CN116162633A - 病毒核酸分子及其组合物和使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及缺陷干扰基因及其病毒。已经发现，根据流感病毒和冠状病毒物种设计的缺陷干扰基因可以抑制亲本病毒的感染或复制。在体内，DIG诱导受感染动物对致死病毒剂量快速起效预防性保护。因此，本文公开了含有DIG的核酸、其药物组合物和相关的使用方法。例如，本文描述了含有一个或多个缺陷干扰基因的分离的多核苷酸，其中，该一个或多个缺陷干扰基因中的每一个含有对应于流感病毒或冠状病毒基因或基因组的一个或多个部分的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列包含基因中的缺失。该DIG可以是质粒的形式。质粒的药物组合物可用于限制病毒复制，以及预防或治疗流感病毒或冠状病毒相关疾病。

Description

病毒核酸分子及其组合物和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2021年11月24日提交的美国临时申请No.63/283,101的优先权和权益。于2021年11月24日提交的申请No.63/283，101全文通过引用并入本文。

序列表引用

于2022年10月18日创建的名为“UHK_01130_US_ST26.xml”，且具有89,128字节大小的序列表文本文件通过引用并入本文。

技术领域

所公开的发明总体涉及抗病毒剂，具体涉及用于预防和/或治疗病毒感染和疾病的组合物和方法。

背景技术

临床研究表明，早期治疗或预防性治疗可能是控制这些疾病的更有效方法。除了正在开发的治疗性抗病毒剂之外，预防性抗病毒剂可能在控制感染性疾病方面起着重要作用。疫苗接种目前是预防病毒感染最有效的策略，但疫苗效力是菌株依赖性的，并且回顾历史，在过去几十年，疫苗接种对流感的保护率在10％至60％不等[Centers for DiseaseControl and Prevention，Update：drug susceptibility of swine-origin influenza A(H1N1)viruses，MMWRMorb Mortal Wkly Rep，58，433-435(2009)]。考虑到SARS-CoV-2变异株的持续传播，这种情况可能也适用于新冠肺炎(COVID-19)疫苗。有效疫苗保护的起效需要至少两周时间，以产生足够滴度的中和抗体。针对流感病毒的神经氨酸酶抑制剂扎那米韦(zanamivir)和奥司他韦(oseltamivir)被批准用于预防，但是两者都需要每天施用，但如果经常使用这些神经氨酸酶抑制剂，则存在耐药性问题。直接靶向SARS-CoV-2的抗病毒药物已显示对具有轻度或中度症状的患者有益，但对呈现严重症状的患者获益并不明确[Beigel，J.H.et al.，The New England Journal of Medicine，383，1813-1826，Doi：10.1056/NEJMoa2007764，(2020)；Spinner，C.D.et al.，JAMA，324(11)，1048-1057，Doi：10.1001/jama.2020.16349，(2020)；Thiruchelvam，K.et al.，Expert Rev Anti InfectTher，1-19，Doi：10.1080/14787210.2021.1949984，(2021)]。这可能表明，对于COVID-19病例应考虑进行早期治疗或预防性治疗。

缺陷干扰基因(DIG)是具有内部缺失的病毒基因[Huang，A.S.&Baltimore，D.Nature,226，325-327，Doi：10.1038/226325a0，(1970)]。流感病毒DIG可抑制同源全长病毒RNA的复制，且抗病毒活性受DIG的长度和来源影响[Meng，B.et al.，Virology journal14，138，Doi：10.1186/s12985-017-0805-6(2017)；Duhaut，S.D.&Dimmock，N.J.J GenVirol83，403-411，Doi：10.1099/0022-1317-83-2-403，(2002)；Dimmock，N.J.，et al.，JVirol 82(17)，8570-8578，Doi：10.1128/JVI.00743-08(2008)；Bdeir，N.et al.PLoS One,14，e0212757，Doi：10.1371/journal.pone.0212757，(2019)；Zhao，H.et al.Nat Commun，9，2358，Doi：10.1038/s41467-018-04792-7，(2018)]。冠状病毒的亚基因组RNA的分析表明，冠状病毒会在病毒复制期间产生缺陷基因。但不清楚哪种DIG对于抗流感活性起着最佳作用，以及是否存在任何能够在体外和体内显著抑制冠状病毒的DIG。

对于新出现的流感病毒和冠状病毒，特别是对于具有易感染风险和/或严重疾病的人而言，需要开发具有新的抗病毒机制和广谱抗病毒作用的预防性抗病毒剂。

本发明的一个目的是提供抗病毒组合物及其使用方法。

本发明的另一个目的是提供用于递送编码缺陷干扰基因的核酸的组合物和方法。

本发明的另一个目的是提供用于预防和/或治疗病毒性疾病的组合物和方法，该病毒性疾病包括由流感病毒和冠状病毒(包括SARS-CoV-2)引起的个体疾病。

对本说明书中包含的文献、行为、材料、装置、制品等的任何讨论不应被认为是承认任何或所有这些内容形成现有技术基础的一部分，或因其在本申请的每项权利要求的优先权日之前就已存在而被认为是与本发明相关的领域中的公知常识。

发明内容

已经开发了防止致病病毒物种及其变异株的有效的抗病毒剂。工作实施例证明了根据流感和冠状病毒物种设计的缺陷干扰基因(DIG)的开发可以显著抑制同源病毒的感染和复制。在进行体内测试时，来自流感病毒或冠状病毒的DIG诱导了对受感染动物快速起效的预防性保护，从而提供了当前抗流感病毒和冠状病毒预防性临床策略的替代方案。因此，本文公开了含有DIG的核酸、其药物组合物和相关的使用方法。

特别地，本发明公开了一种含有一个或多个缺陷干扰基因的分离的多核苷酸，其中，该一个或多个缺陷干扰基因中的每一个含有对应于病毒基因或基因组的一个或多个部分的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列包含基因中的缺失。更具体地，该病毒基因的部分包含相对于病毒基因的缺失。优选地，该病毒是流感病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒)或冠状病毒(例如，SARS-CoV1、SARS-CoV2、MERS-CoV和其它冠状病毒)。

在一些形式中，当该病毒是流感病毒时，该基因编码RNA聚合酶或其亚基，例如但不限于PA、PB1和PB2。在一些形式中，该核苷酸序列可包含基因中的内部(中心)缺失。更具体地，包含在该核苷酸序列中的病毒基因的部分包含相对于病毒基因的内部缺失。在一些形式中，该核苷酸序列包含从该基因的5’端起的约150至600个核苷酸、从该基因的3’端起的约150至600个核苷酸，或其组合。优选地，该核苷酸序列包含从该基因的5’端起的约450个核苷酸和从该基因的3’端起的约450个核苷酸。

在特定形式中，该一个或多个缺陷干扰基因包含SEQ ID NO：7-11、14-16或18中任一个的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7-11、14-16或18中任一个具有75％或更高序列同一性的核苷酸序列。在一些形式中，该多核苷酸共包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16的核苷酸序列。

在一些形式中，当该病毒是冠状病毒，例如β-冠状病毒，更优选SARS-CoV-2时，该基因编码选自ORF1a、ORF1b、S、M、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF8和ORF10的结构、非结构或辅助蛋白或其片段。在一些形式中，该核苷酸序列包含从该冠状病毒基因组的5’端起的约600至1200个核苷酸、从该冠状病毒基因组的3’端起的约600至1200个核苷酸、编码ORF1b的基因的约600至1200个核苷酸，或其组合。在一些形式中，该一个或多个缺陷干扰基因包含SEQID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6具有75％或更高序列同一性的核苷酸序列。

在前述任一项中，相对于DIG所基于的病毒，该缺失可包含约400至2000个核苷酸或约3000至27000个核苷酸。在一些形式中，该缺失包含连续核苷酸。在一些形式中，该缺失包含非连续核苷酸。

本发明还提供了载体。在一些形式中，该载体含有本发明所公开的多核苷酸。该载体还可包含一个或多个启动子和/或聚腺苷酸化信号，其可操作地连接至包含在该多核苷酸中的一个或多个缺陷干扰基因。优选地，该载体是表达载体，例如质粒。

本发明还描述了含有本发明所公开的多核苷酸或载体的组合物。在一些形式中，该组合物还包含肽。合适的肽包括TAT-P1(YGRKKRRQRRRCWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQID NO：3)、TAT2-P 1(RKKRRQRRRCWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQ ID NO：4)、LAH4：KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA-NH2(SEQ ID NO：83)或其组合。在一些形式中，该组合物中肽与多核苷酸的重量比在约2：1至4：1的范围内。优选地，该重量比为4：1。

在一些形式中，该组合物还可包含一个或多个额外的所公开的多核苷酸或一个或多个额外的所公开的载体。在一些形式中，该组合物包含所公开的载体中的三个，其中第一载体包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列，其中第二载体包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列，并且其中第三载体包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列。

在一些形式中，肽与多核苷酸复合形成纳米颗粒。因此，所公开的组合物可包含肽-多核苷酸纳米颗粒。在一些形式中，该纳米颗粒的平均直径小于200nm或小于150nm。在一些形式中，该纳米颗粒的平均直径为约135nm。

本发明还提供了药物组合物。在一些形式中，该药物组合物包含与药学上可接受的载体或赋形剂组合的任何前述组合物。

本发明描述了所公开的核酸及其组合物的使用方法。本发明公开了一种产生一个或多个缺陷干扰基因的方法，该方法包括将所公开的载体引入宿主细胞，并在足以表达多核苷酸的条件下孵育该宿主细胞，从而产生该一个或多个缺陷干扰基因。

本发明还提供了一种减少流感病毒或冠状病毒在细胞中的复制的方法，该方法包括在适合于细胞产生含有从多核苷酸转录的一种或多种RNA的缺陷病毒的条件下，将所公开的载体引入细胞中，从而减少病毒的复制。

本发明公开了一种通过向受试者施用有效量的所公开的药物组合物来治疗受试者的流感病毒或冠状病毒感染的方法。本发明还描述了一种预防或治疗受试者的流感病毒或冠状病毒相关疾病的方法，该方法包括向受试者施用有效量的药物组合物。在一些形式中，该受试者已经暴露于流感病毒或冠状病毒、感染了流感病毒或冠状病毒，或处于感染流感病毒或冠状病毒的风险中。在一些形式中，该受试者是免疫受损的。

该流感病毒可选自甲型流感病毒或乙型流感病毒。合适的流感病毒株包括H1Nl、H2N2、H3N2、H3N8、H5N1或H7N9。在一些形式中，该冠状病毒是SARS-CoV-1或SARS-CoV-2。合适的SARS-CoV-2病毒株或变异株包括：SARS-CoV-2HKU-001a、SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变异株)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变异株)和SARS-CoV-2B.1.617.3。

在前述方法的任一种中，该组合物可以通过口服、鼻内或气管内施用。优选地，其中，该受试者是人。

所公开的方法和组合物的其他优点将部分地在以下描述中进程阐述，部分地将从一些描述中理解，或者可以通过所公开的方法和组合物的实践而获知。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求中特别指出的元素和组合来实现和获得。应当理解，前文的整体概述和下文的详细描述都仅仅是示例性和解释性的，而并不限制所要求保护的本发明。

附图说明

包含在本说明书中并构成本说明书的一部分的附图示出了所公开的方法和组合物的几个实施方案，并与说明书一起用于解释所公开的方法和组合物的原理。

图1A是缺陷干扰基因(DIG)的构建的示意图。通过融合PCR产生了具有内部缺失的DI-PB2、DI-PB1和DI-PA的DIG。虚线表示野生型病毒聚合酶基因中的内部缺失。所示的缩短的病毒聚合酶基因PB2、PB1和PA的实线序列插入PHW2000载体中。图1B是示出了各种DIG在A549细胞中抗A(H7N7)病毒的抗病毒活性的柱状图。图1C是示出了单一的PAD4和组合的DIG-3(包括PAD3、PB2D3和PB1D3)和DI-PAD4(包括PAD4、PB2D3和PB1D3)的剂量依赖性抗病毒效率的柱状图。将所示浓度的质粒DIG或空载体(PHW)转染到A549细胞中，然后在转染后24小时用H7N7病毒感染细胞。感染后48小时，通过噬菌斑测定法测量细胞上清液中的病毒滴度。图1D是示出了两剂DIG对A(H1N1)感染小鼠的保护作用的存活曲线。在病毒接种前48小时和24小时，将由TAT1-P1包装的DI-PAD4、PAD4、DIG-3或空载体(PHW)气管内接种到相应小鼠体内。由每组中的5只小鼠产生存活曲线。图1E是示出了一剂DIG对A(H1N1)感染小鼠的保护作用的存活曲线。在病毒接种前24小时，将由TAT1-P1包装的DI-PAD4、PAD4、DIG-3或PHW气管内接种到小鼠体内。由每组10只小鼠产生存活曲线。

图2A示出了冠状病毒DIG的构建。根据HKU-001a的亲本序列合成冠状病毒DIG(CD2100和CD3600)，并将其插入到载体PHW2000中。虚线表示野生型HKU001a(SARS-CoV-2)中的内部缺失。将连接在一起的三个实线序列插入PHW2000载体中，以产生CD2100和CD3600。图2B是示出了DIG RNA在293T、Calu-3和HK-2中的表达的柱状图。质粒转染24小时后，用特异性CD2100和CD3600引物通过RT-qPCR来测量细胞中的RNA表达。图2C是示出了DIG在HK-2细胞中的抗病毒活性的柱状图。将SARS-CoV-2(B.1.1.63)加入到DIG转染的细胞中，用于病毒复制。感染后48小时通过噬菌斑测定法测量细胞上清液中的病毒滴度。图2D是示出了CD3600的剂量依赖性抗病毒活性的柱状图。在病毒感染前一天，将CD3600或PHW(0.5μg、0.25μg或0.125μg/孔)转染到HK-2细胞中。感染后48小时，测量细胞上清液中的病毒滴度。图2E是示出了病毒传代后多个周期病毒复制期间CD3600抗病毒活性的柱状图。从HK-2细胞(用PHW或CD3600转染，并用SARS-CoV-2感染)中采集的上清液病毒在Vero-E6细胞中传代，并在感染后24小时测定上清液中的病毒滴度。图2F是示出了CD3600抗5种SARS-CoV-2变异株的广谱抗病毒活性的柱状图。

图3A是示出了TAT-P1、TAT2-P1和体内jetPEI在小鼠肺中的转染效率的柱状图。pCMV-Luc用肽：DNA的重量比为4：1的所示载体包装。在转染后24小时，测量小鼠肺中的荧光素酶表达。将小鼠肺中的荧光素酶表达标准化为1mg蛋白质，TAT-P1为1000。Mock表示用不具有pCMV-Luc的5％葡萄糖处理的小鼠。图3B是示出了由所示载体包装的pDI-PAD4纳米颗粒的流体动力学直径的柱状图。尺寸通过DynaPro Plate Reader动态激光粒度仪进行测量。图3C是示出了分别用纳米颗粒TAT2-P1/pCMV-Luc(1mg ml^-1/0.25mg ml^-1)和TAT2-P1/pCMV-Luc(2mg ml^-1/0.5mg ml^-1)转染的小鼠肺中荧光素酶表达的柱状图。Mock表示用不具有DNA的TAT2-P1接种的小鼠肺。

图4A是示出了在病毒攻击前3天施用至小鼠肺的抗病毒剂的保护效力的存活曲线。在A(H1N1)pdm09病毒攻击前3天，将TAT2-P1/DI-PAD4(20μg/5μg)、扎那米韦(40μg)或TAT2-P1/PHW(20μg/5μg)气管内接种到相应小鼠体内。对于疫苗治疗，在A(H1N1)pdm09病毒攻击前3天，使小鼠气管内接种TAT2-P1/PHW，并肌内注射480ng疫苗(疫苗-480)。图4B示出了对应于图4A的受感染小鼠的体重变化。图4C是示出了在病毒攻击前5天施用至小鼠肺的抗病毒剂的保护效力的存活曲线。在A(H1N1)pdm09病毒攻击前5天，将TAT2-P1/PHW、TAT2-P1/DI-PAD4或疫苗-480气管内接种到小鼠体内。图4D示出了对应于图4C的受感染小鼠的体重变化。由每组5至10只小鼠产生存活曲线。图4E和4F是示出了感染后2天仓鼠肺中病毒滴度的柱状图。在SARS-CoV-2(Delta)攻击之前一天(CD3600-D1)或3天(CD3600-D3)，将TAT2-P1/CD3600(50μg/12.5μg)鼻内接种到仓鼠肺。在病毒攻击前1天，将TAT2-P1/PHW施用至仓鼠肺。在感染后第2天采集肺组织，用于通过噬菌斑测定法和RT-qPCR测量病毒载量。

图5A至5G是证实TAT2-P1&LAH4在体内增强基因表达并抑制SARS-CoV-2变异株的结果的柱状图。图5A示出了293T细胞中的荧光素酶表达。pCMV-Luc由所示载体(TAT2-P1、LAH4，且TAT2-P1∶LAH4＝3∶2、4∶1或9∶1)包装，并转染到293T细胞中(n＝4)。图5B示出了小鼠肺中的荧光素酶表达(n＝4)。pCMV-Luc由所示载体包装，并接种到小鼠肺。在转染后24小时检测小鼠肺中荧光素酶的表达。图5C示出了由所示载体包装的质粒的肽纳米颗粒尺寸(n＝4)。*表示P＜0.05，且**表示P＜0.01。图5D示出，TAT2-P1&LAH4可递送CD3600，以显著抑制奥密克戎(Omicron)(n＝3)变异株在仓鼠肺中的复制。在病毒攻击前1天，将一剂CD3600气管内接种到仓鼠肺。在感染后第2天测量仓鼠肺中的病毒载量。图5E示出，TAT2-P1显著抑制SARS-CoV-2在VeroE6细胞中的感染(n＝4)。将用所示肽处理的SARS-CoV-2用于噬菌斑减少试验。PFU(噬菌斑形成单位，％)是经肽处理的病毒的噬菌斑数，其相对于未经处理的病毒的噬菌斑数归一化。**表示P＜0.01。图5F示出了在奥密克戎SARS-CoV-2感染前1天和感染后8小时，向仓鼠肺施用2剂PBS(n＝4)、TAT2-P1(n＝3)、具有CD3600(n＝4)或PHW(n＝3)的TAT2-P1&LAH4。图5G示出，在Delta SARS-CoV-2感染前1天和感染后8小时，向仓鼠肺施用PBS(n＝4)或具有CD3600的TAT2-P1&LAH4(n＝4)。在感染后第2天测量病毒载量。*表示P＜0.05，且**表示P＜0.01。P值通过双尾学生t检验进行计算。

图6是示出了TAT2-P1和LAH4在293T细胞中的细胞毒性的柱状图。将指定浓度的肽在293T细胞中孵育24小时。细胞活力(％)是经肽处理的细胞的OD值，其相对于未处理的细胞的OD值归一化。细胞毒性通过MTT法测定。数据以四个生物样品的平均值±SD表示。

图7是用于细胞转染的纳米颗粒稳定性的柱状图。在293T细胞中转染前72小时、24小时和15分钟，制备由TAT2-P1&LAH4(4∶1)包装的荧光素酶质粒。转染后，在转染后24小时，测量细胞中的荧光素酶表达。数据以至少四个生物样品的平均值±SD表示。

具体实施方式

通过参考以下具体实施方式和其中包括的实施例的详细描述以及附图及其先前和以下的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。

已经发现，通过TAT-P1递送至小鼠肺部的流感病毒的缺陷干扰基因可以保护小鼠免于感染甲型流感病毒[Zhao，H.et al.Nat Commun，9，2358，Doi：10.1038/s41467-018-04792-7，(2018)]。实践实施例示出，肺中DIG的抗病毒活性与肺组织中DIG的抗病毒活性和DIG的转染效率有关。TAT介导的转染主要是通过内吞作用，包括网格蛋白介导的内吞作用进行[Richard，J.P.et al.，J Biol Chem 280，15300-15306，Doi：10.1074/jbc.M401604200，(2005)]，caveolae/lipid-raft-mediated endocytosis[Ferrari，A.etal.，Mol Ther8，284-294；Doi：10.1016/s1525-0016(03)00122-9，(2003)]，micropinocytosis[Wadia，J.S.，et al.,Nat Med 10，310-315；Doi：10.1038/nm996，(2004)]，and endocytosis independent pathways[Duchardt，Fet al.，Traffic 8，848-866，Doi：10.1111/j.1600-0854.2007.00572.x.(2007)]。在气道和肺中，纳米颗粒的被动细胞摄取主要通过内吞途径介导，并且由于气道粘液的屏障效应而受到纳米颗粒尺寸的影响[Wang，Z.et al.，ACS Nano 3，4110-4116，Doi：10.1021/nn9012274，(2009)；Zhao，F.etal.Small 7，1322-1337，Doi：10.1002/smll.201100001，(2011)；Duncan，G.A.，et al.，MolThet24，2043-2053，Doi：10.1038/mt.2016.182(2016)；Foroozandeh，P.&Aziz，A.A.Nanoscale Res Lett 13，339，Doi：10.1186/s11671-018-2728-6(2018)]。增加气道和肺中的摄取效率的一种可行方式是优化纳米颗粒尺寸，以降低粘液的屏障效应，从而克服气道粘液中平均孔径(100至200nm)设定的限制[Duncan，G.A.，et al.，Mol Thet24，2043-2053，Doi：10.1038/mt.2016.182(2016)；Mastorakos P.et al.，Proc Natl Acad SciU SA112，8720-8725，Doi：10.1073/pnas.1502281112(2015)]。

工作实施例中描述的研究证明，与来自分段RNA流感病毒的聚合酶基因的12种其它DIG相比，缺陷干扰流感PA基因(PAD4)在人A549细胞中具有最好的抗病毒活性。当与用PAD4或DIG-3处理的小鼠相比时，用三种缺陷干扰基因的组合DIG-4(包括PAD4、PB1D3和PB2D3)对小鼠进行处理赋予了针对A(H1N1)pdm09病毒的最佳保护。还发现，与TAT-P1载体相比，TAT2-P1载体能更有效地体内转染质粒，且毒性更小。因此，当在病毒攻击前1天将CD3600施用至仓鼠肺部时，单剂TAT2-P1/CD3600可抑制SARS-CoV-2在仓鼠体内的复制。还观察到，在病毒攻击前3天和5天分别使小鼠施用DIG-4时，单剂TAT2-P1/DIG-4可有效地保护90％和50％的小鼠免受致死性流感病毒感染。

这些实验的结果表明，冠状病毒或流感病毒的单剂DIG可在受感染的动物体内提供快速起效的预防性保护，从而提供当前用于抗冠状病毒和流感病毒预防性临床策略的替代方案。由于DIG诱导抗药性病毒的可能性较低[Dimmock，N.J.&Easton，A.J.Journal ofvirology 88，5217-5227，Doi：10.1128/JVI.03193-13，(2014)]，所以DIG可规避与当前方法相关的耐药性挑战。

应当理解，除非另有说明，否则所公开的方法和组合物不限于具体的合成方法、具体的分析技术或具体的试剂，并且因此其可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制。

I.定义

在基因或基因组的上下文中，“缺陷干扰”是指衍生自亲本病毒或与亲本病毒相关的基因。这些基因被称为“缺陷的”，因为它们丧失了编码独立复制所需的所有病毒蛋白的能力，因此在不存在亲本病毒(也称为辅助病毒)的情况下是缺陷的。因此，需要辅助病毒以反式提供缺失的复制蛋白。DIG被称为“干扰”，因为它们可以减弱由辅助病毒引起的症状。通常，DIG相对于亲本病毒基因或基因组具有一个或多个缺失。因此，DIG可具有其相应辅助病毒基因或基因组的非连续部分。

术语“SARS-CoV-2”和“严重急性呼吸综合征冠状病毒2型”是指衍生自2019年底亚洲出现的动物传染病源的beta冠状病毒的Sarbecovirus亚属的致病性冠状病毒株，它们是2019人新型冠状病毒病(COVID-19)的大流行的病原体。SARS-CoV-2病毒在基因组中的遗传突变率高，导致多重变异的SARS-CoV-2病毒株快速发展。在这场大流行期间，全球范围内记录了导致COVID-19的病毒的多种变异株，包括在英国发现的称为B.1.1.7的变异株、在南非发现的称为B.1.351的变异株，以及在巴西发现的称为P.1的变异株。

术语“流感病毒”、“流感”可互换使用，并且是指甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒和丁型流感病毒。在美国，人甲型和乙型流感病毒几乎每个冬季都在人类中引起季节性的疾病流行(称为“流感季节”)。流感疾病的全球性流行被称为“流感大流行”，并且常会在新的和非常不同的甲型流感病毒出现时发生，该甲型流感病毒既会使人类感染，又能够在人类之间有效传播。基于所涉及的蛋白质，可以将甲型流感病毒分类为血凝素亚型或神经氨酸酶亚型。存在18种不同的血凝素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型。甲型流感病毒是流感大流行的主要原因。

在核酸的上下文中，“对应”是指第一核苷酸序列与第二核苷酸序列编码相同产物的关系。这两个核苷酸序列不必为了对应而相同，但它们可以相同。这两个核苷酸序列中的一个可以根据另一个核苷酸序列的序列进行设计。

本文所用的“引入”是指接触。“接触”是指允许或促进至少两个元素之间的直接接近或关联的状态。例如，将组合物(例如，含有缺陷干扰基因的所公开的多核苷酸或载体)引入细胞中是为了使细胞与组合物之间接触。该术语包括通过任何合适的方式，例如通过转染、电穿孔、转导、基因枪、纳米颗粒递送等，使接触的组合物渗透到细胞内部。

术语“可操作地连接”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能性连接，使得它们可以以它们预期的方式起作用(例如，导致后者表达)。该术语包括使调控区和核酸中的待转录序列定位，以便影响此序列的转录或翻译。`例如，为了使编码序列处于启动子的控制之下，多肽的翻译阅读框的翻译起始位点通常位于启动子下游1至约50个核苷酸之间。然而，启动子可位于翻译起始位点上游多达约5000个核苷酸或转录起始位点上游约2000个核苷酸。

“分离的”是指从自然状态改变或去除。分离的核酸可以以基本纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境(例如，宿主细胞)中。“分离的”核酸包括已经与天然存在状态下位于其侧翼的序列分开的核酸区段或片段，例如，已经从通常与其天然存在的基因组中的片段相邻的序列中除去的DNA片段。该术语也适用于已经从天然伴随该核酸的其它组分中基本纯化的核酸(例如，细胞中天然伴随该核酸的RNA或DNA或蛋白质)。因此，该术语包括，例如，mRNA或重组DNA，其整合到载体中，整合到自主复制的质粒或病毒中，或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中，或作为独立于其它序列的单独分子(例如，作为cDNA或通过PCR或限制酶消化产生的基因组或cDNA片段)存在。分离不需要绝对纯度，并且可包括至少50％分离的例如至少75％、80％、90％、95％、98％、99％或甚至99.9％分离的蛋白质、肽、核酸或病毒分子。

术语“抑制”或“降低”是指降低例如活性、表达或水平。这可以是活性或表达的完全抑制，或部分抑制。抑制可以与对照或标准水平进行比较。抑制可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77,％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

本文所用的术语“预防”是指在疾病或病症的临床症状发作之前施用化合物，以预防与疾病或病症相关的畸变的身体症状。

“载体”是包含分离的核酸，并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。载体的实例包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。“表达载体”是指含有多核苷酸的载体，所述多核苷酸具有与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体含有足够的顺式作用元件用于表达；用于表达的其它元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，例如粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)、噬菌粒、BAC、YAC，以及包含重组多核苷酸的病毒载体(例如，衍生自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒的载体)。

术语“序列同一性百分比(％)”描述了在对齐序列并引入间隙(如有必要)以获得最大序列同一性百分比后，候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。用于确定序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。用于测量比对的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法，可以通过已知方法确定。

给定核酸或氨基酸序列C与给定核酸或氨基酸序列D的序列同一性％(其可替代地表述为给定序列C与给定序列D具有特定序列同一性％)计算如下：

100乘以分数W/Z，

其中W是通过C和D的序列比对程序中的序列比对评分为相同匹配的核苷酸或氨基酸的数目，并且其中Z是D中的核苷酸或氨基酸的总数。应当理解，当序列C的长度不等于序列D的长度时，C与D的序列同一性％将不等于D与C的序列同一性％。

术语“有效量”是指足以提供所需药理学和/或生理学效果的量。所需的确切量可随受试者而变化，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、所治疗疾病的严重程度、所使用的特定化合物及其施用模式等。因此，无法指定确切的“有效量”。然而，本领域普通技术人员仅利用常规实验即可确定合适的有效量。

“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理学病状或病症的受试者的医学管理。该术语包括积极治疗，即具体针对疾病、病理状况或病症的改善的治疗，并且还包括病因治疗，即针对相关疾病、病理状况或病症的病因消除的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即，设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即，涉及最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理学状况或病症的发展的治疗；以及支持性治疗，即，用于补充旨在改善相关疾病、病理学状况或病症的另一种特定疗法的治疗。应当理解，治疗虽然旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理学状况或病症，但实际上不需要导致治愈、改善、稳定或预防。治疗效果可以如本文所述和本领域已知的适合于所涉及的疾病、病理学状况或病症的方式测量或评估。这种测量和评估可以以定性和/或定量的方式进行。因此，例如，疾病、病理学状况或病症的特征或特点和/或疾病、病理学状况或病症的症状可被降低至任何效果或任何量。

“药学上可接受的”是指不是生物学上或其它方面不期望的材料，即该材料可与所选化合物一起施用于受试者而不引起任何不期望的生物效应，或不以有害方式与其中含有该材料的药物组合物的任何其它组分相互作用。

如本文所用的，术语“受试者”是指任何个体、生物体或实体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、山羊、猪、黑猩猩或马、非人灵长类动物和人)和/或植物。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，预期涵盖成年和新生受试者以及胎儿，无论是男性还是女性。受试者可以是健康的或患有或易患疾病、病症或病状。

除非本文另有说明，否则数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值均并入本说明书中，如同其在本文中单独列举一样。

术语“约”的使用旨在描述在高于或低于所述值约+/-10％的范围内的值；在其他形式中，这些值可以在高于或低于所述值的+/-5％的范围内；在其他形式中，这些值可以在高于或低于所述值的+/-2％的范围内；在其他形式中，这些值可以在高于或低于所述值的+/-1％的范围内；前述范围旨在使上下文变得清楚，而并不暗示进一步的限制。

II.组合物

1.核酸

本发明公开了含有缺陷干扰基因(DIG)的核酸，该缺陷干扰基因根据流感病毒和冠状病毒物种设计，可以显著抑制同源病毒的感染和复制。

特别地，本发明公开了含有一个或多个缺陷干扰基因的分离的多核苷酸，其中，该一个或多个缺陷干扰基因中的每一个含有对应于病毒基因或基因组的一个或多个部分的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列包含基因中的缺失。更具体地，该病毒基因的部分包含相对于病毒基因的缺失。优选地，该病毒是流感病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒)或冠状病毒。

在一些形式中，当该病毒是流感病毒时，该基因编码RNA聚合酶或其亚基，例如但不限于PA、PB1和PB2。在一些形式中，该核苷酸序列可包含基因中的内部(中心)缺失。更具体地，包含在核苷酸序列中的病毒基因部分包含相对于源病毒基因的缺失。在一些形式中，该核苷酸序列包含从该基因5′端起的约150至600个核苷酸、从该基因3′端起的约150至600个核苷酸，或其组合。优选的是使基因片段不能产生功能性蛋白，但又不会大到阻碍病毒基因片段包装成病毒颗粒的内部缺失。从5′端和3端起的150个核苷酸对于病毒复制和包装是必需的，因此被保留下来。甚至更优选地，该核苷酸序列包含从该基因5′端起的约450个核苷酸和从该基因3′端起的约450个核苷酸。

在特定形式中，该一个或多个缺陷干扰基因包含SEQ ID NO：7-11、14-16或18中任一个的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：7-11、14-16或18中任一个具有75％或更高序列同一性的核苷酸序列。在一些形式中，该多核苷酸共包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ IDNO：16的核苷酸序列。

在一些形式中，当该病毒是冠状病毒，例如β-冠状病毒，更优选SARS-CoV-2时，该基因编码选自ORF1a、ORF1b、S和M的结构、非结构或辅助蛋白或其片段。在一些形式中，该核苷酸序列包含从该冠状病毒基因组5′端起的约600至1200个核苷酸、从该冠状病毒基因组3′端起的约600至1200个核苷酸、编码ORFlb的基因的约600至1200个核苷酸，或其组合。在一些形式中，该一个或多个缺陷干扰基因包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6具有75％或更高序列同一性的核苷酸序列。

在前述任一项中，相对于DIG所基于的病毒，该缺失可包含约400至2000个核苷酸或约3000至27000个核苷酸。在一些形式中，该缺失包含连续核苷酸。在一些形式中，该缺失包含非连续核苷酸。

本发明还描述了含有本发明所公开的多核苷酸或载体的组合物。在一些形式中，该组合物还包含肽。合适的肽包括TAT-P1(YGRKKRRQRRRCWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQID NO：3)、TAT2-P 1(RKKRRQRRRCWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQ ID NO：4)、LAH4(KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA-NH2；SEQ ID NO：83)或其组合。在一些形式中，该组合物中肽与多核苷酸的重量比在约2：1至4：1的范围内。优选地，该重量比为4：1。

在一些形式中，肽与多核苷酸复合形成纳米颗粒。因此，所公开的组合物可包含肽-多核苷酸纳米颗粒。在一些形式中，该纳米颗粒的平均直径小于200nm或小于150nm。在一些形式中，该纳米颗粒的平均直径为约135nm。

流感病毒可选自甲型流感病毒或乙型流感病毒。合适的流感病毒株包括HlNl、H2N2、H3N2、H3N8、H5N1或H7N9。在一些形式中，冠状病毒是SARS-CoV-2。合适的SARS-CoV-2病毒株或变异株包括：SARS-CoV-2HKU-001a、SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变异株)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变异株)和SARS-CoV-2B.1.617.3。

a.冠状病毒DIG

在一些实施方案中，DIG衍生自一种或多种冠状病毒。冠状病毒(巢病毒目、冠状病毒科和冠状病毒属)是在人和其它动物中引起呼吸道和肠道疾病的多种大型、有包膜的正链RNA病毒。

冠状病毒通常具有狭窄的宿主特异性，并且可以在许多动物中引起严重的疾病，并且几种病毒(包括传染性支气管炎病毒、猫传染性腹膜炎病毒和猪传染性胃肠炎病毒)是重要的兽医病原体。人冠状病毒(HCoV)在第1组(HCoV-229E)和第2组(HCoV-OC43)中均有发现，并且历史上造成了约30％的轻度上呼吸道疾病。

在约30000个核苷酸处，它们的基因组是在任何RNA病毒中发现的最大的。存在三组冠状病毒；第1组和第2组含有哺乳动物病毒，而第3组仅含有禽病毒。在每组中，根据宿主范围、抗原关系和基因组组织形式将冠状病毒分成不同的种类。基因组组织形式是典型的冠状病毒，其在两端具有特征性的基因顺序(5′-复制酶[rep]、刺突[S]、包膜[E]、膜[M]、核壳[N]-3′)和短的非翻译区。SARS-CoV复制酶基因(包括大约三分之二的基因组)编码两个多蛋白(由ORF1a和ORF1b编码)，其经历共翻译蛋白水解加工。rep下游有4个开发阅读框(ORF)，它们被预测编码所有已知冠状病毒共有的结构蛋白S、E、M和N。

在一些实施方案中，DIG衍生自Sarbecovirus亚属的严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)β冠状病毒。SARS-CoV-2病毒与2003年鉴定的SARS-CoV病毒具有大约75％的基因组序列同一性。SARS-CoV-2ORF1a/b基因的示例性核酸序列列于GenBank登录号MN908947.3中。SARS-CoV-2病毒的基因组组织形式与其他β冠状病毒相同；六个功能性开放阅读框(ORF)从5′到3′依次排列为：复制酶(ORF1a/ORF1b)、刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核壳(N)。此外，编码辅助蛋白的7个推定ORF散布在结构基因之间。

在一些优选实施方案中，DIG包含来自编码结构(S、E、M、N)或非结构(NSP)SARS-CoV-2蛋白的一个或多个基因的一个或多个SARS-CoV-2核酸序列。在一些实施方案中，DIG包含一个或多个SARS-CoV-2基因，或具有在多种不同冠状病毒中保守的SARS-CoV-2基因组中的选定表位的基因表达产物。在一些实施方案中，SARS-CoV-2变异株选自SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变异株)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变异株)、SARS-CoV-2B.1.617、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变异株)和SARS-CoV-2B.1.617.3。

b.流感病毒DIG

在一些实施方案中，DIG是缺陷流感病毒颗粒。流感病毒DIG可衍生自特定的流感分支或毒株，或者可以是被设计为对应于多种不同流感病毒毒株中的高度保守基因的合成DIG。

流感病毒有四种类型：甲型、乙型、丙型、丁型。人甲型和乙型流感病毒会引起季节性流行病。甲型流感病毒是已知引起流感大流行(即，流感全球性流行)的唯一流感病毒。丙型流感病毒感染通常会引起轻度疾病，并且不被认为会引起人类流感大流行。丁型流感病毒主要影响牛，并且尚不清楚是否会在人类中感染或引起疾病(参见w.w.w，cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm)。

甲型流感病毒粒子布满了比例为约四比一的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的糖蛋白刺突，该刺突从宿主细胞衍生的脂质膜上突出。较少数目的基质(M2)离子通道穿过脂质包膜，其中M2：HA的比约为每101-102个HA分子一个M2通道。包膜及其三个完整膜蛋白HA、NA和M2覆盖包围病毒体核心的M1蛋白的基质。在M1基质内部存在核输出蛋白(NEP；也称为非结构蛋白2，NS2)和核糖核蛋白(RNP)复合物，其包括包被有核蛋白(NP)的病毒RNA片段和异源三聚体RNA依赖性RNA聚合酶，该聚合酶由两个“碱性聚合酶”和一个“酸性聚合酶”亚基(PB1、PB2和PA)组成。乙型流感病毒的组织形式相似，具有四个包膜蛋白：HA、NA、NB(而不是M2)和BM2。因此，在一些实施方案中，DIG衍生自任何甲型或乙型流感病毒的HA、NA、M2、NS2、NB、PB1、PB2、PA或NP基因中的一种或多种。在特定实施方案中，DIG衍生自甲型或乙型流感病毒的PA基因(Bouvier and Palese P，Vaccine.2008；26Suppl 4(Suppl 4)：D49-D53.doi：10.1016/j.vaccine.2008.07.039)。

甲型和乙型流感病毒基因组各自包括8个负义单链病毒RNA(vRNA)片段，而丙型流感病毒的基因组具有7个片段。甲型和乙型流感病毒的8个片段(和丙型流感病毒的7个片段)按长度递减的顺序编号。在甲型和乙型流感病毒中，片段1、3、4和5每个片段仅编码一种蛋白质：PB2、PA、血凝素(HA)蛋白和核蛋白(NP)。所有流感病毒都在片段2上编码聚合酶亚基PB1；在一些甲型流感病毒株中，该片段也在+1交替读码框中编码辅助蛋白PB1-F2，PB1-F2是一种具有促凋亡活性的87个氨基酸的小蛋白质。在乙型或丙型流感病毒中没有发现PB1-F2的类似物。相反，甲型流感病毒的片段6仅编码NA蛋白，而乙型流感病毒的片段6既编码NA蛋白，又在-1交替阅读框中编码NB基质蛋白，NB基质蛋白是对应于甲型流感病毒M2蛋白的整合膜蛋白。甲型和乙型流感病毒的片段7都编码M1基质蛋白。在甲型流感病毒基因组中，M2离子通道也通过RNA剪接从片段7表达，而乙型流感病毒在+2交替阅读框中编码其BM2膜蛋白。最后，甲型和乙型流感病毒都具有单个RNA片段(片段8)(它们从该片段表达干扰素拮抗剂NS1蛋白)，并通过mRNA剪接表达参与病毒RNP从宿主细胞核输出的NEP/NS2。甲型流感病毒基于病毒表面的血凝素(H)和神经氨酸酶(N)蛋白分为不同的亚型。存在18种不同的血凝素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型(分别为H1至H18，和N1至N11)。因此，在一些实施方案中，DIG衍生自流感病毒的PA基因。在其它实施方案中，DIG衍生自流感病毒的PB1和/或PB2基因。尽管可能有198种不同的甲型流感病毒的亚型组合，但实际上仅检测到131种亚型。目前在人中常规传播的甲型流感病毒亚型包括A(H1N1)和A(H3N2)。因此，在一些实施方案中，DIG衍生自A(H1N1)流感病毒或A(H3N2)流感病毒，或提供对A(H1N1)流感病毒或A(H3N2)流感病毒的免疫。在一些实施方案中，DIG在所有A(H1N1)流感病毒之间是保守的，和/或提供对所有A(H1N1)流感病毒的免疫。在一些实施方案中，DIG在所有A(H3N2)流感病毒之间是保守的，和/或提供对所有A(H3N2)流感病毒的免疫。在优选的实施方案中，抗原在所有A(H1N1)流感病毒之间是保守的，和/或提供对所有A(H1N1)流感病毒的免疫。

甲型流感病毒被进一步分类为多种亚型(例如，H1N1或H3N2)，而乙型流感病毒被分类为两种谱系之一：B/Yamagata和B/Victoria。甲型和乙型流感病毒均可进一步分类为特定的分支和亚分支。可替换地，分支和亚分支可以分别被称为“组”和“亚组”。流感分支或组是基于其HA基因序列的相似性而对流感病毒进行的进一步细分(除了亚型或谱系之外)。分支和亚分支在系统发育树上显示为一组病毒，其通常具有相似的遗传变化(即，核苷酸或氨基酸变化)，并且有一个共同的祖先表示为树中的一个节点。与其它分支或亚分支遗传上不同的分支和亚分支不一定是抗原性不同的(即，与其他分支或亚分支相比，来自特定分支或亚分支的病毒可能不具有影响宿主免疫的变化)。在一些实施方案中，DIG在相同亚型和/或亚分支中的两种或更多种流感病毒之间是保守的，和/或提供对相同亚型和/或亚分支中的两种或更多种流感病毒的免疫。在优选实施方案中，DIG在不同亚型和/或亚分支中的两种或更多种流感病毒之间是保守的，和/或提供对不同亚型和/或亚分支中的两种或更多种流感病毒的免疫。在一些实施方案中，DIG在相同亚型和/或亚分支中的所有流感病毒之间是保守的，和/或提供对相同亚型和/或亚分支中的所有流感病毒的免疫。在优选实施方案中，DIG在不同亚型和/或亚分支中的多种流感病毒之间是保守的，和/或提供对不同亚型和/或亚分支中的多种流感病毒的免疫。

目前流行的流感A(H1N1)病毒与2009年春季出现的2009H1N1病毒大流行有关，并引起了流感大流行(参见w.w.w.cdc.gov/flu/about/viruses/types.htm)。该病毒称为“A(H1N1)pdm09病毒”或“2009H1N1”，并且从2009年到2021年季节性地持续传播。随着时间的推移，这些H1N1病毒经历了相对较小的遗传变化和抗原性变化。

在人类中传播并引起人类疾病的流感病毒中，A(H3N2)流感病毒在遗传上和抗原性上改变更迅速，并形成了许多持续共同传播的分离的、遗传上不同的分支。因此，在一些实施方案中，DIG衍生自所有当前传播的H1N1流感病毒，和/或提供对所有当前传播的H1N1流感病毒的免疫。在一些实施方案中，DIG衍生自所有当前传播的H3N2流感病毒，和/或提供对所有当前传播的H3N2流感病毒的免疫。在优选的实施方案中，DIG衍生自所有当前传播的H1N1流感病毒和H3N2流感病毒，和/或提供对所有当前传播的H1N1流感病毒和H3N2流感病毒的免疫。在一些实施方案中，DIG衍生自甲型流感病毒PA基因或甲型流感病毒PA基因的表达产物。

乙型流感病毒分为两种谱系：B/Yamagata和B/Victoria。乙型流感病毒还分类为特定的分支和亚分支。与甲型流感病毒相比，乙型流感病毒在遗传和抗原特性方面变化更慢。近几年的监测数据显示，在美国和全球，来自这两种谱系的乙型流感病毒共同传播。因此，在一些实施方案中，DIG衍生自乙型流感病毒，和/或提供对乙型流感病毒的免疫。因此，在一些实施方案中，DIG衍生自乙型流感病毒，和/或提供对乙型流感病毒的免疫。在一些实施方案中，DIG衍生自所有当前传播的乙型流感病毒，和/或提供对所有当前传播的乙型流感病毒的免疫。在一些实施方案中，DIG衍生自乙型流感病毒NP基因或乙型流感病毒PA基因的表达产物。

在一些实施方案中，DIG衍生自B/Yamagata和B/Victoria流感病毒，和/或提供对B/Yamagata和B/Victoria流感病毒的免疫。在其它实施方案中，DIG衍生自一种或多种H1N1流感病毒和一种或多种乙型流感病毒，和/或提供对一种或多种H1N1流感病毒和一种或多种乙型流感病毒的免疫。在其它实施方案中，DIG衍生自一种或多种H3N2流感病毒和一种或多种乙型流感病毒，和/或提供对一种或多种H3N2流感病毒和一种或多种乙型流感病毒的免疫。在其它实施方案中，DIG衍生自一种或多种H1N1流感病毒、一种或多种H3N2流感病毒和一种或多种乙型流感病毒，和/或提供对一种或多种H1N1流感病毒、一种或多种H3N2流感病毒和一种或多种乙型流感病毒的免疫。

c.其他病毒DIG

在一些实施方案中，DIG分离自包括但不限于来自任何以下病毒家族的病毒：沙粒病毒科(Arenaviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)、星状病毒科(Astroviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)、杆菌状核糖核酸病毒科(Barnaviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、亚马逊肺炎病毒(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、发状病毒属(Capillovirus)、香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)、圆环病毒科(Circoviridae)、长线形病毒属(Closterovirus)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、丁型肝炎病毒(Deltavirus)、香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)、耳突花叶病毒属(Enamovirus)、丝状病毒科(Filoviridae，例如马尔堡病毒(Marburg virus)和埃博拉病毒(Ebola virus，例如Zaire、Reston、IvoryCoast或Sudan病毒株))、黄病毒科(Flaviviridae，例如丙型肝炎病毒、1型登革病毒、2型登革病毒、3型登革病毒和4型登革病毒)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae，例如疱疹病毒1、3、4、5和6型，以及巨细胞病毒(Cytomegalovirus))、减毒病毒科(Hypoviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多泡病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae，例如麻疹、痄腮和人呼吸道合胞病毒)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae，例如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、肝病毒和口蹄疫病毒)、痘病毒科(Poxviridae，例如牛痘病毒和天花病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae，例如轮状病毒)、逆转录科病毒(Retroviridae，例如慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV)1型和HIV 2型)、弹状病毒科(Rhabdoviridae，例如狂犬病病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒等)、披膜病毒科(Togaviridae，例如风疹病毒、登革病毒等)以及单分体病毒科(Totiviridae)。

病毒DIG可衍生自特定病毒株，例如乳头瘤病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒)；肝炎病毒，例如，甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV))、蜱传脑炎病毒；副流感病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、轮状病毒、鼻病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、裂谷热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。

2.表达载体

在一些实施方案中，多核苷酸被整合到载体中或载体的一部分中。构建含有遗传序列和合适的转录和翻译控制元件的表达载体的方法是本领域熟知的。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。表达载体通常含有调控序列和所插入的编码序列的翻译和/或转录所必需的元件，所述编码序列可以是例如目的多核苷酸。编码序列可以可操作地连接至启动子和/或增强子，帮助控制所需基因产物的表达。根据预期的基因表达控制类型，生物技术中使用的启动子具有不同的类型。它们通常可分为组成型启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子和合成启动子。

例如，在一些实施方案中，编码缺陷干扰颗粒的核酸与启动子或本领域已知的其它调控元件可操作地连接。因此，多核苷酸可以是载体，例如表达载体。用于在原核或真核系统中表达的多核苷酸的工程化可以通过重组表达领域技术人员通常已知的技术进行。表达载体通常包括一种或多种启动子控制下的组合物中的一种。为了使编码序列“处于”启动子的控制之下，通常将阅读框的翻译起始位点的5′端定位在所选启动子(即3′)“下游”的约1至50个核苷酸之间。“上游”启动子刺激所插入的DNA的转录，并促进编码的重组蛋白的表达。这是在本文使用的上下文中的“重组表达”的含义。

许多标准技术可用于构建含有适当核酸和转录/翻译控制序列的表达载体，以便在多种宿主表达系统中实现蛋白质或肽的表达。可用于表达的细胞类型包括但不限于用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的哺乳动物细胞和细菌。应当理解，这些载体中的任何一种都可用于包装和递送DIG。

用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括复制起点(根据需要)、位于待表达基因前面的启动子，以及任何必需的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。复制起点可通过构建包含外源起点的载体来提供，例如可衍生自SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)来源，或可通过宿主细胞染色体复制机制来提供。如果载体整合到宿主细胞染色体中，则通常后者就足够了。

启动子衍生自哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。此外，还可以且可能期望使用通常与所需基因序列相关的启动子或控制序列，前提是所述控制序列与宿主细胞系统相容。

可以使用许多基于病毒的表达系统，例如，通常使用的启动子衍生自于多瘤病毒、2型腺病毒、巨细胞病毒和猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子是有用的，因为两者都容易从病毒获得，作为还含有SV40病毒复制起点的片段。也可以使用更小或更大的SV40片段，前提是包含从HindIII位点向位于病毒复制起点的BglI位点延伸的约250bp序列。

在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可以通过体外或体内重组将该嵌合基因插入腺病毒基因组中。插入病毒基因组的非必需区域(例如，区域E1或E3)中会产生活的并且能够在受感染的宿主中表达蛋白质的重组病毒。

组合物的有效翻译也可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。可能还需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员能够容易地确定这种需要，并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同框(或同相)以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以源自于天然和合成的多种来源。可以通过包含适当的转录增强子元件或转录终止子来提高表达效率。

在真核表达中，如果在原始克隆片段中不含适当的聚腺苷酸化位点，则通常也希望在转录单位中掺入适当的聚腺苷酸化位点。通常，polyA加成位点位于蛋白质终止位点的下游约30至2000个核苷酸处，位于转录终止之前的位置。

为了长期、高产率地生产重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可以工程化稳定表达编码蛋白的构建体的细胞系。与使用含有病毒复制源的表达载体不同，宿主细胞可以通过适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸位点等)和可选标记控制的载体进行转化。引入外源DNA后，可以使工程改造的细胞在富集培养基中生长1至2天，然后转入选择性培养基中。重组质粒中的可选标记对选择具有抗性，并使得细胞可以稳定地将质粒整合到染色体中，生长形成聚集，进而可以克隆并扩展到细胞系中。

在优选实施方案中，多核苷酸货物是RNA，如mRNA。mRNA可以编码目的多肽。在一些实施方案中，mRNA在5′端和/或3′端poly(A)尾部具有帽，其可以调节核糖体结合、翻译起始和细胞中mRNA的稳定性。

3.药物制剂

本发明还提供了包含与药学上可接受的载体或赋形剂组合的任何前述组合物的药物制剂。

制剂是使用由被认为是安全且有效的材料组成的药学上可接受的“载体”来制备的，并且可以施用至个体而不引起不期望的生物学副作用或不期望的相互作用。“载体”是药物制剂中存在的除活性成分以外的所有组分。术语“载体”包括但不限于：稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填料和涂料组合物。关于用于制备片剂和延迟释放剂型的材料、设备和工艺的详细信息，参见Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，eds.Lieberman et a1.(New York：Marcel Dekker,Inc.，1989)，and Ansel et al.，Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems，6.sup.th Ed.(Media，PA：Williams&Wilkins，1995)。

III.制备方法

本文描述了制备所公开的含有缺陷干扰基因的核酸组合物及其药物制剂的方法。实施例中描述了制备和验证所公开的核酸DIG的方法的实例。通常通过重组方法产生用于整合到病毒中的缺陷干扰病毒RNA。在一些形式中，载体含有所公开的多核苷酸。载体还可包含一个或多个启动子和/或聚腺苷酸化信号，其可操作地连接至包含在多核苷酸中的一个或多个缺陷干扰基因。优选地，载体是表达载体，例如质粒。可用于制备所公开的DIG、多核苷酸、载体和组合物的许多技术和方法都是已知的，并且适于这种用途。

本发明公开了产生一个或多个缺陷干扰基因的方法，该方法包括将所公开的载体引入宿主细胞中，并在足以表达该多核苷酸的条件下孵育该宿主细胞，从而产生该一个或多个缺陷干扰基因。

IV.使用方法

本发明还提供了所公开的含有缺陷干扰基因的核酸组合物及其药物制剂的使用方法。本发明提供了减少流感病毒或冠状病毒在细胞中的复制的方法，该方法包括在适于该细胞产生包含从所述多核苷酸转录的一种或多种RNA的缺陷病毒的条件下，将所公开的载体引入该细胞中，从而减少病毒的复制。

在一些形式中，该方法可用于通过向受试者施用有效量的所公开的药物组合物来治疗受试者的流感病毒或冠状病毒感染。在一些形式中，该方法可用于通过向受试者施用有效量的药物组合物来预防或治疗受试者的流感病毒或冠状病毒相关疾病。在一些形式中，该受试者已经暴露于流感病毒或冠状病毒、被流感病毒或冠状病毒感染，或处于感染流感病毒或冠状病毒的风险中。在一些形式中，该受试者是免疫受损的。

在一些形式中，该方法包括将缺陷干扰基因用作抗病毒剂。该流感病毒可选自甲型流感病毒或乙型流感病毒。合适的流感病毒株包括H1N1、H2N2、H3N2、H3N8、H5N1或H7N9。在一些形式中，该冠状病毒是SARS-CoV-1或SARS-CoV-2。合适的SARS-CoV-2病毒株或变异株包括：SARS-CoV-2HKU-001a、SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变异株)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变异株)和SARS-CoV-2B.1.617.3。在所有情况下，该序列从5′到3′呈阳性(反基因组意义)。该序列也表示为DNA。

所公开的缺陷干扰病毒基因也可用于诱导宿主免疫应答。例如，所公开的缺陷干扰病毒基因可用于疫苗组合物中。所公开的缺陷干扰病毒基因也可以通过诱导宿主免疫应答而用于广谱抗病毒活性。

在前述方法的任一种中，组合物可以通过口服、鼻内或气管内施用。优选地，其中，该受试者是人。

V.试剂盒

所公开的多核苷酸、试剂、组合物和其它材料可以以任何合适的组合包装在-起，作为用于实施或辅助实施所述方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的组分被设计为并适于在该方法中一起使用，则是有用的。

例如，包括用于施用给受试者的疫苗或其它组合物的试剂盒可以包括在无菌针、安瓿、管、容器或其它合适容器中的预定剂量的组合物。试剂盒可包括剂量和给药方案的说明书。在一些形式中，组合物是冻干的。试剂盒还可包括试剂(例如，盐水、缓冲溶液)和形成用于施用的制剂的说明书。说明书可规定试剂盒及其组分的合适储存条件。

还提供了用于产生蛋白质的试剂盒。此类试剂盒可包括所公开的多核苷酸(例如，质粒或其它表达载体)、病毒和/或使用说明书。该试剂盒还可包括用于转染或转导受体细胞的试剂和说明书。

所公开的组合物和方法可通过以下编号段落进一步理解。

1.一种包含一个或多个缺陷干扰基因的分离的多核苷酸，其中，该一个或多个缺陷干扰基因中的每一个包含对应于病毒基因的一个或多个部分的核苷酸序列，其中，该病毒基因的该部分包含相对于该病毒基因的缺失，其中，该病毒是流感病毒或冠状病毒。

2.如段落1所述的多核苷酸，其中，该病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。

3.如段落2所述的多核苷酸，其中，该基因编码选自PA、PB1和PB2的RNA聚合酶或其亚基。

4.如段落1至3中任一项所述的多核苷酸，其中，该病毒基因的部分包含相对于该病毒基因的内部缺失。

5.如段落1至4中任一项所述的多核苷酸，其中，该核苷酸序列包含从该基因5’端起的约150至600个核苷酸和从该基因3’端起的约150至600个核苷酸。

6.如段落5所述的多核苷酸，其中，该核苷酸序列包含从该基因5’端起的约450个核苷酸和从该基因3’端起的约450个核苷酸。

7.如段落1至6中任一项所述的多核苷酸，其中，该一个或多个缺陷干扰基因中的至少一个包含SEQ ID NO：5-10、13-15或17的核苷酸序列，或SEQ ID NO：5-10、13-15或17具有75％或更高序列同一性的核苷酸序列。

8.如段落1至7中任一项所述的多核苷酸，其中，该多核苷酸共包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的核苷酸序列。

9.如段落1所述的多核苷酸，其中，该病毒是冠状病毒，优选β-冠状病毒，更优选SARS-CoV-2。

10.如段落9所述的多核苷酸，其中，该基因编码选自ORF1a、ORF1b、S、M、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF8和ORF10的结构、非结构、辅助蛋白或其片段。

11.如段落9或10所述的多核苷酸，其中，该核苷酸序列包含从该冠状病毒基因组5’端起的约600至1200个核苷酸、从该冠状病毒基因组3’端起的约600至1200个核苷酸、编码ORF1b的基因的约600至1200个核苷酸，或其组合。

12.如段落9至11中任一项所述的多核苷酸，其中，该一个或多个缺陷干扰基因中的至少一个包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6具有75％或更高序列同一性的核苷酸序列。

13.如段落1至12中任一项所述的多核苷酸，其中，该缺失包含约400至2000个核苷酸或约3000至27000个核苷酸，任选地其中，该核苷酸是连续或非连续多核苷酸。

14.一种载体，其包含段落1至13中任一项所述的多核苷酸，其中，该载体包含与该一个或多个缺陷干扰基因可操作地连接的一个或多个启动子和/或聚腺苷酸化信号。

15.如段落14所述的载体，其中，该载体是表达载体，优选质粒。

16.一种产生一个或多个缺陷干扰基因的方法，该方法包括将段落14或15所述的载体引入宿主细胞中，并在足以表达多核苷酸的条件下孵育该宿主细胞，从而产生该一个或多个缺陷干扰基因。

17.一种减少流感病毒或冠状病毒在细胞中的复制的方法，该方法包括在适于该细胞产生包含从多核苷酸转录的一种或多种RNA的缺陷病毒的条件下，将如段落14或15所述的载体引入细胞中，从而减少病毒的复制。

18.一种组合物，其包含如段落1至4中任一项所述的多核苷酸或如段落14或15所述的载体。

19.如段落18所述的组合物，其还包含选自以下的肽：TAT-P1(YGRKKRRQRRRCWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQ ID NO：3)、TAT2-P 1(RKKRRQRRRCWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQ ID NO：4)、LAH4(KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA-NH2；SEQ ID NO：83)或其组合。

20.如段落19所述的组合物，其中，肽：多核苷酸的重量比在约2：1至4：1的范围内，优选4：1。

21.如段落19或20所述的组合物，其中，肽与多核苷酸复合形成多个纳米颗粒。

22.如段落21所述的组合物，其中，该纳米颗粒具有小于200nm，优选小于150nm，更优选约135nm的平均直径。

23.如段落18至22中任一项所述的组合物，其还包含一个或多个额外的如权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸或一个或多个额外的如权利要求14或15所述的载体。

24.如段落23所述的组合物，其中，该组合物包含载体中的三个，其中，第一载体包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列，其中第二载体包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列，并且其中第三载体包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列。

25.一种药物组合物，其包含如段落17至24中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

26.一种治疗受试者的流感病毒或冠状病毒感染的方法，该方法包括向该试者施用有效量的如段落25所述的药物组合物。

27.一种预防或治疗受试者的流感病毒或冠状病毒相关疾病的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的如段落25所述的药物组合物。

28.如段落26或27所述的方法，其中，该受试者已经暴露于流感病毒或冠状病毒、被流感病毒或冠状病毒感染，或处于感染流感病毒或冠状病毒的风险中。

29.如段落26至28中任一项所述的方法，其中，该受试者是免疫受损的。

30.如段落26至29中任一项所述的方法，其中，该流感病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒，或者其中，该冠状病毒是SARS-CoV-2。

31.如段落30所述的方法，其中，该甲型流感病毒选自H1N1、H2N2、H3N2、H3N8、H5N1和H7N9。

32.如段落30所述的方法，其中，SARS-CoV-2选自：SARS-CoV-2HKU-001a、SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变异株)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变异株)和SARS-CoV-2B.1.617.3。

33.如段落26至32中任一项所述的方法，其中，该组合物通过口服、鼻内或气管内施用。

34.如段落26至33中任一项所述的方法，其中，该受试者是人。

实施例

实施例1：对流感病毒和sARs-CoV-2病毒表现出有效活性的抗病毒DIG的产生和表征

材料和方法

细胞和病毒培养物

将马丁达比犬肾(MDCK，ATCC CCL-34)、293T(ATCC CRL-3216)、A549(ATCC CCL-185)、Vero-E6(ATCC CRL-1586)、VeroE6-TMPRSS2(VeroE6-T)、Calu-3(ATCC HTB-55)[Zhaoet al.，Nat Commun 12，1517，doi：10.1038/s41467-021-21825-w(2021)]和HK-2细胞[Yeung et al.，Cell，184，2212-2228.e2212，Doi：10.1016/j.cell.2021.02.053(2021)]在补充有10％胎牛血清(FBs)、100IU ml^-1青霉素和100μg ml^-1链霉素的Dulbecco最小基本培养基(DMEM)或DMEM-F12K中进行培养。本研究中使用的病毒株包括A/Hong Kong/415742Md/2009(H1N1)[Zhao，H.et al.，Sci Rep 6，22008，Doi：10.1038/srep22008(2016)]、A/Netherlands/219/2003(H7N7)[Zhao，H.et al.，Virology 498，1-8，10.1016/j.virol.2016.08.004(2016)]，以及SARS-CoV-2变异株[Zhao，H.et al.，Nat Commun 11，4252，Doi：10.1038/s41467-020-17986-9(2020)and Chen，L.L.et al.，Clin Infect Dis，Doi：10.1093/cid/ciab656(2021)]。流感病毒在MDCK细胞中进行培养，而SARS-CoV-2在VeroE6或VeroE6-T细胞中进行培养，并通过噬菌斑测定法测定病毒滴度。

冠状病毒DIG的构建和表达

基于鉴定了冠状病毒可能的包装基因的先前研究[Qin，L.et al.，ActaPharmacol Sin，24，489-496(2003)；Masters，P.S.Virology 537，198-207，Doi：10.1016/j.virol.2019.08.031(2019)；Seim，I.，Roden，C.A.&Gladfelter,A.S.bioRxiv，Doi：10.1016/j.bpj.2021.06.018(2021)]，合成了HKU-001a的sARS-CoV-2的5’端序列(约700和1200bp)、ORF 1b中的内部序列和3’端序列(GenBank：MT230904.1，参见表1)。将合成的基因插入PHW2000载体中，以产生表达SARS-CoV-2的缺陷基因的质粒CD2100和CD3600。通过Sanger测序验证具有CoV-DIG的构建质粒的DNA序列。在转染后24小时质粒转染入细胞后，通过RT-qPCR测量CD2100和CD3600在293T、A549和HK-2细胞中的表达。为了测定DIG RNA表达，根据制造商的说明书用DNaseI(QIAGEN，Cat#79254)处理所有RNA样品，并使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Cat#74106)进一步纯化。用DIG引物通过RT-qPCR检测RNA表达水平(参见表2)。

表1：冠状病毒DIG的序列

表2：用于RT-qPCR的引物

流感病毒DIG构建

基于对在3’端和5’端具有约300个核苷酸的DIG的先前研究，构建了在3’端和5’端具有约150个核苷酸和450个核苷酸的DIG[Zhao，H.et al.Dual-functional peptide withdefective interfering genes effectively protects miceagainst avian andseasonal influenza.Nat Commun 9，2358(2018)，参见表3]。基于在A549细胞中的抗病毒活性进一步构建了在3’端和5’端具有约225个核苷酸和600个核苷酸的DIG。野生型A/WSN/1933PA、PB1和PB2基因的全长序列用作模板以产生缺陷干扰PA、PB1和PB2基因(DI-PA、DI-PB1和DI-PB2)。用通过引物Premier 5.0设计的基因特异性引物扩增DIG 3’端和5’端的短基因片段(参见表3)。将扩增的3’端和5’端的短基因片段通过融合PCR进行融合[Heckman，K.L.&Pease，L.R.Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlapextension.Nat Protoc 2，924-932(2007)]，以针对每个基因使用两对引物产生DI-PA、DI-PB1和DI-PB2基因(参见表4)。将融合的DI-PA、DI-PB1和DI-PB2基因(表3)插入PHW2000载体的BsmBI/BsaI位点中，以分别产生DI-PA、DI-PB1和DI-PB2的质粒。通过Sanger测序验证具有DIG的构建质粒的DNA序列。

表3：流感病毒DIG的序列

表4：用于DIG构建的引物

体外DIG转染和抗病毒试验

对于体外抗病毒实验，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000试剂(Invitrogen，Cat#1857483)或GeneJuice(Sigma，Cat#70967)将DI-PA、DI-PB1、DI-PB2、CD1200、CD3600和空载体PHW2000的质粒转染到A549或HK-2细胞中。转染24小时后，将细胞转染培养基替换为含有0.005MOI A(H7N7)病毒或0.01MOI SARS-CoV-2的新鲜DMEM，用于在A549细胞(流感病毒)或HK-2细胞(SARS-CoV-2)中感染。感染后48小时采集上清液。使用前述的噬菌斑测定法来测定病毒滴度[Zhao，H.et al.，Sci Rep 6，22008，Doi：10.1038/srep22008(2016)]。通过比较用DIG质粒或空载体PHW转染的细胞的上清液中的病毒滴度，产生DIG的抗病毒活性。

毒性分析

TAT-P1和TAT2-P1由ChinaPeptide(中国上海，参见表5)合成。通过使用如前所述的基于四氮唑的比色MTT测定法检测50％细胞毒性浓度(CC50)来测定细胞毒性[Zhao，H.etal.，Sci Rep 6，22008，Doi：10.1038/srep22008(2016)]。将293T细胞以3×10⁴个细胞/孔的初始密度接种在96孔细胞培养板中的补充有10％FBS的DMEM中。培养过夜后，用补充有各种浓度的肽和1％FBS的新鲜DMEM替换细胞培养基。在37℃下孵育24小时后，向每个孔中加入MTT溶液(5mg ml^-1，10μl/孔)，在37℃下孵育4小时，然后向每个孔中加入100μl的含10％SDS的0.01M HCl溶液。在室温下进一步孵育并摇动过夜后，使用VictorTM X3 MultilabelReader(PerkinElmer，USA)在OD570下读取板。将不含肽的细胞培养孔用作实验对照，将培养基本身用作空白对照。通过测试气管内接种了TAT-P1/DNA(20μg/5μg)、TAT2-P1/DNA(20μg/5μg)和体内jetPEI/DNA(0.7μl/5μg)的小鼠的体重下降来测量纳米颗粒的体内毒性。

表5：肽序列

凝胶阻滞分析

根据之前的研究[Zhao，H.et al.Nat Commun，9，2358，Doi：10.1038/s41467-018-04792-7，(2018)]，肽和DNA以各种重量比与0.5μg质粒DNA在4μl蒸馏水中于室温下预混合15分钟。将样品加载到含有溴化乙锭核酸染料的1重量％琼脂糖凝胶中。在TBE缓冲液中于120V下进行凝胶电泳20分钟，然后在紫外(UV)照射下观察琼脂糖凝胶。

流体动力学粒度测量

根据之前的研究[Zhao，H.et al.Nat Commun，9，2358，Doi：10.1038/s41467-018-04792-7，(2018)]，以各种重量比制备了肽和DNA。在蒸馏水中分别制备肽和质粒DNA溶液。将等体积的肽和质粒DNA溶液混合在一起，得到含有0.5μg质粒DNA的4μl最终体积。将该复合物在室温下孵育15分钟后，将4μl复合物在蒸馏水中稀释至50μl，然后通过

Plate Reader动态激光粒度仪(Wyatt，USA)测量粒径。

透射电子显微镜分析

为了确定病毒或纳米颗粒的大小和形状，将以肽：DNA的重量比(4：1)预混的肽/DNA纳米颗粒施加到连续碳网格上，并除去过量的溶液。将网格转移到4％乙酸双氧铀中，并孵育1分钟。除去溶液后，将网格在室温下风干[Zhao，H.et al.，Nat Commun 12，1517，Doi：10.1038/s41467-021-21825-w(2021)]。对于每个肽/DNA纳米颗粒，通过FEI Tecnal G2-20TEM拍摄TEM图像，进行了两个独立的实验。

体外发光测定

将肽和质粒DNA以各种重量比与0.5μg质粒DNA在4μl蒸馏水中混合。在室温下孵育15分钟后，用肽/DNA复合物转染24孔板中的293T细胞，所述肽/DNA复合物包含肽和0.1μg编码PA、PB1、PB2、NP和pPoLI-fluc-RT的小基因组(pLuciferase，萤火虫荧光素酶报告子)的各pHW2000质粒[Zhao，H.et al.Virology 498，1-8，Doi：10.1016/j.virol.2016.08.004(2016)]。转染24小时后，用Victor X3 Multilabel reader(PerkinElmer，USA)通过萤光素酶测定系统(Promega，Cat^#E1910)测量发光。将发光读数归一化为1mg蛋白质。

体内生物发光分析法

在40μl蒸馏水中，用5μg质粒DNA以肽：DNA的重量比为4：1来制备具有pCMV-Cypridina Luc(pCMV-Luc，ThermoFisher，Cat#RF233236)的肽复合物。将该复合物在室温下放置15分钟后，将该复合物气管内接种到小鼠肺中，24小时后测定肺组织中的荧光素酶表达。根据制造商的方案制备jetPEI/pCMV-Luc(0.7μl/5.0μg)复合物作为阳性对照(Polyplus Transfection，Cat#201-10G)。将仅用肽或jetPEI接种的小鼠肺用作阴性对照。为了检测生物发光信号，对小鼠肺组织进行匀浆，并以15,000×g离心10分钟。上清液用于通过Cypridina荧光素酶快速测定试剂盒(ThermoFisher，Cat#16168)来分析荧光素酶蛋白表达。将小鼠肺中的荧光素酶表达水平归一化为1mg蛋白质，TAT-P1设为1000作为归一化参考值，进行分析。对于体内生物发光成像，取出小鼠肺，然后将底物加入肺中，通过

Spectrum活体光学成像系统(PerkinElmer，USA)进行成像。

RT-qPCR测定

如前所述进行实时RT-qPCR[Zhao，H.et al.，Sci Rep 6，22008，Doi：10.1038/srep22008(2016)]。通过PrimeScript II 1st Strand cDNA合成试剂盒(Takara，Cat#6210A)，使用引物Uni-12或随机引物，利用

PCRsystem 9700(AppliedBiosystems，USA)将RNA逆转录成cDNA。然后利用

480SYBR Green I Master(Roach，USA，参见表3)，使用DI-PA、DI-PB1、DI-PB2、细胞因子和趋化因子的特异性引物来扩增cDNA。对于定量分析，制备相当于每个反应10¹至10⁶个拷贝的标准质粒的10倍连续稀释液，以产生校准曲线。使用

96system(Roche，USA)进行实时qPCR实验。

体内抗病毒测定

在BALB/c小鼠和仓鼠中进行了纳米颗粒TAT-P1/DIG和TAT2-P1/DIG的抗病毒分析[Zhao，H.et al.，Nat Commun 12，1517，Doi：10.1038/s41467-021-21825-w(2021)]。BALB/c雌性小鼠(对于H1N1病毒，10至12周)取自香港大学比较医学研究中心(The Universityof Hong Kong Centre for Comparative Medicine Research)，雌性仓鼠(对于SARS-CoV-2病毒，4至6周)通过香港大学比较医学研究中心取自香港中文大学实验动物服务中心。将动物保存在生物安全水平为2/3的实验室中(饲养温度为22-25℃，黑暗/光照循环)，动物可随意获取标准颗粒饲料和水。所有实验方案均遵循已批准的生物安全等级为2的动物设施标准操作规程，并由香港大学教学和研究中的活体动物使用委员会批准[Zheng，B.J.etal.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 105，8091-8096，Doi：10.1073/pnas.0711942105(2008)]。小鼠适应的A(H1N1)pdm09病毒被用于小鼠的致死攻击。为了评价预防功效，在病毒攻击前1至10天，使小鼠气管内接种40μlTAT-P1/DIG(20.0μg/5.0μg)、TAT2-P1/DIG(20.0μg/5.0μg)或扎那米韦(40.0μg/小鼠，在PBS中)。将流感疫苗-480(480.0ng，溶于PBS中)肌内注射到小鼠体内。接着，将3LD₅₀的病毒鼻内接种至小鼠体内。监测存活情况和总体状况16天或直至死亡。对于仓鼠体内抗SARS-CoV-2(B.1.617.2，Delta)的DIG，在病毒接种(500PFU)前1天或3天将TAT2-P1/CD3600或TAT2-P1/PHW(50.0μg/12.5μg)接种至仓鼠肺中。将实验动物随机分配至每组。在感染后第2天测试仓鼠肺中的病毒载量和组织病理学变化。

结果

冠状病毒DIG抑制SARS-CoV-2在人HK-2细胞中的复制

迄今为止，证明冠状病毒的缺陷基因是否会显著干扰冠状病毒复制的研究非常有限[Vignuzzi，M.&López，C.B.Nat Microbiol 4，1075-1087，Doi：0.1038/s41564-019-0465-y(2019)]。为了鉴定针对冠状病毒的DIG，根据SARS-CoV的可能包装序列[Qin，L.etal.，Acta Pharmacol Sin 24，489-496，(2003)；Masters，P.S.Virology 537，198-207，Doi：10.1016/j.virol.2019.08.031(2019)]，构建了冠状病毒DIG(CD2100和CD3600)，其包括SARS-CoV-2的5’端序列、ORF 1b中的内部序列和’端序列(图2A)。首先在包括293T、Calu-3和HK-2的人细胞系中测试基因表达。在转染的HK-2细胞系中证实了CD2100和CD3600的高RNA水平，其与293T细胞中的RNA表达相似(图2B)。因此，选择HK-2用于CD2100和CD3600的抗病毒测定。在将DIG转染到HK-2细胞中后，将SARS-CoV-2加入到细胞中用于感染。与空载体PHW相比，CD3600和CD2100能显著抑制SARS-CoV-2复制(图2C)。CD3600显示出比CD2100显著更好的抗病毒活性。为了进一步证实CD3600在细胞中的抗病毒效果，证明了与PHW相比，CD3600能以剂量依赖性方式显著抑制SARS-CoV-2复制(图2D)。

测试了CoV-DIG在多个生长周期中发挥抗病毒活性的能力，这可能有助于DIG的抗病毒活性扩展。观察到，与非DIG载体(PHW)对照相比，在感染后24小时，在VeroE6/TMPRSS2细胞的病毒传代过程中，含有CD3600的细胞的上清液中的病毒显示出显著更少的病毒复制(图2E)。这表明，转染的CD3600甚至在VeroE6/TMPRSS2细胞的多个生长周期的病毒传代过程中也能发挥抗SARS-CoV-2复制的扩展活性。为了证实VeroE6/TMPRSS2细胞中的传代上清液中存在CD3600缺陷病毒，将相同PFU的PHW处理的病毒和CD3600处理的病毒培养，并在感染后72小时采集上清液用于超速离心，以回收病毒用于进行TEM测定。与PHW处理的细胞培养上清液(100-150nm)相比，CD3600处理的细胞培养上清液显示小球形颗粒(<40nm)增加。该结果表明，用CD3600进行处理导致了更小的缺陷病毒颗粒的包装。此外，RT-qPCR数据显示，与PHW处理的病毒相比，上清液中的CD3600 RNA拷贝数更高，但PFU滴度更低。此外，证明了CD3600对5种其它SARS-CoV-2变异株具有广泛的抗病毒活性，与DIG的广泛抗病毒机制一致，DIG涉及消耗病毒复制和病毒复制的包装组分，其竞争性抑制病毒包装而不靶向特定病毒蛋白。总之，这些结果表明，具有SARS-Cov-2的5’端序列、ORF 1b中的内部序列和3’端序列的CoV-DIG可以通过在多个生长周期中维持其自持续性DIG生产而广泛抑制SARS-CoV-2复制。

A549细胞中和小鼠中抗流感病毒的最佳缺陷-干扰基因

为了鉴定针对流感病毒的有效抗病毒DIG，设计并构建了具有聚合酶基因的3’端和5’端的150nt至600nt的不同基因长度的10个DIG(图1A)，以鉴定在体外和体内具有更有效抗病毒活性的DIG。将每种DIG转染到A549细胞中，然后在转染后24小时用A(H7N7)病毒感染细胞，而不需要向细胞培养物中加入胰蛋白酶(图1B)。含有PA基因片段的3端和5端的450nt的PAD4显示出最强的抗病毒活性，病毒载量降低3-4log，比之前研究中使用的PAD3、PB1D3和PB2D4低4至10倍[Zhao，H.et al.Nat Commun，9，2358，Doi：10.1038/s41467-018-04792-7，(2018)]。PB2D3、PB1D3、PAD2和PAD3显示出非常强的抗病毒活性，病毒复制抑制2-3log。PB2D2、PB2D4、PB1D2、PB1D4和PAD5显示出弱的抗病毒活性，有或无显著性差异(图1B)。具有3′端和5′端的约150nt的PB2D1、PB1D1和PAD1未显示抗病毒活性，这与如之前的研究证明的聚合酶基因需要5端的至少150nt用于病毒基因包装的结论一致[Duhaut，S.D.&Dimmock’N.J.J Gen Virol83，403-411，Doi：10.1099/0022-1317-83-2-403.(2002)；Duhaut，S.D.&Dimmock，N.J.Virology248，241-253，Doi：10.1006/viro.1998.9267(1998)]。这些数据表明，具有3′端和5′端的450nt的PAD4显示出最好的抗病毒活性。具有3′端和5′端的300nt的PB2D3和具有3′端和5′端的300nt的PB1D3分别显示出比太短或太长的DIG具有更好的抗病毒活性。接下来，进一步测试了单一PAD4的抗病毒活性，并与不同浓度的两种组合DIG(图1C)进行了比较。单独的PAD4以剂量依赖性方式显示出更强的抗病毒活性，病毒载量与DIG-3(PAD3、PB2D3和PB1D3的组合)或DI-PAD4(PAD4、PB2D3和PB1D3的组合)相比低>5倍。

考虑到多个DIG在体内将会具有更多的机会干扰多个同源全长基因，因此选择DI-PAD4、单个PAD4和DIG-3来评价在小鼠中的抗病毒功效。理论上，三种DIG可产生七种类型的缺陷干扰流感病毒，与单个DIG相比，这可能会增加抑制小鼠肺中野生型病毒复制的机会。为了体内转染DIG，将由TAT-P1载体包装的DIG气管内接种到小鼠肺中。在感染前48小时和24小时施用两剂DI-PAD4、单个PAD4或DIG-3可分别100％、80％和80％保护小鼠免受A(H1N1)pdm09病毒的致死攻击(图1D)，这显著优于空质粒PHW(0％)。对于在感染前24小时气管内施用1剂的方案(图1E)，接受DI-PAD4(90％)的小鼠的存活率显著高于接受单个PAD4(50％)或DIG-3(50％)的小鼠。存活数据表明，组合的DI-PAD4可在小鼠中提供比单个PAD4或DIG-3更好的保护。因此，选择DI-PAD4用于进一步的体内研究。

TAT2-P1在肺组织中显示出基因递送效率

为了显示DIG在体内更好的抗病毒活性，研究了基于TAT-肽的载体的体内递送效率。之前的研究表明，TAT2(RKKRRQRRR；SEQ ID NO：1)是一种在体外表现出比TAT(YGRKKRRQRRR；SEQ ID NO：2)更好的转导效率的较短形式的肽[Park，J.et al.J GenVirol 83，1173-1181，doi：10.1099/0022-1317-83-5-1173(2002)；Vives，E.，Brodin，P.&Lebleu，B.JBiolChem 272，16010-16017，doi：10.1074/jbc.272.25.16010(1997)]。因此，构建了TAT2-P1载体，用于评价与TAT-P1相比的体外和体内转染效率。

首先，利用凝胶阻滞分析测定这些基于肽的载体的DNA结合能力。当肽与质粒DNA的重量比大于2时，质粒DNA可被这些载体完全包装。转染效率表明，肽：DNA的重量比(4∶1)可以在细胞中显示有效的转染。接下来，为了评估这些载体在体内的DNA转染效率，将由TAT-P1、TAT2-P1或体内jetPEI包装的pCMV-Luc气管内接种到小鼠体内，并在转染后24小时测量荧光素酶表达。TAT2-P1在小鼠肺中显示出比TAT-P1显著更好的转染效率(图3A)。TAT2-P1在细胞和小鼠体内的毒性低于TAT-P1。

为了鉴定TAT2-P1在体内转染效率更高的机制，测量了肽/pCMV-Luc颗粒的粒径。由TAT-P1和TAT2-P1包装的pCMV-Luc可形成平均直径分别为148nm和134nm的颗粒(图3B)。这些纳米颗粒的TEM照片显示，由TAT2-P1形成的颗粒是均匀的球形纳米颗粒，并且小于TAT-P1纳米颗粒。这些数据表明，TAT2-P1在小鼠肺中的高转染效率可能与TAT2-P1形成的较小粒径有关，但缺乏统计学显著性。

为了证实粒径影响TAT2-P1在肺中的基因递送，通过将TAT2-P1与不同浓度的DNA混合，但使用相同量的肽/DNA和比例(4：1)制备了不同大小的TAT2-P1/pCMV-Luc。TAT2-P1/pCMV-Luc(2mg ml^-1/0.5mg ml^-1)的粒径(约190nm)比TAT2-P1/pCMV-Luc(1mg m1^-1/0.25mgml^-1)的粒径(约130nm)更大。此外，在小鼠肺中，与由TAT2-P1(1mg ml-1)包装的pCMV-Luc相比，由TAT2-P1(2mg ml-1)包装的pCMV-Luc显示出显著更低的转染效率(图3C)，但在293T细胞中，与TAT2-P1(1mg ml^-1)相比时，TAT2-P1(2mg ml^-1)的转染效率不受影响。在293T细胞中的这一结果表明，由TAT2-P1(2mg ml^-1)包装的质粒DNA在小鼠肺中的转染效率低于TAT2-P1(1mg ml^-1)并不是由于这两种条件下DNA包装效率的差异。因此，只有纳米颗粒TAT2-P1/DNA的粒径差异才能显著影响TAT2-P1在小鼠肺中的基因递送。这些数据表明，TAT2-P1/DNA能够形成小于140nm的均匀球形纳米颗粒，其可穿过气道粘液中的平均孔径(100至200nm)的屏障，从而增加肺中的DNA摄取。

DIG对流感病毒和SARS-CoV-2的预防活性

为了研究DIG在体内的预防性保护，使用单剂量的TAT2-P1/DIG-4来评估与疫苗(Influsplit Tetra)和扎那米韦相比对流感病毒感染小鼠的预防性保护[Zhao，H.etal.Nat Commun 9，2358，doi：Nat Commun(2018)]。当使用体重作为参照时，疫苗剂量(480ng)比用于人的疫苗剂量高几乎80倍[Groves，H.T.et al..Front Immunol 9，126，doi：10.3389/fimmu.2018.00126(2018)]。感染前3天施用TAT2-P1/DI-PAD4的小鼠的存活率(90％)显著优于感染前3天施用疫苗-480(20％)、扎那米韦(20％)或TAT2-P1/PHW(O％，阴性对照)的小鼠的存活率(图4A)。与TAT2-P1/PHW组相比，观察到用TAT2-P1/DI-PAD4处理的小鼠从第2天至第8天显著更少的体重降低(图4B)。在病毒感染前一天施用扎那米韦的小鼠存活率为90％。扎那米韦在感染前1天提供有效保护，而在感染前3天无显著保护，这与扎那米韦的半衰期短一致。对于在病毒攻击前5天用TAT2-P1/DIG-4处理的小鼠(图4C)，存活率(50％)显著高于用疫苗-480(10％)或TAT2-P1/PHW(0％)处理的小鼠。观察到用TAT2-P1/DIG-4处理的小鼠在第4天至第8天的体重下降比用PHW处理的小鼠更少(图4D)。当在病毒攻击前10天施用至小鼠时，疫苗-480显示出40％的小鼠存活率，这与疫苗需要超过1至2周才能诱导免疫保护一致。

为了研究冠状病毒CD3600在体内抗SARS-CoV-2的抗病毒活性，在SARS-CoV-2攻击前1天或3天将TAT-P1/CD3600接种到仓鼠肺中。由于针对SARS-CoV-2的仓鼠非致死模型以及感染后2天仓鼠肺中的病毒滴度达到峰值[Chan，J.F.et al.Clin Infect Dis，71(9)：2428-2446.doi：10.1093/cid/ciaa325(2020)；Kaptein，S.J.F.et al.Proc Natl AcadSci U SA117，26955-26965doi：10.1073/pnas.2014441117(2020)]，因此在感染后第二天通过噬菌斑测定法(图4E)和RT-qPCR(图4F)测量了仓鼠肺中的病毒载量。当在病毒攻击前一天施用至仓鼠肺中时，CD3600显著抑制了肺中的SARS-CoV-2复制。与PHW处理的肺相比，检测到用CD3600处理的仓鼠肺中炎症变化减少。总之，这些体内数据表明，当在病毒攻击前一天向仓鼠肺部施用DIG时，一剂TAT2-P1/DIG可对小鼠提供针对甲型流感病毒的快速起效(3或5天)的预防性保护，并且还可显著抑制SARS-CoV-2在仓鼠体内的复制。

TAT2-P1&LAH4在肺组织中显示出高效的基因转染

为了进一步研究基于肽的载体在肺气道中的基因递送，证明了肽LAH4(Lam，J.K.et al.Effective endogenous gene silencing mediated by pH responsivepeptides proceeds via multiple pathways.J Control Release 158，293-303(2012))在细胞中的转染效率明显高于TAT2-P1(图5A)，其中TC₅₀高于125μgm1^-1(图6)，但在肺组织中转染效率明显低于TAT2-P(图5B)。细胞中的高转染效率表明了LAH4包装的质粒³⁵的高内体逃逸能力。然而，肺组织中的转染效率低可能是由于LAH4-纳米颗粒的尺寸大(图5C)，其在TEM照片中不是球形的。pCMV由LAH4(1mg ml^-1)、TAT2-P1&LAH4(3：2)、TAT2-P1&LAH4(4：1)和TAT2-P1&LAH4(9：1)包装。将纳米颗粒负染，用于透射电子显微镜分析。对TEM照片的分析表明，TAT2-P1和LAH4可形成小的球形纳米颗粒。由于大小和形状是穿过肺组织中粘膜层的潜在障碍(Zhao，F.et al.Cellular uptake，intracellular trafficking，andcytotoxicity of nanomaterials.Small7，1322-1337(2011)；Duncan，G.A.，etal.TheMucus Barrier to Inhaled Gene Therapy.Mol Ther24，2043-2053(2016)；Wang，Z.，etal.Size and dynamics of caveolae studied using nanoparticles in livingendothelial cells.ACS Nano 3，4110-4116)，推测使用可以形成具有高内体逃逸能力的小球形纳米颗粒的TAT2-P1&LAH4可以实现转染效率的提高。在TAT2-P1：LAH4的比为4：1(图5C)的情况下，TAT2-P1&LAH4-pCMV可形成球形纳米颗粒(约140nm)。在细胞中的转染效率(4：1)显著高于TAT2-P1的转染效率(图5A)，并且TAT2-P1&LAH4纳米颗粒在室温下可稳定超过72小时(图7)。重要的是，TAT2-P1&LAH4在小鼠肺中比仅TAT2-P1或仅LAH4显示出显著更高的转染效率(图5B)。这些结果进一步证明，小的纳米颗粒尺寸(TAT2-P1&LAH4)对于穿透气道粘液以增加在肺中的基因表达是重要的。

TAT2-P1&&LAH4/CD3600抑制仓鼠中的SARS-CoV-2变异株

结果证明，在病毒攻击前一天向仓鼠施用一剂TAT2-P1&LAH4/CD3600时，其抑制了SARS-CoV-2(奥密克戎)在仓鼠肺中的复制(图4D)。结果表明，防卫素衍生肽P9R可抑制SARS-CoV-2(Zhao，H.et al.A broad-spectrum virus-and host-targeting peptideagainst respiratory viruses including influenza virus and SARS-CoV-2.NatCommun 11，4252(2020))。P1衍生自P9R(表4)。这进一步证明了，P1和TAT2-P1显著抑制SARS-CoV-2复制(图5E)。当在SARS-CoV-2攻击前1天和攻击后8小时将两剂TAT2-P1&LAH4/CD3600施用至仓鼠肺中时，TAT2-P1&LAH4/CD3600更有效地抑制了SARS-CoV-2奥密克戎在仓鼠肺中的复制(图5F)。TAT2-P1&LAH4-PHW也抑制了SARS-CoV-2的复制(图5G)，这可归因于TAT2-P1对SARS-CoV-2的抗病毒活性(图5E和5F)。TAT2-P1的双重功能(基因递送和抗病毒)使TAT2-P1&LAH4/CD3600在体内显示出更强的抗SARS-CoV-2的抗病毒活性。此外，证明了两剂TAT2-P1&LAH4/CD3600显著抑制Delta SARS-CoV-2在仓鼠肺中的复制(图5F)。对仓鼠肺进行纳米颗粒染色。用Delta变异株或奥密克戎变异株感染仓鼠，并用两剂PBS或TAT2-P1&LAH4/CD3600对仓鼠进行处理。在感染后第2天采集感染的肺用于NP染色。将未感染的仓鼠肺组织的染色用作对照。纳米颗粒染色进一步表明，CD3600可以减少奥密克戎和Delta变异株在仓鼠肺中的复制。这些结果表明，具有小球形颗粒和高效内体逃逸能力的肽TAT2-P1&LAH4纳米颗粒可有效地穿透气道粘液，以在肺气道中表达基因并递送DIG，从而显著抑制SARS-CoV-2变异株在仓鼠肺中的复制。

讨论

在该研究中，证实了缺陷干扰基因(DIG)可用于体外和体内抑制流感病毒和冠状病毒。在该研究中鉴定的CoV-DIG显著抑制SARS-CoV-2复制，并且DIG对流感病毒的抑制可用作具有高抗药性屏障的广谱抗病毒剂。预期可发现更多的针对其他病毒(包括分段和非分段RNA病毒)的DIG。随着体内基因转染载体的发展，DIG抗病毒剂可在抗病毒发展中发挥越来越大的作用。

对于呼吸道病毒疾病，疫苗接种是最有效的预防策略。在缺乏疫苗接种的情况下，早期开始抗病毒治疗对于患者的良好结果至关重要，这在COVID-19和流感病毒相关疾病中得到了明确的证明。目前，世界卫生组织(WHO)推荐用于流感病毒暴露前和暴露后的预防性药物需每日施用，持续10天，但会存在抗药性问题。目前还没有广泛可用的有效药物被推荐用于预防冠状病毒[Principi，N.et al.Front Med(Lausanne)6，109doi：10.3389/fmed.2019.00109(2019)；Anand，U.et al.Front Immunol 12，658519doi：10.3389/fimmu.2021.658519.(2021)]。因此，重要的是鉴定具有新抗病毒机制的抗病毒剂作为预防性应用，其应具有快速起效、长效活性且诱导耐药性病毒的可能性低的特征。对于流感病毒，在体内5天内，一剂DIG-4的预防效果显著优于一剂疫苗。疫苗在一周内对小鼠的预防性保护弱是由于疫苗诱导的免疫起效缓慢，通常需要约2周时间[Groves，H.T.et al.FrontImmunol9，126doi：10.3389/fimmu.2018.00126(2018)；Mohn，K.Get al.Hum VaccinImmunother 14，571-578doi：10.1080/21645515.2017.1377376.(2018)]。扎那米韦的预防效果表明，对于在病毒攻击前一天施用的预防治疗，一剂可以有效地保护小鼠免受感染。然而，在目前的实验中，一剂扎那米韦不能提供与长效DIG-4相同的保护。

SARS-CoV-2疫苗在许多国家被发现在控制COVID-19方面很有前景。由于对疫苗的犹豫和对变异株的担忧，因此还需要SARS-CoV-2抗病毒剂作为更好地控制冠状病毒疾病和降低死亡率的替代方法。该研究报道了CoV-DIG的开发，CoV-DIG是可以补充当前抗冠状病毒药物候选物的不同类别的抗病毒剂。一剂冠状病毒CD3600显示出快速起效的预防活性，同时可以显著抑制SARS-CoV-2在仓鼠体内的复制。较短的CD2100对SARS-CoV-2的抗病毒活性低于CD3600，而PAD4在体外对流感病毒显示出最强的抗病毒活性，这表明DIG的长度可决定阻断野生型病毒复制的有效性[Marriott，A.C.&Dimmock，N.J.Rev Med Virol 20，51-62doi：10.1002/rmv.641.(2010)]。DIG的抗病毒活性不依赖于对特定蛋白质或基因的特异性抑制，而是依赖于对病毒基因组包装成新病毒粒子的抑制[Meng，B.et al.Virologyjournal 14，138doi：10.1186/s12985-017-0805-6.(2017)]。当用作预防性抗病毒剂时，这种抑制不太可能产生耐药性病毒。

既往研究表明，流感缺陷干扰病毒不依赖于干扰素应答来保护流感病毒攻击的小鼠，并且可以保护老年小鼠[Scott，P.D.，etal.Virology journal 8，212(2011)；Easton，A.J.et al.Vaccine 29，2777-2784doi：10.1016/j.vaccine.2011.01.102.(2011)]。TAT2-P1/DIG在被甲型流感病毒攻击的易感小鼠或被SARS-CoV-2攻击的仓鼠中的预防性抗病毒活性的快速起效作也表明，抗病毒活性可能不依赖于宿主免疫应答。这可为DIG在老年或免疫功能低下患者中的有效保护提供额外或潜在的优势。流感DIG对不同流感病毒的广谱抗病毒活性以及CoV-DIG对SARS-CoV-2变异株的广谱抗病毒活性表明，DIG方案可能不太容易产生病毒耐药性[Zhao，F.et al.Small 7，1322-1337doi：10.1002/smll.201100001.(2011)；Dimmock，N.J.&Easton，A.J.Journal of virology 88，5217-5227doi：10.1128/JVI.03193-13(2014)]。虽然流感病毒和COVID-19疫苗在免疫抑制患者中不太有效，但是TAT2-P1/DIG纳米颗粒可以是提供快速起效的预防性保护的潜在候选物，其诱导对冠状病毒和流感病毒的耐药性的可能性较低。

应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求限定。

本发明公开了可用于、可结合使用、可用于制备所公开的方法和组合物或其产品的材料、组合物和组分。本文公开了这些和其它材料，并且应理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的每种不同的单独和集合组合以及排列的具体参考，但是本文具体考虑和描述了每种情况。例如，如果公开和讨论了DIG，并且讨论了可以对包括DIG的多种分子进行的多种修饰，则除非明确地另有说明，否则DIG的每一种组合和排列以及可能的修改都是具体考虑的。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并且公开了组合分子A至D的实例，则即使没有单独列举每一种，每一种也都是单独和共同考虑的。因此，在该实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个都被具体考虑，并且应当被认为是从A、B和C；D、E和F；以及A-D的示例性组合公开的。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。因此，例如，子组A-E、B-F和C-E被具体考虑，并且应当被认为是从A、B和C；D、E和F；以及A-D的示例性组合公开的。此外，如上预期和公开的每种材料、组合物、组分等也可具体地和独立地包括或排除在此类材料的任何组、亚组、列表、集合等之内或之外。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种附加步骤，则应当理解，这些附加步骤中的每一个都可以用所公开的方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行，并且每个这样的组合都被具体考虑并且应当被认为是公开的。

必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”也包括复数引用，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“一个DIG”的引用包括多个这样的DIG，对“该DIG”的引用是对一个或多个DIG及其本领域技术人员已知的等同物的引用，等等。

在本说明书的具体实施方式和权利要求中，“包括”一词及其变体，例如“包含”和“含有”，是指“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。

“任选”或“任选地”是指，随后描述的事件、情况或材料可能发生或可能不发生或不存在，并且该描述包括事件、情况和材料发生或存在的实例以及不发生或未出现的实例。

除非上下文明确指出，否则“能够”一词的使用表示所涉及的对象或条件的选项或能力。通常，以这种方式使用“能够”意味着肯定地声明该选项或能力，同时也不排除这种选项或能力在所指对象或条件的其他形式或实施方案中可能不存在。除非上下文另有明确指出，否则“可”一词的使用是表示所指对象或条件的选项或能力。通常，以这种方式使用“可”意味着肯定地声明该选项或能力，同时也不排除这种选项或能力在所指对象或条件的其他形式或实施方案中可能不存在。除非上下文另有明确说明，否则本文中使用的“可”并不指对象或条件的未知或可疑特征。

范围可以在本文中表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定的值。当表示这样的范围时，还特别考虑所公开的是从一个特定值和/或到另一个特定值的范围，除非上下文另有特别指出。类似地，当值通过使用先行词“约”被表示为近似值时，可以理解的是，该特定值形成了另一个特别预期的实施方案，除非上下文特别指出，否则该实施方案应该被认为是所公开的。还应当理解的是，每个范围的端点相对于另一端点都是重要的，并且独立于另一个端点，除非上下文另有明确说明。应当理解，包含在明确公开的范围内的所有单独的值和值的子范围也都是具体考虑的，并且应当被认为是公开的，除非上下文另有明确说明。最后，应当理解的是，所有范围都是指所列举的范围以及从第一端点(包括第一端点)到第二端点(包括第二端点)的单个数字的集合。在后一种情况下，应当理解，任何单个数字都可以被选择为范围所指的数量、值或特征的一种形式。通过这种方式，范围描述了从第一端点到第二端点且包括第一端点和第二端点的一组数字或值，可以选择集合中的单个成员(即单个数字)作为范围所指的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方案中的一些或全部，前述内容都适用。

除非另有说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本方法和组合物的实践或测试中可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但特别有用的方法、装置和材料都如上所述的。本文中的任何内容都不应被解释为承认承认本发明由于先前的发明而无权提前公开。不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述了其作者所声称的内容，并且本申请人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应当清楚地理解，尽管本文引用了许多出版物，但是这样的引用并不是承认这些文献中的任何一个形成本领域公知常识的一部分。

虽然材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可以包括许多选择和替代方案，但这不应被理解为，也不是承认，这些选择和替代方案是相互等价的，或特别是明显的替代方案。因此，例如，不同DIG的列表并不表示所列出的DIG彼此是明显的，也不承认具有等价或明显性。

本文所公开的每种多核苷酸旨在并且应当被认为是本文具体公开的。此外，可在本公开内容内识别的每个亚组旨在且应被视为在本文中具体公开。因此，特别考虑到任何多核苷酸，或多核苷酸的亚组可以被明确地列入或排除多核苷酸的使用中，或列入或排除在多核苷酸列表中或之外。

本领域技术人员应当认识到或能够确定，仅通过常规实验就可以确定本文所述方法和组合物的具体实施方案的许多等效物。这些等同物旨在包括在以下权利要求中。

Claims (34)

1.一种包含一个或多个缺陷干扰基因的分离的多核苷酸，其中，所述一个或多个缺陷干扰基因中的每一个包含对应于病毒基因的一个或多个部分的核苷酸序列，其中，所述病毒基因的所述部分包含相对于所述病毒基因的缺失，其中，所述病毒是流感病毒或冠状病毒。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述病毒是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其中，所述基因编码选自PA、PB1和PB2的RNA聚合酶或其亚基。

4.如权利要求1至3中任一项所述的多核苷酸，其中，所述病毒基因的所述部分包含相对于所述病毒基因的内部缺失。

5.如权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列包含从所述基因5’端起的约150至600个核苷酸、从所述基因的3’端起的约150至600个核苷酸，或其组合。

6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列包含从所述基因5’端起的约450个核苷酸和从所述基因3’端起的约450个核苷酸。

7.如权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸，其中，所述一个或多个缺陷干扰基因中的至少一个包含SEQ ID NO:5-10、13-15或17中任一个的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:5-10、13-15或17中任一个具有75％或更高序列同一性的核苷酸序列。

8.如权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸共包含SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的核苷酸序列。

9.如权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述病毒是冠状病毒，优选β-冠状病毒，更优选SARS-CoV-2。

10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中，所述基因编码选自ORF1a、ORF1b、S、M、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF8和ORF10的结构、非结构、辅助蛋白或其片段。

11.如权利要求9或10所述的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列包含从所述冠状病毒基因组5’端起的约600至1200个核苷酸、从所述冠状病毒基因组3’端起的约600至1200个核苷酸、编码ORF1b的基因的约600至1200个核苷酸，或其组合。

12.如权利要求9至11中任一项所述的多核苷酸，其中，所述一个或多个缺陷干扰基因中的至少一个包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6具有75％或更高序列同一性的核苷酸序列。

13.如权利要求1至12中任一项所述的多核苷酸，其中，所述缺失包含约400至2000个核苷酸或约3000至27000个核苷酸，任选地，其中所述核苷酸是连续或非连续多核苷酸。

14.一种载体，其包含如权利要求1至13中任一项所述的多核苷酸，其中，所述载体包含与所述一个或多个缺陷干扰基因可操作地连接的一个或多个启动子和/或聚腺苷酸化信号。

15.如权利要求14所述的载体，其中，所述载体是表达载体，优选质粒。

16.一种产生一个或多个缺陷干扰基因的方法，所述方法包括将如权利要求14或15所述的载体引入宿主细胞，并在足以表达所述多核苷酸的条件下孵育所述宿主细胞，从而产生所述一个或多个缺陷干扰基因。

17.一种减少流感病毒或冠状病毒在细胞中的复制的方法，所述方法包括在适于所述细胞产生包含从所述多核苷酸转录的一种或多种RNA的缺陷病毒的条件下，将如权利要求14或15所述的载体引入所述细胞中，从而减少所述病毒的复制。

18.一种组合物，其包含如权利要求1至13中任一项所述的多核苷酸或如权利要求14或15所述的载体。

19.如权利要求18所述的组合物，其还包含选自以下的肽：TAT-P1(YGRKKRRQRRRCWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQ ID NO:3)、TAT2-P1(RKKRRQRRRCWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQ IDNO:4)、LAH4(KKALLAHALHLLALLALHLAHALKKA-NH2；SEQ ID NO:83)或其组合。

20.如权利要求19所述的组合物，其中，所述肽:多核苷酸的重量比在约2:1至4:1的范围内，优选4:1。

21.如权利要求19或20所述的组合物，其中，所述肽与所述多核苷酸复合形成多个纳米颗粒。

22.如权利要求21所述的组合物，其中，所述纳米颗粒具有小于200nm，优选小于150nm，更优选约135nm的平均直径。

23.如权利要求18至22中任一项所述的组合物，其还包含一个或多个额外的如权利要求1至13中任一项所述的多核苷酸或一个或多个额外的如权利要求14或15所述的载体。

24.如权利要求23所述的组合物，其中，所述组合物包含所述载体中的三种，其中，第一载体包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，其中第二载体包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，并且其中第三载体包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。

25.一种药物组合物，其包含如权利要求18至24中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

26.有效量的如权利要求25所述的药物组合物在制备用于治疗受试者的流感病毒或冠状病毒感染的药物中的用途。

27.有效量的如权利要求25所述的药物组合物在制备用于预防或治疗受试者的流感病毒或冠状病毒相关疾病的药物中的用途。

28.如权利要求26或27所述的用途，其中，所述受试者已经暴露于所述流感病毒或冠状病毒、被所述流感病毒或冠状病毒感染，或处于感染所述流感病毒或冠状病毒的风险中。

29.如权利要求26至28中任一项所述的用途，其中，所述受试者是免疫受损的。

30.如权利要求26至29中任一项所述的用途，其中，所述流感病毒是甲型流感病毒或乙型流感病毒，或者其中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。

31.如权利要求30所述的用途，其中，所述甲型流感病毒选自HlNl、H2N2、H3N2、H3N8、H5N1和H7N9。

32.如权利要求30所述的用途，其中，所述SARS-CoV-2选自：SARS-CoV-2HKU-001a、SARS-CoV-2B.1.1.7(Alpha变异株)、SARS-CoV-2B.1.351(Beta变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.1(Kappa变异株)、SARS-CoV-2B.1.617.2(Delta变异株)和SARS-CoV-2B.1.617.3。

33.如权利要求26至32中任一项所述的用途，其中，所述组合物通过口服、鼻内或气管内施用来施用。

34.如权利要求26至33中任一项所述的用途，其中，所述受试者是人。

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