CN116157679A - 用于惰性液相色谱系统和柱的系统适用性测试的化合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种用于评估系统惰性的试剂盒。所述试剂盒包括包含金属相互作用部分的阳性对照和不含金属相互作用部分的阴性对照。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括容纳系统适应性溶液(例如，阳性对照和阴性对照的等摩尔混合物)的容器。

Description

用于惰性液相色谱系统和柱的系统适用性测试的化合物
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式以电子方式提交，并且据此全文以引用的方式并入本文。在2021年9月8日创建的所述ASCII副本命名为W-4289-US02_SL.txt并且大小为907字节。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月16日提交并且名称为“用于评估惰性液相色谱系统和柱的系统适用性测试的化合物(Compounds for Use in System Suitability Testing ofInert LC Systems and Columns)”的美国临时专利申请第63/079,151号的优先权和权益。本申请也要求于2020年9月16日提交并且标题为“系统惰性的评估(Evaluation of SystemInertness)”的美国临时专利申请第63/079,160号的优先权和权益。这两个申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及用于惰性LC系统和柱的系统适用性测试的化合物。更具体地，该技术涉及用于在液相色谱、色谱柱和耦接的检测器中检测暴露的金属的探针化合物。
背景技术
液相色谱(LC)是一种分析分离技术，其能够基于混合物的化合物与固定相之间的差异相互作用(定义为主要相互作用)来分离化学物质的混合物，该主要相互作用是混合物、设计的固定相与来自具体选择的流动相/环境条件的调节之间的预期相互作用。这些相互作用取决于许多受控变量，例如流动相组成、温度和流速。因为给定分离的分析品质因数取决于大量变量，这些变量直接影响主要化学相互作用的范围和程度，所以小心地通过仔细制备流动相、适当恒温控制设备和使用可重复制造的色谱柱，在一致的设定点操作。
发明内容
探针化合物与色谱系统和柱中暴露的金属相互作用的程度可用于设计和执行产生有用信息的适用性实验。评估惰性LC系统和柱的适用性的一种技术使用探针化合物作为阳性对照和阴性对照。可选择可适合作为一对以起到阳性对照和阴性对照作用的化合物。阳性对照和阴性对照的一个示例是腺苷-5'-三磷酸(ATP)和腺苷。还可使用腺苷和ATP以及其他核苷酸的化学改性的类似物以便适应替代的检测模式，诸如荧光检测。一组ATP类似物和相关的非相互作用阴性对照分别为2'(3')-O-(4-苯甲酰基苯甲酰基)腺苷5'-三磷酸(Bz-ATP)和二苯甲酮。同样，不可水解的核苷酸类似物是感兴趣的，因为众所周知天然的焦磷酸酯键易于水解。其他化学部分可用于系统适用性标准。
确认仪器性能是任何分析测量的关键方面。当分析易于金属吸附的化合物时，需要确认的不仅仅是机械仪器的性能。验证所选LC的惰性也是重要的。本公开提出了评估色谱系统的惰性的新方法。
关于标准品稳定性的考虑导致被称为AMPcP的核苷酸类似物的使用，与ATP和ADP不同，所述AMPcP不含有焦磷酸酯键，从而使得其是水解稳定的。使用AMPcP的流动注射分析，相对于基于金属合金的仪器，可从惰性LC系统观察到更高且更一致的回收率。
还证实能够将AMPcP与作为阴性对照的咖啡因配对，其中AMPcP的使用成功地鉴定了金属的存在，同时咖啡因有助于验证总体机械性能。
在一个方面，本公开包括用于评估系统惰性的试剂盒。该试剂盒包括阳性对照和阴性对照，该阳性对照包含具有不可水解的α-β键的核苷酸二磷酸或其化学改性的类似物，其中该阳性对照含有金属相互作用部分，该阴性对照不含金属相互作用部分。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于形成阴性对照和阳性对照的混合物的溶液(例如，系统适应性溶液)的容器。在一些实施方案中，具有不可水解的α-β键的核苷酸二磷酸是腺苷5’-(α,β-亚甲基)二磷酸(AMPcP)。在一些实施方案中，阴性对照和阳性对照的混合物的溶液是等摩尔混合物。在一些实施方案中，阴性对照和阳性对照有相同的发色团，有相同的最大UV吸收波长，以及在该波长下表现出相同的消光系数。在一些实施方案中，阴性对照由腺苷组成或基本上由腺苷组成(例如，腺苷在水或水/极性溶剂混合物中的稀释溶液)。在一些实施方案中，阴性对照由咖啡因组成或基本上由咖啡因组成(例如，咖啡因在水或水/极性溶剂混合物中的稀释溶液)。
在另一个方面，本公开包括用于评估系统惰性的试剂盒。该试剂盒包括具有阳性对照和阴性对照的溶液，该阳性对照包含腺苷-5'-三磷酸(ATP)或其化学改性的类似物，该阴性对照不含金属相互作用部分；以及容纳溶液的容器。在一些实施方案中，阴性对照和阳性对照有相同的发色团，有相同的最大UV吸收波长，以及在该波长下表现出相同的消光系数。在一些实施方案中，阴性对照和阳性对照的溶液是等摩尔混合物。在一些实施方案中，腺苷-5'-三磷酸(ATP)的化学改性的类似物为2'(3')-O-(4-苯甲酰基苯甲酰基)腺苷5'-三磷酸(Bz-ATP)化合物。在一些实施方案中，阴性对照由腺苷组成或基本上由腺苷组成。在一些实施方案中，阴性对照由咖啡因组成或基本上由咖啡因组成。
在另一个方面，本公开包括用于评估系统惰性的试剂盒。该试剂盒包括：阳性对照，该阳性对照包含金属相互作用部分；阴性对照，该阴性对照不含金属相互作用部分；以及容纳系统适应性溶液的容器。在一些实施方案中，阴性对照和阳性对照有相同的发色团，有相同的最大UV吸收波长，以及在该波长下表现出基本上相同的消光系数。在一些实施方案中，阴性对照和阳性对照是化合物，并且其中阴性对照和阳性对照之间的差异是一系列三个磷酸酯基团。在一些实施方案中，阳性对照为腺苷-5'-三磷酸(ATP)或其化学类似物，并且阴性对照为腺苷或咖啡因。在一些实施方案中，阳性对照为腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸(AMPcP)或其化学类似物，并且阴性对照为腺苷或咖啡因。在一些实施方案中，阳性对照为具有不可水解的α-β键的核苷酸二磷酸。在一些实施方案中，阴性对照由腺苷组成或基本上由腺苷组成。在一些实施方案中，阴性对照由咖啡因组成或基本上由咖啡因组成。在一些实施方案中，阴性对照和阳性对照具有不同的光谱特性。在一些实施方案中，阴性对照和阳性对照的溶液是等摩尔混合物。在一些实施方案中，阳性对照为具有以下结构的亚乙烯基腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸：
Figure BDA0004128523440000041
在一个方面，本公开包括用于评估系统惰性的试剂盒。该试剂盒包括具有阳性对照的溶液的容器，该阳性对照包含金属相互作用部分，其中该阳性对照为具有以下结构的亚乙烯基腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸：
Figure BDA0004128523440000042
本发明的该方面的实施方案还可包括以下特征中的一者或多者。该试剂盒还可包括注射器，该注射器用于将阳性对照注射到液体分析系统的至少一部分中(例如，注射到柱被移除的LC系统的流体处理系统中；注射到LC柱中，注射到柱在适当位置的LC系统中等)。试剂盒的一些实施方案还包括阴性对照的容器，该阴性对照不含金属相互作用部分(例如，腺苷、咖啡因等)。
本公开的上述方面和特征可组合并提供优于现有技术的多种优点。在一些实施方案中，在惰性LC系统和柱的系统适用性测试中使用本公开的化合物有许多有益效果。例如，本公开使用探针化合物以检测液相色谱、色谱柱和耦接的检测器中暴露的金属。这些化合物(例如，适用性样品)可有助于分析者在将不提供有意义的结果的分离上花费资源(例如，时间和金钱)之前(并且不需要花费该资源)来确定系统对于特定应用的适用性。即，通过在期望的分离或应用之前确定系统的惰性的适用性，分析者将知道不会在注定失败的分离/应用上浪费资源。该信息可以防止时间和费用的资源浪费，因为系统对于特定应用的适用性的知识将消除或大大减少注定要给出不良质量结果的实验。
附图说明
通过以下结合附图所作的详细描述，将更充分地理解本技术，在附图中：
图1是根据本公开的例示性实施方案的包括色谱柱和各种其他部件的色谱系统的示意图。
图2是根据本公开的例示性实施方案的显示应用于检测色谱流动路径中的金属的AMPcP的敏感性和重复性的代表性示例。
图3是根据本公开的例示性实施方案的证实在不依赖于色谱法的情况下，对探针化合物的金属敏感性的评估测试的代表性示例。
图4是示出根据本公开的例示性实施方案的评估系统适用性的方法的流程图。
图5是根据本公开的例示性实施方案的证实利用金属敏感化合物和惰性类似物对惰性表面的色谱测试的代表性示例。
图6显示用杂化表面技术(HST)部分配置(相对于完全配置)的UHPLC重复注射AMPcP和咖啡因如何通过增加的峰面积相对标准偏差以及绝对回收率的降低容易地鉴定暴露的金属表面。
图7A是显示在配备有PEEK(无金属)的色谱系统上的咖啡因峰和AMPcP峰的色谱图。
图7B显示用于比较图7A中提供的AMPcP和咖啡因峰形的峰比较工具。
图8A是显示在配备有乙烯桥连杂化物涂覆的色谱表面(惰性材料覆盖金属表面)的色谱系统上的咖啡因峰和AMPcP峰的色谱图。
图8B显示用于比较图8A中提供的AMPcP和咖啡因峰形的峰比较工具。
图9A是显示在配备有故意降解的亚乙基桥杂化物涂覆的色谱表面的色谱系统上的咖啡因峰和AMPcP峰的色谱图(由于预期的涂层降解导致的金属暴露)。
图9B显示用于比较图9A中提供的AMPcP和咖啡因峰形的峰比较工具。
具体实施方式
一般来讲，本公开涉及用于评估惰性表面的适当运行的惰性LC系统表征方法，特别是当分析已知表现出高度金属相互作用的化合物时。可选择可适合作为一对以起到阳性对照和阴性对照作用的化合物。探针化合物与色谱系统和柱中暴露的金属相互作用的程度可用于设计和执行产生有用信息的适用性实验。
系统适用性测试的一种方法涉及制备混合物，该混合物含有感兴趣的分析物或表现出相同的化学特性的替代试剂分子。如果方法在各种全球药典中公布，则标准品可以是可商购获得的，否则科学家将不得不手动鉴定和制备适用于测试的标准品。在样品分析之前注入已知的测试混合物以确认系统适用性。对照预期或历史结果参考这些测量结果可确认适当的系统性能，并且可将其用于监测随时间推移的方法性能。
用于分析吸附到金属表面的化合物的系统准备度的评估可能相对复杂。在一些情况下，使用不含金属敏感化合物的适用性标准品对检测暴露的金属表面几乎没有帮助。解决这些问题的一个选择是使用金属敏感探针化合物来检查仪器的流动路径连同任何检测器的流动路径。在本文中，提出了将水解稳定的核苷酸类似物AMPcP用于系统准备度测量。该分子证实在结合金属方面与腺苷三磷酸一样有效，但在储存和长期使用期间不易降解。一种技术涉及利用这种金属吸附性化合物的方法，该金属吸附性化合物连同非吸附性咖啡因标准品一起简单地用于实施流动注射测试。这些方法示出在检测金属和快速研究LC设备的惰性方面是有效的。
经由阳性对照和阴性对照评估惰性LC系统的适用性的一种技术使用腺苷-5'-三磷酸(ATP)和腺苷。还可使用腺苷和ATP以及其他核苷酸的化学改性的类似物以便适应另选的检测模式，诸如荧光检测。一组ATP类似物和相关的非相互作用阴性对照为2'(3')-O-(4-苯甲酰基苯甲酰基)腺苷5'-三磷酸(Bz-ATP)和二苯甲酮。
可用于实现与Bz-ATP类似目的的另一组分子包括但不限于，亚乙烯基腺苷，6-氨基己基腺苷和氨基嘌呤以及核苷酸，用MANT(甲基-邻氨基苯甲酰基)、TNP(三硝基苯基)、萤光素、芘、7-炔丙基氨基-7-去氮杂、DY-647P1标记的核苷酸或核碱基，以及荧光核碱基和核苷酸。
不可水解的核苷酸类似物也是感兴趣的，因为天然的焦磷酸酯键可能易于水解。具有不可水解键的一些示例性核苷酸包括ATPαS、ApCpp、AppCp、AppNHp、和ATPγS。其他等同物包括但不限于基于鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷和胸腺嘧啶的那些。具有不可水解的α-β键的核苷酸二磷酸由于其改善的稳定性特性可用于某些应用。
考虑用于系统适用性标准品的一些其他化学部分包括基于或类似于下列的探针：2-羟基吡啶-1-氧化物、四环素、果糖-1,6-二磷酸、pyranine、去铁酮、地拉罗司(deferasirox)、含双膦酸盐的分子、替鲁膦酸、利塞膦酸、二苯基乙二肟、α-苯偶姻肟或水杨醛肟。也可使用基于三羧酸部分的分子。
可利用化合物完成测试以测试系统的健康，包括作为维护步骤。可以排定用于测试LC系统的特定时间，例如，在设定的时间量、设定的使用次数之后，或在使用特定化合物之后。在给定时间可能仅需要测试LC系统的一部分。例如，仅评估系统的一部分可用于对系统进行故障诊断。
所测试的内容也可以变化。同时测量多个性能特性的评估测试是期望的。这是通过使用化合物混合物采用各种色谱方法实现的。例如，单个实验可使用若干化合物并组合色谱方法以同时评估梯度递送和暴露的金属表面。
LC分离的品质因数取决于许多难以控制的变量，其中“次级相互作用”是降低性能的常见来源。一个示例是在固定相二氧化硅颗粒中发现的控制不良的金属含量。颗粒中金属的不受控制的存在导致可变的次级相互作用，其可降低分析分离的质量和再现性。次级相互作用的附加来源包括色谱柱中的各种金属部件和LC流动路径部件(例如柱管、熔块、注射器针和管材)。为了减弱涉及系统表面(例如，LC流动路径部件的表面)的不期望的相互作用，分析者已经严重依赖于钝化或调节硬件表面，并且甚至通过使用离子对试剂、化学衍生、和螯合剂作为流动相添加剂等等来改变分析方法。
提出的解决次级相互作用的有害作用的另一种方法涉及使用LC部件，其防止分析物与金属表面接触。这些技术包括PEEK或其他非金属部件、PEEK衬里的钢部件和金属部件，它们已经在表面上进行了化学改性或涂覆。经涂覆表面的示例是使用基于气相沉积的有机硅和羧基硅烷组合物的表面技术的经涂覆表面。Lauber等人公布的专利申请(US20190086371A)更详细地描述了这种新兴技术。基于此类技术的LC系统通常被描述为惰性LC。US 20190086371全文以引用方式并入本文。
另一种方法是用液体溶剂(诸如硝酸)钝化该系统。溶剂方法提供临时钝化，即，向系统提供临时惰性(或惰性涂层)。
存在可以单独或组合采用的许多方法以解决次级相互作用的存在及其对给定色谱分离质量的影响。需要能够帮助评价涂覆/钝化方法是否为处理的样品提供惰性系统的化合物。因此，需要可单独使用或与其他化合物组合使用的化合物来评估惰性LC系统和柱的系统适用性测试。首先将关于图1讨论系统/装置和使系统/装置惰性化的涂层。
图1是可用于分离样品中的分析物诸如肽化合物的色谱系统/装置100的代表性示意图。系统100包括若干部件，该若干部件包括：流体管理器系统105(例如，控制流动通过系统的流动相)；管材110(其也可被微加工流体导管替换或与微加工流体导管配套使用)；流体连接器115；熔块120；色谱柱125；样品注射器135，该样品注射器包括用于将样品插入或注入流动相中的针(未示出)；用于在注射之前盛装样品的小瓶、或样品容器130；以及检测器150，诸如质谱仪。色谱柱125可以是反相柱。色谱系统/装置100的部件的内表面形成具有润湿表面的流体流动路径。流体流动路径的部件可具有至少20、至少25、至少30、至少35或至少40的长度与直径比率。流体流动路径可包括电喷针的润湿表面(未示出)。
润湿表面的至少一部分可以具有涂层，诸如烷基甲硅烷基涂层。涂层可调整润湿表面的疏水性。涂层可通过气相沉积来施加。因此，本公开的方法和装置可包括流动系统的耐高压材料(例如，不锈钢)以及流体流动路径的润湿表面，该表面提供适当的疏水性，因此对样品的有害相互作用或不期望的化学效应可被最小化。
在一些示例中，流动路径的涂层相对于分析物诸如金属敏感化合物(例如，肽)是非结合性的。因此，分析物诸如肽化合物不与流动路径的涂层结合。
涂层可在整个系统中由从流体管理器系统105一直延伸到检测器150的管材或流体导管110提供。涂层也可被施加到流体路径的部件的部分上。即，可选择涂覆一个或多个部件或部件的部分而不是整个流体路径。例如，可对柱125的内部部分及其熔块120和流体连接器115进行涂覆，而流动路径的其余部分可保持不被修改。此外，可以对可移除/可替换的部件进行涂覆。例如，可对容纳样品的小瓶130以及熔块120进行涂覆。
在一些示例中，系统100将需要在评估开始之前被清洁/清除以便在开始测试之前建立基线以确定适用性。确保系统100处于基线可以帮助证明没有污染物。其还可用于在系统100的制造完成之后验证系统100的制备过程。例如，在制造系统100之后，可使用图4的方法400。
流体系统的流动路径可至少部分地由管材的内表面限定。流体系统的流动路径还可至少部分地由微加工流体导管的内表面描述。并且流体系统的流动路径可至少部分地由柱的内表面或至少部分地由通过熔块的通道描述。流体系统的流动路径还至少部分地由样品注射针的内表面或从样品注射针的内表面延伸遍及柱的内表面描述。此外，流动路径可被描述为从设置在整个流体系统中的样品注射针的内表面上游并与其流体连通的样品容器(例如，小瓶)延伸到连接器/检测器的端口。
在一些实施方案中，仅色谱柱的润湿表面和位于色谱柱上游的部件涂覆有例如烷基甲硅烷基涂层，而位于柱下游的润湿表面未被涂覆。可经由气相沉积将涂层施加到润湿表面上。类似地，实验室器具或其他流体处理装置的“润湿表面”可受益于烷基甲硅烷基涂层。这些装置的“润湿表面”不仅包括流体流动路径，而且还包括位于流体流动路径内的元件。例如，固相萃取装置内的熔块和/或膜与流体样品接触。因此，不仅固相萃取装置内的内壁，而且任何熔块/膜都包括在“润湿表面”的范围内。术语“润湿表面”是指装置(例如，色谱柱、色谱注射系统、色谱流体处理系统、实验室器皿、固相提取装置、移液管顶端、离心管、烧杯、透析室等)内与流体(尤其是含有所关注分析物的流体)接触的所有表面。
在以沿着润湿表面或在润湿表面上的惰性涂层为特征的实施方案中，润湿表面的至少一部分涂覆有烷基甲硅烷基涂层。烷基甲硅烷基涂层对于样品中的分析物中的至少一种是惰性的。
在一些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是有机二氧化硅涂层。在某些实施方案中，烷基甲硅烷基涂层是形成润湿表面或涂覆润湿表面的杂化无机/有机材料。
涂层(例如烷基甲硅烷基涂层)可具有至少约15°的与水的接触角。在一些实施方案中，该涂层可具有小于或等于30°的接触角。接触角可小于或等于约115°。在一些实施方案中，涂层的接触角介于约15°至约90°之间，在一些实施方案中介于约15°至约105°之间，并且在一些实施方案中介于约15°至约115°之间。例如，涂层的接触角可为约0°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、95°、100°、105°、110°或115°。
涂层(例如，烷基甲硅烷基涂层)的厚度可为至少约
Figure BDA0004128523440000101
例如，厚度可介于约
Figure BDA0004128523440000102
至约
Figure BDA0004128523440000103
之间。涂层的厚度可为约
Figure BDA0004128523440000104
Figure BDA0004128523440000105
Figure BDA0004128523440000106
或
Figure BDA0004128523440000107
涂层(例如，气相沉积的烷基甲硅烷基涂层)的厚度可通过肉眼进行光学检测。例如，较高的不透明度和着色指示较厚的涂层。当在全光谱光(诸如太阳光)下观察到涂覆的部件时，从薄到厚，颜色从黄色，变成紫色，变成蓝色，变成略微绿色，然后变回黄色。例如，当烷基甲硅烷基涂层的厚度为
Figure BDA0004128523440000108
时，涂层可呈现黄色并反射峰值波长在560nm和590nm之间的光。当烷基甲硅烷基涂层的厚度为
Figure BDA0004128523440000109
时，涂层可呈现紫色并反射峰值波长在400nm和450nm之间的光。当烷基甲硅烷基涂层的厚度为
Figure BDA00041285234400001010
时，涂层可呈现蓝色并反射峰值波长在450nm和490nm之间的光。参见例如Faucheu等人的PVDF涂层的光泽度损失与地形特征的关系(Relating Gloss Loss toTopographical Features of aPVDF Coating)，2004年10月6日公布；Bohlin、Erik的颜料涂层的表面和多孔结构(Surface and Porous Structure of Pigment Coatings)、与柔性版油墨的相互作用及其对印刷质量的影响(Interactions with flexographic ink andeffects of print quality)，Dissertation，Karlstad University Studies，2013:49。
涂层可以是气相沉积的双(三氯甲硅烷基)乙烷、双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷、双(三氯甲硅烷基)辛烷、双(三甲氧基甲硅烷基)辛烷、双(三甲氧基甲硅烷基)己烷或双(三氯甲硅烷基)己烷的产物。涂层可包括由气相沉积的试剂赋予的硅氧烷部分。
在一些方面，润湿表面的至少一部分涂覆有多层相同或不同的烷基甲硅烷基，其中烷基甲硅烷基涂层的厚度与所进行的分层步骤的数量(例如，在润湿表面上的烷基甲硅烷基涂层的沉积层的数量)相关。
色谱装置可具有多个烷基甲硅烷基涂层。例如，第二烷基甲硅烷基涂层可与第一烷基甲硅烷基涂层直接接触。
在一个方面，涂层是正癸基三氯硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷(GPTMS)、水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷(GPTMS)、2-(3,4-环氧基环己基)乙基三甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷、甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷、丙基三氯硅烷、丙基三甲氧基硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三(二甲基氨基)硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三氯硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三甲氧基硅烷、乙烯基三氯硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、烯丙基三氯硅烷、2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三氯硅烷、2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三甲氧基硅烷或2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三(二甲基氨基)硅烷。
流动路径部件可由不锈钢制成，其包括但不限于管材、微加工流体导管、柱熔块、柱入口管材和样品注射针，经由气相沉积用所公开的烷基甲硅烷基中的一种或多种涂覆。在一个方面，将这些涂覆的部件退火以改变它们的化学或物理性质。
由除不锈钢或其他金属以外的其他材料制成的流动路径部件(例如，聚合物、玻璃等)经由气相沉积用所公开的涂层中的一种或多种涂覆。特别地，可连接到注射针的样品小瓶可以被涂覆。
实验室器皿的润湿表面或实验室器皿的润湿表面的至少一些部分可经由气相沉积用一种或多种所公开的烷基甲硅烷基涂层涂覆。在一些示例中，气相沉积的涂层可使样品的吸附损失最小化。气相沉积的涂层可以是中性的(低离子性质)和亲水性的(表现出与水的接触角小于60°)。该涂层可用于减轻许多不同类型材料的问题，包括玻璃和聚合物组合物，例如聚丙烯或聚乙烯。
另选地，可商购获得的气相沉积涂层可用于所公开的系统、装置和方法中，包括但不限于
Figure BDA0004128523440000111
和
Figure BDA0004128523440000112
(两者可从宾夕法尼亚州贝尔丰特的SilcoTek公司(SilcoTekCorporation,Bellefonte,PA)商购获得)。该制造方法描述于2015年4月7日提交的名称为“热化学气相沉积涂覆的制品和过程(Thermal Chemical Vapor Deposition CoatedArticle and Process)”的美国申请序列号14/680,669中，该申请要求2014年4月8日提交的美国临时申请号61/976,789的优先权和权益。各专利申请的内容全文以引用方式并入本文。
在一个方面，烷基甲硅烷基涂层增强金属的腐蚀性能，例如在金属色谱柱中。根据密度和厚度，涂层充当屏障，从而防止水和腐蚀性分子与基体金属反应。提高疏水性和密度改善了腐蚀性能。
在一些实施方案中，用硅烷化试剂改性烷基甲硅烷基涂层以获得期望的表面性质。硅烷化试剂可以是非挥发性两性离子。非挥发性两性离子可以是磺基甜菜碱或羧基甜菜碱。在一些实施方案中，硅烷化试剂为酸性或碱性硅烷。硅烷化试剂可以引入聚环氧乙烷部分。
LC系统的其它部件也可包括本文所述的涂层，例如管材、熔块和/或连接器。LC系统可用于分离金属敏感性分析物，例如生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物和两性离子(如氨基酸和神经递质)，该LC系统包括多个涂覆的部件以最小化或消除沿着流体流动路径内的润湿表面的金属的存在。
涂层提供一种如何使系统(诸如LC系统和柱)适合使用的方法。涂覆的另一个可能的替代方案可以是使用液体溶剂(诸如例如硝酸)来钝化该系统。还可通过使用非金属表面(包括聚醚醚酮或类金刚石碳)使系统惰性化。涂层也可以是通过电荷气相沉积或原子层沉积而沉积的表面或组合物。在使系统惰性化之后，然后需要测试系统以确定该系统是否合适。根据本技术的化合物用于测试该系统是否合适。本文描述了使用该化合物确定系统适用性的技术，诸如惰性LC系统和柱。
用于评估与光学或MS检测器耦接的惰性LC系统的适用性的一种技术涉及腺苷-5'-三磷酸(ATP)和腺苷的等摩尔溶液的色谱分离和检测。这两种化合物有相同的发色团并因此有相同的最大UV吸收波长259nm，以及在所述波长下显示相同的消光系数，在pH 7.0下E＝15400。这两种化合物之间的差异是一系列三个磷酸酯基团，已知它们与金属相互作用。因为ATP含有金属相互作用部分而腺苷不含金属相互作用部分，所以腺苷充当结构类似的阴性对照化合物。此外，阳性对照和阴性对照化合物(诸如ATP和腺苷)的疏水性的显著差异(Log P-5.5对-1.05)确保了它们在反相色谱分离中的解析。logP值相差大于一的两种化合物是期望的。腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸(AMPcP)是腺苷的另一配对(分别为Log P-4.8对-1.05)。
还可使用腺苷和ATP以及其他核苷酸的化学改性的类似物以便适应替代的检测模式，诸如荧光检测。一组ATP类似物和相关的非相互作用阴性对照为2'(3')-O-(4-苯甲酰基苯甲酰基)腺苷5'-三磷酸(Bz-ATP)和二苯甲酮。作为苯甲酰基苯甲酰基O-连接到ATP化合物上的结果，可以预期反相保留程度增加有利地促进系统适用性的基于分离的方法。另外，预期Bz-ATP由于苯甲酰基苯甲酰基官能团而产生增加的UV吸收。同样的情况是Bz-ATP能够在LC-MS的阳性模式和阴性模式下容易地测量，然而ATP仅在阴性模式下被容易地观察到。
除了上述有益效果之外，当任选地采用荧光检测时，等摩尔混合物中的Bz-ATP和二苯甲酮的色谱分析使得能够对惰性流动路径/柱进行评估。针对评估LC惰性的这种荧光类似物方法的附加有益效果是能够在显著降低的摩尔负载下操作，其中次级相互作用更容易被发现，这具有与LC-MS信号强度变化相关的挑战。
可用于实现与Bz-ATP相同目的的另一组分子包括但不限于，亚乙烯基腺苷，6-氨基己基腺苷和氨基嘌呤以及核苷酸，用MANT(甲基-邻氨基苯甲酰基)、TNP(三硝基苯基)、萤光素、芘、7-炔丙基氨基-7-去氮杂、和DY-647P1标记的核苷酸或核碱基，以及荧光核碱基和核苷酸(诸如自然化学(Nature Chemistry)，第9卷，第1043-1055页(2017)中描述的荧光核碱基和核苷酸)。
不可水解的核苷酸类似物也是感兴趣的，因为天然的焦磷酸酯键易于水解。因此，基于核苷酸的标准品对于制造、稳定储存以及在不降解的情况下进行全球运输是具有挑战性的。具有不可水解键的一些示例性核苷酸包括ATPαS、ApCpp、AppCp、AppNHp和ATPγS。其他等同物包括但不限于基于鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷和胸腺嘧啶的那些。具有不可水解的α-β键的核苷酸二磷酸由于其改善的稳定性特性对于某些应用可能是有利的，诸如结构1中描述的示例，腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸(AMPcP)。这些也可用附加的取代基标记或由替代的核碱基样结构构建以更好地促进检测，无论是UV、MS还是荧光检测。
Figure BDA0004128523440000141
结构2是用亚乙烯基-AMPcP示出的此类变体的一个示例，其中经由闭环添加耦接到分子的核碱基部分上的亚乙烯基取代基赋予增加的疏水性，使得能够进行阳性模式MS检测以及荧光检测并且为UV分光光度测量提供更灵敏的UV处理。测试探针的适合功能的化学改性的附加有益效果是能够调节分子螯合金属的能力。这些相互作用的强度的调节使得能够开发和应用测试探针(阴性对照和阳性对照)。测试探针足够强地相互作用以检测色谱仪器和柱中的次级相互作用，但不是太强从而观察不到信号(例如，测试探针的完全吸附)。这在系统适用性的设计中赋予了附加的灵活性程度，这是有帮助的，因为通常与液相色谱一起使用的检测器在检测动态范围方面跨越许多数量级。
Figure BDA0004128523440000142
考虑用于系统适用性标准品的一些其他化学部分包括基于或类似于下列的探针：2-羟基吡啶-1-氧化物、四环素、果糖-1,6-二磷酸、pyranine、去铁酮、地拉罗司(deferasirox)、含双膦酸盐的分子、替鲁膦酸、利塞膦酸、二苯基乙二肟、α-苯偶姻肟或水杨醛肟。也可使用基于三羧酸部分的分子。
生物分子支架也可用于制备系统适用性测试的标准品。合成多肽是一种此类支架。肽可以化学合成以含有一个或多个磷酸化残基，诸如磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸酪氨酸。在一些示例中，O-磷酸化残基比N-磷酸化残基(如磷酸化组氨酸)更稳定且更耐水解。任选地，可合成肽以含有一个或多个荧光氨基酸残基，其包括但不限于色氨酸。在一个示例中，使用金属敏感性探针，其基于H2N-GEGWG(pT)G(pT)GK-OH(SEQ ID NO:1)的序列，并且可将色谱行为与H2N-GEGWGTGTGK-OH(SEQ ID NO:2)的色谱行为进行比较。基于化学合成的寡核苷酸的标准品也可示出实用性。在这些生物分子支架上，可添加附加的取代基以有利地改变色谱效应和可检测性。
本公开包括使用系统适用性标准品(例如腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸(AMPcP)或腺苷三磷酸(ATP))测试LC系统的金属相互作用的方法。这些标准品与金属(即，金属相互作用部分)相互作用，该金属将吸附到暴露的金属部件上。结果，由注入量测量标准品的减少量指示存在暴露的金属和系统不适用的可能性。
已经证实AMPcP的核苷酸类似物具有与腺苷三磷酸(ATP)一样多的吸附到钛熔块上的倾向，仍然耐水解并且对于长期储存和重复使用是稳定的(适用于系统适用性测试所提出的任何试剂)。
AMPcP可用于流动注射测试(无柱直排)以监测损失和峰形扰动，所述损失和峰形扰动可潜在地存在于用一种或多种基于金属的部件制造的任何色谱仪中。在该方法中，在没有柱的情况下进行AMPcP的顺序注射，并且监测各种峰属性并最终与流动路径中的金属量相关。通过使用配备有传统MP35N金属合金部件的超高性能液相色谱(UHPLC)与配备有乙烯桥接的杂化有机-无机表面的等效UHPLC比较AMPcP的峰面积、峰形和注射重复性来验证该方法区分惰性色谱表面与金属的能力。
本公开示出了AMPcP如何能够用于鉴定LC仪器自身的流动路径内的不同程度的暴露金属。当将金属敏感化合物(诸如AMPcP)注射到基于金属的流动路径上时，常见的是在多次注射期间观察到较差再现性，特别是峰面积和峰高的变化，以及总体降低的分析物信号。具有暴露的金属表面的系统还可在重复注射期间示出增加的峰面积，这是分析物吸附到暴露的金属并因此钝化该暴露的金属的结果。这种吸附过程可在后续注射中导致更大的回收率，但是这并不总是可预测的现象并且钝化状态是可逆的。不希望受理论的束缚，据信在施加AMPcP的流动注射之后检测到的峰面积和峰面积变化是对存在金属表面的诊断。峰面积和峰面积变化可单独使用或与分析物回收率或绝对分析物响应组合使用以评估系统适用性。变化的程度可取决于若干因素，诸如被分析的特定化合物、系统历史和流动相。为了确保去除任何先前注射的样品，可采用使用多次注射0.3％氨溶液的冲洗步骤。冲洗可以是用于从流动路径中的任何金属中去除组分和过去的分析物样品的有效方法。
在一些示例中，因为金属相互作用可受到pH的显著影响，所以本公开的测试程序使用中性pH且不使用缓冲剂。使用中性pH且不使用缓冲剂可用于确保大幅度的效果，因为在中性pH下，AMPcP将具有负电荷，然而流动路径的金属表面将具有正电荷。
另外，AMPcP对暴露的金属表面的敏感性在增加的有机组成下可能更显著，这可能是影响流动相的介电常数的结果。本公开的系统设置可包括使用零死体积钛接头代替柱，并且流动条件为0.5mL/min的80:20乙腈:水。
图2显示了在具有乙烯桥接的杂化表面的LC上与在具有生物相容性MP35N流动路径(即，具有暴露的金属表面的流动路径)的色谱上重复注射AMPcP。即，图2是显示应用于检测色谱流动路径中的金属的AMPcP的敏感性和重复性的代表性示例。图2是在配备有乙烯桥接的杂化色谱表面的LC上(上图，202)与配备有金属MP35N部件的等同物LC配置上(下图，204)重复注射1mL的AMPcP 6次的重叠图，如使用流速为0.5mL/min的80:20乙腈：水所采集的。
对于图2，当将AMPcP注射到金属MP35N流动路径上时，存在显著较低的平均峰面积(48％)和平均峰高(47％)。另外，基于金属的生物相容性系统的峰面积RSD为6.4％，然而配备有乙烯桥接的杂化(HST)表面技术的LC的峰面积RSD为0.4％。这种改善的峰面积再现性和总体增加的分析物回收率源于金属相互作用的消除。
图3是根据本公开的例示性实施方案的证实在不依赖于色谱法的情况下，探针化合物的金属敏感性的评估测试的代表性示例。探针化合物(例如，化学合成的化合物)与色谱系统和柱中暴露的金属相互作用的程度可用于设计和执行产生对分析者有用的信息的适用性实验。过度相互作用的化合物可产生零可检测信号，然而最小相互作用的化合物可能无法检测系统和/或柱中暴露的金属。为此，如实施例3中所述，开发了利用具有惰性流动通道(单一组分除外，例如柱)与暴露金属的色谱系统的注射测试。这种评估使得能够表征一组化合物吸附到金属部件(例如主动预热器或直排放置的金属熔块)的程度并进行比较。图3显示不同阳性对照(ATP对AMPcP)相互作用和对金属部件的吸附的比较结果。
如图3所示，测量并比较了探针化合物AMPcP和ATP的面积回收率(％)。该方法使得能够评估探针化合物在测试条件下相对于彼此结合到暴露金属的趋势。此外，该测试可通过在流动路径中使用具有或多或少暴露金属的部件来调节。
图3证实通过用直排钛(Ti)熔块的注射测试测量探针化合物(在此为AMPcP和ATP)的面积回收率(％)的能力。在图3中，测试条件包括10ng进样量和10mM乙酸铵溶剂。流速设定为0.2mL/min，并且Ti熔块是未涂覆的4.6mm Ti熔块。两种探针化合物AMPcP和ATP在水中的浓度为0.01mg/mL。可在等摩尔负载下比较测试探针化合物的回收率以评估它们在测试条件下相对于彼此结合暴露的金属的趋势。
除了用于设计和合成探针化合物以检测液相色谱、色谱柱和耦接的检测器中暴露的金属的所述方法之外，还描述了制造方法和考虑。因为各种所述的金属敏感化合物和金属表面之间的次级相互作用对色谱性能的影响大小是分子负载依赖性的，因此旨在测量暴露金属程度的方法学方法控制测试探针的分子负载。先前描述的一些探针化合物是纯化的或来源于组合物，所述组合物不完全由探针化合物组成。具体地，期望的化合物通常与抗衡离子和/或水结晶。抗衡离子和/或水的量随来源或纯化材料的批次而变化。
另外，吸湿性试剂从大气中吸收水含量，从而从初始测量改变水含量(例如，试剂固体材料中水的质量％)。在不考虑这种变化的情况下制备测试样品(例如，仅包括阳性对照或包括阳性对照和阴性对照两者的适用性样品)将导致金属敏感化合物的可变测试浓度并且使系统适用性测试结果和分析复杂化。
这些挑战可通过制备标准品来解决，其中在原液中制备化学组分，这说明在批量材料中存在抗衡离子和/或水，将其以受控体积等分并冻干到单独的小瓶中。另外，出于化学稳定性和在标准小瓶中制备可见的固体颗粒的目的，可添加稳定化合物，诸如海藻糖。重要的是，稳定化合物不干扰预期的系统适用性测试，从而意指该化合物应当表现出很少至没有UV、荧光或MS信号以及最小至没有MS抑制。以这种方式制造系统适用性标准品提高了测试样品浓度的一致性，从而提高了采用这些标准品的系统适用性技术的可靠性和稳健性。
用于评估系统惰性的试剂盒可与这些原液结合使用。例如，该试剂盒可包括容纳溶液的容器，其中该溶液包括阳性对照，其包含金属相互作用部分；和阴性对照，其不含金属相互作用部分。
图4是示出根据本公开的例示性实施方案的评估系统适用性的方法400的流程图。该方法具有某些任选的步骤，如围绕特定步骤的虚线轮廓所指出的。方法400可以从隔离系统402的部件开始。可能期望在给定时间仅测试LC系统的一部分。在给定时间可能仅需要测试LC系统的一部分。当替换LC系统的部件(例如，样品注射器)时，可以评估该部件。仅评估系统的一部分(例如，仅评估系统的部件)可用于对系统进行故障诊断。
如所指出的那样，隔离系统402的部件是任选的。在一些示例中，将需要评估整个系统/装置的适用性。适用性样品可以流动404经过系统，例如系统/装置100。适用性样品可含有一种化合物或若干种化合物。在样品流经该系统之后，可以使用色谱检测器来评估适用性样品并且因此评估流动路径的部件是否是惰性的。
在使适用性样品流动404期间或之后，方法400包括评估系统406。存在可以单独或组合采用的许多方法以解决次级相互作用的存在及其对给定色谱分离质量的影响。惰性系统表征方法对于评价惰性表面的适当运行是必需的。
在一些实施方案中，系统适用性分析与注射与表面相互作用的敏感探针(阳性对照)和非相互作用探针(阴性对照)同时进行。因此可比较峰面积比率以确认系统适用性。如果阳性对照与阴性对照的比率足够高，则认为该系统具有良好的系统健康并且适于进行分析。
图5是根据本公开的例示性实施方案的证实利用金属敏感化合物和惰性类似物对惰性表面的色谱测试的代表性色谱示例。具体地，图5显示了证实通过反相色谱容易地拆分ATP(阳性对照探针)和腺苷(阴性对照探针)的能力的代表性色谱示例。峰面积比率、峰面积再现性、峰形和峰形再现性的比较允许表征液相色谱和色谱柱的表面惰性和在应用中使用的适用性。该比较将使用已知结合金属的一种或多种化合物来测量表面惰性和适用性。如实施例1(下文所述)中所证实并在图5中显示的，ATP和腺苷之间的相对面积可用于评估系统中金属相互作用的程度，同时考虑非次级相互作用变化(例如注射体积)。此外，ATP化合物的峰形的评估可用于表征系统适用性。
在一些示例中，表征系统的方法包括向系统引入具有阳性对照和阴性对照的样品(例如，适用性样品)。阳性对照是与系统相互作用的敏感探针，而阴性对照基本上不与系统相互作用。在一些示例中，基本上不与系统相互作用的化合物可定义为不含金属相互作用部分的化合物或不含一个或多个强电负性部分(诸如pKa低于5的酸性残基)的分子。该方法还可包括检测阳性对照和阴性对照，并通过将检测到的阳性对照与阴性对照的量进行比较来确定系统适用性。
通过将检测到的阳性对照与阴性对照的量进行比较来确定系统适用性可以包括确定检测到的阳性对照与阴性对照的比率。如果阳性对照与阴性对照的比率足够高，则认为该系统具有良好的系统健康并且适于进行分析。在一些示例中，足够高是大于0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或小于1.1，其中1.0的比率指示分析物与系统流动路径相互作用没有损失。被认为足够高的比率可以基于所选择的阴性对照和阳性对照而变化。例如，与暴露的金属强烈相互作用的阳性对照(例如ATP或AMPcP)可以具有0.75或0.8的比率范围的下限。
在一些示例中，分析者可以调整系统以便以1.0的比率为目标，并且分析者可以基于分析者/系统的需要确定比率的可接受值的较低范围。通过将检测到的阳性对照与阴性对照的量进行比较来确定系统适用性包括确定系统对阳性对照的惰性和/或指示沿着系统的流动路径沉积的惰性涂层的完整性。
确定系统适用性可包括测试系统的一个部件，例如样品注射器。样品可能不利地影响其它部件。在给定时间可能仅需要测试LC系统的一部分。例如，仅评估系统的一部分可用于对系统进行故障诊断。
检测阳性对照和阴性对照可以使用液相色谱-光学、液相色谱-质谱、液相色谱-光学-质谱的检测器配置，其中光学表示紫外/可见(UV/Vis)吸光度或荧光检测器。适用性样品的流动也可以被分流。
可使用多于一种色谱方法来评估该系统。评估该系统的多于一种色谱方法可同时完成。例如，采用多于一种色谱方法包括引入具有多种化合物的样品(即适用性样品)。多种化合物包括阴性对照、阳性对照和经拆分的中性物质的混合物。例如，除了作为表面探针的阳性对照和阴性对照之外，该化合物还可包括对羟基苯甲酸酯或苯酮梯。对羟基苯甲酸酯梯的示例可包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯中的至少一种。苯酮梯的示例可包括苯乙酮、苯丙酮、对羟基苯甲酸丁酯、二苯甲酮或苯戊酮中的至少一种或多种。疏水性的有意变化有助于确保通过反相色谱法成功拆分。此外，良好表征的中性化合物，例如2-乙酰呋喃、咖啡因或乙酰苯胺还可以类似方式使用。选择至少部分地基于疏水性的差异，所述疏水性的差异可导致化合物组，所述化合物组将良好地拆分并能够对各性能方面进行评估，包括梯度递送、流速准确性以及柱效率和健康。该方法可包括在单次注射中评估梯度递送和暴露的金属表面。
表征系统可以是系统的先前确定的维护步骤。例如，可以在先前确定的使用次数或先前确定的时间量之后排定维护步骤。在其他实施方案中，表征系统可以在长的或极长的分离或运行(例如，一天或多天运行)之前发生，以确保在启动长程序之前的适用性。在某些实施方案中，表征系统可以在分离昂贵或珍贵的样品之前发生。在一些实施方案中，表征系统可在高度金属敏感样品或倾向于已知系统环境适用性问题的样品/应用的分离之前发生。
在一些示例中，不使用色谱柱，并且使重复注射的适用性样品(例如，包括阳性对照探针的样品)流经系统并到达检测器。如果检测器指示样品的化合物正在增加，则可以指示该系统不是惰性的。例如，可能存在暴露的金属，并且样品缓慢地钝化暴露的金属，使得在每次注射之后检测到增加量的适用性样品。
当对重复注射进行测试时，观察跨注射的一致性是诊断性的。对于所检测的样品，运行良好的系统将显示跨注射的一致的结果。并且这些结果应该是可再现的。具有暴露的金属的系统将显示跨注射的变化。并且用于评估系统的注射次数可基于系统的部件以及样品的化合物而变化。在一些示例中，存在至少3次注射、3-50次注射、4-20次注射。
虽然使用AMPcP来评估系统惰性是一种新颖的方法，但是AMPcP也可用作测试系统的机械部件性能的方法的一部分。在仅注射AMPcP且反应低于预期的情形下，人们将推测结果是由于金属相互作用还是由于系统的机械方面。为了将金属相互作用的影响与其他系统性能问题区分开来，实施另一参照检查。
图6显示AMPcP(阳性对照探针)和咖啡因(阴性对照探针)在乙烯桥接的HST LC系统上的代表性色谱图(顶部色谱图，602；AMPcP，604；咖啡因，606)与其中一部分被MP35N等效物交换的相同系统上的代表性色谱图(底部色谱图，608；AMPcP，614；咖啡因，612)的重叠图。即，图6显示了在乙烯桥接的HST LC系统上与部分惰性系统上的咖啡因(606、612)和AMPcP(604、614)的注射的重叠图，在部分惰性系统中一个部件(代表流动路径表面积的约40％)被MP35N部件(即，具有暴露的金属的部件)代替。
图6显示用杂化表面技术(HST)部分配置(相对于完全配置)的UHPLC重复注射AMPcP和咖啡因如何通过增加的峰面积相对标准偏差以及绝对回收率的降低容易地鉴定暴露的金属表面。咖啡因的注射被研究作为系统适用性测量的一部分。咖啡因用作金属结合的阴性对照。咖啡因预计不与金属表面相互作用，因此可给出峰形和分散以及总体机械系统性能的仪器特定表示。
对于图6中描述的结果，实验方案包括最初注射0.3％氢氧化铵以清洁任何金属表面，随后多次注射AMPcP，最后多次注射咖啡因。条件包括80:20乙腈:水的流速为0.5mL/min。在六次重复注射0.3％氢氧化铵(水溶液)和用所述流动相和流速平衡两分钟后，分析AMPcP和咖啡因重复。
在该完全与部分惰性系统上运行的代表性咖啡因注射的比较(图6，顶部色谱图602与底部色谱图608比较)显示几乎相同的峰面积、峰高度和峰形。对于完全惰性系统，峰面积、峰高度和面积RSD的平均值分别为16100μAU*秒、32000μAU和1.0％，以及对于部分惰性系统，峰面积、峰高度和面积RSD的平均值分别为16300μAU*秒、32800μAU和1.0％。在两个系统上获得的值存在良好的一致性，这证实咖啡因不经历任何显著的与金属的相互作用。另外，该信息确认两个LC配置被等效地组装并且适当地运行。能够区分系统惰性和机械性能是很重要的。将咖啡因添加到测试方案中允许这些观察结果被解耦。
与咖啡因结果(606和612)相反，AMPcP注射(604和614)证明当在完全与部分惰性系统上观察时是显著不同的。对于完全惰性系统，AMPcP峰面积和峰高度的平均值分别为18000μAU*秒和34400μAU，而对于部分惰性系统，相同值为12900μAU*秒和18100μAU。这对应于平均峰面积降低28％和平均峰高度降低47％。完全惰性系统上的AMPcP峰面积相对标准偏差为0.4％，而部分惰性系统上的相同测量值增加至4.3％。
上述数据证实用于确定系统惰性和系统性能的有效方法。上面收集的数据使用惰性系统，其中单个零件有意地变为金属零件。在一些示例中，该测试可用于确定流动路径中存在未知量的金属。重复性(或其缺乏)的观察结果可能是最能诊断金属问题的。此外，AMPcP和咖啡因之间的峰面积比可能证明是有效的。在图6中，完全惰性系统显示1.1的峰面积比(如预测的)，而部分惰性系统显示仅0.79的峰面积比，这表明一些金属敏感的AMPcP已经损失到流动路径中。
图7A、图8A和图9A提供三种不同系统的咖啡因对AMPcP峰的色谱图。用于获得图7A的峰的色谱系统配备有PEEK(惰性、不含金属的系统)。用于获得图8A的峰的色谱系统配备有乙烯桥接的杂化物涂覆的色谱表面(经由沉积在色谱表面上的有机二氧化硅涂层而成为惰性的金属系统)。用于获得图9A的峰的色谱系统配备有故意降解的乙烯桥接的杂化物色谱表面(由于涂层的降解而具有预期的金属暴露的系统)。图7A、图8A和图9A的快速视觉比较说明如何使用系统适用性溶液(含AMPcP和咖啡因的等摩尔溶液)的实施方案来显示适用性(等摩尔阳性对照和阴性对照探针的峰形)与不适用性(咖啡因的峰形不同于AMPcP的峰形)相比基本上类似。
虽然重复性和峰面积比的数学计算对于确定系统惰性是有用的，但是探索了最后一种类型的数据处理，即比较获得的咖啡因和AMPcP色谱图、输出差图并且还量化迹线之间的百分比差的工具。峰观察器工具被设计成获取咖啡因和AMPcP的色谱图(即，图7A、图8A和图9A中所示的那些)并且在绘制跨越所收集的数据点的强度差异之前将它们的峰高度归一化(图7B、图8B和图9B)。将峰高度归一化以说明样品制备中的任何潜在差异。峰观察器工具因此识别两个色谱图之间的峰形和拖尾的有意义的差异。对于完全惰性系统，咖啡因和AMPcP峰的比较应给出总体低水平的差异，因为峰形将仅基于系统分散效应。然而，如果系统在流动路径中包含一些量的暴露的金属，则咖啡因峰形(702、702'和702')和AMPcP峰形(704、704'和704')的差异将被预测为更显著。使用原型峰观察器工具来处理示例流动注射测试的全PEEK流径(图7B)，与惰性乙烯桥接的涂覆表面(图8B)相比，并且确定19.88％和20.84％的差值。两者均为低水平差异且两者均在相同差异范围内(即，彼此在1％内)。同时，对于来自包括乙烯桥接的涂覆表面的色谱系统的流动注射结果，测定55.69％的％差值，其中单一部件已经通过暴露于pH 10和90℃条件的96L水溶液历经57天而被有意地和积极地降解(图9B)。具有强迫降解的LC部件的LC上的％差的显著增加证明峰可视化工具用于确定色谱流动路径内金属的存在的有用性。可以容易地实施该工具使得考虑这种类型的系统就绪测量是有吸引力的。
实施例
对于实施例的试剂和标准品，所有试剂均得自密理博-Sigma公司(马萨诸塞州柏林顿市(Millipore-Sigma(Burlington,MA))。LC-MS级乙腈得自霍尼韦尔公司(密歇根州马斯基根市)(Honeywell(Muskegon,MI))。使用Millipore Milli-Q系统制备去离子水。包括色谱柱的液相色谱系统已经通过上述有机二氧化硅的气相沉积进行处理以减弱金属相互作用。
实施例1采用UV检测。
实施例1
检测腺苷-5'-三磷酸(ATP)和腺苷的反相LC-UV
实施例1是用于评估表面金属暴露的技术，其涉及通过色谱柱分离和测量ATP/腺苷。腺苷充当阴性对照，其中将观察到对分离和回收无金属相互作用相关影响。例如，注射器的输送体积不足将导致金属敏感性ATP以及腺苷对照化合物的面积减小。
如实施例1中所证实并在图5中显示的，ATP和腺苷之间的相对面积可用于评估系统中金属相互作用的程度，同时考虑非次级相互作用变化(例如注射体积)。此外，ATP化合物的峰形的评估可用于表征系统适用性。
由ATP在水中和腺苷在水中的1mg/mL原液制备由20ng/μL ATP和9.5ng/μL腺苷在水中组成的测试样品(例如，适用性样品)。然后将这些溶液稀释到单个样品小瓶中以产生测试样品。由于预期通过水解将ATP降解为ADP，推荐使用新鲜制备的测试样品。类似地，所使用的乙酸铵流动相也是每天新鲜制备的，因为已知乙酸铵缓冲盐是挥发性的。
分离细节见于表1中。在分析测试样品的至少五次注射之后，可以评估ATP和腺苷的峰面积、再现性和峰形的结果。有效的金属相互作用衰减由两种化合物的相当的峰面积、相当的且低的峰面积变化以及相当的且低的峰拖尾来指示。
表1：实施例1的分离细节
Figure BDA0004128523440000241
Figure BDA0004128523440000251
实施例2
检测腺苷5’-(α,β-亚甲基)二磷酸(AMPcP)和腺苷的反相LC-UV
实施例2是评估表面金属暴露的技术，其涉及使用色谱柱分离和测量AMPcP和腺苷。腺苷充当阴性对照，其中将观察到对分离和回收无非金属相互作用相关影响。例如，注射器的输送体积不足将导致金属敏感性AMPcP以及腺苷对照化合物的面积减小。
由AMPcP在水中和腺苷在水中的1mg/mL原液制备由17ng/μL AMPcP和10.7ng/μL腺苷在水中组成的测试样品。然后将这些溶液稀释到单个样品小瓶中以产生测试样品。乙酸铵流动相将是每天新鲜制备的，因为已知乙酸铵缓冲盐是挥发性的。
分离细节见于表2中。在分析测试样品的至少五次注射之后，可以评估AMPcP和腺苷的峰面积、再现性和峰形的结果。有效的金属相互作用衰减由两种化合物的相当的峰面积、相当的且低的峰面积变化以及相当的且低的峰拖尾来指示。
表2：实施例2的分离细节
Figure BDA0004128523440000252
Figure BDA0004128523440000261
实施例3
用于评估阳性探针化合物的受控金属暴露测试
实施例3是用于评估化合物检测色谱系统中的受控水平的暴露金属的能力的技术的示例。方法细节见于表3中。在分析测试样品的至少五次注射之后，可评估探针化合物的峰面积和再现性的结果。结果与在相同条件下分析的其他探针化合物的比较提供了对化合物检测暴露金属能力的理解。
表3：实施例3的分离细节
Figure BDA0004128523440000271
本公开的上述方面和特征提供了优于现有技术的多种优点。在一些实施方案中，在惰性LC系统和柱的系统适用性测试中使用本公开的化合物有许多有益效果。例如，本公开使用探针化合物以检测液相色谱、色谱柱和耦接的检测器中暴露的金属。这些化合物(例如，适用性样品)可有助于分析者在将不提供有意义的结果的分离上花费资源(例如，时间和金钱)之前(并且不需要花费该资源)来确定系统对于特定应用的适用性。该信息可以防止时间和费用的资源浪费，因为系统对于特定应用的适用性的知识将消除或大大减少注定要给出不良质量结果的实验。
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<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 磷酸苏氨酸
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<221> MOD_RES
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<223> 磷酸苏氨酸
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Gly Glu Gly Trp Gly Thr Gly Thr Gly Lys
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<211> 10
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 2
Gly Glu Gly Trp Gly Thr Gly Thr Gly Lys
1 5 10

Claims (23)

1.一种用于评估系统惰性的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一小瓶，所述第一小瓶包含阳性对照，所述阳性对照包含具有不可水解的α-β键的核苷酸二磷酸或其化学改性的类似物，其中所述阳性对照含有金属相互作用部分；以及
第二小瓶，所述第二小瓶包含阴性对照，所述阴性对照不含金属相互作用部分。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述具有不可水解的α-β键的核苷酸二磷酸是腺苷5’-(α,β-亚甲基)二磷酸(AMPcP)。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，还包含用于形成所述阴性对照和所述阳性对照的溶液的容器。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述阴性对照和所述阳性对照有相同的发色团，有相同的最大UV吸收波长，以及在所述波长下表现出相同的消光系数。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述阴性对照由腺苷组成或基本上由腺苷组成。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述阴性对照由咖啡因组成或基本上由咖啡因组成。
7.一种用于评估系统惰性的试剂盒，所述试剂盒包括：
第一小瓶，所述第一小瓶包含阳性对照，所述阳性对照包含腺苷-5'-三磷酸(ATP)或其化学改性的类似物；以及
第二小瓶，所述第二小瓶包含阴性对照，所述阴性对照不含金属相互作用部分。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述阴性对照和所述阳性对照有相同的发色团，有相同的最大UV吸收波长，以及在所述波长下表现出相同的消光系数。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，还包含用于形成所述阴性对照和所述阳性对照的溶液的容器。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述腺苷-5'-三磷酸(ATP)的化学改性的类似物为2'(3')-O-(4-苯甲酰基苯甲酰基)腺苷5'-三磷酸(Bz-ATP)化合物。
11.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述阴性对照由腺苷组成或基本上由腺苷组成。
12.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述阴性对照由咖啡因组成或基本上由咖啡因组成。
13.一种用于评估系统惰性的试剂盒，所述试剂盒包括：
阳性对照，所述阳性对照包含金属相互作用部分；
阴性对照，所述阴性对照不含金属相互作用部分；以及
用于容纳系统适应性溶液的容器。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阴性对照和所述阳性对照有相同的发色团，有相同的最大UV吸收波长，以及在所述波长下表现出基本上相同的消光系数。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阴性对照和所述阳性对照是化合物，并且其中所述阴性对照和所述阳性对照之间的差异是一系列三个磷酸酯基团。
16.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阳性对照为腺苷-5'-三磷酸(ATP)或其化学类似物，并且所述阴性对照为腺苷或咖啡因。
17.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阳性对照为腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸(AMPcP)或其化学类似物，并且所述阴性对照为腺苷或咖啡因。
18.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阳性对照为具有不可水解的α-β键的核苷酸二磷酸。
19.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阴性对照由腺苷组成或基本上由腺苷组成。
20.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阴性对照由咖啡因组成或基本上由咖啡因组成。
21.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阴性对照和所述阳性对照具有不同的光谱特性。
22.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述系统适应性溶液包含所述阴性对照和所述阳性对照的等摩尔混合物。
23.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述阳性对照为具有以下结构的亚乙烯基腺苷5'-(α,β-亚甲基)二磷酸：
Figure FDA0004128523430000031
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