CN116179663A - 一种基于γ-溶血素纳米孔道收缩区实现核酸单分子片段式测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于γ‑溶血素纳米孔道收缩区实现核酸单分子片段式测序的方法，步骤：构建纳米膜片钳装置，在电解池的顺式、反式检测池间设置固态孔，并设置盐溶液；在固态孔上附着磷脂层阻断固态孔；γ‑溶血素蛋白形成由前庭及β‑桶状结构组成的八聚体结构；其连接区域为收缩区；在磷脂层上构建γ‑溶血素纳米孔道，使顺、反式检测池间的液体贯通；施加电压，获得开孔电流；在顺式检测池内加入核酸单分子水溶液，施加电压，使核酸单分子片段式移位通过所述收缩区；测量阻断电流；据此识别核酸单分子，获取片段式测序信息。本发明对双链亚稳态构象动力学特性的精准检测，实现识别码末端3个碱基的高空间分辨率识别，实现目标序列高精准测序。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于γ-溶血素纳米孔道收缩区实现核酸单分子片段式测序的方法。
背景技术
纳米孔道传感技术起始于1953年获得专利的库尔特计数法概念[1]。为了更进一步探索细胞内的基因信息，1996年，Deamer、Branton和Kasianowicz等人首次报告了蛋白质纳米孔道检测核苷酸的情况[2]。蛋白质纳米孔道目前可以实现DNA、RNA、多肽和蛋白质的信息提取(包括长度[3]、序列[4]、修饰碱基[5]等)，以及分子构象[6]和小分子物质[7]的检测。这种卓越的传感性能源于其作为电解池两室间唯一允许溶液中离子经过的通道。利用外加电源在纳米孔道两侧形成稳定的电势差，从而根据阻断电流情况反应样本信息。
γ-溶血素(γ-溶血素)是一种来自金黄色葡萄球菌的蛋白。其组成的纳米孔道具有八聚体β-桶状结构，较α-溶血素纳米孔道来说具有更大的前庭区域[8]。2018年，γ-溶血素纳米孔(HlgC-HlgB)道首次被Cherie S.Tan等人用作DNA结构分析，并成功实现了双链DNA碱基G到I的变化区分[8]。利用γ-溶血素纳米孔道收缩区的高传感灵敏度以及特有的空间尺寸可以使双链序列实现短暂停留，但高精度检测并区分不同双链的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种基于γ-溶血素纳米孔道收缩区实现核酸单分子片段式测序的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种基于γ-溶血素纳米孔道收缩区实现核酸单分子片段式测序的方法，包括以下步骤：构建纳米膜片钳装置，在所述纳米膜片钳装置中电解池的顺式检测池和反式检测池之间设置固态孔，使所述顺式检测池和所述反式检测池之间连通，所述顺式检测池内和反式检测池内分别设置有盐溶液；在所述固态孔上附着磷脂层，阻断所述顺式检测池和所述反式检测池之间的固态孔；制备γ-溶血素蛋白,所述γ-溶血素蛋白由分别来自于F类多肽与来自于S类多肽组装，形成由前庭及β-桶状结构组成的八聚体结构；前庭及β-桶状结构的连接区域为收缩区；在所述磷脂层上构建γ-溶血素纳米孔道，使所述顺式检测池和所述反式检测池之间的液体贯通；施加电压，获得开孔电流；在所述顺式检测池内加入核酸单分子水溶液，施加电压，使所述核酸单分子从γ-溶血素纳米孔道顺式端片段式移位通过所述收缩区；测量穿过所述γ-溶血素纳米孔道的阻断电流；根据测得的阻断电流识别所述核酸单分子，获取片段式测序信息。
所述盐溶液的浓度为2-4M，盐溶液的溶剂为pH＝5.0的HOAc/KOAc缓冲液。
所述盐为氯化钾或氯化钠。
所述核酸单分子为目标序列及目标序列对应的识别码，形成至少2段互补杂交分子，为A-型双螺旋结构，所述A-型双螺旋结构尺寸与收缩区尺寸结构匹配。
所述收缩区是由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4之一所示的F类多肽中的第104号至112号和第141号至152号的氨基酸序列与SEQ ID NO.5、SEQIDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9之一所示的S类多肽中的第100号至109号和第132号至141号氨基酸序列任意组合。
所述目标序列为第一种DNA或第一种RNA，第一种DNA对应的识别码为第二种RNA或PNA；所述第一种RNA对应的识别码为第二种DNA。
本发明的优点：
本发明跳脱极窄纳米孔直读和生物酶控速的固有思维，将识别码与目标序列结合形成单双链交替构象，利用γ-溶血素纳米孔道收缩区对于双链亚稳态构象动力学特性的精准检测，实现识别码末端3个碱基的高空间分辨率识别，实现目标序列高精准测序。
附图说明
图1表明目标序列和识别码互补情况。
图2显示了γ-溶血素纳米孔道检测样本中核酸单分子的全过程。
图3显示驱动电压在100mV下γ-溶血素纳米孔道开孔电流。
图4显示驱动电压在100mV下两段RNA识别码与目标序列过孔电信号。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种基于γ-溶血素纳米孔道收缩区实现核酸单分子片段式测序的方法，包括以下步骤：构建纳米膜片钳装置，用温控仪器将初始电压调至30mV，温度控制在20.0±0.5℃；电信号为0pA，在所述纳米膜片钳装置中电解池的顺式检测池和反式检测池之间设置直径2微米的固态孔(玻璃纳米孔)，使所述顺式检测池和所述反式检测池之间连通(使其成为电解质流通的唯一途径)，用注射器向顺式检测池内和反式检测池内分别注射3M氯化钾溶液(氯化钾溶液的溶剂为pH＝5.0的20mM的HOAc/KOAc缓冲液，也可以是2M-4M之间的任意浓度的氯化钾溶液或氯化钠溶液)，使其没过固态孔，电信号消失。重复多次可见相同现象，表明固态孔(玻璃纳米孔)洁净且畅通，可以用于后续实验；
在所述固态孔上附着磷脂层：
将二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)粉末以10mg/mL的浓度溶解在癸烷中为溶液一，随后，向顺式检测池中的盐水溶液中滴入溶液一使二植酰磷脂酰胆碱终浓度为0.0025mg/mL，利用注射器通过多次的抽吸式调整液面位置，促进二植酰磷脂酰胆碱从玻璃纳米孔经过并附着。当盐溶液液面无论是否没过固态孔，在施加初始电压下观察到电流信号值均为0pA，可以表明磷脂层成功附着在了固态孔上。随后施加击破气压100Pa(也可以在100-130Pa中任选一值)，若在给予某一气压量程范围内的气压后，电信号突然消失，表明磷脂层被击破且厚度适中，未击破则过厚，则需重新注入磷脂。阻断所述顺式检测池和所述反式检测池之间的固态孔；采样率为10kHz时，噪声小于2pA，可以开始后续实验，
制备γ-溶血素蛋白:(γ-溶血素蛋白由分别来自于F类多肽与来自于S类多肽组装，形成由前庭及β-桶状结构组成的八聚体结构；前庭及β-桶状结构的连接区域为收缩区)：
用F类多肽HlgB(SEQ ID NO.4市售)和S类多肽HlgC(SEQ ID NO.8，市售)和100mM脱氧胆酸盐(DOC)(100mM Tris-HCl为溶剂)溶液混合(HlgB/HlgC/DOC质量比1:1:10)，在100mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.3)中逐步搅拌至最终浓度为6.25mM DOC和3.5μM(S类多肽HlgC和F类多肽HlgB的混合物)。室温下进行两小时培育，通过100kDa截止离心过滤器(Amicon Ultra 100K设备)去除单体，提纯后获得γ-溶血素蛋白。
收缩区是由SEQ ID NO.4所示的F类多肽中的第104号至112号和第141号至152号的氨基酸序列与SEQ ID NO.8所示的S类多肽中的第100号至109号和第132号至141号氨基酸序列任意组合。
在所述磷脂层上构建γ-溶血素纳米孔道
将5μgγ-溶血素蛋白添加到顺式检测池中，施加气压30Pa(也可以选20-40Pa中任意一值和200mV(也可以选100-350mV中任意一值)电压帮助γ-溶血素蛋白嵌入磷脂层上。随后开始用正负电压对装置进行扫描，在外加电压的作用下，在所述磷脂层上构建γ-溶血素纳米孔道，使所述顺式检测池和所述反式检测池之间的液体贯通。当加压至出现开孔电流，气压归0后信号消失，则证明γ-溶血素纳米孔道已经在磷脂层上形成。在3M KCl溶液中，施加电压(外加30mV的电压)，获得开孔电流634pA(见图3)。通过对γ-溶血素纳米孔道开孔电流的检测，发现该γ-溶血素纳米孔道稳定性良好，能够保持开孔状态，并能够支撑完成数小时的实验；
制备核酸单分子：
采用固相合成方式制备目标序列第一种DNA(SEQ ID NO.10：5’-(A)30-GCAGAGTACTAACCA-(A)15-TAACCACTATACGAT-3’)和目标序列第一种DNA对应的识别码第二种RNA(SEQ IDNO.11：5’-UGGUUAGUACUCUGC-3’、SEQ ID NO.12：5’-AUCGUAUAGUGG UUA-3’)，合成后使用阴离子交换HPLC纯化方法，在30分钟内纯化每个样本，同时在260nm处监测UV吸光度。样本在4℃的ddH2O中透析36小时以去除纯化盐，之后通过冻干干燥。通过测量260nm处的吸光度并使用一级序列估计消光系数，从而获得ddH2O中重悬第一种DNA或第二种RNA分子的浓度。
获取核酸单分子阻断电流信号
在所述顺式检测池内加入核酸单分子水溶液(识别码第二种RNA/目标序列第一种DNA摩尔浓度比2：1)，于池内形成多段互补序列(见图1，所述核酸单分子为目标序列及目标序列对应的识别码，形成至少2段互补杂交分子，为A-型双螺旋结构，所述A-型双螺旋结构尺寸与收缩区尺寸结构匹配。)，施加电压(外加60mV的电压)，使所述核酸单分子从γ-溶血素纳米孔道顺式端片段式移位通过所述收缩区(见图2)；片段式移位的过程包括第一段互补序列短暂停留后，识别码脱落，第二段互补序列接触纳米孔道收缩区，直至所有识别码脱落完毕。
每次电压调节以20mV作为一档，最高不超过200mV，测量穿过所述γ-溶血素纳米孔道的阻断电流；直至出现高阻断电流信号；
信号收集与处理：
将所得到的阻断电流信号用QuB软件进行处理，获取时域频域信号特征，并利用Matlab软件对信号进行进一步分析，结合OriginLab软件对数据进行分析作图，根据测得的阻断电流识别所述核酸单分子，获取片段式测序信息(见图4)。核酸单分子为第一种DNA和二种RNA形成的2段互补杂交分子。
实验证明，还可以选用第一种DNA与PNA，或第一种RNA与第二种DNA形成互补序列，用于核酸单分子检测。
还可以选用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的F类多肽中的第104号至112号和第141号至152号的氨基酸序列替代SEQ ID NO.4所示的F类多肽中的第104号至112号和第141号至152号的氨基酸序列，其它同本实施例，组成新的实施例；
还可以选用SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示的S类多肽中的第100号至109号和第132号至141号氨基酸序列替代SEQ ID NO.8所示的所示的S类多肽中的第100号至109号和第132号至141号氨基酸序列，其它同本实施例，组成新的实施例。
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8.Tan CS,Fleming AM,Ren H,et al.γ-Hemolysin Nanopore Is Sensitive toGuanine-to-Inosine Substitutions in Double-Stranded DNAat the Single-MoleculeLevel.J Am Chem Soc 2018,140:14224-14234。
Claims (6)
1.一种基于γ-溶血素纳米孔道收缩区实现核酸单分子片段式测序的方法，其特征在于包括以下步骤：构建纳米膜片钳装置，在所述纳米膜片钳装置中电解池的顺式检测池和反式检测池之间设置固态孔，使所述顺式检测池和所述反式检测池之间连通，所述顺式检测池内和反式检测池内分别设置有盐溶液；在所述固态孔上附着磷脂层，阻断所述顺式检测池和所述反式检测池之间的固态孔；制备γ-溶血素蛋白,所述γ-溶血素蛋白由分别来自于F类多肽与来自于S类多肽组装，形成由前庭及β-桶状结构组成的八聚体结构；前庭及β-桶状结构的连接区域为收缩区；在所述磷脂层上构建γ-溶血素纳米孔道，使所述顺式检测池和所述反式检测池之间的液体贯通；施加电压，获得开孔电流；在所述顺式检测池内加入核酸单分子水溶液，施加电压，使所述核酸单分子从γ-溶血素纳米孔道顺式端片段式移位通过所述收缩区；测量穿过所述γ-溶血素纳米孔道的阻断电流；根据测得的阻断电流识别所述核酸单分子，获取片段式测序信息。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述盐溶液的浓度为2-4M，盐溶液的溶剂为pH＝5.0的HOAc/KOAc缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是所述盐为氯化钾或氯化钠。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述核酸单分子为目标序列及目标序列对应的识别码，形成至少2段互补杂交分子，为A-型双螺旋结构，所述A-型双螺旋结构尺寸与收缩区尺寸结构匹配。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述收缩区是由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4之一所示的F类多肽中的第104号至112号和第141号至152号的氨基酸序列与SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9之一所示的S类多肽中的第100号至109号和第132号至141号氨基酸序列任意组合。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述目标序列为第一种DNA或第一种RNA，第一种DNA对应的识别码为第二种RNA或PNA；所述第一种RNA对应的识别码为第二种DNA。
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| Title |
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| CHERIE SHUO TAN: "Detection of DNA Base Modifications by Biological Nanopores", UNIVERSITY OF UTAH THESES & DISSERTATIONS, pages 5 * |
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