生物样品”包括但不限于含细胞的体液、体液、外周血、组织匀浆、抽吸物和可从人类受试者获得的稀有细胞的任何其他来源。
术语“决定簇”在涉及本文所述的任何靶细胞使用时可以被生物特异性配体或生物特异性试剂特异性结合，并且指参与并负责与特异性结合物质选择性结合的靶细胞部分，选择性结合的发生需要所述部分的存在。从根本上讲，决定簇是靶细胞上的分子接触区域，其在特异性结合对反应中被受体识别。
如本文所用，术语“特异性结合对”包括抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、生物素-链霉亲和素、核酸(RNA或DNA)杂交序列、Fc受体或小鼠IgG-蛋白A、亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素和病毒-受体相互作用。各种其他决定簇特异性的结合物质组合被考虑用于实施本发明的方法，例如对本领域技术人员来说将是显而易见的。当特异性结合对的第一成员，例如抗CD3 mAb，与其第二成员，即T细胞上的CD3表位结合时，此类反应称为“标记反应”，并且这些T细胞被认为已被mAb标记。
“阳性选择”是指从特异性结合对的第一成员的不同附着的混合物纯化，所述第一成员选择性地结合存在于目标靶细胞类型上的第二结合对的第二成员，从而使细胞从所述混合物中被离析出来。使用特异性结合对的第二成员进行阳性选择，即纯化目标实体的多种方式和方法在本领域是公知的。
“阴性选择”是指通过将一个或多个特异性结合对的一个或多个第一成员附着到混合物中除目标细胞类型之外的每一种细胞类型，从不同细胞类型的混合物中纯化靶细胞类型。使用结合对的第二成员的特异性结合对反应允许那些携带结合对的第一成员的实体从混合物中被分离出来，从而留下目标实体。用于进行此类分离的方式和方法是本领域公知的。留下的混合物部分称为阴性级分。
“基本上幼稚或未接触的状态”是指未被任何特异性结合对成员接触的细胞亚群。
“T细胞”是指CD3+细胞。根据定义，CD3+细胞的阴性选择产生未与任何特异性结合对的成员接触的幼稚T细胞。
“Fc受体阴性靶细胞”是表达很少或不表达Fc受体的靶细胞。
在阳性和阴性选择中，分别要回收或消除的细胞类型通常与特异性结合对的一个成员，例如与相应的抗体反应的那些细胞上的表位接触，或以高亲和力与该表位特异性结合的某些试剂，即所述特异性结合对的第二成员接触。这种高亲和力的结合对反应通常被称为“标记反应”。
术语“抗体”包括但不限于特异性结合抗原的糖蛋白免疫球蛋白。通常，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合分子。每条H链包含重链可变区和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。由轻链和重链可变区(VL和VH)相互作用及其恒定区(CL和CH1)相互作用形成的抗体分子部分称为Fab或Fab片段(抗原结合部分)。抗体的木瓜蛋白酶消化导致产生Fab片段(每个分子2个片段)和称为Fc(结晶部分)的结晶的部分。Fc片段由铰链区下方的重链结构域组成，并且由CH2结构域彼此相互作用形成，以及类似地与CH3结构域相互作用形成。抗体的胃蛋白酶消化会切割铰链区下方的抗体分子，从而使连接重链的二硫键保持完整。因此，产生了由二硫化物连接的两个Fab样片段，并被称为(Fab’)2。当那些二硫化物被还原时，会产生单一抗原结合片段(Fab’)。重链的铰链区和CH2结构域(就在铰链区下方且接近铰链区的区域)包含与细胞上的Fc受体(FcR)结合的抗体分子的区域。因为抗体的胃蛋白酶消化并不总是导致均匀切割，一些(Fab’)2制剂可以包含FcR结合序列。
抗体或免疫球蛋白(Ig)可源自任何通常已知的同种型，其包括但不限于IgG、IgM、IgE、IgA和分泌型IgA。IgG亚类也是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4或小鼠IgG1、IgG2和IgG3。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的和非天然存在的抗体两者；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人类或非人类抗体；全合成抗体；重组产生的抗体；免疫球蛋白、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-重链对、胞内抗体(intrabody)、抗体融合物、异源偶联抗体(heteroconjugate antibody)、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fvs(scFv)、亲和抗体(affibody)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)，以及任何上述的抗原结合片段。如上所定义的抗体可以从任何种类获得。
表达Fc受体(FcRC)的细胞与其他造血细胞的区别在于它们粘附抗体-抗原复合物的能力。FcR与主要位于某些抗体亚类的CH2结构域中的氨基酸序列结合。FcR与抗体重链上的序列结合，所述序列位于铰链的下部或下方，并且接近某些抗体亚类的CH2的铰链区。FcγR是一类FcR，其仅与某些亚类的IgG抗体特异性结合。这些跨膜分子识别多种免疫球蛋白(Ig)类和亚类的Fc区。不同同种型的FcR的术语及其相应的CD命名如下：对于IgG(FcγRI/CD64、FcγRII/CD32和FcγRIII/CD16)、IgE(Fc∈RI)、IgA(FcαRI/CD89)、IgM(FcμR)、和IgA/IgM(Fcα/μR)。短语“基本上不含FcR”是指细胞不会粘附到携带免疫复合物的表面，其中那些复合物由已知与FcR结合的Ig同种型及其亚类形成。
“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类或亚类(例如，IgM或IgG1)。
术语“可检测标记”是指任何物质，对其通过物理或化学手段直接或间接地进行检测或测量可以指示测试样品中靶细胞的存在。有用的可检测标记的代表性实例包括但不限于以下：可基于光吸收、荧光、反射、光散射、磷光或发光特性直接或间接检测的分子或离子；可通过其放射性特性检测的分子或离子；可通过其核磁共振或顺磁特性检测的分子或离子。例如，包括在可基于光吸收或荧光间接检测的分子组中的是各种酶，其引起适当的底物转化，例如从非光吸收分子转化为光吸收分子，或从非荧光分子转化为荧光分子。
短语“基本上排除”是指生物特异性配体(例如，mAb)或生物特异性试剂(例如，生物素和链霉亲和素)与其相应的靶决定簇(例如，目标细胞上的细胞受体)之间结合反应的特异性。生物特异性配体和试剂对其靶决定簇具有特异性结合活性，但也可能表现出与其他样品成分的低水平非特异性结合。
如本文所用，术语“富集”是指从生物样品中富集靶T细胞和B细胞。
用于实施本发明的优选磁性颗粒是表现为胶体的颗粒。此类颗粒的特征在于它们的亚微米颗粒尺寸，其通常小于约200纳米(nm)(0.20微米)，以及它们长时间的在重力作用下从溶液中分离的稳定性。除了许多其他优点之外，这个尺寸范围使它们对于通常应用于细胞分析的分析技术基本上是不可见的。考虑将90-150nm范围内且具有70-90％磁性物质的颗粒用于本发明。合适的磁性颗粒由被分子包围的超顺磁性材料的结晶核心组成，所述分子结合(例如，物理吸收或共价附着)至磁芯并赋予稳定的胶体性质。涂层材料应优选地以有效防止样品中存在的生物大分子与磁芯之间的非特异性相互作用的量施加。此类生物大分子可包括非靶细胞表面的唾液酸残基、凝集素、糖蛋白(glyprotein)和其他膜成分。此外，所述材料应包含尽可能多的磁性物质/纳米颗粒。包含磁芯的磁性晶体的尺寸足够小，以至于它们不包含完整的磁畴。纳米颗粒的尺寸足够小，以至于它们的布朗能量超过它们的磁矩。因此，即使在中等强度的磁场中，这些胶体磁性颗粒的北极、南极排列和随后的相互吸引/排斥似乎也不会发生，从而有助于它们的溶液稳定性。最后，磁性颗粒应该在高磁梯度外场分离器中是可分离的。该特性有利于样品处理，并提供优于装载有铁磁性珠或钢丝绒的更复杂的内部梯度柱的经济优势。具有上述特性的磁性颗粒可以通过对美国专利号4,795,698、5,597,531以及5,698,271中描述的基础材料进行改性来制备。它们由这些基础材料的制备在下文进行描述。
有效离析幼稚、未接触的靶细胞
本文描述了制备用于基因工程方法和治疗方法如过继细胞疗法的幼稚细胞如T细胞的方法。具体地，在一些实施方案中，所述方法使用或生成含有多个不同细胞群或细胞类型的组合物，例如离析的CD4+和/或CD8+ T细胞群。在一些实施方案中，所述方法包括离析一个或多个细胞群的步骤。进行本文所述方法的细胞通常离析自源于哺乳动物受试者，优选人类受试者的样品。
我们发现有多种方法可以利用FcRC上的FcR以最少数量的特异性抗体对多个重要的细胞群进行阴性选择。在T细胞的情况下，我们发现单一抗体，优选IgG类抗体，其氨基酸残基在铰链区下方并与之接近，CH2结构域或完整的Fc能够与FcγRC产生结合反应。在除标记抗体外基本上不存在内源性或添加的IgG的情况下，此类抗体的Fab部分与B细胞上的独特表位发生反应，并可有效用于标记PBMC制剂中除幼稚和记忆T细胞外的所有细胞，而在其他情况下则与存在的IgG发生反应。与一系列公知的细胞分离技术相结合，例如，使用固体支持物的特异性结合对反应和流式细胞术类型的细胞分选方法，我们的发现能够用单一mAb或高度特异性的多克隆抗体纯化幼稚T细胞。换言之，在单核细胞、巨噬细胞、树突细胞(DC)、粒细胞和NK细胞上表达的FcγR以及与FcγR相互作用的抗体的Fc部分可创造性地和有利地用于细胞分离和幼稚T细胞的纯化。当该发现与针对B细胞表位(例如B细胞上的表面Ig、CD19、CD20或CD32)的单一mAb的使用相结合时，就实现了一种简单、高效且极其经济的用于制备幼稚T细胞的方法。结合针对CD4+或CD8+细胞的第二mAb，幼稚CD4+或CD8+细胞很容易被制备。本发明有多个实施方案。
在用于产生幼稚T细胞的一个实施方案中，基本上标记PBMC中除幼稚T细胞外的所有细胞以进行后续去除，是通过将来自与FcγR结合的抗体类别的Fc片段附着到固体支持物以及能够以足够结合能与B细胞结合的另一个实体来实现的，在这两种情况下，分别从悬浮液中去除FcγRC和B细胞。这可以使用具有独特B细胞特异性和与FcγR结合的亚类的单一抗体来实现。值得注意的是，我们已经确定此类表面上Fc的密度会影响与FcγR或与结合至FcγR的Ig的结合相互作用，并且确定必须考虑该表面上Fc的接近。我们推测，通过生物过程中公知的多价结合相互作用，这些相互作用得到了增强。
存在可以针对上述目的的多个对B细胞特异性的决定簇或表位，例如CD19、CD20和表面Ig。这些B细胞特异性表位的表达在B细胞发育过程中非常稳定。另一个合适的表位是CD32，其由于其广泛表达而在其他B细胞特异性表位中是优选的。CD32在B细胞和其他WBC上表达，T细胞除外。这种广泛的表达提供了一种通过强的Fab/CD32表位结合和Fc/FcγR结合用于标记所有FcγRC的有效方法。在本申请中，我们描述了多种适用于此任务的mAb。只需将这些FcγR反应性mAb中的任何一种以适当的密度偶联到表面，即可产生会结合B细胞和FcγRC的固体支持物。在将这些mAb中的一种与培养皿或类似容器偶联的情况下，研究人员或诊断医生只需去除不需要的细胞即可轻松制备幼稚T细胞。在将此类mAb与纳米颗粒(例如本文使用的FF)、其他磁性颗粒或具有漂浮能力的纳米/微米实体偶联的情况下，可以使用简单的方法进行更大规模的分离。存在多种方式可将mAb直接附着至表面上或通过合适的接头偶联。它们可以通过接头偶联，这可能是有利的，但正如我们展示的那样，直接偶联效果良好。
应当理解，在上述实施方案中可以使用抗体片段。生产Fab和Fc片段的方法已为人所知近50年，并且很容易生产，制备CH2结构域的方法也是如此，CH2结构域是与FcγR结合的IgG分子的主要部分。因此，Fc或CH2片段或甚至铰链区的氨基酸序列以及就在铰链区下方且接近铰链区的氨基酸序列(Kiyoshi M.,等人Structural basis for binding ofhuman IgG1 to its high-affinity human receptor FcγRI.Nature Communications,(2015),6:6866)都可以与抗B细胞特异性实体一起固定，以产生强而特异性的固体支持物用于捕获和随后去除FcγRC和B细胞。这些片段可以被直接连接，但使用接头可能更有效，因为后一种方法会产生更多的立体化学结合机会。
在用于产生具有由间接标记过程所提供的一些优势以及普通捕获剂的优点的幼稚T细胞的另一实施方案中，PBMC将与针对B细胞表位(例如抗CD19、抗CD20、抗人Ig或抗CD32)的mAb一起孵育。然后在一些携带针对标记mAb来源种类的抗Fc的适当支持物上与普通捕获剂一起孵育。对这种抗Fc的要求是它必须是能够与本领域公知的FcγR发生强烈相互作用的亚型。尽管对于临床使用，该实施方案需要两种mAb(标记mAb和普通捕获mAb)，但可以有效地使用标记mAb，即使用分子形式的抗B细胞mAb，而普通捕获剂上的第二mAb能够以这种方式用于许多其他特定的分离过程。
为此，我们采用了以高密度与FF偶联的单克隆大鼠抗小鼠Fc(RAM)，并且如前所述，我们还使用了与固体支持物结合的SA以及生物素化的靶向mAb。
值得注意的是，在间接方案中使用偶联到固体支持物的RAM来标记FcγRC的情况下，可能会有两个种类参与该标记反应，即RAM-固体支持物和与靶向抗体结合的成分，前提是它们属于适当的亚类。或者，当使用SA缀合的固体支持物或其他特异性结合对反应时，可能存在不同的机制。在这些情况下，当它们结合靶向mAb时，以及还可能借助它们的多价性，通过与有关FcγR的生物素标记的mAb结合时，普通捕获剂很可能成为FcγRC的标记剂。存在本领域已知的其他特异性结合对反应，例如DNP/抗DNP、荧光素/抗荧光素、生物素/抗生物素和阿胂酸/抗阿胂酸，它们可用于代替生物素/链霉亲和素，但是，生物素/SA结合对的强度与现有的共价键非常接近。在这种阴性选择过程中，不需要逆转标记，如果将来需要对那些被去除的细胞进行逆转反应，可以使用结合亲合力较小的结合对，例如脱硫生物素和链霉亲和素或生物素-抗生物素结合对反应，其可与亲和素或链霉亲和素解离。也可以考虑其他打破mAb和生物素之间或者链霉亲和素和HSA之间的键的方法。
因为PBMC可以分为三个亚组或级分，即幼稚T、B细胞和FcγRC，任何可以去除后两组的方法都应该导致幼稚T细胞的离析。上述实施方案利用了许多细胞类型上的FcγR的共性，并且靶向此类细胞，并结合与固体支持物偶联的抗B细胞mAb，将通过适当的处理产生幼稚T细胞。此外，标记和分离处理步骤可以通过使用生物素化mAb或其结合片段与SA普通捕获剂的间接程序进行。SA可以偶联至所提到的任何纳米/微米颗粒，或者可以连接至柱填料材料，例如琼脂糖或纤维以及本领域已知的其他材料(参见，例如，Etchells和Peterson，美国专利号5,215,926)。
如上所述，PBMC可以分为三个亚组或级分，即幼稚T、B细胞和FcγR细胞，并且使用一种特异性靶向B细胞表位的抗体可有效将CD3+ T细胞离析至高纯度。事实上，B细胞也表达低亲和力的FcγR、FcγRIIB，因此PBMC也可分为两类，例如T细胞和FcγR细胞。使用靶向FcγR的抗体也将提供去除非T细胞的能力，其Fab和Fc部分都与FcγR结合。众所周知，CD32，也称为FcγRII，在B细胞、单核细胞、粒细胞、树突细胞、NK细胞和血小板上广泛表达，因此，IgG类抗人CD32抗体应该能够去除所有使用Fab区的FcγRII表达细胞和使用Fc区的其他携带FcγR的细胞和适当缀合水平的FF，在级分中只留下T细胞。
如前所述，在使用单一抗体，即对B细胞具有独特特异性的mAb来产生幼稚T细胞的实施方案中，如果添加针对CD4+或CD8+ T细胞的第二mAb，则很明显，借助适当的分离系统将产生幼稚CD4+或CD8+细胞。在另一个实施方案中，同样有可能在一个分离方案中回收幼稚CD4+或CD8+细胞以及标记有mAb的那些细胞中的一个或另一个。换句话说，提供了一种方法用于获得那些未接触的幼稚亚群的一个和用mAb标记的另一个，所述方法在单一磁性分离或浮力分离中进行。例如，如果在一种情况下，将生物素化抗B细胞和脱硫生物素抗CD4的mAb混合物与PBMC混合，则所有FcRC、B细胞和CD4+细胞在加入SA固体支持物并与之孵育后都会被磁性标记。磁性分离后，CD8+细胞将保留在上清液或液相中，没有FcRC、B细胞和CD4+细胞。悬浮液中的CD8+因此很容易回收。在这种情况下，磁性分离的细胞将包含“阳性选择”的CD4+细胞。通过添加破坏脱硫生物素:SA键的生物素，可以很容易地释放这些细胞。如果分离是在能够大面积地磁性收集细胞的设备和分层非常均匀的细胞上进行的，就像我们开发的系统一样(WO 2016/183032 A1)，则可以预期这些CD4+细胞的良好回收率。如果需要，可以通过使用脱硫生物素抗CD8 mAb而不是抗CD4 mAb来实现通过这种方法回收幼稚CD4+细胞。除了通过生物素置换的脱硫生物素解离手段之外，用于解离生物素/抗生物素反应的方法是本领域公知的(Lund,G.和Wegmann,T.,美国专利号5,518,882；Brieden,J.和Dose,C.美国专利号20140113315A1)。因此，在上述方案中有多种方法可以回收mAb标记的CD4+或CD8+细胞。
除了本文公开的所有上述实施方案之外，还有可以使用的另一个变量，其甚至进一步扩展了这些概念和方法，使得离析幼稚NK细胞甚至幼稚B细胞成为可能。如上所述，由于除幼稚T细胞外的白细胞都表达FcγR，而且因为高亲和力受体和低亲和力受体的解离常数存在很大差异(Mkaddem S.,等人“Understanding Fc receptor involvement ininflammatory diseases”:Frommechanisms to new therapeutic tools.FrontImmunol.10:811,2019；Chauhan A.K.,Human CD4+ T-cells:A role for low-affinityFc receptors.Front Immunol.7:215,2016)，因此可以通过改变用于标记PBMC制剂的mAb浓度来实现优化的阴性分离条件。我们假设高亲和力FcγR可以通过与固体支持物上的Fc相互作用被选择性标记，这些支持物的聚集程度低于与低亲和力FcγR足够强的结合可能需要的那些。因此，现在可以离析仅携带低亲和力FcγR的FcγRC。
当合适的mAb与多价结合表面如SA-FF相互作用并随后与FcR相互作用时形成复合物的另一个结果是血小板也携带FcγR。因此，当PBMC与例如足够高浓度(>2μg/mL，例如2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μ/ml)的适当同种型的生物素化mAb孵育，然后与SA-FF孵育时，血小板也变成生物素标记的。因此，使用如上所述的普通捕获磁性纳米颗粒进行分离，或使用采用固体支持物或其他分离基质的一些其他方法进行分离也会从阴性级分中去除血小板。由于即使在制备不含大多数内源性IgG的PBMC时，血小板污染也可能是一个问题，因此它们可以通过其FcγR被去除。因此，本发明不仅提供了用于产生用于制备幼稚T细胞和其他细胞的方法的手段，而且还节省了时间和金钱，因为消除了在开始选择之前对血液产品进行任何重要处理的需要。
除了上述所有内容之外，如本文所公开的FcγRC可以容易地被除尽的原理使得其他重要的临床策略成为可能。例如，目前，CD34+干细胞是通过使用抗CD34 mAb的阳性选择来离析的。需要能够从未接触或幼稚细胞开始处理此类细胞用于移植或用于基因工程疗法。使用目前的做法，可以完成阴性选择，但这需要7-9种mAb才能将除CD34+细胞以外的所有细胞去除。从经济角度来看，这不是一个可行的方法。另一方面，从对正常人和白血病患者的胎儿和成人骨髓的研究中，已经证实FcγR不在未定型祖细胞CD34+细胞中表达(Olweus J.等人CD64/Fc Gamma RI is a granulo-monocytic lineage marker on CD34+hematopoietic progenitor cells.Blood.85:2402-13,1995；Aoki Y.,等人Identification of CD34+and CD34-leukemia-initiating cells in MLL-rearrangedhuman acute lymphoblastic leukemia.Blood.125:967-80,2015)。因此，使用本文所述的方法和试剂可实现未接触的CD34+干细胞的阴性选择。如下所示，仅用一种mAb，即生物素化抗CD3 mAb即可实现该结果。
使用在表面上聚集的Fc以结合FcγRC和血小板的原理可用于另一个有利的目的。如所公开的，我们已经发现用RAM-FF处理PBMC可以除尽所有单核细胞。此外，我们已经观察到血小板可能会被具有在其表面上的聚集的Fc区的构建体除尽。因此，PBMC和其他类似的混合物可以用此类试剂处理，以产生不含携带FcR的成分的PBMC制剂和混合物。人IgG以一种使其Fc片段紧密接近的方式结合到表面上，这对于结合携带FcγR的成分来说是理想的。这种FcγR载体的去除可以容易地通过使用具有磁性或浮力的颗粒使PBMC在密集结合的人IgG吸附剂上通过以及简单地通过标记此类实体来实现，从而它们的密度就会发生变化，使得基于细胞实体的差异密度的离心分离方法成为可能。
总之，我们发现FcγRC上的FcγR可以有利地用于幼稚T细胞的阴性选择，仅使用对B细胞具有特异性反应性的单一抗体和与FcγR结合的Fc区。公开了两种主要方法，每一种方法都能够以直接标记方法进行，即使用与固体支持物结合的单一关键试剂，或以间接标记方法进行，所述间接标记方法采用单一关键试剂以及表面或固体支持物，例如普通捕获剂，其能够使关键试剂以紧密堆积的方式与其结合。可以采用多种分离方法。
除了B细胞的直接结合，我们认为在FcγRC标记中起作用的机制是：(i)当使用针对B细胞的抗体(例如抗CD19或抗CD20)时，用在固体支持物上聚集的Fc标记FcγRC；(ii)在使用抗B细胞表面Ig如小鼠抗人IgG的情况下，事实上，小鼠抗人IgG也可以结合与FcγRC结合的免疫球蛋白，并可能通过近邻免疫球蛋白的交联稳定那些结合反应，从而增强FcγR-抗体反应的结合常数；(iii)如果使用抗CD32，抗体可以通过Fab互补位结合FcγRII，以及通过Fc区结合所有FcγR(图1)。如上所述，机制“2”对系统中的游离IgG敏感，因此最好以未清洗的PBMC样品中存在的较低水平的内源性IgG进行。当低亲和力FcγR通过增强其亲和力常数与彼此紧密接近的Fc区相互作用时，似乎它们也可以在“标记”FcγRC中发挥作用。因此，通过改变与PBMC结合的mAb水平，可以仅选择性地标记高亲和力FcγR。这种能力能够离析幼稚NK细胞和B细胞。
除了实际利用我们在FcR和表面上聚集的Fc之间观察到的“特异性结合对反应”的上述方法之外，我们还公开了免疫特异性靶向FcγR的方法作为纯化未接触或幼稚T细胞的方法。
目前要求保护的方法和组合物可用于有利地制备用于CAR T疗法的细胞。本发明还提供了阴性选择CD34+的方法，所述方法也具有显著的治疗潜力。
最后，鉴于本文提供的信息，可以设计重组分子以通过产生一种或多种多肽序列来发挥mAb的功能，这些多肽序列模拟那些与FcγR结合的抗体的FcγR结合区和可以特异性结合B细胞的分子实体(组合的或独立的)，或根据本申请的一些其他特异性。
提供以下材料和方法以帮助实施本发明。
磁性颗粒-铁磁流体(FF)：所有FF均由BioMagnetic Solution(State College,PA)制造。BSA/HSA-FF通过用牛血清白蛋白(BSA,Sigma)或人血清白蛋白(HSA,AkronBiotech,Boca Raton,FL)包被FF来合成，包被后的大小约为125-130nm，其含有84％的磁性物质；RAM-FF是通过使用标准trout试剂和sulfo-SMCC程序(Thermo Fisher,Waltham,MA)将大鼠抗小鼠IgG1 mAb缀合到BSA或HSA-FF上制成的，以及SA-FF类似地通过将链霉亲和素(Agilent,Santa Clara,CA)与BSA或HSA-FF缀合来合成，RAM-FF和SA-FF两者的大小约为155-165nm。
抗体和流式细胞术分析：小鼠抗人IgG多克隆抗体获自Jackson Laboratory(目录号209-005-082)。多克隆山羊抗人IgG(Fab’)2-生物素和Fab-生物素购自RocklandImmunochemicals(Pottstown,PA)，人CD3、CD19、IgG、CD20和CD32的mAb来自Absoluteantibody(Boston,MA)。抗人CD34和CD56抗体来自Biolegend(San Diego,CA)，荧光抗体抗CD45-FITC、抗CD3-PE、抗CD11b-PEcy5、抗CD19-PEcy5、抗CD34-PE和抗CD56-PE来自Biolegend。离析前后的细胞用荧光缀合抗体染色，通过对CD45阳性细胞进行门控来分析CD3、CD11b和CD19阳性细胞，使用同种型对照设置分析门(analysis gate)，并使用
Figure BDA0004113699150000221
easyCyteTM流式细胞仪(Luminex)分析样品。
细胞与细胞分离：用于许多实验的细胞来源于直接被离心以去除血浆的单采产品，所述细胞通过三个离心循环用含有0.5％ BSA的PBS洗涤，其中最终沉淀的细胞用CryoStor-CS10(Biolife Solutions,Bothell,WA)制成悬浮液,等分并冷冻。CryoStor-CS10是一种无血清和无蛋白质的细胞冷冻培养基。这些等分试样被称为PBMC-Ig，因为它们基本上不含内源性人IgG。还使用新鲜单采产品进行实验，所述单采产品用PBS中的1％ BSA或HSA洗涤两次。
直接阴性细胞选择程序：根据制造商的建议，使用Trout试剂和sulfo-SMCC将主要为IgG1同种型的小鼠抗人IgG(MAH-Ig)多克隆抗体与BSA-FF缀合。缀合旨在将抗体密集堆积在FF表面(4000-7000mAb/颗粒)。还用抗人CD19 mAb进行了类似的缀合。冷冻的PBMC直接用等体积的缓冲液(PBS中的4％ BSA)稀释，并与15ug/mL(基于Fe)MAH-Ig-FF和2-10x107个细胞/mL的细胞浓度在室温下孵育20分钟。由于FF很容易通过扩散标记细胞，因此在20分钟的孵育过程中不需要进一步混合。孵育结束时，如果需要，将细胞进一步稀释至2x107/mL，并在四重磁性分离器中分离15分钟。未分离的细胞-阴性级分-通过抽吸收集。使用CD45、CD3和CD11b抗体通过使用Guava EasyCyte Plus流式细胞仪的流式细胞术对阴性级分(未接触的细胞)进行分析。分析了CD3+ T细胞的纯度和产率。
间接阴性选择程序：首先将细胞与生物素化抗体孵育20分钟，然后将SA-FF直接添加到细胞混合物中并再孵育15分钟。然后将细胞稀释至2x107/mL并进行磁性分离。
提供以下实施例以说明本发明的某些实施方案。它们不意图以任何方式限制本发明。
实施例1
使用直接标记程序用抗人IgG抗体从单采产品/PBMC中离析未接触的CD3+ T细胞
主要为IgG1同种型的小鼠抗人IgG多克隆抗体(小鼠抗人IgG(MAH-Ig))获自Jackson Laboratory(目录号209-005-082)，并使用Trout试剂和sulfo-SMCC与FF缀合。MAH-Ig-FF上的抗体缀合水平约为300μg-500/μg铁。对于这些145nm的纳米颗粒，这表示抗体在颗粒表面“密集堆积”，每个颗粒具有大约4000-7000mAb。
将未经进一步处理的解冻PBMC-Ig(基本上去除了内源性Ig)与15μg/mL(基于铁浓度)MAH-Ig-FF和2-10x107个细胞/mL的细胞浓度在室温下孵育20分钟。由于FF很容易通过扩散标记细胞，因此在20分钟的孵育过程中不需要进一步混合。孵育结束时，任选地将细胞稀释至2x107/mL，并在四重磁性分离器中分离15分钟。未分离的细胞-阴性级分-通过抽吸收集。使用Guava EasyCyte Plus流式细胞仪通过流式细胞术对阴性级分(未接触的细胞)进行分析，其中通过使用抗CD45-FITC和抗CD3-PE对细胞进行染色来鉴定T细胞。参见图2。多个实验中CD3+ T细胞的纯度>95％。
从这些结果可以看出，显然，对人B细胞表面Ig具有结合特异性的单一抗体足以去除大部分FcγRC以及B细胞。95％纯度的T细胞通常高于主要临床制造组织中用于CAR T生产的T细胞。
实施例2a
使用生物素化抗人IgG抗体和SA-FF从单采产品/PBMC中离析未接触的CD3+ T细胞
如通过HABA测试所测量的，多克隆小鼠抗人IgG(MAH-Ig)被生物素化(MAH-Ig-生物素)至七个生物素/mAb的水平。SA-FF(145nm)来自BioMagnetic Solutions,StateCollege,PA(目录号SAFF-109)。将浓度为2-10x107的PBMC-Ig与2-4μg/mL的主要为IgG1同种型的MAH-Ig-生物素在室温下孵育20分钟。将SA-FF(15μg/mL)添加到细胞混合物中并再孵育15分钟。孵育结束时，将细胞稀释至2x107/mL，然后如上所述进行磁性分离。如实施例1那样，将阴性级分中的细胞通过荧光染色和流式细胞术分析进行分析，并在多个实验中发现>95％的未接触或幼稚CD3+ T细胞。
鉴于普通捕获剂SA-FF与PBMC-Ig中的细胞没有反应，特别是与任何这些细胞的FcγR没有反应，在这些实验中通过以下一种或多种机制去除t FcγRC。首先，当与PBMC混合时，MAH-Ig-生物素可以清楚地标记B细胞；它还可以与高亲和力的FcγR结合，如果浓度足够，还可以与低亲和力的FcγR结合；MAH-Ig-生物素交联占据FcγR的内源性Ig，这种交联由于亲和常数的多价增强而导致那些内源性Ig与其FcγR的结合增加。因此，MAH-Ig-生物素能够以高亲合力用生物素标记FcγRC。在将SA-FF在初始抗体孵育后添加到系统时应该发生的另一个反应是未结合的MAH-Ig-生物素也将同时与SA-FF结合形成能够与FcγR结合的复合物。因此，FcγRC被磁性标记的方式显然有多种。总结起来就是：(i)SA-FF通过多价相互作用与FcγRC上的生物素结合，产生非常强的结合，即亲合力，(ii)SA-FF与MAH-Ig-生物素复合，后者与“空的”FcγR强烈相互作用或由于多价附着的可能性，取代“填充的”FcγR中的Ig，或(iii)MAH-Ig-生物素与占据FcγR的Ig结合并通过多价附着交联Ig，产生足够的结合能，使得细胞容易被SA-FF标记。
实施例2b
使用生物素化抗人IgG(Fab’)2片段从单采产品/PBMC中离析未接触的CD3+ T细胞
山羊抗人IgG(FαHIg)的多克隆生物素化(Fab’)2片段购自RocklandImmunochemicals(Pottstown,PA)，并用于与实施例2a中所述类似的实验，只是在抗体标记之前将不同量的人IgG添加到细胞中。在添加抗人IgG(FαHIg)的生物素化F(ab’)2片段之前，PBMC-Ig与人IgG预孵育的效果列于表1中。随着人IgG量的增加，B细胞污染(在该制剂中最初为15％)显著增加，这是意料之中的，因为标记抗体被添加的人IgG中和。另一方面，CD11b+细胞(最初为29.3％)受到的影响明显较小。这表明复杂的结合反应在这些实验中起作用。例如，当没有添加人IgG时，(Fab’)2最有可能结合至与FcγR结合的Ig并导致这些Ig交联并稳定它们与FcγR的相互作用。此外，当人IgG的添加量增加时，可能会发生第二种现象，即(Fab’)2与IgG结合并形成与FcγRC强烈相互作用的复合物，从而导致它们被生物素标记并随后被SA-FF或用作为Ig-(Fab’)2-SA-FF复合物的一部分的SA-FF去除。然而，增加IgG的添加量会竞争(Fab’)2与B细胞表面IgG的相互作用，并影响B细胞的除尽。
表1.在FαHIg之前添加人IgG对离析的幼稚T细胞的纯度和产率的影响
预孵育时的[hIgG](μg/mL) 无 125 250 离析前
CD3+细胞纯度，％ 95.3 88.7 84.3 54.94
CD11b+细胞，％ 0.7 1.2 2.4 29.28
B细胞(CD19+)，％ 0.9 8.3 13.4 15.15
CD3+细胞产率，％ 57.0 73.0 78.9
当使用生物素化抗CD19 mAb进行与上述几乎相同的实验时，产生了高纯度的幼稚T细胞。使用人IgG的预处理在这些实验中几乎没有或没有影响，这证实了我们关于相互作用机制的假设。
实施例3
使用生物素化抗人CD32和SA-FF从单采产品中离析未接触的CD3+ T细胞
因为FcγR可用于去除FcγRC，如以上实施例所示，所以应该有可能以下列方式通过结合抗体-表位反应和聚集的Fc介导的FcRC磁性标记，用与FcγR结合的抗体去除所有此类细胞。抗CD32抗体与FcγRII结合，后者在白细胞(如B细胞/单核细胞/粒细胞/血小板)上广泛表达，但不在T细胞上表达。该抗体可通过抗体-表位反应用于标记所有携带FcγRII的细胞，包括制剂中的任何B细胞。未结合的生物素化抗CD32抗体与SA-FF反应也会发生结合，导致Fc在FF上聚集，FF也亲合结合FcγRC。这种方法能够标记所有γ类的FcR，在一种情况下使用抗CD32抗体，在另一种情况下使用与引入系统的捕获表面结合的抗CD32抗体。在适当的分离装置中孵育后，获得高纯度的幼稚T细胞悬浮液。为了证明该方法的效率，使用了对人CD32具有亲和力的IgG类生物素化小鼠mAb。将浓度为2-10x107的PBMC与2μg/mL的IgG1同种型的生物素化小鼠抗人CD32mAb在室温下孵育15分钟—为后续反应提供足够的未结合mAb。将SA-FF添加到细胞混合物中并再孵育15分钟。通过抗体-表位反应或通过SA-FF上的聚集Fc实现了FcRγC的有效标记。标记的细胞分离后，阴性级分中未接触或幼稚CD3+ T细胞的纯度>92％。
实施例4
使用两种抗体从单采产品或PBMC中阴性选择CD4+或CD8+ T细胞
基于前面的实施例，设计了用于制备幼稚CD4+或CD8+细胞的方法，其中包括一种针对CD4或CD8的额外mAb，具体取决于要阴性选择的T细胞类型。使用CD4+幼稚细胞的阴性选择来说明，两种mAb将被固定到FF上，其中一种或两种都与FcγR反应，即是正确的亚类/同种型。因此，如果通过将抗人IgG和抗CD8 mAb与FF偶联来修改实施例1，则此类缀合物在不存在大量竞争性IgG的情况下应该除尽所有FcγRC、B细胞和CD8+细胞，留下阴性级分中未接触的CD4+细胞。要获得幼稚CD8+细胞，固定的第二mAb将是抗CD4而不是抗CD8。因此，阴性级分将包含CD8+细胞。
在另一种方法中，当使用普通捕获剂如SA-FF时，可以使用两种生物素化mAb来实现与上述相同的结果。因此，通过将PBMC与生物素化抗CD8和抗B细胞特异性mAb一起孵育以标记CD8+细胞、B细胞和FcRC，可以实现生产幼稚CD4+细胞。使用SA-FF进行磁性分离会产生阴性选择的CD4+细胞。根据本文报告的纯度种类，预计CD4+细胞纯度将达到90％的中高水平。使用抗CD19-生物素和抗CD8生物素结合SA-FF通过实验证实了这一点，获得了纯度>92％的CD4+细胞。
实施例5
在单一磁性分离中使用两种mAb回收CD4+和CD8+细胞
基于由限定的比例的CD4+和CD8+细胞制备的CAR T构建体的临床重要性，以有效的方式完成此类分离将是需要的。使用本文描述的程序，可以合理地预期以下仅使用两种mAb特异性的方案能够完成该任务。实现这种分离的一种策略是从PBMC-Ig中除尽CD4+细胞外的所有细胞，将CD4+细胞留在阴性级分中，然后通过简单的提取过程从阳性选择的级分中回收CD8+细胞。
例如，基本上不存在IgG的PBMC可以和与FcγR相互作用的生物素化mAb，例如对B细胞特异性的同种型IgG1、IgG2或IgG3，以及IgG亚类的脱硫生物素化mAb以及对CD8+细胞特异性的非FcR结合抗体一起孵育。因此，所有携带FcγR的细胞都将被抗B细胞mAb标记有生物素，而CD8+细胞将被脱硫生物素化mAb标记。添加普通捕获剂，例如SA-FF，结合和分离后，CD8+细胞和所有FcγRC将被阳性分离，而剩余的阴性选择的幼稚CD4+ T细胞很容易回收。基于生物素和脱硫生物素与SA的结合常数的非常显著的差异(Hirsch JD,等人AnalyticalBiochemistry.308:343–357,2002)，应该可以通过与生物素孵育从SA-FF中释放CD8+细胞，生物素将从它们的SA结合位点取代脱硫生物素mAb。除了通过生物素置换的脱硫生物素解离手段之外，用于解离生物素–抗生物素反应的方法是本领域公知的(Lund,G.和Wegmann,T.,美国专利号5,518,882；Brieden,J.和Dose,C.美国专利号20140113315A1)。因此，在上述方案中有多种方法可以回收mAb标记的CD4+或CD8+细胞。
为了从SA-FF或其他合适的可解离结合对中回收CD8+细胞，有利的是使用磁性分离装置，其通过将它们散布在具有足够面积和磁性梯度特性的收集表面上使得它们不会堆积成堆来分离磁性标记的细胞。如果实现了这一点，如采用与专利公开WO2016/183032A1中公开的磁性分离系统一样，CD8+细胞可以在它们被磁性固定在收集表面上的同时被温和地提取。或者，磁性捕获的细胞可以用生物素悬浮(在SA-生物素系统的情况下)，会发生释放。然后再次分离混合物，留下容易回收的悬浮的CD8+细胞。
实施例6
通过用两种mAb间接标记从单采产品中离析未接触的B细胞
基于前述实施例中的结果，我们采用这些方法成功地生产了幼稚B细胞。在这种方法中，我们利用了在白细胞上表达的FcγR具有不同的结合亲和力这一事实。例如，单核细胞、巨噬细胞、DC和粒细胞表达高亲和力FcγR(FcγRI)，而B细胞和NK细胞表达低亲和力FcγR(对于B细胞为FcγRIIB，而对于NK细胞为FcγRIIC和FcγRIIIA)。虽然高亲和力FcγR对化合价不敏感，但低亲和力FcγR优选结合多聚体抗体。由于B细胞表达低亲和力FcγR(FcγRIIB)，因此降低标记步骤中使用的mAb浓度并调整FF上的SA涂层应该只会促进高亲和力反应，从而通过Fc结合在用于靶向的mAb上，优先标记反应混合物中的携带高亲和力FcγR的细胞，例如单核细胞、粒细胞和DC。由于CD3+细胞和NK细胞也需要被靶向去除，因此可以使用两种适用于此目的的mAb，包括但不限于抗CD3和抗CD16。PBMC-Ig可以与生物素化抗-CD3(约0.15μg/mL)和抗CD16(约0.05μg/mL)一起孵育15至20分钟，以达到适当的标记水平。然后可以用普通捕获磁性纳米颗粒或本领域熟知的一些其他合适的试剂去除所有不需要的细胞类型。通过这些方法，实现了高纯度的未接触的B细胞的回收。
实施例7
使用两种抗体从单采产品或PBMC中离析未接触的NK细胞
5-10％的PBMC是NK细胞，它们是提供了迄今为止已知的最有效的抗癌剂之一的革命性CAR-T免疫疗法的主要组成部分(Shimasaki N.,等人Nature Reviews DrugDiscovery,2020,19:200–218)。用癌症抗原离析用于基因工程的幼稚NK细胞包括CAR-T的重要初始步骤。基于实施例6中详述的相同概念，通过限制标记反应期间的mAb浓度和FF颗粒上的SA密度，在基本上不存在竞争性IgG的情况下，可以获得分离的未接触的NK细胞。在一种方法中，使用了生物素化小鼠抗人B细胞抗体(例如抗CD19 mAb)和生物素化小鼠抗人CD3抗体的组合，至少一种试剂是IgG1同种型。所述抗体将以总共约0.2μg/mL的浓度添加(0.15μg/mL的抗CD3 mAb和0.05μg/mL的抗B(CD19)mAb)。在这些抗体限制条件下，仅发生高亲和力FcγR结合。在与上述近似浓度的mAb孵育后，将添加SA-FF，并如实施例2中所述进行分离。随着mAb浓度的降低，T细胞、B细胞以及那些高亲和力的FcγRC将被磁性分离，从而将NK细胞留在阴性级分中。
实施例8
通过阴性选择离析未接触的CD34+造血干细胞
在广泛使用的当前方案中，CD34+干细胞是通过使用抗CD34 mAb的阳性选择来离析的。需要能够从未接触或幼稚细胞开始处理此类细胞用于移植或用于基因工程疗法。使用目前的做法，可以完成阴性选择，但这需要7-9种mAb才能将除CD34+细胞以外的所有细胞去除。从经济角度来看，这不是一个可行的方法。另一方面，从对正常人和白血病患者的胎儿和成人骨髓的研究中，已经证实FcγR不在未定型祖细胞CD34+细胞中表达(Olweus J.等人CD64/Fc Gamma RI is a granulo-monocytic lineage marker on CD34+hematopoietic progenitor cells.Blood.85:2402-13,1995；Aoki Y.,等人Identification of CD34+and CD34-leukemia-initiating cells in MLL-rearrangedhuman acute lymphoblastic leukemia.Blood.125:967-80,2015)。
因此，从选择适当的mAb开始以除尽PBMC中除CD34+幼稚细胞以外的所有细胞，可以应用以下策略：将IgG同种型的生物素化mAb-抗CD3与PBMC一起孵育大约20分钟，从而标记所有T细胞和FcγR表达细胞。非标记细胞的阴性选择可以用在如FF的固体支持物上的SA完成。这种磁性分离的上清液将是富集的CD34+细胞群，因为T细胞、B细胞和其他FcγRC(包括血小板)从溶液中被磁性分离出来。在某些实施方案中，PBMC的供体已用G-CSF处理以诱导造血干细胞从骨髓迁移到外周血中。
在这个实施方案中，重要的是通过向系统提供足量的生物素化mAb以及足够的孵育时间来彻底标记所有要去除的细胞，因为大约98-99％的有核细胞需要去除。在细胞浓度约为1x108/mL的情况下，使用浓度为2μg/mL细胞悬浮液的高亲和力mAb并孵育约20分钟应该就足够了。在这种情况下，存在约80000个mAb/细胞，这对于标记和随后去除此类细胞来说应该绰绰有余。
随着如此大比例的细胞被除尽，存在可能夹带所需CD34+细胞的危险。因此，建议在总细胞浓度低于约3x107个总细胞/mL并且可能低至5x106个总细胞时进行这种类型的分离。根据我们的经验，我们发现添加1％的蔗糖会显著减少夹带。此外，在采用磁性分离时，建议通过大面积分离去除不需要的细胞，以最大限度地减少截留。为实现这一点，建议使用分离系统，例如Liberti等人在WO2016/183032A1中公开的系统。该系统不仅最大限度地减少了收集成堆的细胞，而且还提供了一种通过称为“半月板擦洗(meniscus scrubbing)”的过程(一种去除夹带细胞的温和方法)去除夹带细胞的方法。
虽然上面已经描述并具体例示了本发明的某些优选实施方案，但是并不意味着本发明限于这些实施方案。本文引用的所有专利、专利申请和出版物均出于所有目的明确通过引用整体并入。在不脱离如权利要求所阐述的本发明的范围和精神的情况下，可以对其进行各种修改。

Claims (22)

1.一种从至少包含T细胞和B细胞的外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析靶细胞级分的方法，所述制剂基本上缺乏内源性或添加的IgG，所述靶细胞表面基本上不含Fc受体，所述方法包括：
(a)向所述PBMC制剂中引入单一免疫活性捕获剂，所述捕获剂同时与携带Fc受体的细胞和存在于所述制剂中的B细胞上的表位两者结合，所述捕获剂可操作地连接至包含磁响应颗粒的铁磁流体，从而形成选自B细胞、单核细胞、粒细胞和血小板的携带Fc受体的细胞的磁性簇；
(b)在磁性分离器中从所述制剂中离析所述携带Fc受体的细胞和B细胞的磁性簇；和
(c)回收处于基本上幼稚状态的靶细胞级分。
2.一种从至少包含T细胞和B细胞的外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析靶细胞级分的方法，所述制剂基本上缺乏内源性或添加的IgG，所述靶细胞表面基本上不含Fc受体，所述方法包括：
(a)向所述PBMC制剂中引入单一免疫活性捕获剂，所述捕获剂同时与携带Fc受体的细胞和存在于所述制剂中的B细胞上的表位两者结合，所述捕获剂可操作地连接至特异性结合对的第一成员；
b)在所述第一和第二结合对成员之间形成特异性结合对的条件下，使步骤a)的制剂与包含可操作地连接至第二结合成员的磁响应颗粒的铁磁流体接触，从而形成选自B细胞、单核细胞、粒细胞和血小板的携带Fc受体的细胞的磁性簇；
c)在磁性分离器中从所述制剂中离析所述携带Fc受体的细胞和B细胞的磁性簇；和
(d)回收处于基本上幼稚状态的靶细胞级分。
3.一种从至少包含T细胞和B细胞的外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析靶细胞级分的方法，所述制剂基本上不含内源性IgG，所述靶细胞表面基本上不含Fc受体，所述方法包括：
(a)向所述PBMC制剂中引入抗人IgG和捕获剂，所述捕获剂包含特异性结合对的第一成员和与B细胞上的表位结合的Fab或F(ab)’2；
b)在所述第一和第二结合对成员之间形成特异性结合对的条件下，使步骤a)的制剂与包含可操作地连接至第二结合对成员的磁响应颗粒的铁磁流体接触，从而形成选自B细胞、单核细胞、粒细胞和血小板的携带Fc受体的细胞的磁性簇；
c)在磁性分离器中从所述制剂中离析结合所述捕获剂的携带Fc受体的细胞和B细胞；和
(d)回收处于基本上幼稚状态的靶细胞级分。
4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是CD3+T细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述捕获剂是抗体或其免疫活性片段，其具有免疫特异性结合B细胞上的表位的Fab区和结合非靶细胞上的FcγR的Fc区。
6.根据权利要求5所述的方法，其中携带FcγR的非靶细胞选自单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突细胞和NK细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述Fab区结合选自CD19、CD20、IgG和CD32的B细胞表位。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述免疫活性捕获剂是小鼠或人来源的单克隆IgG抗体，并包含与人FcγR结合的Fc区。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述单克隆抗体为IgG1。
10.根据前述权利要求的任一项所述的方法，其中所述结合对成员选自生物素-链霉亲和素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、亲和素-生物素、生物素类似物-亲和素、脱硫生物素-链霉亲和素、脱硫生物素-亲和素、亚氨基生物素-链霉亲和素和亚氨基生物素-亲和素。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获剂包含铁磁流体，所述铁磁流体具有可操作地连接至大鼠抗小鼠IgG抗体或小鼠抗人IgG抗体的磁响应颗粒。
12.根据权利要求2所述的方法，其中所述特异性结合对的所述第一或第二成员是生物素。
13.根据权利要求12所述的方法，其中每个抗体包含3-7个生物素分子。
14.根据权利要求2所述的方法，其中所述特异性结合对的所述第一或第二成员是链霉亲和素。
15.一种从至少包含T细胞和B细胞的外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析幼稚CD4+T细胞的方法，所述制剂基本上缺乏内源性或添加的IgG，所述CD4+T细胞表面基本上不含Fc受体，所述方法包括：
(a)向所述PBMC制剂中引入第一免疫活性捕获剂和第二免疫活性捕获剂，所述第一免疫活性捕获剂同时与携带Fc受体的细胞和B细胞上的表位两者结合，所述第二免疫活性捕获剂与CD8+T细胞结合，所述第一和第二免疫活性捕获剂中的每一个可操作地连接至存在于铁磁流体中的磁响应颗粒；
(b)在磁性分离器中从所述制剂中离析结合所述捕获剂的携带Fc受体的细胞、B细胞和CD8+细胞；和
(c)回收处于基本上幼稚状态的CD4+T细胞。
16.一种从外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析幼稚CD8+T细胞的方法，所述制剂基本上缺乏内源性或添加的IgG，所述CD8+T细胞表面基本上不含Fc受体，所述方法包括：
(a)向所述PBMC制剂中引入第一免疫活性捕获剂和第二免疫活性捕获剂，所述第一免疫活性捕获剂同时与携带Fc受体的细胞和B细胞上的表位两者结合，所述第二免疫活性捕获剂与CD4+T细胞结合，所述第一和第二免疫活性捕获剂中的每一个可操作地连接至存在于铁磁流体中的磁响应颗粒，所述CD4+T细胞、所述B细胞和所述携带Fc受体的细胞形成磁性簇；
(b)在磁性分离器中从所述制剂中离析所述细胞的磁性簇；和
(c)回收处于基本上幼稚状态的CD8+T细胞。
17.一种从外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析幼稚NK细胞的方法，所述制剂基本上缺乏内源性或添加的IgG，在适合高亲和力Fc受体结合的条件下，所述方法包括：
(a)在适合高亲和力FcR结合的条件下，向所述PBMC制剂中引入第一免疫活性捕获剂和第二免疫活性捕获剂，所述第一免疫活性捕获剂同时与携带Fc受体的细胞和B细胞上的表位两者结合，所述第二免疫活性捕获剂与CD3+T细胞结合，所述第一和第二免疫活性捕获剂中的每一个可操作地连接至存在于铁磁流体中的磁响应颗粒并形成携带Fc受体的细胞、B细胞和CD3+细胞的磁性簇；
(b)在磁性分离器中从所述制剂中离析所述磁性细胞簇；和
(c)回收处于基本上幼稚状态的NK细胞。
18.一种从至少包含T细胞和B细胞的外周血单个核细胞(PBMC)制剂中离析幼稚CD34+干细胞的方法，所述制剂基本上缺乏内源性或添加的IgG，所述CD34+细胞表面基本上不含Fc受体，所述方法包括：
(a)向所述PBMC制剂中引入免疫活性捕获剂，所述免疫活性捕获剂同时与携带Fc受体的细胞和T细胞上的表位两者结合，所述免疫活性捕获剂可操作地连接至存在于铁磁流体中的磁响应颗粒；
(b)在磁性分离器中从所述制剂中离析结合所述捕获剂的携带Fc受体的细胞和T细胞；和
(c)回收处于基本上幼稚、未接触的状态的CD34+干细胞细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述PBMC离析自用G-CSF处理以引起造血干细胞从骨髓迁移到外周血中的供体。
20.根据权利要求18所述的方法，其中单克隆抗体和链霉亲和素以促进与FcγRI相互作用的浓度存在。
21.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述铁磁流体包含4000-7000个单克隆抗体/颗粒。
22.根据权利要求17所述的方法，其中通过将单克隆抗体的浓度降低至约0.2μg/ml来促进高亲和力FcR结合条件。
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