CN116144714B - 一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，本发明涉及秸秆阴极电发酵制备己酸的方法。解决现有混合菌群发酵存在己酸产量低、发酵周期长、需要外加大量电子供体，经济性较差的问题，解决由于秸秆成分复杂难降解，电发酵在强化以秸秆为底物的己酸发酵中受到阻碍的问题。将预处理秸秆及发酵培养基加入到电发酵反应器的阴极室中，接种初始混合菌群，然后电驯化培养直至阴极室内发酵液的己酸含量不再上升，然后取出发酵物接种至新的电发酵反应器中进行下一周期的电驯化培养，重复多次直至周期内发酵得到的己酸最大含量与上一周期相比不再增加，驯化结束；本发明用于通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸。
Description
技术领域
本发明涉及秸秆阴极电发酵制备己酸的方法。
背景技术
己酸是含有6个碳原子的中长链羧酸，是一种重要的功能性化工品。相比于短链羧酸，它更容易分离，具有更高的能量密度和价值。己酸可以被应用于食品、医药、工业等各个领域，如它可以被进一步加工成香料、化学材料、食品添加剂和抗菌剂，还可以作为生物燃料前体。目前，己酸的制取方法主要有提取法、化学合成法和生物法。其中生物发酵法具有原料来源广泛、环境友好、可持续，是最为经济和环保的。
利用废弃生物质作为底物经生物发酵生产己酸，不仅可避免废弃生物质焚烧、堆腐引起的区域性大气污染、土地退化和农村环境治理难等问题，还能够降低己酸的生产成本，是应对全球气候变化、能源供需矛盾、生态环境恶化等重大问题的战略举措，受到广泛关注。秸秆作为储量丰富的废弃生物质，可被微生物水解和发酵的主要成分是纤维素和半纤维，并进一步转化为可发酵糖，是己酸生产的良好来源。
混合菌群发酵可以通过微生物的协同代谢作用，具有底物利用率高、工艺简单、易于管理和运行等优势，但也存在己酸产量低、发酵周期长、需要外加大量电子供体(乙醇、乳酸等)，经济性较差等问题。电发酵技术可通过外加电势调控微生物胞内氧化还原水平、改变ATP和细胞物质合成、调控代谢分配，可显著提高目标产物的产量和产率等。电发酵技术已被应用于以纯物质(如CO2、乙酸、丁酸、乙醇等)为底物的己酸生产中。然而，由于秸秆成分复杂难降解，电发酵在强化以秸秆为底物的己酸发酵中的应用受到了阻碍。
发明内容
本发明要解决现有混合菌群发酵存在己酸产量低、发酵周期长、需要外加大量电子供体(乙醇、乳酸等)，经济性较差的问题，解决由于秸秆成分复杂难降解，电发酵在强化以秸秆为底物的己酸发酵中受到阻碍的问题，进而提供一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法。
一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，它是按以下步骤进行：
将预处理秸秆及发酵培养基加入到电发酵反应器的阴极室中，然后接种初始混合菌群并调节pH，得到发酵液，同时向电发酵反应器的阳极室中加入K4(Fe(CN)6)溶液，将电发酵反应器的三个电极和恒电位仪连接，在阴极室电势为-1.2V～-0.4VvsAg/AgCl的条件下，电驯化培养直至阴极室内发酵液的己酸含量不再上升，然后取出发酵物接种至新的电发酵反应器中进行下一周期的电驯化培养，重复多次直至周期内发酵得到的己酸最大含量与上一周期相比不再增加，驯化结束，即完成通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过电驯化菌群改变了群落结构，优化了菌群之间的协作过程，驯化后的菌群更加适应电发酵，群落中与己酸合成相关菌属多样性与丰度大幅提高，其中主要的己酸合成菌属Caproiciproducens的丰度由42.88％增加至69.10％，使得电发酵的效率提高，己酸选择性和产率显著性提高，缩短秸秆己酸发酵时间。
(2)本发明通过菌群的富集驯化，可以在以废弃物秸秆为唯一底物，无需添加外源电子供体(乙醇、乳酸等)的条件下，直接发酵秸秆生产己酸，发酵过程操作简单，生产成本大幅降低。
附图说明
图1为本发明电发酵反应器的结构示意图；
图2为实施例一驯化后的混合菌群接种至新的电发酵反应器中电驯化培养7d的产酸情况；
图3是对比例一未驯化的初始混合菌群接种至电发酵反应器中电驯化培养7d的产酸情况；
图4为实施例一驯化后的混合菌群与对比例一未驯化的初始混合菌群接种至新的电发酵反应器中电驯化培养7d的己酸生产效能对比图；
图5为实施例一驯化后的混合菌群和未驯化的初始混合菌群的群落结构对比图；
图6为实施例二驯化后的混合菌群接种至新的电发酵反应器中电驯化培养9d的产酸情况。
具体实施方式
具体实施方式一：结合图1具体说明，本实施方式一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，它是按以下步骤进行：
将预处理秸秆及发酵培养基加入到电发酵反应器的阴极室中，然后接种初始混合菌群并调节pH，得到发酵液，同时向电发酵反应器的阳极室中加入K4(Fe(CN)6)溶液，将电发酵反应器的三个电极和恒电位仪连接，在阴极室电势为-1.2V～-0.4VvsAg/AgCl的条件下，电驯化培养直至阴极室内发酵液的己酸含量不再上升，然后取出发酵物接种至新的电发酵反应器中进行下一周期的电驯化培养，重复多次直至周期内发酵得到的己酸最大含量与上一周期相比不再增加，驯化结束，即完成通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法。
本具体实施方式在培养过程中，通入氮气保证厌氧条件，每1～3天分别从阴极室吸取发酵液并测定发酵液组分。
本具体实施方式周期内电驯化培养过程均接种上一周期的发酵物。
本具体实施方式的有益效果是：
(1)本具体实施方式通过电驯化菌群改变了群落结构，优化了菌群之间的协作过程，驯化后的菌群更加适应电发酵，群落中与己酸合成相关菌属多样性与丰度大幅提高，其中主要的己酸合成菌属Caproiciproducens的丰度由42.88％增加至69.10％，使得电发酵的效率提高，己酸选择性和产率显著性提高，缩短秸秆己酸发酵时间。
(2)本具体实施方式通过菌群的富集驯化，可以在以废弃物秸秆为唯一底物，无需添加外源电子供体(乙醇、乳酸等)的条件下，直接发酵秸秆生产己酸，发酵过程操作简单，生产成本大幅降低。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的电发酵反应器具体为双室H型反应器，用钛丝固定石墨毡作为阳极和阴极，Ag/AgCl作为参比电极，双室中间放置质子交换膜，阴极室外接集气袋收集发酵气体。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：所述的发酵液中预处理秸秆的浓度为10g/L～50g/L；所述的初始混合菌群的接种量为发酵液体积的5％～10％；且每一周期的发酵物接种量均为发酵液体积的5％～10％。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述的K4(Fe(CN)6)溶液的浓度为100mmol/L～300mmol/L，且K4(Fe(CN)6)溶液与发酵液体积相等。其它与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：在氮气气氛、发酵液pH为5.5～7.5、温度为35℃～38℃、搅拌速度为100rpm～150rpm及阴极室电势为-1.2V～-0.4VvsAg/AgCl的条件下，电驯化培养7d～20d。其它与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：所述的发酵培养基是由蛋白胨、NaCl、CaCO3、酵母浸粉、L-Cys、K2HPO4·3H2O及(NH4)2SO4组成，且发酵培养基中蛋白胨的浓度为5g/L，NaCl的浓度为5g/L，CaCO3的浓度为1g/L～10g/L，酵母浸粉的浓度为1g/L～10g/L，L-Cys的浓度为0.1g/L～0.5g/L，K2HPO4·3H2O的浓度为0.5g/L，(NH4)2SO4的浓度为0.5g/L。其它与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：所述的初始混合菌群为富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、腐木腐叶混合物的菌群。其它与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：所述的初始混合菌群的富集过程具体是按以下步骤进行：将从牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、腐木腐叶采集到的样品置于以秸秆为碳源的富集培养基中，在温度为35℃～38℃及搅拌速度为100rpm～120rpm的条件下进行厌氧培养，连续传代培养3个月～5个月。其它与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：所述的以秸秆为碳源的富集培养基中是由预处理秸秆、蛋白胨、NaCl、CaCO3、酵母浸粉及L-Cys组成，且以秸秆为碳源的富集培养基中预处理秸秆的浓度为5g/L～30g/L，蛋白胨的浓度为5g/L，NaCl的浓度为5g/L，CaCO3的浓度为5g/L，酵母浸粉的浓度为1g/L，L-Cys的浓度为0.5g/L。其它与具体实施方式一至八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：所述的预处理秸秆是按以下步骤制备：将秸秆分割成1cm～2cm的片段，然后在温度为30℃～60℃的条件下，将分割后的秸秆浸渍于质量百分数为1％～3％的NaOH溶液中浸泡72h～120h，过滤收集浸泡后的秸秆，用水清洗至pH为中性。其它与具体实施方式一至九相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：
一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，它是按以下步骤进行：
将3g预处理秸秆及100mL发酵培养基加入到电发酵反应器的阴极室中，然后接种初始混合菌群并调节pH，得到发酵液，同时向电发酵反应器的阳极室中加入K4(Fe(CN)6)溶液，将电发酵反应器的三个电极和恒电位仪连接，在氮气气氛、发酵液pH为7.0、温度为37℃、搅拌转速为120rpm及阴极室电势为-0.6VvsAg/AgCl的条件下，电驯化培养直至阴极室内发酵液的己酸含量不再上升，然后取出发酵物接种至新的电发酵反应器中进行下一周期的电驯化培养，重复多次直至周期内发酵得到的己酸最大含量与上一周期相比不再增加，驯化结束，即完成通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法；
所述的初始混合菌群的接种量为发酵液体积的5％；且每一周期的发酵物接种量均为发酵液体积的5％。
所述的电发酵反应器具体为双室H型反应器，每个反应室体积为120mL，用钛丝固定2cm×2cm的石墨毡作为阳极和阴极，Ag/AgCl作为参比电极，双室中间放置质子交换膜，阳极室和阴极室通过顶部盖紧的橡胶塞来保证密闭环境，阴极室外接集气袋收集发酵气体，如图1所示。
所述的K4(Fe(CN)6)溶液的浓度为200mmol/L，且K4(Fe(CN)6)溶液与发酵液的体积相等。
所述的发酵培养基是由蛋白胨、NaCl、CaCO3、酵母浸粉、L-Cys、K2HPO4·3H2O及(NH4)2SO4组成，且发酵培养基中蛋白胨的浓度为5g/L，NaCl的浓度为5g/L，CaCO3的浓度为5g/L，酵母浸粉的浓度为1g/L，L-Cys的浓度为0.5g/L，K2HPO4·3H2O的浓度为0.5g/L，(NH4)2SO4的浓度为0.5g/L。
所述的初始混合菌群为富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、腐木腐叶混合物的菌群。
所述的初始混合菌群的富集过程具体是按以下步骤进行：将从牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、腐木腐叶采集到的样品置于以秸秆为碳源的富集培养基中，在温度为35℃及搅拌速度为120rpm的条件下进行厌氧培养，连续传代培养5个月。
所述的以秸秆为碳源的富集培养基中是由预处理秸秆、蛋白胨、NaCl、CaCO3、酵母浸粉及L-Cys组成，且以秸秆为碳源的富集培养基中预处理秸秆的浓度为10g/L，蛋白胨的浓度为5g/L，NaCl的浓度为5g/L，CaCO3的浓度为5g/L，酵母浸粉的浓度为1g/L，L-Cys的浓度为0.5g/L。
所述的预处理秸秆是按以下步骤制备：将秸秆分割成1cm～2cm的片段，然后在温度为50℃的条件下，将分割后的秸秆浸渍于质量百分数为1％的NaOH溶液中浸泡72h，过滤收集浸泡后的秸秆，用水清洗至pH为中性。
本实施例周期内电驯化培养过程均接种上一周期的发酵物。
实施例一中初始混合菌群电驯化培养直至阴极室内发酵液的己酸含量不再上升后，得到的发酵物为驯化后的混合菌群，将驯化后的混合菌群接种至新的电发酵反应器中，在发酵液中预处理秸秆的浓度为30g/L、氮气气氛、发酵液pH为7.0、温度为37℃、搅拌转速为120rpm及阴极室电势为-0.6VvsAg/AgCl的条件下电驯化培养7d，测定驯化后的混合菌群产酸情况，详见下图2及图4。
对比例一：本对比例与实施例一不同之处在于：取消驯化步骤，将初始混合菌群接种至电发酵反应器中，在发酵液中预处理秸秆的浓度为30g/L、氮气气氛、发酵液pH为7.0、温度为37℃、搅拌转速为120rpm及阴极室电势为-0.6VvsAg/AgCl的条件下电驯化培养7d。其他与实施例一相同。测定未驯化的初始混合菌群产酸情况，详见下图3及图4。
图2为实施例一驯化后的混合菌群接种至新的电发酵反应器中电驯化培养7d的产酸情况；图3是对比例一未驯化的初始混合菌群接种至电发酵反应器中电驯化培养7d的产酸情况；由图可知，驯化后的菌群较未驯化的菌群发酵秸秆生产己酸的浓度增加，7d时分别为3.36g/L和2.23g/L，驯化后的己酸产量为驯化前的1.48倍。菌群经过驯化后，生产己酸的速率也有所增加，驯化后的菌群发酵第4天的己酸产量便达到了未驯化菌群发酵所得最高浓度。
图4为实施例一驯化后的混合菌群与对比例一未驯化的初始混合菌群接种至新的电发酵反应器中电驯化培养7d的己酸生产效能对比图；由图可知，菌群经驯化后，己酸选择性由0.18(g/g总酸)升高至0.26(g/g总酸)，己酸产率由0.08(g/g消耗秸秆)升高至0.12(g/g消耗秸秆)，选择性和产率相比于对比例一分别提高了44.4％和50.0％。
对驯化前后的菌群群落结构进行检测，丰度最高的5组菌属的丰度对比；图5为实施例一驯化后的混合菌群和未驯化的初始混合菌群的群落结构对比图；由图可知，混合菌群主要包括纤维素降解菌属、短链脂肪酸合成菌属和己酸合成菌属。由图5可以看出，初始菌群菌群经过电驯化后，群落结构发生了变化，与己酸合成相关的菌属Caproiciproducens、Oscillibacter、Rummeliibacillus和纤维素降解相关的菌属Ruminiclostridium的丰度增加，其中主要的己酸合成菌属Caproiciproducens的丰度由42.88％增加至69.10％。与短链脂肪酸合成相关的菌属Clostridium_sense-stricto_1的丰度降低。这些群落结构的变化解释了菌群经电驯化后显著增强了己酸发酵效能的原因。
实施例二：本实施例与实施例一不同的是：步骤一中预处理秸秆为4g，发酵液中预处理秸秆的浓度为40g/L。其它与实施例一相同。
图6为实施例二驯化后的混合菌群接种至新的电发酵反应器中电驯化培养9d的产酸情况；可以看出，将经电驯化后的菌群投入更高底物浓度，即40g/L秸秆的条件下进行发酵，可以获得更高的己酸产量即6.94g/L，且己酸已成为发产物中选择性(g/g总酸)最高的产物，达到0.36。
Claims (5)
1.一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，其特征在于它是按以下步骤进行：
将预处理秸秆及发酵培养基加入到电发酵反应器的阴极室中，然后接种初始混合菌群并调节pH，得到发酵液，同时向电发酵反应器的阳极室中加入K4(Fe(CN)6)溶液，将电发酵反应器的三个电极和恒电位仪连接，在氮气气氛、发酵液pH为5.5～7.5、温度为35℃～38℃、搅拌速度为100rpm～150rpm及阴极室电势为-1.2V～-0.4V vsAg/AgCl的条件下，电驯化培养7d～20d直至阴极室内发酵液的己酸含量不再上升，然后取出发酵物接种至新的电发酵反应器中进行下一周期的电驯化培养，重复多次直至周期内发酵得到的己酸最大含量与上一周期相比不再增加，驯化结束，即完成通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法；
所述的初始混合菌群的富集过程具体是按以下步骤进行：将从牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤、腐木腐叶采集到的样品置于以秸秆为碳源的富集培养基中，在温度为35℃～38℃及搅拌速度为100rpm～120rpm的条件下进行厌氧培养，连续传代培养3个月～5个月；所述的以秸秆为碳源的富集培养基中是由预处理秸秆、蛋白胨、NaCl、CaCO3、酵母浸粉及L-Cys组成，且以秸秆为碳源的富集培养基中预处理秸秆的浓度为5g/L～30g/L，蛋白胨的浓度为5g/L，NaCl的浓度为5g/L，CaCO3的浓度为5g/L，酵母浸粉的浓度为1g/L，L-Cys的浓度为0.5g/L；
所述的发酵培养基是由蛋白胨、NaCl、CaCO3、酵母浸粉、L-Cys、K2HPO4·3H2O及(NH4)2SO4组成，且发酵培养基中蛋白胨的浓度为5g/L，NaCl的浓度为5g/L，CaCO3的浓度为1g/L～10g/L，酵母浸粉的浓度为1g/L～10g/L，L-Cys的浓度为0.1g/L～0.5g/L，K2HPO4·3H2O的浓度为0.5g/L，(NH4)2SO4的浓度为0.5g/L。
2.根据权利要求1所述的一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，其特征在于所述的电发酵反应器具体为双室H型反应器，用钛丝固定石墨毡作为阳极和阴极，Ag/AgCl作为参比电极，双室中间放置质子交换膜，阴极室外接集气袋收集发酵气体。
3.根据权利要求1所述的一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，其特征在于所述的发酵液中预处理秸秆的浓度为10g/L～50g/L；所述的初始混合菌群的接种量为发酵液体积的5％～10％；且每一周期的发酵物接种量均为发酵液体积的5％～10％。
4.根据权利要求1所述的一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，其特征在于所述的K4(Fe(CN)6)溶液的浓度为100mmol/L～300mmol/L，且K4(Fe(CN)6)溶液与发酵液体积相等。
5.根据权利要求1所述的一种通过混合菌群电驯化强化秸秆阴极电发酵制备己酸的方法，其特征在于所述的预处理秸秆是按以下步骤制备：将秸秆分割成1cm～2cm的片段，然后在温度为30℃～60℃的条件下，将分割后的秸秆浸渍于质量百分数为1％～3％的NaOH溶液中浸泡72h～120h，过滤收集浸泡后的秸秆，用水清洗至pH为中性。
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