CN116178566A - 靶向cd33的嵌合抗原受体和制备b16-cd33 car-nk细胞的方法 - Google Patents

靶向cd33的嵌合抗原受体和制备b16-cd33 car-nk细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116178566A
CN116178566A CN202211206295.9A CN202211206295A CN116178566A CN 116178566 A CN116178566 A CN 116178566A CN 202211206295 A CN202211206295 A CN 202211206295A CN 116178566 A CN116178566 A CN 116178566A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
cd33car
car
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211206295.9A
Other languages
English (en)
Inventor
刘庆喜
肖海蓉
魏卿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Boya Perception Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Boya Perception Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Boya Perception Pharmaceutical Co ltd filed Critical Shenzhen Boya Perception Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202211206295.9A priority Critical patent/CN116178566A/zh
Publication of CN116178566A publication Critical patent/CN116178566A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及靶向CD33的嵌合抗原受体和制备B16‑CD33CAR‑NK细胞的方法。一方面，涉及一种嵌合抗原受体，其包括作为第一信号的抗原结合域、跨膜结构域、作为第二信号的细胞内传导结构域、以及表达CD16抗体的第三信号域。所述制备CAR‑NK细胞的方法包括步骤：质粒合成、病毒包装、病毒收获及浓缩、NK细胞的制备、慢病毒感染。本发明的各个方面呈现如说明书所述优良效果。

Description

靶向CD33的嵌合抗原受体和制备B16-CD33 CAR-NK细胞的 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌CD16抗体的CD33 CAR-NK细胞，本发明还涉及此CAR-NK细胞如B16-CD33 CAR-NK细胞的制备方法及其用途。
背景技术
造血干细胞移植可以延长急性髓系白血病(AML)患者的生存期，但约20％的患者由于耐药仍不能达到完全缓解。针于复发/难治的(R/R)AML患者，几种新药和细胞疗法已被采用，包括去甲基化药，组蛋白去乙酰化酶抑制剂，免疫调节药物，靶向酪氨酸激酶抑制剂和嵌合抗原受体修饰(CAR)-T。CAR-T在AML中的治疗受限，主要原因是AML中存在的抗原(如CD33)可以被CAR-T细胞高度靶向识别杀伤，但也在正常髓系细胞和造血干细胞中表达。因此，CAR-T细胞靶向这些抗原可能导致严重的清髓毒性[Gill S,Tasian SK,Ruella M,Shestova O,Li Y,Porter DL,Carroll M,Danet-Desnoyers G,Scholler J,Grupp SA,June CH,Kalos M.Pre-clinical targeting of human acute myeloid leukemia andmyeloablation using chimeric antigen receptor-modified T cells.Blood 2014；123:2343-54]，以及其他不良反应：脱靶效应、细胞因子释放综合征和神经毒性。自然杀伤细胞(NK)能抑制人恶性血液肿瘤生长，具有抗肿瘤的能力，是先天免疫系统的关键。NK细胞活性受激活和抑制受体的调节，这些受体的平衡将决定NK细胞对健康或恶性细胞的反应，包括“自我”保持沉默(耐受)、自身反应性或细胞毒性(同种异体反应性)。NK细胞的功能可以通过以下途径实现：I)含有颗粒酶和穿孔素的溶酶体脱颗粒后，对肿瘤靶细胞产生自然的细胞毒性；II)细胞因子如干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)帮助形成适应性免疫反应；和，III)通过CD16，有效的低亲和力FcγRIII受体，介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
研究已经证明了通过CD16和单克隆治疗性抗体操纵NK细胞的治疗潜力，可将肿瘤细胞上的表面抗原与细胞毒性淋巴细胞(如NK细胞)的效应细胞受体连接起来，从而产生抗肿瘤作用。CD16xCD33BiKE包含两个抗体片段，第一个识别CD16(FcγRIII)，第二个针对骨髓分化抗原CD33，它们共同触发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。此外，CD16xCD33 BiKE已被证明能克服KIR信号传导的抑制作用，提高NK对AML的杀伤。B16-CD33 CAR的质粒构建原件中将CD16 VHH的氨基酸序列与CD33scFv串联，可以在两个方面增加NK细胞基础上的免疫治疗作用：1)作为肿瘤部位的锚定分子，募集NK细胞，使得局部NK细胞数量增加，延长肿瘤细胞与NK的接触时间，增强NK细胞的杀伤作用；2)在肿瘤部位激活NK细胞，进而杀伤肿瘤细胞。
本领域仍然期待有能够克服现有构建CAR-NK细胞技术中的缺陷的改进的肿瘤治疗的方法，例如通过提供一种具有优良性能的分泌CD16抗体的CD33 CAR-NK细胞来治疗肿瘤，为此，本领域技术人员期待有制备CAR-NK细胞的新方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有构建CAR-NK细胞技术中的缺陷，改进肿瘤治疗的方法，例如通过提供一种具有优良性能的分泌CD16抗体的CD33 CAR-NK细胞，以期来治疗肿瘤；进而，制备CAR-NK细胞的新方法亦是本发明的目的之一。
针对目前CAR-NK技术实际需求，本发明提供了共表达CD16抗体的CD33 CAR-NK表达质粒的构建，从而不仅能够将CD16抗体分泌到NK细胞外，还能够起到结合NK细胞表面相应受体结合进一步加强NK细胞的ADCC。
本发明制得的CAR-NK细胞亦可称为B16-CD33 CAR-NK细胞。
为达到上述至少一个目的，本发明采取以下技术方案。
本发明第一方面提供了一种嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)，其包括：
a)作为第一信号的抗原结合域、
b)跨膜结构域、
c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及
d)表达CD16抗体的第三信号域。
根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，所述第一信号的抗原结合域，其包含SEQID NO.1所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.1：EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTITDSNIHWVRQAPGQSLEWIGYIYPYNGGTDYNQKFKNRATLTVDNPTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCVNGNPWLAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASESLDNYGIRFLTWFQQKPGKAPKLLMYAASNQGSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQTKEVPWSFGQGTKVEVKRTV。
根据本发明第一方面的嵌合抗原受体，所述表达CD16抗体的第三信号域，其包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。SEQ ID NO.2：EVQLVESGGGFVQAGESLTLSCTSSTLTFTPYRMAWYRQAPGKQRDLVADISSGDGRTTNYADFAKGRFTISRDNIKNTVFLRMTNLKPEDTAVYYCNTFVSFVGIARSWGQGTQVTVSS。
本发明第二方面提供了制备CAR-NK细胞的方法，其包括以下步骤：
1、质粒合成：
使用载体pLVX合成B16-CD33 CAR-NK质粒，该质粒由CD33单链可变区、铰链区、跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、B16抗体构成；
2、病毒包装：
将步骤1构建的B16-CD33 CAR-NK质粒，以及病毒包装质粒(BaEV-gp和SPAX2)三者按5：1.5：3.5的比例(共10ug)与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至293T细胞(例如于T-75培养瓶，例如至融合度达70％～85％)，转染后6h更换DMEM完全培养基；
3、病毒收获及浓缩：
分别在48小时和72小时，收集细胞培养上清液，在4℃下4000rpm离心15min后取上清，0.45μm滤膜过滤，以22000rpm超速离心2小时后弃上清，用新鲜的DMEM培养基重悬沉淀，得到病毒浓缩液，备用(例如-80℃保存备用)；
4、NK细胞的制备：
取来自单采健康供者的外周血20ml，吸取20ml的Ficoll淋巴细胞分离液于离心管中，将采集的外周血于Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上层；在4℃下500g离心15min，离心后从管底至液面依次分为4层：红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层(即白膜层)、血浆层；用移液管直接吸去上层的血浆，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中，用PBS悬浮至40ml，在4℃下500g离心5min，重复两次以清洗细胞；用PBS重悬细胞沉淀并计数，将细胞密度调整至1*107个细胞/ml；取5*107个细胞(5ml)加入100μL的CD3Microbeeds(货号：130-050-101，美天旎公司)重悬，4-8℃孵育15min；将专用LS磁珠分选柱(货号：130-042-401，美天旎公司)置于磁力架(MACS，美天旎公司)上，使用2ml PBS冲洗LS柱后，将孵育后的细胞悬液加入到LS柱里，使之流到50ml离心管，作为要收集的细胞；用PBS洗两遍，计数后取2*107单个核细胞备用；复苏NK细胞扩增试剂(ZY-NKZ-0104，杭州中赢生物)中的滋养层细胞，然后放入盛有10ml完全培养基(NK细胞无血清培养基，增补有5％自体血浆+200IU/ml IL-2+80U/ml庆大霉素)的T-75培养瓶中，再将刚制备好的单个核细胞加入T-75培养瓶中混合培养，培养3天，为NK细胞；
5、慢病毒感染：
将NK细胞取出，悬浮细胞计数，接种于六孔板中，每孔种3*106个NK细胞，并加入1ml的ALyS505NK-EX培养基，按MOI＝20的感染系数加入制备好的病毒，感染8-12天，收获细胞，即得B16-CD33 CAR-NK细胞。
根据本发明第二方面的方法，其中所述B16-CD33 CAR的质粒构建原件及图谱如图1所示。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤2中，B16-CD33 CAR-NK质粒、病毒包装质粒BaEV-gp、病毒包装质粒SPAX2三者共添加10ug。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤2中，质粒与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至T-75培养瓶中的293T细胞。
根据本发明第二方面的方法，其中步骤2中，质粒与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至T-75培养瓶中的293T细胞，至融合度达70％～85％。
根据本发明第二方面的方法，其还进一步包括对经慢病毒感染的B16-CD33 CAR-NK细胞进行慢病毒转染效率检测。
根据本发明第二方面的方法，其还进一步包括对经慢病毒感染的B16-CD33 CAR-NK细胞进行慢病毒转染效率检测，平均转染效率大于30％例如大于40％。
根据本发明第二方面的方法，其还进一步包括对所得B16-CD33 CAR-NK细胞进行细胞毒性检测。
根据本发明第二方面的方法，其还进一步包括对所得B16-CD33 CAR-NK细胞进行NK细胞脱颗粒流式检测。
进一步的，本发明第三方面提供了一种CAR-NK细胞，其转染了表达本发明第一方面所述嵌合抗原受体的序列。
根据本发明第三方面的CAR-NK细胞，其能够分泌CD16抗体。
根据本发明第三方面的CAR-NK细胞，其包含靶向CD33的嵌合抗原受体。
根据本发明第三方面的CAR-NK细胞，其是照本发明第二方面任一项所述方法制备得到的。
在本发明上述各种操作步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
众所周知，嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是可以识别特定蛋白质(抗原)的细胞表面受体，这些蛋白质是由其他受体(嵌合体)的部分组成的。在我们的免疫系统中，B细胞和T细胞分别有表面受体叫做B细胞受体(BCRs)和T细胞受体(TCRs)，这些受体识别与疾病或病原体有关的特定蛋白质，这两种受体都有各自的优缺点。
没有抗原递呈细胞的帮助，TCRs无法识别抗原。然而，TCR可以向它的T细胞发出信号，直接杀死它找到的细胞，也可以发出信号，招募更多的细胞。另一方面，BCRs可以在没有任何帮助的情况下识别抗原。然而，来自BCR的信号只能用于招募其他细胞，而不能直接杀死目标。
CAR包含多个免疫受体的部分，目的是设计一种无需任何帮助就能识别抗原(如BCR)，然后直接杀死被识别的细胞(如TCR)的受体。CAR由两个主要的结构域组成:胞外域和胞内信号转导区。胞外域位于细胞外部，与环境相互作用。胞内信号转导区，位于细胞内，将细胞外的信号传递到细胞内部。胞外域通常是BCR的一个片段，已知它可以识别特定的抗原。例如，用于临床试验的一个CAR包含BCR的一部分，已知能识别CD19。这个片段可以被改变生成一个CAR，可以识别任何有已知BCR的抗原。
胞内信号转导区由信号分子的部分组成，这些信号分子对激活T细胞很重要。自从引入CAR，这个领域有了很大的发展。第一代的CAR含有CD3分子的一部分，它负责发出信号，表明受体已经被外界所束缚。第二代CAR包括另一种蛋白质CD28/4-1BB的一部分，CD28/4-1BB是一种可以增强受体信号的协同刺激分子。随着对CAR及其组成的研究不断进行，胞内信号转导区进行了进一步细化。第三代CAR目前同时包含两种共刺激分子，可以增强T细胞的信号和(或)存活。
设计一个CAR，可以使用任何BCR来检测任何已知的抗原，并用它来激活T细胞来杀死靶标。这是本领域目前正在探索的一种方法，用CAR对抗癌症。首先，从病人身上分离出T细胞，用一个专门针对他们的癌症的CAR来设计病人的T细胞，然后将这些细胞扩增并重新导入病人体内。目前，在临床或临床前试验中有30多个不同抗原的CAR，这些CAR有潜力针对大量的癌症，包括白血病、淋巴瘤、胶质母细胞瘤和乳腺癌。对CD19的CAR-T细胞疗法最近在美国被批准用于治疗B细胞癌。然而，对CAR进行微调的工作仍在进行中。就像第三代CAR以第二代CAR为基础，未来第四代CAR的开发很可能会进一步改进胞内信号转导区，以改善CAR信号。下一代CAR还可能含有一种编码的“自杀基因”，一旦被激活，将清除患者体内所有的CAR-T细胞。这将使临床医生在观察到明显的副作用或癌症已被清除时终止治疗。通过利用多种免疫受体的成分，CAR可以利用B细胞的特异性，并将其与T细胞的效力结合在一起，靶向并清除目的抗原。在过去的一年中，两家公司获得了美国食品和药物管理局(FDA)对用于治疗白血病和淋巴瘤的CAR-T细胞疗法的批准。随着对癌症特异性抗原的进一步研究和深入理解，嵌合抗原受体将成为癌症治疗的最大进展之一。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)是一种最近应用于临床上的新型细胞疗法，利用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞设计病人自身的免疫细胞来对抗癌细胞，是一种突破性的癌症疗法。
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(CAR-T)是一种最近应用于临床上的新型细胞疗法，利用嵌合抗原受体(CAR)-T细胞设计病人自身的免疫细胞来对抗癌细胞，是一种突破性的癌症疗法。
尽管目前人们在嵌合抗原受体T细胞免疫疗法方面取得了一些科学成就，然而在CAR-NK细胞免疫疗法方面仍然期待有所进展。本发明的目的就是为CAR-NK细胞免疫疗法提供一种新的途径。
已经发现，本发明与CAR-NK细胞免疫疗法相关的各个方面呈现优良的技术效果。
附图说明
图1：B16-CD33 CAR的质粒构建原件及图谱。
图2：CD33 CAR的质粒构建原件及图谱。
图3：检测转染72h后，利用PL抗体检测B16-CD33 CAR-NK中CAR的转染效率，转染效率是44.67％。
图4：THP1细胞株CD33的表达。
图5：流式检测按效靶比为1:1时，control/CD33 CAR-NK/B16-CD33 CAR-NK和THP1共培养0h，3h和12h后，对THP1细胞的杀伤水平，结果显示分别在3h和12h，CD33 CAR-NK和B16-CD33 CAR-NK对THP1的杀伤作用显著高于control组。
图6：流式检测control/CD33 CAR-NK/B16-CD33 CAR-NK和THP1分别按不同效靶比为5:1,2.5:1，1:1和0.5:1混合培养，结果显示共培养6h对THP1的杀伤效果，在效靶比为1:1和0.5:1时B16-CD33CAR-NK对THP1的杀伤作用显著高于control组和CD33 CAR-NK。
图7：CD33-B16 CAR-NK/CD33 CAR-NK/NK与THP1细胞系分别按1：1的比例共孵育4小时后采用流式细胞术检测CD3-CD56+CD107a+和CD3-CD56+Granzyme+的表达。
图8：CD33 CAR-NK和B16-CD33 CAR-NK输注小鼠体内肿瘤负荷柱状图。
图9：CD33 CAR-NK和B16-CD33 CAR-NK输注小鼠生存曲线图。
具体实施方式
下列实例将进一步说明发明的具体步骤以及特征，该等实例仅为示例而用，并非对本发明的限制，说涉及到的试剂和材料非特殊说明均为市售。
实施例1：制备CAR-NK细胞
1、质粒合成：
使用载体pLVX合成B16-CD33 CAR-NK质粒，该质粒由CD33单链可变区、铰链区、跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、B16抗体构成(图1显示了B16-CD33 CAR的质粒构建原件及图谱)；
使用载体pLVX合成CD33 CAR-NK质粒，该质粒由CD33单链可变区、铰链区、跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号构成(图2显示了CD33 CAR的质粒构建原件及图谱)。
CAR的组装的一般性方法是本领域公知的，例如，在本发明中，CAR的组装可参考中国专利号201710341236.5中所记载的方法进行。
2、病毒包装：
将步骤1构建的B16-CD33 CAR-NK质粒，以及病毒包装质粒(BaEV-gp和SPAX2)三者按5：1.5：3.5的比例(共10ug)与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至293T细胞(T-75培养瓶，至融合度达70％～85％)，转染后6h更换DMEM完全培养基；LipoFiter 3.0脂质体转染试剂购自汉恒生物；
将步骤1构建的CD33 CAR-NK质粒，以及病毒包装质粒(BaEV-gp和SPAX2)三者按5：1.5：3.5的比例(共10ug)与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至293T细胞(T-75培养瓶，至融合度达70％～85％)，转染后6h更换DMEM完全培养基；(具体的转染操作过程参见该转染试剂说明书，该转染试剂通过市售途径购自汉恒生物)；
3、病毒收获及浓缩：
分别在48小时和72小时，收集细胞培养上清液，在4℃下4000rpm离心15min后取上清，0.45μm滤膜过滤，以22000rpm超速离心2小时后弃上清，用新鲜的DMEM培养基重悬沉淀，得到病毒浓缩液(每瓶293T细胞所得沉淀加150ul培养基重悬)，-80℃保存(避免浓缩病毒液反复冻融)；
4、NK细胞的制备：
取来自单采健康供者的外周血20ml，吸取20ml的Ficoll淋巴细胞分离液于离心管中，将采集的外周血于Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上层。在4℃下500g离心15min，离心后从管底至液面依次分为4层：红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层(即白膜层)、血浆层；用移液管直接吸去上层的血浆，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中，用PBS悬浮至40ml，在4℃下500g离心5min，重复两次以清洗细胞；用PBS重悬细胞沉淀并计数，将细胞密度调整至1*107个细胞/ml；取5*107个细胞(5ml)加入100μL的CD3Microbeeds(货号：130-050-101，美天旎公司)重悬，4-8℃孵育15min；将专用LS磁珠分选柱(货号：130-042-401，美天旎公司)置于磁力架(MACS，美天旎公司)上，使用2ml PBS冲洗LS柱后，将孵育后的细胞悬液加入到LS柱里，使之流到50ml离心管，作为要收集的细胞(将CD3+T除去)；用PBS洗两遍，计数后取2*107单个核细胞备用；复苏NK细胞扩增试剂(IL-21NK细胞扩增试剂，货号ZY-NKZ-0104，杭州中赢生物)中的滋养层细胞，然后放入盛有10ml完全培养基(NK细胞无血清培养基，货号ZY-NKJ-1000，杭州中赢生物，其中还增补有5％自体血浆+200IU/ml IL-2+80U/ml庆大霉素)的T-75培养瓶中，再将刚制备好的单个核细胞加入T-75培养瓶中混合培养，培养3天，为NK细胞，进行慢病毒感染；
在本发明中，如未另外说明，所述PBS为pH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法为：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。
5、慢病毒感染：
将NK细胞取出，悬浮细胞计数，接种于六孔板中，每孔种3*106个NK细胞，并加入1ml的ALyS505NK-EX培养基(CELL SCIENCE&TECHNOLOGY INSTITUTE INC.，是一种NK细胞无血清培养基，其中不含动物源成分亦不含滋养层细胞)，按MOI＝20的感染系数加入制备好的病毒，感染8-12天(本实施例为10天)，收获细胞，即得B16-CD33 CAR-NK细胞(即分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞)或CD33 CAR-NK细胞。
实施例2：检测
下面接着对实施例1步骤5收获的B16-CD33 CAR-NK细胞和CD33 CAR-NK细胞或者制备细胞的方法进行考察。
1、慢病毒转染效率检测：
向实施例1步骤5所得经慢病毒感染的B16-CD33 CAR-NK细胞中加入PL蛋白(ACRO公司，货号：RPL-PP2H2)，混匀后于4℃孵育30min，PBS清洗后采用流式细胞仪进行检测。
图3显示了检测转染10天后，利用PL抗体检测B16-CD33 CAR-NK中CAR的转染效率，转染效率是44.67％；另外，同法对检测对经慢病毒感染的CD33 CAR-NK细胞的转染效率，结果为42.38％。慢病毒转染效率是本发明制备CAR-NK细胞的一个重要考量因素，一般地讲，在各种条件固定的情况下，转染效率低于10％以下是有可能的、高至60％甚至70％亦是有可能的，转染效率即使提高5％也是非常有意义的。以上步骤“3、病毒收获及浓缩”所得两种病毒(均为同一批次)在步骤“5、慢病毒感染”中对步骤“4、NK细胞的制备”所得同一批NK细胞进行感染，慢病毒感染操作平行进行6次，检测6次的转染效率，计算其转染效率的平均值(n＝6)，结果：对B16-CD33 CAR-NK细胞的平均转染效率为43.36％(±3.63％，n＝6)，对CD33 CAR-NK细胞的转染效率为41.64％(±4.12％，n＝6)。本发明人另外发现，在慢病毒感染阶段，向所用ALyS505NK-EX培养基中增补添加微量赤藓糖醇和氯化锌能够明显地提高转染效率，此一发现通过以下补充试验a～c描述。补充试验a：在实施例1中进行另外的“5、慢病毒感染”的操作，与实施例1不同的仅是所用NK细胞无血清培养基即ALyS505NK-EX培养基中还额外增补添加80μg/ml的氯化锌和6mg/ml的赤藓糖醇(两种试药预先用注射用水配制成50倍浓溶液，用安瓿瓶分装，121℃热压灭菌15分钟，临用时按比例添加至培养基中，添加量为使NK细胞无血清培养基中氯化锌的浓度为80μg/ml、赤藓糖醇的浓度为6mg/ml，本文其余语境中若有类似表述亦具有类似含义)，分别得到B16-CD33 CAR-NK细胞(即分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞)和CD33 CAR-NK细胞两种细胞；照实施例2之“1、慢病毒转染效率检测”测得两种细胞的平均转染效率分别为67.14％(±8.32％，n＝6)和64.32％(±5.86％，n＝6)；补充试验b：在实施例1中进行另外的“5、慢病毒感染”的操作，与实施例1不同的仅是所用NK细胞无血清培养基即ALyS505NK-EX培养基中还额外增补添加80μg/ml的氯化锌(预先用注射用水配制成50倍浓溶液，用安瓿瓶分装，121℃热压灭菌15分钟，临用时按比例添加至培养基中)，分别得到B16-CD33 CAR-NK细胞(即分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞)和CD33 CAR-NK细胞两种细胞；照实施例2之“1、慢病毒转染效率检测”测得两种细胞的平均转染效率分别为40.52％(±6.47％，n＝6)和42.67％(±7.32％，n＝6)；补充试验c：在实施例1中进行另外的“5、慢病毒感染”的操作，与实施例1不同的仅是所用NK细胞无血清培养基即ALyS505NK-EX培养基中还额外增补添加6mg/ml的赤藓糖醇(预先用注射用水配制成50倍浓溶液，用安瓿瓶分装，121℃热压灭菌15分钟，临用时按比例添加至培养基中)，分别得到B16-CD33 CAR-NK细胞(即分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞)和CD33 CAR-NK细胞两种细胞；照实施例2之“1、慢病毒转染效率检测”测得两种细胞的平均转染效率分别为42.31％(±5.94％，n＝6)和39.14％(±6.84％，n＝6)。根据上述补充试验，向所用ALyS505NK-EX培养基中增补规定量的赤藓糖醇和氯化锌能够使转染效率提高20～25％，这完全是出人意料的发现，因此，在本发明的任一方面的任一实施方案中，步骤“5、慢病毒感染”所用NK细胞无血清培养基即ALyS505NK-EX培养基中还额外增补添加80μg/ml的氯化锌和6mg/ml的赤藓糖醇。在本发明中，所用氯化锌的添加量以其无水物计。
2、细胞毒性检测：
为证明上述补充试验a制备的分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞对急性髓系白血病的靶向杀伤能力：我们选取了高表达CD33的阳性细胞株THP1(即人单核细胞白血病细胞，见图4)，使B16-CD33CAR-NK/CD33 CAR-NK/NK与THP1细胞系分别按1：1的比例共孵育48小时后采用流式细胞术检测细胞杀伤率。
图5显示了流式检测按效靶比为1:1时，control(即NK)/CD33 CAR-NK/B16-CD33CAR-NK和THP1共培养0h、3h和12h后，对THP1细胞的杀伤水平，结果显示分别在3h和12h，CD33 CAR-NK和B16-CD33 CAR-NK对THP1的杀伤作用显著高于control组。
图6显示了流式检测control/CD33 CAR-NK/B16-CD33 CAR-NK和THP1分别按不同效靶比为5:1,2.5:1，1:1和0.5:1混合培养，结果显示共培养6h对THP1的杀伤效果，在效靶比为1:1和0.5:1时B16-CD33 CAR-NK对THP1的杀伤作用显著高于control组和CD33 CAR-NK。
另外，参照上述细胞毒性检测的方法，对实施例1所得分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞同法进行检测，结果显示这些细胞与补充试验a所得细胞的结果基本相同。
3、NK细胞脱颗粒流式检测：
CD107a和Granzyme是NK细胞脱颗粒的标志物。使补充试验a所得B16-CD33 CAR-NK/CD33 CAR-NK/NK与THP1细胞系分别按1：1的比例共孵育4小时后采用流式细胞术检测CD3-CD56+CD107a+和CD3-CD56+Granzyme+的表达。结果如图7所示。
另外，参照上述NK细胞脱颗粒流式检测的方法，对实施例1所得分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞同法进行检测，结果显示这些细胞与补充试验a所得细胞的结果基本相同。
4、动物实验验证：
为进一步论证B16-CD33 CART NK细胞的体内靶点特异性，我们选用12只雌性6-8周龄NOD/Shi-scid IL-2Rγ(NOG)小鼠20±1.6g(n＝36，北京维通利华实验动物科技有限公司)，通过尾静脉分别注射3×106个带有荧光素酶标记的THP1细胞，建立AML小鼠模型；将AML模型小鼠分成3组，每组各4只，肿瘤细胞注射后第7天，3组小鼠分别接受2×107个补充试验a所得B16-CD33 CAR-NK细胞/CD33 CAR-NK细胞/Control(不加细胞的阳性对照组)治疗，此后，通过活体成像技术每周2次监测小鼠体内肿瘤负荷。成瘤后第35天，再注射2×107个B16-CD33 CAR-NK细胞治疗进行治疗，通过活体成像技术每周2次监测小鼠体内肿瘤负荷，检测到60天。图8为CD33 CAR-NK和B16-CD33 CAR-NK输注小鼠体内肿瘤负荷柱状图，图9为CD33 CAR-NK和B16-CD33 CAR-NK输注小鼠生存曲线图。
另外，参照上述动物实验验证的方法，对实施例1所得分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞同法进行检测，结果显示这些细胞与补充试验a所得细胞的结果基本相同。
根据上述结果可知，本发明所构建分泌CD16抗体的CD33-CAR-NK细胞可以应用于治疗多种恶性肿瘤，包括血液系统肿瘤(急性髓细胞白血病，慢性粒细胞白血病，骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤等液体肿瘤)。特别的，对于部分髓系恶性肿瘤(肿瘤细胞高表达CD33)，B16-CD33 CAR-NK细胞能够增强NK的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC作用)，增强CAR-NK的对阳性肿瘤细胞的杀伤，从而降低了疾病复发的风险。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (10)

1.制备CAR-NK细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)质粒合成：
使用载体pLVX合成B16-CD33 CAR-NK质粒，该质粒由CD33单链可变区、铰链区、跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、B16抗体构成；
(2)病毒包装：
将步骤1构建的B16-CD33 CAR-NK质粒，以及病毒包装质粒BaEV-gp和病毒包装质粒SPAX2三者按5：1.5：3.5的比例与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至293T细胞，至融合度达70％～85％，转染后6h更换DMEM完全培养基；
(3)病毒收获及浓缩：
分别在48小时和72小时，收集细胞培养上清液，在4℃下4000rpm离心15min后取上清，0.45μm滤膜过滤，以22000rpm超速离心2小时后弃上清，用新鲜的DMEM培养基重悬沉淀，得到病毒浓缩液，备用；
(4)NK细胞的制备：
取20ml的Ficoll淋巴细胞分离液于离心管中，将采集的外周血20ml于Ficoll液面上方1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上层；在4℃下500g离心15min，离心后从管底至液面依次分为4层：红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层即白膜层、血浆层；用移液管直接吸去上层的血浆，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中，用PBS悬浮至40ml，在4℃下500g离心5min，重复两次以清洗细胞；用PBS重悬细胞沉淀并计数，将细胞密度调整至1*107个细胞/ml；取5*107个细胞加入100μL的CD3 Microbeeds重悬，4-8℃孵育15min；将LS磁珠分选柱置于磁力架上，使用2ml PBS冲洗LS柱后，将孵育后的细胞悬液加入到LS柱里，使之流到50ml离心管，作为要收集的细胞；用PBS洗两遍，计数后取2*107单个核细胞备用；复苏NK细胞扩增试剂中的滋养层细胞，然后放入盛有10ml完全培养基即NK细胞无血清培养基的T-75培养瓶中，再将刚制备好的单个核细胞加入T-75培养瓶中混合培养，培养3天，为NK细胞；所述NK细胞无血清培养基增补有5％自体血浆+200IU/ml IL-2+80U/ml庆大霉素；
(5)慢病毒感染：
将NK细胞取出，悬浮细胞计数，接种于六孔板中，每孔种3*106个NK细胞，并加入1ml的ALyS505NK-EX培养基，按MOI＝20的感染系数加入制备好的病毒，感染8-10天，收获细胞，即得B16-CD33 CAR-NK细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所述B16-CD33 CAR的质粒构建原件及图谱如图1所示。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤2中，质粒与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至T-75培养瓶中的293T细胞。
4.根据权利要求1的方法，步骤2中，质粒与LipoFiter 3.0脂质体转染试剂共孵育后转染至T-75培养瓶中的293T细胞，至融合度达70％～85％。
5.根据权利要求1的方法，其还进一步包括对经慢病毒感染的B16-CD33 CAR-NK细胞进行慢病毒转染效率检测。
6.根据权利要求1的方法，其还进一步包括对经慢病毒感染的B16-CD33 CAR-NK细胞进行慢病毒转染效率检测，平均转染效率大于30％。
7.根据权利要求1的方法，其还进一步包括对所得B16-CD33 CAR-NK细胞进行NK细胞脱颗粒流式检测。
8.一种嵌合抗原受体，其包括：
a)作为第一信号的抗原结合域、
b)跨膜结构域、
c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及
d)表达CD16抗体的第三信号域；
所述第一信号的抗原结合域包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述表达CD16抗体的第三信号域包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
9.一种CAR-NK细胞，其转染了表达权利要求8所述嵌合抗原受体的序列。
10.根据权利要求9的CAR-NK细胞，其能够分泌CD16抗体；和/或，其包含靶向CD33的嵌合抗原受体。
CN202211206295.9A 2022-09-30 2022-09-30 靶向cd33的嵌合抗原受体和制备b16-cd33 car-nk细胞的方法 Pending CN116178566A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211206295.9A CN116178566A (zh) 2022-09-30 2022-09-30 靶向cd33的嵌合抗原受体和制备b16-cd33 car-nk细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211206295.9A CN116178566A (zh) 2022-09-30 2022-09-30 靶向cd33的嵌合抗原受体和制备b16-cd33 car-nk细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116178566A true CN116178566A (zh) 2023-05-30

Family

ID=86442993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211206295.9A Pending CN116178566A (zh) 2022-09-30 2022-09-30 靶向cd33的嵌合抗原受体和制备b16-cd33 car-nk细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116178566A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109385403B (zh) 靶向gpc3的car nk细胞
WO2020108645A1 (en) Cd19-and bcma-based combined car-t immunotherapy
CN108276497A (zh) 靶向cd19的嵌合抗原受体t细胞及其应用
US11932872B2 (en) Dual chimeric antigen receptor-t cell which can be regulated, construction method therefor and use thereof
CN110317822B (zh) Trop2嵌合抗原受体、其t细胞及其制备方法和用途
CN108884440A (zh) 用于增强免疫疗法的抗肿瘤活性的间充质干细胞
CN113214408B (zh) 一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途
CN112426526A (zh) 一种nk细胞的制备方法及其在治疗癌症中的应用
CN110305906A (zh) 一种靶向pdl1的car嵌合受体的慢病毒载体及pdl1-car-t细胞
CN113621077B (zh) 一种tim-3/cd28融合蛋白及所述融合蛋白修饰的car-t细胞
CN113583143B (zh) Car-t细胞及其制法
CN109265563B (zh) 一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体及其应用
CN117210411A (zh) 一种免疫细胞及其表达载体、应用和制备方法
CN116836282B (zh) 抗体、嵌合抗原受体及其用途
CN116178566A (zh) 靶向cd33的嵌合抗原受体和制备b16-cd33 car-nk细胞的方法
CN117230013A (zh) B16-cd33 car-nk细胞及其治疗肿瘤的用途
CN114989310A (zh) 一种嵌合抗原受体、表达嵌合抗原受体的巨噬细胞及应用
CN107019703A (zh) LSECtin在作为治疗和/或预防埃博拉病毒的靶点中的应用
CN116286660B (zh) 一种ipsc-（car）自然杀伤细胞、制备方法及其在肿瘤治疗中的应用
CN112661846B (zh) 一种靶向tshr的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体、其构建方法及其应用
CN114149978B (zh) 制备car-t细胞的方法
CN117143254B (zh) 一种嵌合抗原受体（car）以及在抗癌中的应用
CN116239692B (zh) 分离的抗体、包含该抗体的car及其用途
CN117384968B (zh) 一种嵌合抗原受体（car）及其用于治疗白血病的用途
WO2024087267A1 (zh) 一种靶向TGFβRII的嵌合抗原受体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination