CN116159068A - 胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的新应用，胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂以其胆汁酸受体为作用靶点，短时间内可以调控近端肾小管细胞、成骨细胞和成肌细胞中CYP27B1的活性，从而促进不同组织器官中活性维生素D(1,25(OH)2D3)的产生及分泌，靶点明确，作用时间短，从而快速补充人体尤其是特殊人群所需的活性维生素D3，可应用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病，避免了现有维生素D补充剂在老年人及肝肾功能不足等特殊人群中使用的局限性。

Description

胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的新应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的新应用。
背景技术
维生素D作为一种人体必需的脂溶性维生素，在调节人体血液中钙、磷的平衡及骨骼生长代谢中发挥着重要作用。研究表明，维生素D还具有调节细胞生长分化及免疫功能的作用，此外，近年来的研究还发现心脏病、肺病、癌症、糖尿病、高血压、精神分裂症和多发性硬化等疾病形成都与维生素D缺乏密切相关。随着对维生素D生理活性的研究的不断深入，维生素D的重要性也日益突出，目前维生素D缺乏成为了一种在世界范围内普遍存在的问题，据估计全世界有十亿人处于维生素D不足或缺乏状态，加剧了成人患骨软化病、骨折、癌症及免疫系统疾病的风险。
维生素D作为一种激素前体，本身不具备生物活性，需要经过羟基化转变才能转化为具有生理活性的活性形式。其中CYP27B1基因编码的25-羟维生素D-1α-羟化酶(CYP27B1)是维生素D活性转化中的重要一环。在25-羟维生素D-1α-羟化酶的作用下，25(OH)D3可转化为具有活性的1,25(OH)2D3，从而与靶器官中的维生素D受体(VDR)结合并发挥相应的生物学效应。虽然此前肾脏被认为是产生活性维生素D的主要场所，但近期越来越多的研究发现一些肾以外的细胞，例如皮肤细胞、骨细胞、肌细胞等都具有分泌活性维生素D的能力，并通过自分泌或旁分泌的方式在各组织中发挥生理活性。此外在慢性肾病患者和无肾患者体内，由肾以外的细胞所产生的活性维生素D可分泌进入循环系统，由此对由肾功能缺失引起的维生素D缺乏进行一定的补偿。
维生素D3和钙补充剂是目前被广泛使用的一种用来维持机体钙平衡以及骨骼健康的制剂。然而，由于机体功能衰退或服用药物的拮抗作用，部分特殊人群的维生素D缺乏症的改善不能直接获益于胆钙化醇和麦角钙化醇的补充。美国医学会杂志(JAMA)于2017年发表的一项研究表明，补充维生素D3和钙的补充剂并不能显著降低老年人或骨质疏松患者骨折的风险，提示在机体功能退化或老化状态下非活性维生素D活化方面的缺陷。对于老年骨质疏松患者，其胃肠道吸收能力弱，肝肾功能减退，使得维生素D3无法通过代谢最终产生足够的25-羟基维生素D3和1,25-二羟基维生素D3。对于脂肪吸收障碍综合征患者，其不能直接吸收脂溶性维生素D。对于肾病综合征患者，其维生素D结合蛋白丢失，血1,25-二羟基维生素D3浓度偏低。对于服用抗惊厥药物的患者，常因维生素D分解代谢增强而导致血25-羟基维生素D3缺乏。
已知CYP27B1活性退化或功能不足成为机体无法获得充足的活性维生素D而导致相关疾病的因素之一，故调节CYP27B1的生理活性才能从根本上改善机体维生素D水平。越来越多的研究发现对于肾以外的细胞中CYP27B1活性的调节作用机制并不同于经典的肾脏CYP27B1调控。作为可明显提高肾脏CYP27B1活性的甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)，并未在免疫细胞及成骨细胞中显现出明显的调节CYP27B1活性的作用。因此目前对于骨细胞中CYP27B1调控的机制及策略尚未有过详细报道。
胆汁酸作为胆汁的主要成分，在调节脂质分解代谢中发挥着重要的作用。研究结果表明TGR5与FXR分别作为胆汁酸膜受体及核受体，广泛表达在哺乳动物细胞中。当这些受体信号通路被胆汁酸激活后，可参与介导具有细胞特异性的糖脂代谢、能量代谢、炎症反应及细胞增殖与凋亡等生理反应。目前多种用于治疗血脂异常及二型糖尿病的胆汁酸药物已被批准上市，作为FXR受体激动剂用于治疗非酒精性脂肪肝等代谢性疾病的药物也已进入临床试验阶段。而胆汁酸或胆汁酸受体激动剂在维生素D缺乏相关领域的应用却未见报道。
发明内容
鉴于胆汁酸或胆汁酸受体激动剂在维生素D缺乏相关领域的应用未见报道，本发明提供一种胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的新应用，解决现有维生素D补充剂在老年人及肝肾功能不足等特殊人群中使用的局限性。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病的药物、功能性食品或食品添加剂中的应用。
可选地，所述慢性疾病包括骨质疏松、肌萎缩、佝偻病、软骨病、骨折、甲状旁腺功能亢进症、慢性肾脏病中的一种或多种。
本发明的第二方面，提供了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备活性维生素D调节剂中的应用。
本发明的第三方面，提供了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备活性维生素D3合成酶活性调节剂中的应用。
可选地，所述胆汁酸选自胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸中的一种或多种，和/或，所述胆汁酸受体激动剂选自TGR5受体激动剂、FXR受体激动剂、中的一种或两种。
可选地，所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂、以及药学上可接受的载体、辅料、佐剂或前药中的一种或几种的组合。
可选地，所述活性维生素D调节剂由治疗有效量的胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂组成。
可选地，所述活性维生素D调节剂的剂型选自溶液剂、丸剂、片剂、胶囊剂、散剂、锭剂、糊剂、气溶胶、贴剂中的一种。
可选地，所述药学上可接受的载体包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物中的一种或多种，和/或，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的溶剂、赋形剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、释放剂、包衣剂、增甜剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂中的一种或多种。
可选地，所述活性维生素D调节剂的给药途径包括口服、静脉内注射、静脉内输注、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射中的一种或多种的组合。
有益效果：本发明提供了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的新应用，具体提供了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病的药物、功能性食品或食品添加剂中的应用。本发明中胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂以其胆汁酸受体为作用靶点，短时间内可以调控近端肾小管细胞、成骨细胞和成肌细胞中CYP27B1(活性维生素D3合成酶)活性，从而促进不同组织器官中活性维生素D(1,25(OH)2D3)的产生及分泌，靶点明确，作用时间短，从而快速补充人体尤其是特殊人群所需的活性维生素D3，可应用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病，避免了现有维生素D补充剂在老年人及肝肾功能不足等特殊人群中使用的局限性。
附图说明
图1a为本发明实施例1中不同浓度胆酸对近端肾小管细胞CYP27B1表达活性的影响的结果图；图1b为本发明实施例1中不同浓度石胆酸对近端肾小管细胞CYP27B1表达活性的影响的结果图。
图2为本发明实施例1中不同浓度石胆酸对促进近端肾小管细胞合成1,25-二羟基维生素D3的影响的结果图。
图3a为本发明实施例2中不同浓度脱氧胆酸对人成骨样细胞CYP27B1表达活性的影响的结果图。
图3b为本发明实施例2中不同浓度鹅脱氧胆酸对人成骨样细胞CYP27B1表达活性的影响的结果图。
图3c为本发明实施例2中不同浓度石胆酸对人成骨样细胞CYP27B1表达活性的影响的结果图。
图4为本发明实施例2中不同浓度石胆酸对促进人成骨样细胞合成1,25-二羟基维生素D3的影响的结果图。
图5a为本发明实施例3中不同浓度脱氧胆酸对小鼠胚胎肌母细胞CYP27B1表达活性的影响的结果图。
图5b为本发明实施例3中不同浓度石胆酸对小鼠胚胎肌母细胞CYP27B1表达活性的影响的结果图。
图6为本发明实施例4中胆汁酸受体对CYP27B1表达活性的作用结果图。
图7为本发明实施例4中胆汁酸受体对介导胆汁酸调控CYP27B1表达活性的作用结果图。
图8为本发明实施例5中石胆酸及胆汁酸受体激动剂对小鼠体内活性维生素D水平的影响的结果图。
图9为本发明实施例6中不同浓度石胆酸对成骨分化的影响结果图。
图10a为本发明实施例7中对细胞中肌小管进行显微镜测试的结果图。
图10b为本发明实施例7中不同浓度石胆酸对肌细胞分化的影响的结果图。
图中，横坐标涉及各成分的浓度大小的，表示为其摩尔浓度的常用对数值(logM)；*表示相对于空白组(Control组)具有统计学差异p<0.05，**表示相对于空白组具有显著统计学差异p<0.01，***表示相对于空白组具有显著统计学差异p<0.001；^表示相对于胆汁酸对照组具有统计学差异p<0.05。
具体实施方式
本发明提供一种胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的新应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明，本发明中使用的“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明中的CYP27B1如无特殊说明都指的是由CYP27B1基因编码的25-羟维生素D-1α-羟化酶也即活性维生素D3合成酶。
本发明实施例提供了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病的药物、功能性食品或食品添加剂中的应用。本实施例中胆汁酸可用于制备预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病的药物、功能性食品或食品添加剂，胆汁酸受体激动剂也可用于制备预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病的药物、功能性食品或食品添加剂，胆汁酸和胆汁酸受体激动剂可共同用于制备预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病的药物、功能性食品或食品添加剂。
本发明实施例中胆汁酸、胆汁酸受体激动剂或胆汁酸和胆汁酸受体激动剂以其胆汁酸受体为作用靶点，即可通过其胆汁酸受体直接作用，短时间内可以提高近端肾小管细胞、成骨细胞和成肌细胞中CYP27B1(活性维生素D3合成酶)活性，从而促进不同组织器官中活性维生素D(1,25(OH)2D3)的产生及分泌，靶点明确，作用时间短，从而快速补充人体尤其是特殊人群所需的活性维生素D3，可应用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病，避免了现有维生素D补充剂在老年人及肝肾功能不足等特殊人群中使用的局限性。
在一种实施方式中，所述慢性疾病包括骨质疏松、肌萎缩、佝偻病、软骨病、骨折、甲状旁腺功能亢进症、慢性肾脏病中的一种或多种，但不限于此。胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂可有效促进1,25-二羟基维生素D3的合成，且促细胞成骨及成肌分化作用明显，可应用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的上述疾病。
本发明实施例还提供了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备活性维生素D调节剂中的应用。
胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂可有效促进肾细胞、成骨细胞和成肌细胞表达CYP27B1，提高1,25-二羟基维生素D3的合成，从而快速补充人体尤其是特殊人群所需的活性维生素D3，可用于制备活性维生素D调节剂。
在一种实施方式中，所述胆汁酸选自胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸中的一种或多种，但不限于此。
在一种实施方式中，所述胆汁酸受体激动剂选自TGR5受体激动剂、FXR受体激动剂中的一种或两种，但不限于此。
在一种实施方式中，所述胆汁酸选自胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸中的一种或多种，所述胆汁酸受体激动剂选自TGR5受体激动剂、FXR受体激动剂中的一种或两种，但不限于此。
本实施方式中，所述胆汁酸可选自市售化合物单体，也可选自采用本领域技术人员知晓的常规技术手段进行制备获得，还可选自含有该活性成分的天然提取物，本实施方式不作具体限定。所述胆汁酸受体激动剂可选自市售化合物单体，也可采用本领域技术人员知晓的常规技术手段进行制备获得，还可选自含有该活性成分的天然提取物，本实施方式中不作具体限定。
本实施方式中的多种胆汁酸均为内源性胆汁酸，易于被人体吸收，可在生理浓度下调节活性维生素D的合成及分泌，避免了外源性药物对机体产生的毒副作用。此外，本实施方式所述的胆汁酸容易获得，能够与辅料按照药学人员能够理解的方法和制剂上能够接受的工艺处理成药，其制备工艺稳定，有效保证了药物的活性稳定性，而且还降低了生产成本。
具体地，作为举例，所述胆酸具有如下化学结构(I)、所述脱氧胆酸具有如下化学结构(Ⅱ)、所述鹅脱氧胆酸具有如下化学结构(Ⅲ)、所述石胆酸具有如下化学结构(Ⅳ)。
Figure BDA0003374161420000081
所述胆汁酸受体激动剂具有以下化学结构(Ⅴ)。
Figure BDA0003374161420000082
在一种实施方式中，所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂、以及药学上可接受的载体、辅料、佐剂或前药中的一种或几种的组合。
本实施方式中，治疗有效量是指足以对个体显示益处或临床意义的本发明实施例的胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的使用剂量。本领域技术人员将会理解，给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被治疗的疾病的性质和严重性、被治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等。
本实施方式中，所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸、以及药学上可接受的载体、辅料、佐剂或前药中的一种或几种的组合；或，所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸受体激动剂、以及药学上可接受的载体、辅料、佐剂或前药中的一种或几种的组合；或所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸和胆汁酸受体激动剂、以及药学上可接受的载体、辅料、佐剂或前药中的一种或几种的组合。例如，所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸、药学上可接受的载体、辅料；又如：所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸受体激动剂、药学上可接受的载体、辅料、佐剂；又如：所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸和胆汁酸受体激动剂、药学上可接受的载体、辅料、佐剂、前药。
在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物中的一种或多种，但不限于此。
在一些具体的实施方式中，所述糖可选自乳糖、葡萄糖、蔗糖中的至少一种，但不限于此；所述淀粉可选自玉米淀粉、马铃薯淀粉中的至少一种，但不限于此；所述纤维素及其衍生物可选自羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素中的至少一种，但不限于此。
所述药学上可接受的辅料是指本领域技术人员已知的适合于特定的给药模式的任何辅料，辅料应当是无毒的、不干扰或不损害本发明实施例活性成分的效力，且该辅料可以根据上述实施例所述活性维生素D调节剂的具体剂型而灵活选用。在一种实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的溶剂、赋形剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、释放剂、包衣剂、增甜剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂中的一种或多种，但不限于此。
在一种具体的实施方式中，所述赋形剂包括可可脂、栓剂蜡、植物油、醇、酯、琼脂中的一种或多种，但不限于此。
在一些实施方式中，所述植物油选自花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、大豆油中的至少一种，但不限于此；所述醇选自丙二醇，但不限于此；所述酯选自油酸乙酯、十二酸乙酯中的至少一种，但不限于此。
在一种具体的实施方式中，所述缓冲剂包括氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无致热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇和磷酸盐缓冲溶液中的一种，但不限于此。
在一种实施方式中，所述润滑剂包括十二烷基硫酸钠、硬脂酸镁中的一种或两种，但不限于此。
在一种实施方式中，所述活性维生素D调节剂由治疗有效量的胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂组成。本实施方式中活性维生素D调节剂可只含有活性成分胆汁酸、胆汁酸受体激动剂或胆汁酸和胆汁酸受体激动剂，而不含有其他辅料或载体。
在一种实施方式中，所述活性维生素D调节剂的剂型选自溶液剂、丸剂、片剂、胶囊剂、散剂、锭剂、糊剂、气溶胶、贴剂中的一种，但不限于此。
在一种实施方式中，所述活性维生素D调节剂的给药途径包括口服、静脉内注射、静脉内输注、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射中的一种或多种的组合。
本发明实施例还提供了胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备活性维生素D3合成酶活性调节剂中的应用。
胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂以其胆汁酸受体作为作用靶点，同时调控近端肾小管细胞、成骨细胞和成肌细胞中CYP27B1(活性维生素D3合成酶)活性，从而促进活性维生素D(1,25(OH)2D3)的产生及分泌，从而可作为活性维生素D3合成酶活性调节剂进行应用。
下面通过具体的实施例对本发明作进一步地说明。
需要说明的是，以下实施例及结果图中各成分的浓度均为摩尔浓度(mol/L，M)；空白组标记为control，骨化二醇标记为25OHD3，胆酸标记为CA，脱氧胆酸标记为DCA，鹅脱氧胆酸标记为CDCA，石胆酸标记为LCA，胆汁酸受体激动剂标记为OA，1,25-二羟基维生素D3标记为1,25(OH)2D3，由CYP27B1基因编码的25-羟维生素D-1α-羟化酶也即活性维生素D3合成酶标记为CYP27B1。
实施例1
本实施例研究了不同胆汁酸对近端肾小管细胞内CYP27B1表达活性的影响，CYP27B1催化25OHD3代谢，产生1,25(OH)2D3。
1、选择HKC-8人近端肾小管细胞系，随机分为多个测试组，分别为：空白组、浓度为10-7M的甲状旁腺素(PTH)组、浓度为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M的胆酸(CA)组以及浓度分别为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M的石胆酸(LCA)组，空白组不加入任何底物；将各测试组孵育HKC-8细胞4小时后，检测各组CYP27B1酶蛋白表达水平，以β-Actin作为内参蛋白。
如图1a和1b所示，胆酸(CA)在浓度10-6M时可显著提高HKC-8细胞中CYP27B1酶的蛋白表达水平，相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)。而石胆酸(LCA)在浓度(10-10-10-5M)均可不同程度地提高HKC-8细胞中CYP27B1酶的蛋白表达水平，相对于空白组具有显著统计学差异(p<0.01)。说明胆酸(CA)及石胆酸(LCA)能够在生理浓度(<10-5M)下即可促进近端肾小管细胞CYP27B1的表达。
2、选择HKC-8人近端肾小管细胞系，随机分为多个测试组，分别为：空白组、骨化二醇(25OHD3)单独用药组、PTH和骨化二醇(25OHD3)联合用药组以及石胆酸(LCA)和骨化二醇(25OHD3)联合用药组；其中，空白组不加入任何底物；测试组中，骨化二醇(25OHD3)的终浓度为10-6M，PTH的终浓度为10-7M，石胆酸(LCA)的终浓度为10-12、10-10、10-8、10-6M。然后，将各测试组孵育HKC-8细胞4小时，测定细胞培养液中1,25(OH)2D3浓度。
如图2所示，25OHD3可作为CYP27B1催化生成1,25(OH)2D3的底物。与25OHD3(10-6M)单独作用相比，石胆酸(LCA)(10-10、10-8M)可显著增加CYP27B1酶活性，促进合成1,25(OH)2D3。相对于25OHD3(10-6M)单独作用组具有统计学差异(p<0.05)。显示其对近端肾小管细胞中CYP27B1酶活性的诱导作用，具有改善活性维生素D水平不足的潜力。
实施例2
本实施例研究了不同胆汁酸对人成骨样细胞内CYP27B1表达活性的影响，CYP27B1催化25OHD3代谢，产生1,25(OH)2D3。
1、选择MG-63人成骨样细胞系，随机分为多个测试组，分别为：空白组、浓度为10-7M的甲状旁腺素(PTH)组、浓度为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M的脱氧胆酸(DCA)组、浓度为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M的鹅脱氧胆酸(CDCA)组、以及浓度分别为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M的石胆酸(LCA)组，空白组不加入任何底物；将各测试组孵育MG-63人成骨样细胞4小时后，检测各组CYP27B1酶蛋白表达水平，以β-Actin作为内参蛋白。
如图3a-3c所示，不同种类的胆汁酸可不同程度地提高人成骨样细胞中CYP27B1的表达水平。浓度为10-12-10-6M的脱氧胆酸(DCA)相对于空白组具有显著统计学差异(p<0.01)；浓度为10-12-10-6M的鹅脱氧胆酸(CDCA)相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)；浓度为10-12-10-5M的石胆酸(LCA)相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)。
2、选择MG-63人成骨样细胞系，随机分为多个测试组，分别为：空白组、骨化二醇(25OHD3)单独用药组、甲状旁腺素(PTH)和骨化二醇(25OHD3)联合用药组以及石胆酸(LCA)和骨化二醇(25OHD3)联合用药组；其中，空白组不加入任何底物；测试组中，骨化二醇(25OHD3)的终浓度为10-6M，PTH的终浓度为10-7M，LCA的终浓度为10-12、10-10、10-8、10-6M。然后，将各测试组孵育MG-63人成骨样细胞细胞4小时，测定细胞培养液中1,25(OH)2D3浓度。
如图4所示，25OHD3可作为CYP27B1催化生成1,25(OH)2D3的底物。与25OHD3(10-6M)单独作用相比，石胆酸(LCA)(10-6M)可显著增加CYP27B1酶活性，促进合成1,25(OH)2D3，相对于25OHD3(10-6M)单独作用组具有显著统计学差异(p<0.01)。显示其对人成骨样细胞中CYP27B1酶活性的诱导作用，从而具有促进成骨分化的潜力。
实施例3
本实施例研究了不同胆汁酸对肌细胞内CYP27B1启动子活性的影响。
1、选择C2C12小鼠胚胎肌母细胞系，运用插入CYP27B1转录启动子序列的pGL-3-basic vector转染细胞，然后随机分为多个测试组，分别为：空白组、浓度为10-7M的甲状旁腺素(PTH)组、浓度为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M的脱氧胆酸(DCA)组、以及浓度分别为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M的石胆酸(LCA)组，空白组不加入任何底物；将各测试组孵育小鼠胚胎肌母细胞24小时后，检测各组CYP27B1转录启动子活性水平。
如图5a-5b所示，脱氧胆酸(DCA)及石胆酸(LCA)均可不同程度地提高小鼠胚胎肌母细胞中CYP27B1转录启动子的活性水平。浓度为10-10-10-7M的脱氧胆酸(DCA)相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)；浓度为10-10-10-7M的石胆酸(LCA)相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)；其中，浓度为10-8M的脱氧胆酸(DCA)及浓度为10-10-10-8M的石胆酸(LCA)相对于空白组具有显著统计学差异(p<0.01)。表明胆汁酸可通过调控CYP27B1转录从而影响CYP27B1的表达及活性维生素D产生，具有促进成骨分化过程的潜力。
实施例4
本实施例研究了胆汁酸受体对胆汁酸调控CYP27B1表达的影响。
1、选择MG-63人成骨样细胞系，运用插入TGR5基因编码序列的质粒转染细胞使其过量表达胆汁酸受体TGR5，随机分为多个测试组，分别为：空白组、2μg TGR5质粒转染组、4μg TGR5质粒转染组，空白组细胞进行空质粒转染；将各测试组MG-63人成骨样细胞进行质粒转染48小时后，检测各组细胞TGR5及CYP27B1蛋白表达水平。
如图6所显示，随着TGR5质粒的转入，人成骨样细胞中TGR5表达水平进一步提高，CYP27B1的表达水平也相应增加。2μg TGR5质粒转染组相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)；4μg TGR5质粒转染组相对于空白组具有显著统计学差异(p<0.01)。表明胆汁酸受体具有参与调控CYP27B1表达的潜力。
2、选择MG-63人成骨样细胞系，运用插入CYP27B1转录启动子序列的pGL-3-basicvector转染细胞。然后随机分为多个测试组：空白组、胆汁酸受体抑制剂(Triamterene)预处理组、石胆酸(LCA)单独用药组以及胆汁酸受体抑制剂(Triamterene)与石胆酸(LCA)用药组。其中，空白组不加入任何底物；测试组中，胆汁酸受体抑制剂(Triamterene)的终浓度为10-7M，石胆酸(LCA)的终浓度为10-6M。然后，将各测试组孵育人成骨样细胞24小时，检测各组CYP27B1转录启动子活性水平。
如图7所示，10-6M石胆酸(LCA)可显著提高人成骨样细胞中CYP27B1转录启动子的活性水平，且相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)。当使用胆汁酸受体抑制剂(Triamterene)处理细胞时，可显著抵消石胆酸(LCA)对细胞CYP27B1转录启动子活性的作用。胆汁酸受体抑制剂(Triamterene)与石胆酸(LCA)用药组相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)。表明胆汁酸调控CYP27B1转录启动子活性的作用是通过其受体TGR5来实现的。
实施例5
本实施例研究了石胆酸及胆汁酸受体激动剂对小鼠血清活性维生素D水平的影响。
1、选择成年雄性小鼠(4-6月龄)，随机分为多个给药组：空白组、给药剂量为25mg/kg的石胆酸(LCA)组、给药剂量为25mg/kg的胆汁酸受体激动剂(OA)组。空白组灌胃蒸馏水，并喂食正常饮食；将各组小鼠进行连续灌胃给药三天，并于最后一次给药后5小时进行采血，检测血清中活性1,25(OH)2D3水平。
如图8所示，石胆酸(LCA)及胆汁酸受体激动剂(OA)均可不同程度地提高小鼠血清中活性1,25(OH)2D3水平。其中，石胆酸(LCA)给药组相对于空白组具有显著统计学差异(p<0.01)；胆汁酸受体激动剂(OA)给药组相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)。证实了胆汁酸在体内调控活性维生素D产生及分泌的作用。同时表明胆汁酸可通过结合其受体从而调控CYP27B1表达及活性维生素D的产生。
实施例6
本实施例研究了石胆酸对成骨细胞分化的影响。
1、选择MG-63人成骨样细胞系，随机分为多个测试组，分别为：空白组、浓度为10-7M的甲状旁腺素(PTH)组、浓度为10-12、10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5M的石胆酸(LCA)组，空白组不加入任何底物；将各测试组孵育MG-63细胞24小时后，检测各组碱性磷酸酶(ALP)的基因表达水平。
如图9所示，浓度为10-8-10-5M的石胆酸(LCA)可不同程度地提高人成骨样细胞中碱性磷酸酶ALP表达水平。其中10-7M的石胆酸(LCA)相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)；10-8、10-6、10-5M的石胆酸(LCA)相对于空白组具有显著统计学差异(p<0.01)。说明石胆酸(LCA)可显著提高成骨细胞的碱性磷酸酶的表达，促进成骨细胞分化。
实施例7
本实施例研究了石胆酸对肌细胞分化的影响。
1、选择C2C12小鼠胚胎肌母细胞系，随机分为多个测试组：空白组、浓度为10-8M的活性维生素D(1,25(OH)2D3)组、浓度为10-11、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6M的石胆酸(LCA)组，空白组不加入任何底物；将各测试组孵育人小鼠胚胎肌母细胞5天后，通过显微镜观察测定细胞中肌小管形成的数量。
如图10a-10b所示，浓度为10-10-10-6M的石胆酸(LCA)可不同程度地促进肌细胞肌小管的形成。其中10-6M的石胆酸(LCA)相对于空白组具有统计学差异(p<0.05)；10-10-10-7M的石胆酸(LCA)相对于空白组具有显著统计学差异(p<0.01)。说明石胆酸(LCA)具有调控活性维生素D产生从而促进细胞成肌分化的作用。
以上实施例表明：
胆酸及石胆酸可在4小时内显著提高近端肾小管细胞CYP27B1的蛋白表达水平，且相较于空白组具有统计学差异(p<0.05)。而石胆酸在较低浓度下(10-12、10-10M)亦可显著提高近端肾小管细胞中CYP27B1的蛋白表达水平。石胆酸可显著提高近端肾小管产生活性1,25(OH)2D3的能力，且提高非活性骨化二醇的转化利用，其可作为活性维生素D调节剂，可快速补充人体尤其是特殊人群所需的维生素D3。
脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸以及石胆酸可在4小时内显著提高成骨细胞CYP27B1的蛋白表达水平。浓度为10-6M的石胆酸可显著提高成骨细胞产生活性1,25(OH)2D3的水平，与空白组相比具有显著统计学差异(p<0.01)。说明其对于成骨细胞中CYP27B1酶活性具有诱导作用，同时可提高非活性骨化二醇的转化利用，从而调节活性维生素D3的水平。浓度为10-6M的石胆酸可显著提高成骨细胞碱性磷酸酶基因表达。充分说明其在促进人成骨分化方面的有效性，可改善由于活性维生素D不足引起的成骨缺陷。
浓度为10-10-10-7M的脱氧胆酸以及浓度为10-10-10-7M的石胆酸可显著提高小鼠胚胎肌母细胞CYP27B1的转录启动子活性水平，与空白组相比具有统计学差异(p<0.01)。浓度为10-10-10-7M的石胆酸可促进小鼠胚胎肌母细胞分化形成肌小管，其作用相对比于空白组具有显著的统计学差异(p<0.001)。充分说明其在促进肌生成方面的有效性，可改善由于活性维生素D不足引起的肌萎缩。
对胆汁酸受体进行过表达可显著提高成骨细胞中CYP27B1蛋白表达水平，表明胆汁酸受体可影响成骨细胞中CYP27B1的表达情况。使用胆汁酸受体抑制剂可显著阻断胆汁酸对成骨细胞中CYP27B1的转录启动子活性的诱导作用。表明胆汁酸受体在介导胆汁酸调控骨细胞中CYP27B1转录启动子活性中的重要作用。从而进一步提示了相关胆汁酸受体激动剂对于调控CYP27B1表达的影响。
以石胆酸为代表的胆汁酸及胆汁酸受体激动剂对成年雄性小鼠进行灌胃。可于连续给药后三天明显提高小鼠血中活性1,25(OH)2D3的水平，且相比于空白组具有显著统计学差异(p<0.01)或统计学差异(p<0.05)。表明胆汁酸及胆汁酸受体激动剂作为活性维生素D调节剂，口服生物利用率高，起效快，可有效提高体内活性维生素D水平，从而改善特殊人群因活性维生素D缺乏所引起的相关疾病。
因此，胆汁酸及胆汁酸受体激动剂可用于制备用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病的药物、功能性食品或食品添加剂，可用于制备活性维生素D调节剂，可用于制备活性维生素D3合成酶活性调节剂。通过调节不同组织器官中CYP27B1的表达及活性，从而促进活性1,25(OH)2D3的产生及分泌，可有效改善特殊人群体内活性维生素D水平。对治疗活性维生素D不足引起的疾病有良好的药效，特别是对骨骼肌肉代谢相关疾病，包括骨质疏松、佝偻病、软骨病、骨折、甲状旁腺功能亢进症和慢性肾脏病等有良好的药效。
综上所述，本发明提供了一种胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂的新应用。本发明中胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂以其胆汁酸受体为作用靶点，短时间内可以调控近端肾小管细胞、成骨细胞和成肌细胞中CYP27B1(活性维生素D3合成酶)活性，从而促进不同组织器官中活性维生素D(1,25(OH)2D3)的产生及分泌，靶点明确，作用时间短，从而快速补充人体尤其是特殊人群所需的活性维生素D3，可应用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病，避免了现有维生素D补充剂在老年人及肝肾功能不足等特殊人群中使用的局限性。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备用于预防或治疗因维生素D缺乏引起的慢性疾病的药物、功能性食品或食品添加剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述慢性疾病包括骨质疏松、肌萎缩、佝偻病、软骨病、骨折、甲状旁腺功能亢进症、慢性肾脏病中的一种或多种。
3.胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备活性维生素D调节剂中的应用。
4.胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂在制备活性维生素D3合成酶活性调节剂中的应用。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的应用，其特征在于，所述胆汁酸选自胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸中的一种或多种，和/或，所述胆汁酸受体激动剂选自TGR5受体激动剂、FXR受体激动剂中的一种或两种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述活性维生素D调节剂包括治疗有效量的胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂、以及药学上可接受的载体、辅料、佐剂或前药中的一种或几种的组合。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述活性维生素D调节剂由治疗有效量的胆汁酸和/或胆汁酸受体激动剂组成。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述活性维生素D调节剂的剂型选自溶液剂、丸剂、片剂、胶囊剂、散剂、锭剂、糊剂、气溶胶、贴剂中的一种。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物中的一种或多种，和/或，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的溶剂、赋形剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、释放剂、包衣剂、增甜剂、调味剂、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂中的一种或多种。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述活性维生素D调节剂的给药途径包括口服、静脉内注射、静脉内输注、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射中的一种或多种的组合。
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