CN116162152A - 一种生物素化单克隆抗体的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物素化单克隆抗体的制备方法和应用，属于单克隆抗体制备技术领域。所述生物素化单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：构建表达ScFv‑生物素连接酶融合蛋白的表达载体；将该表达载体转入表达细胞或细菌中进行诱导表达；往诱导表达后的培养液中加入生物素，使ScFv‑生物素连接酶融合蛋白发生生物素化；而后进行纯化处理，得到所述生物素化单克隆抗体。本发明所制备的生物素化抗体可以极大地降低成本，且显著增加免疫检测的灵敏度和信号强度；此外，本发明所制备的抗体还可直接用于临近标记技术等现有抗体达不到的地方。因此，本发明所述抗体对免疫检测试剂盒质量的提高具有可预见的作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种生物素化单克隆抗体的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种生物素化单克隆抗体的制备方法及其应用。
背景技术
抗体分子由四条多肽链组成，即两条重链(Heavy chain,H)和两条轻链(Lightchain,L)。每一条重链和轻链都包含2个区域，即恒定区和可变区；其中，可变区能够特异性识别抗原上的表位。单链抗体(single chain variable fragment,scFv)是一种通过基因工程方法得到的融合蛋白，它主要由抗体的重链可变区(Variable heavy chain,VH)基因和轻链可变区(Variable light chain,VL)基因，通过一段肽链(linker)连接而成。单链抗体的VH和VL功能区域折叠后，仍然可以特异性紧密结合抗原表位。单链抗体具有能够结合抗原功能的最小抗体片段，其分子量远低于较常规抗体，且具有较强的亲和力和特异性，因此，相对于普通抗体，单链抗体更加容易通过基因工程技术进行改造和大量生产。
生物素(Biotin)又称维生素B7、维生素H或辅酶R，是一种水溶性B族维生素。目前，生物素是蛋白质检测中经常使用的亲和标签，因为它与亲和素(Avidin)和链霉亲和素(Streptavidin，SA)高亲和力地结合，这种结合是目前已知强度最高的非共价作用之一，解离常数Kd为10-15mol/L，比抗原与抗体间的亲和力高1万倍以上。生物素几乎可以共价附着到任何感兴趣的分子的合适基团上，将生物素共价连接到蛋白质、核酸或其它分子上的过程称为生物素化。由于生物素的分子量小，且生物素与亲和素/链霉亲和素的结合紧密，因此，生物素化被广泛应用于生物技术的各个领域。生物素化蛋白质是指生物素与蛋白质共价结合。将生物素与蛋白质共价连接后，由于生物素与亲和素等具有高亲和力、高特异性和高灵敏度，因此，生物素标记蛋白被广泛用于生物分子的测定。例如，蛋白质A被生物素化修饰后，然后加入荧光标记的亲和素，就可以让蛋白质A产生荧光，从而利用流式细胞仪或者荧光显微镜进行检测。目前，生物素-亲和素系统被广泛用于流式细胞术、荧光成像、蛋白质印迹和ELISA检测中，
生物素连接酶可以催化生物素连接到蛋白质的赖氨酸残基上，在体内或体外实现蛋白质的生物素化。其中，被广泛应用到各类实验中的生物素连接酶是BirA，其来源于大肠杆菌。BirA能够识别生物素受体标签蛋白(如AviTag融合蛋白)上，从而使融合蛋白生物素化。此外，BirA的突变体(BirA-R118G，BioID)不需要特定的生物素受体序列，被广泛用于蛋白质的生物素标记实验，其缺点是催化效率较低，通常需要15-24小时的标记时间。最近，基于BioID的定向进化开发了两种新的生物素连接酶，即TurboID和miniTurbo，它们的效率催化活性具有极大的提高，仅仅需要10分钟就可以使它们本身及其周围在10nm左右的蛋白质发生生物素化。此外，基于枯草芽孢杆菌BirA，Khavari等鉴定了一个新的生物素连接酶，命名为BASU。BASU的酶活性较BioID明显提高，它可在1min内使其附近蛋白质发生生物素化。
利用不同的生物素标志物(生物素、过氧化物酶、PE、FITC等)标记抗体，使得抗体能够应用于许多不同的领域。而抗体的生物素化是其中最常用的适应方法之一。生物素化的抗体，常用的手段是在体外将酰化的生物素连接到抗体蛋白质的ε-氨基上。随后，生物素化的抗体可应用酶标-亲和素或荧光染料-链霉亲和素复合物来进行检测。此外，也有研究者将重组抗体与AviTag进行融合表达，然后利用BirA生物素酶将AviTag进行生物素化，从而得到生物素化的抗体。
在免疫学检测中广泛应用的抗体主要可以分为多克隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体常用免疫动物的方法获得，而单克隆抗体则采用杂交瘤技术制备。单克隆抗体具有特异性强、纯度高、均一性好等优点，从而作为诊断试剂而广泛应用。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种生物素化单克隆抗体的制备方法及其应用，以降低单克隆抗体的成本，以及增加抗体信号强度和灵敏性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种生物素化单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建表达ScFv-生物素连接酶融合蛋白的表达载体；
(2)将步骤(1)构建的表达载体转入表达细胞或细菌中进行诱导表达；往诱导表达后的培养液中加入生物素，使ScFv-生物素连接酶融合蛋白发生生物素化；
(3)生物素化的ScFv-生物素连接酶融合蛋白经体外纯化处理，得到所述生物素化单克隆抗体。
步骤(1)中，所述的生物素连接酶优选为TurboID或BASU。
步骤(1)中，ScFv序列插入到生物素连接酶基因的N端或C端。
步骤(2)中，往诱导表达后的培养液中加入的生物素的浓度优选为100-500μM。
一种生物素化单克隆抗体，通过上述制备方法得到。该生物素化单克隆抗体主要包含2个功能结构域：(1)能识别特异性抗原的单链单体ScFv；(2)使单克隆抗体发生生物素化的生物素连接酶。该生物素化单克隆抗体能被抗生物素抗体、链霉亲和素和卵清亲和素等识别并产生高灵敏度和高强度的信号。
所述的生物素化单克隆抗体在抗原检测中的应用。所述的应用包括：
a)通过免疫组化和免疫荧光检测抗原的定位及表达水平；
b)通过流式细胞术检测抗原在细胞中的表达；
c)通过western blot检测蛋白在样品中的表达水平；
d)通过免疫沉淀技术分析抗原的相互作用分子(RNA、DNA和蛋白)；
e)利用临近标记技术结合质谱分析技术鉴定抗原互作蛋白。所述生物素化单克隆抗体由于含有高活性生物素连接酶，因此，在细胞内结合特定抗原后，在生物素化缓冲液(含有5mM MgCl2、20μM biotin、1mM ATP的PBS溶液)中，可以使抗原分子及其临近蛋白发生生物素化，从而可利用临近标记技术结合质谱分析技术鉴定抗原互作蛋白。
所述的生物素化单克隆抗体自身被高度生物素化，能被可结合生物素的分子(例如抗生物素抗体、链霉亲和素和卵清亲和素等)识别。因此，利用这些生物素结合分子-偶联物(包括荧光基团偶联物、发光基团偶联物等)对单克隆抗体上的生物素分子进行检测，最终达到检测目的抗原。
一种利用所述的生物素化单克隆抗体检测目的抗原的方法，包括以下步骤：a)将生物素化单克隆抗体与样品进行孵育，使得抗体与抗原结合；b)加入生物素结合分子-偶联物进行孵育，从而形成抗原-单克隆抗体-生物素结合分子-偶联物复合物；c)利用偶联物的特征，选择合适的检测试剂，从而达到对抗原进行检测。
所述的生物素化单克隆抗体在制备免疫检测试剂或免疫检测试剂盒中的应用。
一种免疫检测试剂或免疫检测试剂盒，包含所述的生物素化单克隆抗体。所述抗体对免疫检测试剂盒质量的提高具有可预见的作用，具有广阔的应用前景。
本发明将抗体基因与高活性的生物素连接酶基因融合表达，以此来获得高纯度的生物素化单克隆抗体，它由单个蛋白组成，可经过原核和真核表达系统诱导表达和纯化，极大地降低抗体生产的成本。由于融合有高活性的生物素连接酶基因，在原核或者真核培养过程中，在生物素存在条件下，可以高效产生生物素化单克隆抗体。所述生物素化单克隆抗体本身具有高水平的生物素化修饰，可利用生物素-亲和素/链霉亲和素系统放大信号进行检测。所述生物素化单克隆抗体与现有的抗体具有完全不同的结构基础，其具备常规生物素化抗体灵敏度高的优点，也具备单克隆抗体特异性强的优点，与抗体抗原系统相比，显著增加了检测的灵敏度和检测信号的强度。
本发明联合了单链抗体ScFv较强的亲和力和特异性，以及生物素系统的高灵敏度和检测信号的强度的优点，所述生物素化单克隆抗体的制备方法简单，其应用也比较广泛，可用于细胞成像、流式细胞术、蛋白质印迹、Co-IP、临近标记等实验中。
本发明相对于现有技术的优点和有益效果包括以下几点：(1)极大地节约成本(成本仅仅不到原来的5％)，更低的成本有利于提升产品的竞争力；(2)灵敏度高，生物素-亲和素/链霉亲和素系统较灵敏度是抗体-抗原系统高100倍；(3)适用广，可以用于一些现有普通抗体做不到的地方，例如，利用临近标记技术大规模筛选相互作用蛋白等。
附图说明
图1是本发明生物素化单克隆抗体制备的流程图；
图2是实施例4中SDS-PAGE检测生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体原核表达的结果图。
图3是实施例4中SDS-PAGE检测生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体纯化的结果图。
图4是实施例5中生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体的应用结果图，其中：A：WB结果显示，PD-L1-GCN4稳定过表达细胞系中PD-L1-GCN4的表达，其中GAPDH作为内参；B：利用PD-L1-GCN4生物素化单克隆抗体用于免疫荧光检测抗原；C：利用PD-L1-GCN4生物素化单克隆抗体用于流式细胞术检测抗原分子的表达。
具体实施方式
本发明提供的生物素化单克隆抗体的制备方法，具体可以包括以下步骤：
(1)构建表达高活性生物素连接酶TurboID或者BASU的表达载体；
(2)选择针对特定抗原的单链抗体(ScFv)序列；
(3)将ScFv序列插入到生物素连接酶基因的N端或者C端，构建可融合表达ScFv和生物素连接酶融合蛋白的表达载体；
(4)诱导融合基因的表达以及利用载体上的标签序列进行体外纯化，得到所述的生物素化单克隆抗体。
步骤(1)构建表达生物素连接酶的表达载体的方法为：在公司合成细菌核糖体结合位点RBS、生物素连接酶以及多克隆位点，且在C末端加入Strep tag II标签，并将这一序列插入到原核表达载体pET32a的XbaI和Xho1酶切位点间，最终获得可原核表达生物素连接酶的表达载体。
步骤(2)筛选针对目的蛋白的单链抗体(ScFv)序列，主要利用噬菌体展示技术来得到抗体基因。
获得ScFv序列后，将其插入到表达生物素连接酶的表达载体中，使得抗体基因能与生物素连接酶融合表达。随后，诱导ScFv-生物素连接酶融合蛋白的表达，并在培养结束前加入100-500μM的biotin，使得ScFv-生物素连接酶发生生物素化；接着，利用载体上的6×His标签过镍柱来纯化融合蛋白，得到生物素化的单克隆抗体。
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1、构建表达高活性生物素连接酶的表达载体
(1)在武汉擎科生物公司合成的含核糖体结合位点、多克隆位点和TurboID生物素连接酶基因的序列为SEQ ID NO.1所示；在武汉擎科生物公司合成的含核糖体结合位点、多克隆位点和BASU生物素连接酶基因的序列为SEQ ID NO.2所示。
这里以原核表达系统为例，将从公司合成的上述序列连接到pET32a的XbaI和Xho1酶切位点间，得到pET32a-TurboID、pET32a-BASU。
实施例2、获得ScFv序列
(1)如背景技术所提到的，目前通常采用用噬菌体展示技术来得到抗体基因；此外，到目前为止，已经有许多针对特定抗原的ScFv被报道。
(2)本发明的主要侧重点是发明一种制备生物素化单克隆抗体的方法，因此，这里就利用一种已知的可针对GCN4的ScFv为例来进行测试这种方法的可行性。
实施例3、构建ScFv-GCN4-生物素连接酶融合表达载体
(1)在生工生物工程(上海)股份有限公司合成一对引物F和R，序列为F：TGCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCCCGACAT；R：CCGGAATTCAGCGTAATCTGGAACATCGT。以F和R为引物，pHRdSV40-scFv-GCN4-sfGFP-VP64-GB1-NLS质粒(addgene,60904)为模板，利用KOD-Plus-neo酶(Toyobo,Code No.KOD-401)进行PCR扩增，PCR扩增条件为于94℃下变性2min，然后在94℃10s、40℃1min、72℃1min进行2个循环的反应，接着在94℃10s、60℃1min、2℃1min进行25个循环，最后于72℃下反应5min。
(2)将PCR产物进行胶回收，随后利用XbaI和EcoRI进行双酶切反应，并将酶切后的片段与XbaI和EcoRI双酶切的pET32a-TurboID或pET32a-BASU进行连接反应。随后，将连接产物转化DH5α感受态细胞，经过氨苄青霉素筛选阳性克隆，得到ScFv-GCN4-生物素连接酶融合表达载体。
实施例4、生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体的纯化
(1)将得到的ScFv-GCN4-生物素连接酶融合表达载体转入BL21感受态细胞中，在37℃下培养，待OD600值到0.8后，加入IPTG诱导，并移到16℃摇床中培养过夜；第二天上午加入Biotin溶液，达终浓度100-500μM，标记1小时后，收集细菌。
(2)用裂解液(0.02M HEPES pH 7.2，0.5M NaCl，0.001M EDTA，10％glycerol，0.2％Triton X-100，10μg/mL PMSF)重悬细菌沉淀，利用超声破碎仪促进细菌破碎，然后在16℃下12000rpm离心30分钟，收集上清；取一部分上清制备蛋白样品，用于SDS-PAGE检测诱导情况，如图2所示，加入IPTG组中存在表达非常明显的目的蛋白。
(3)由于融合蛋白中带有6×His标签，随后采用镍柱来纯化融合蛋白，接着利用500μL洗脱液(0.01M Tris-HCl，0.001M EDTA，10％ Glycerol，0.5M NaCl，0.02MImidazol)进行洗脱。最后，利用超滤管(Millipore，UFC903096)进行浓缩。纯化后的生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体制备蛋白样品进行SDS-PAGE，如图3所示，经过纯化后的蛋白得到了明显的富集。
实施例5、生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体的应用
为了验证这种利用原核表达系统制备的生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体能否用于常规免疫检测，本实施例首先利用293T细胞构建了稳定表达PD-L1-GCN4的细胞系，Western结果证实，PD-L1-GCN4具有明显的表达(图4中A)。随后，将293T和稳定表达PD-L1-GCN4的细胞利用甲醇固定后，加入前面纯化制备的生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体(1：500)室温孵育20分钟后，利用PBS洗涤3次，每次5分钟；然后加入Cy3-conjugated Streptavidin(YEASON，35108ES80，1：200)室温孵育20分钟，利用PBS洗涤3次，每次5分钟；接着加入DAPI染色细胞核，在显微镜下稳定表达PD-L1-GCN4的细胞可见在细胞膜上有明显红色信号，而对照细胞293T却没有(图4中B)。此外，将293T和稳定表达PD-L1-GCN4的细胞分别用胰酶消化后，室温收集细胞后；在细胞沉淀中加入300μL digitonin buffer(0.04％digitonin溶解于PBS中)在细胞膜上穿孔，室温孵育20分钟后，离心细胞，弃上清；用digitonin buffer重悬细胞沉淀，在digitonin buffer中按照1：100加入前面纯化制备的生物素化ScFv-GCN4单克隆抗体在室温孵育20分钟后，离心弃上清，然后加入PE anti-Biotin(biolegend，409003)在冰上孵育20分钟后，离心收集细胞，用PBS洗涤2次，然后重悬于200μL的PBS溶液中，随后进行流式分析，其结果显示稳定表达PD-L1-GCN4细胞中信号明显较对照细胞293T强(图4中C)。这说明利用本发明制备的生物素化单克隆抗体能够用于常规免疫学检测。
从以上的描述中，可以发现，上述实施例实现了如下技术效果：本发明提供了一种制备生物素化单克隆抗体的方法，该方案只需要将单链可变区片段(ScFv)基因与生物素连接酶基因融合，在真核或原核表达系统中表达纯化后，就可得到生物素化单克隆抗体。
以上所述仅仅为本发明的实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物素化单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建表达ScFv-生物素连接酶融合蛋白的表达载体；
(2)将步骤(1)构建的表达载体转入表达细胞或细菌中进行诱导表达；往诱导表达后的培养液中加入生物素，使ScFv-生物素连接酶融合蛋白发生生物素化；
(3)生物素化的ScFv-生物素连接酶融合蛋白经体外纯化处理，得到所述生物素化单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的生物素化单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的生物素连接酶为TurboID或BASU。
3.根据权利要求1所述的生物素化单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，ScFv序列插入到生物素连接酶基因的N端或C端。
4.根据权利要求1所述的生物素化单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，往诱导表达后的培养液中加入的生物素的浓度为100-500μM。
5.一种生物素化单克隆抗体，其特征在于，通过权利要求1-4任一项所述的制备方法得到。
6.权利要求5所述的生物素化单克隆抗体在抗原检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：
a)通过免疫组化和免疫荧光检测抗原的定位及表达水平；
b)通过流式细胞术检测抗原在细胞中的表达；
c)通过western blot检测蛋白在样品中的表达水平；
d)通过免疫沉淀技术分析抗原的相互作用分子；
e)利用临近标记技术结合质谱分析技术鉴定抗原互作蛋白。
8.一种利用权利要求5所述的生物素化单克隆抗体检测目的抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：a)将生物素化单克隆抗体与样品进行孵育，使得抗体与抗原结合；b)加入生物素结合分子-偶联物进行孵育，从而形成抗原-单克隆抗体-生物素结合分子-偶联物复合物；c)利用偶联物的特征，选择合适的检测试剂，从而达到对抗原进行检测。
9.权利要求5所述的生物素化单克隆抗体在制备免疫检测试剂或免疫检测试剂盒中的应用。
10.一种免疫检测试剂或免疫检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求5所述的生物素化单克隆抗体。
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