CN116139276A - Rnf130及其下调剂在制备自身免疫性疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了环指蛋白130(RNF130)及其下调剂在制备自身免疫性疾病药物中的应用。所述的RNF130对CD4+T细胞的增殖有调节作用，参与CD4+T细胞内肥胖诱导的糖酵解代谢，对于CD4+T细胞参与的自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、炎症性肠病、多发性硬化、类风湿性关节炎等中发挥关键作用，可作为缓解或治疗自身免疫性疾病的靶标。本发明也提供了一种小分子的RNF130下调剂DC‑Gonib32，其在细胞水平和动物水平上均呈现良好的缓解由CD4+T细胞过度增殖/活化为特征的自身免疫性疾病。

Description

RNF130及其下调剂在制备自身免疫性疾病药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及RNF130及其下调剂在制备自身免疫性疾病药物中的应用。
背景技术
自身免疫性疾病是免疫系统对自身机体的成份发生免疫反应，造成损害而引发疾病。正常情况下免疫系统只对侵入机体的外来物，如细菌、病毒、寄生虫、移植物等产生反应，消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下，机体的组织成份或免疫系统本身出现了某些异常，致使免疫系统误将自身成份当成外来物来攻击。这时候免疫系统会产生针对机体自身一些成份的抗体及活性淋巴细胞，损害破坏自身组织脏器，导致疾病。CD4+T细胞在一些人类自身免疫性疾病的发病机制中起着重要的作用。
肥胖是一种代谢紊乱的状态，随着体内脂类物质的过度增加，体内CD4+T细胞的活化也会发现转变，使机体处于一种慢性炎症的状态，由此增加了肥胖者患自身免疫性疾病的风险。由肥胖而导致的自身免疫性疾病称为肥胖相关的自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮、炎症性肠病、多发性硬化等。
由于可以加速机体的老化状态，老年个体(例如高于60岁、65岁或70岁年龄的个体)常常表现为与肥胖个体同样的代谢紊乱以及CD4+T细胞过度活化的状态，增加了老年者患自身免疫性疾病的风险。由老年而导致的自身免疫性疾病称为老年相关的自身免疫性疾病，例如炎性衰老，类风湿性关节炎等。
鉴于肥胖或老年相关的自身免疫性疾病具有独特的发病机制，本领域尚缺少针对该类疾病的有效靶点。因此，亟待找到有效的靶向治疗靶点以及筛选出有效的治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供RNF130及其下调剂在制备自身免疫性疾病药物中的应用。
在本发明的第一方面，提供环指蛋白130(Ring Finger protein 130，RNF130)的应用，用于作为缓解或治疗自身免疫性疾病的靶标；或，作为筛选缓解或治疗自身免疫性疾病的药物的靶标。
在本发明的另一方面，提供环指蛋白130的下调剂的应用，用于制备缓解或治疗自身免疫性疾病的组合物。
在一种或多种实施方式中，所述的组合物还用于包括(但不限于)以下方面：抑制CD4+T细胞的增殖；降低高脂诱导的糖酵解水平；减少血清中抗双链DNA、抗单链DNA、抗组蛋白或抗核抗体的含量；减少肾脏中IgG沉积；降低CD4+T细胞中NF-AT入核水平，或抑制NF-AT信号；抑制USP9X的泛素化；和/或，抑制CaN的去泛素化。
在一种或多种实施方式中，所述环指蛋白130的下调剂包括(但不限于)：下调环指蛋白130活性的物质，减少环指蛋白130有效作用时间、下调环指蛋白130的表达、或稳定性的物质。
在一种或多种实施方式中，所述下调剂包括选自(但不限于)：针对环指蛋白130的化学小分子拮抗剂或抑制剂；干扰或敲除环指蛋白130的试剂；特异性与环指蛋白130结合的结合分子(如抗体或配体)；或，干扰环指蛋白130与效应分子(如其下游蛋白或相互作用蛋白)的相互作用的试剂。
在一种或多种实施方式中，所述针对环指蛋白130的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括但不限于DC-Gonib32：1-[(1-丁基-1H-1,2,3,4-四唑-5-基)甲基]-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶，或其盐、水合物、异构体、类似物或衍生物。
在一种或多种实施方式中，在细胞水平上，对于CD4+T细胞而言，DC-Gonib32例如为0.2-5μM，较佳地为0.5-4μM，更佳地为1-3μM，更佳地为1-2μM。
在一种或多种实施方式中，所述干扰或敲除环指蛋白130的试剂包括(但不限于)：特异性干扰环指蛋白130的编码基因表达的干扰分子；针对环指蛋白130的基因编辑试剂；针对环指蛋白130的同源重组试剂或定点突变试剂。
在一种或多种实施方式中，所述基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂将环指蛋白130进行功能丧失性突变，如靶向于其关键结构域进行功能丧失性突变。
在一种或多种实施方式中，利用同源重组结合Cre-LoxP技术去除环指蛋白130基因第三个外显子，进而导致基因功能丧失。
在一种或多种实施方式中，所述干扰分子包括shRNA，siRNA，miRNA，反义核酸等，或能形成所述siRNA、shRNA，miRNA，反义核酸等的构建体。
在一种或多种实施方式中，用于将sgRNA或干扰分子等下调剂引入细胞内的表达构建物(表达载体)包括：病毒载体，非病毒载体；如所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。
在一种或多种实施方式中，所述自身免疫性疾病包括：肥胖相关的自身免疫性疾病(obesity-related autoimmune disease)，老年相关的自身免疫性疾病(aging-relatedautoimmune disease)。
在一种或多种实施方式中，所述的自身免疫性疾病是以CD4+T细胞过度增殖与活化为特征(由CD4+T细胞过度增殖与活化诱导)的自身免疫性疾病。
在本发明的另一方面，提供一种用于缓解或治疗自身免疫性疾病的药物组合物或药盒，包括：环指蛋白130的下调剂。
在一种或多种实施方式中，所述下调剂为针对环指蛋白130的化学小分子拮抗剂或抑制剂，包括(但不限于)：1-[(1-丁基-1H-1,2,3,4-四唑-5-基)甲基]-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶，或其盐、水合物、异构体、类似物或衍生物。
在一种或多种实施方式中，所述下调剂为基因敲除试剂，其敲除环指蛋白130基因第三个外显子以导致基因功能丧失。
在一种或多种实施方式中，所述的药物组合物中，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
在本发明的另一方面，提供一种筛选缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达环指蛋白130；和(2)检测所述体系中环指蛋白130的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调环指蛋白130的表达或活性，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。
在一种或多种实施方式中，步骤(2)中或之后，还包括选自下组的检测筛选：
(a)检测候选物质对于CD4+T细胞的增殖的影响作用，若CD4+T细胞的增殖显著降低，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；
(b)检测候选物质对于高脂诱导的糖酵解水平的影响作用，若糖酵解水平显著降低，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；
(c)检测候选物质对于血清(如动物模型的血清)中抗双链DNA、抗单链DNA、抗组蛋白或抗核抗体的含量的影响作用，若含量显著降低，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；
(d)检测候选物质对于肾脏中IgG沉积的影响作用，若IgG沉积显著降低，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；
(e)检测候选物质对于CD4+T细胞中NF-AT入核水平或NF-AT信号的影响作用，若显著降低，则该候选物质是缓解或治疗的自身免疫性疾病的潜在物质；
(f)检测候选物质对于USP9X的泛素化的影响作用，若显著降低其泛素化，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；和/或
(g)检测候选物质对于CaN的去泛素化的影响作用，若显著降低其去泛素化，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。
在一种或多种实施方式中，所述的筛选方法以筛选药物为目的，不以治疗为目的。
在一种或多种实施方式中，所述的体系选自：细胞体系(如表达环指蛋白130的细胞或细胞培养物)、亚细胞(培养物)体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在一种或多种实施方式中，步骤(1)中，所述体系为CD4+T细胞(培养物)体系。
在一种或多种实施方式中，检测环指蛋白130的表达的方法包括(但不限于)：Southern印迹法，Western印迹法，DNA序列分析，聚合酶链反应法，免疫共沉淀法，酵母双杂交法。
在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对环指蛋白130、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的调控分子或其构建体(如shRNA，siRNA，基因编辑试剂，表达载体，重组的病毒或非病毒构建体等)，化学小分子(如特异性抑制剂或拮抗剂)，相互作用分子等。
在一种或多种实施方式中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制自身免疫性疾病有用的物质。
在一种或多种实施方式中，所述的下调为显著下调，如下调10％以上，20％以上，50％以上，80％以上等，或使之不表达或没有活性。
在本发明的另一方面，提供一种制备环指蛋白130的化学小分子抑制剂1-[(1-丁基-1H-1,2,3,4-四唑-5-基)甲基]-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶的方法，包括：
(1)1-溴-2,4,6-三甲氧基苯(1)在干燥四氢呋喃(THF)中，经碘的活化，再与镁相互作用，得到中间产物；
(2)将(1)的中间产物与酮类化合物
Figure BDA0003364981860000051
加成反应得到中间产物；
(3)将(2)的中间产物在TFA作用下脱水得到中间产物；
(4)将(3)的中间产物在碱性条件下与
Figure BDA0003364981860000052
经亲核取代反应得到最终产物1-[(1-丁基-1H-1,2,3,4-四唑-5-基)甲基]-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶；
在一种或多种实施方式中，
Figure BDA0003364981860000053
由N-丁基-氯乙酰胺在PCl3及NaN3作用下获得。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A-F、T细胞中RNF130敲除抑制了NF-AT活化和T细胞增殖。
图2A-E、T细胞中RNF130敲除抑制了肥胖相关的NF-AT活化和糖酵解代谢。
图3A-C、T细胞中RNF130敲除抑制了肥胖相关的自身免疫疾病。
图4A-B、小分子化合物DC-Gonib32能够与RNF130结合。
图5A-C、小分子化合物DC-Gonib32对CD4+T细胞的凋亡和活力分析。
图6A-B、小分子化合物DC-Gonib32不影响CD4+T细胞中RNF130蛋白表达。
图7A-E、小分子化合物DC-Gonib32抑制了CD4+T细胞中USP9X的泛素化与NF-AT信号的活化。
图8A-C、小分子化合物DC-Gonib32抑制了CD4+T细胞中糖酵解代谢。
图9A-D、小分子化合物DC-Gonib32抑制了CD4+T细胞的增殖。
图10A-C、小分子化合物DC-Gonib32抑制了肥胖来源CD4+T细胞诱导的自身免疫性炎症。
图11A-B、小分子化合物DC-Gonib32抑制了老年个体来源CD4+T细胞诱导的自身免疫性炎症。
具体实施方式
本发明人通过深入的分析研究，揭示了一种环指蛋白130(RNF130)，其对CD4+T细胞的增殖有调节作用，参与CD4+T细胞内肥胖诱导的糖酵解代谢，对于CD4+T细胞参与的自身免疫性疾病(如肥胖或老年相关的自身免疫性疾病)发挥关键作用，可用于作为缓解或治疗自身免疫性疾病的靶标。本发明也提供了RNF130下调剂在缓解或治疗自身免疫性疾病中的新用途。
术语
如本发明所用，所述的“环指蛋白130”、“E3泛素连接酶RNF130”、“RNF130”可互换使用。
如本发明所用，所述的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”等，是指具有统计学意义的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。如与对照组相比，显著“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”；更具体例如20％以上、较佳的50％以上、更佳的80％以上的“抑制”或“下调”或“弱化”或“减少”。
如本发明所用，所述的“下调剂”包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，这些术语可互换使用。
如本发明所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。
RNF130或其调节分子
环指蛋白130(Ring finger protein 130，RNF130)又名Goliath，属于E3泛素连接酶。
肥胖是一种代谢紊乱的状态，随着体内脂类物质的过度增加，体内CD4+T细胞的活化也会发现转变，使机体处于一种慢性炎症的状态，由此增加了肥胖者患自身免疫性疾病的风险。由于可以加速机体的老化状态，老年个体常常表现为与肥胖个体同样的代谢紊乱以及CD4+T细胞过度活化的状态，提示RNF130同样在老年相关自身免疫性疾病中发挥了重要的调控作用。然而RNF130是否在此过程中发挥调节作用并不清楚。
本发明人的研究工作中，首次披露CD4+T细胞中RNF130对自身免疫性疾病的调节作用。
本发明中，人源RNF130的氨基酸序列可以与GenBank登录号NM_018434所示的序列基本上相同。鼠源RNF130的氨基酸序列可以与GenBank登录号NM_021540所示的序列基本上相同。应理解，根据需要，本领域技术人员还可应用来自其它物种的RNF130的同源物。
当被应用于本发明时，所述RNF130可以是天然存在的，也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组RNF130，以应用于实验或临床。所述的RNF130包括全长的RNF130或它们任一的生物活性片段。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的RNF130的氨基酸序列也包括在本发明中。RNF130或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
任何一种RNF130的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，RNF130的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的RNF130的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长RNF130的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长RNF130的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
本发明也可应用经修饰或改良的RNF130，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的RNF130。也就是说，任何不影响RNF130的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
基于本发明人的新发现，本发明提供了一种RNF130或其编码基因的下调剂的用途，用于制备缓解或治疗自身免疫性疾病的组合物。
所述的RNF130或其编码基因的下调剂是指任何可降低RNF130的活性、降低RNF130或其编码基因的稳定性、下调RNF130的表达、减少RNF130有效作用时间、或抑制RNF130基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调RNF130有用的物质，从而可用于缓解或治疗自身免疫性疾病。例如，所述的下调剂是：特异性干扰RNF130基因表达的干扰RNA分子或反义核苷酸；特异性与RNF130基因编码的蛋白结合的抗体或配体；等等。
作为本发明的一种优选方式，所述的下调剂是针对RNF130的小分子化合物。本领域技术人员可以采用适于小分子化合物的筛选的方法，来进行这类小分子化合物的筛选。所述的筛选可以依托本领域现有的或将要开发的各种化合物库，或自行建立一些新化合物库。
本领域现有技术中尚没有专门针对RNF130的小分子抑制剂被开发出来。在论证了RNF130在肥胖或老年相关自身免疫性疾病发生发展中的生理或病理功能后，亟待找到高选择性的RNF130小分子抑制剂，从而进一步探索RNF130在肥胖或老年相关自身免疫性疾病发生发展中的作用。本发明中披露了此类小分子抑制剂。
作为本发明的优选方式，所述的小分子化合物是四氢吡啶类化合物DC-Gonib32、其制备方法及其应用。本发明的化合物可选择性地抑制E3泛素连接酶RNF130的功能，进而抑制肥胖或老年个体中CD4+T细胞的糖酵解代谢，从而缓解肥胖或老年个体CD4+T细胞诱导的自身免疫性炎症。
Figure BDA0003364981860000091
DC-Gonib32可通过特异性靶向E3泛素连接酶RNF130并抑制其E3泛素连接酶功能，进而抑制了CD4+T细胞的糖酵解代谢水平，由此抑制了细胞的增殖与过度活化，从而缓解了肥胖与老年相关的自身免疫性疾病的发生发展。DC-Gonib32可有效地抑制肥胖或老年个体来源CD4+T诱导的系统性自身免疫性炎症，将可能为今后临床治疗肥胖或老年相关自身免疫性疾病提供新的药物研发的前体化合物。
DC-Gonib32通过抑制T细胞受体(T cell receptor,TCR)下游的NF-AT信号通路以实现其对CD4+T细胞糖酵解、增殖与活化的抑制作用。具体来说，E3泛素连接酶RNF130可与去泛素化酶USP9X以及钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)结合，RNF130可直接泛素化USP9X进而使其活化，活化后的USP9X进一步去泛素化CaN，进而活化下游NF-AT信号通路和糖酵解代谢。而DC-Gonib32特异性靶向RNF130的E3泛素连接酶功能，从而直接抑制了USP9X的泛素化与活化，进而抑制了下游NF-AT信号通路的激活，进一步抑制了CD4+T细胞的糖酵解、增殖与活化。
DC-Gonib32在1-2μM的浓度下，不影响CD4+T细胞的凋亡和细胞活力。
所述物DC-Gonib32的一种合成方法包括如下：首先由原料1-溴-2,4,6-三甲氧基苯(1)在干燥THF中，经碘的活化，再与镁相互作用，得到格式试剂2，接着与酮类化合物3发生加成反应得到醇类4，化合物4在TFA作用下脱水得到化合物5，最后5在碱性条件下与四氮唑类化合物7经亲核取代反应得到最终产物DC-Gonib32。而中间体7由N-丁基-氯乙酰胺6在PCl3及NaN3作用下制得。
Figure BDA0003364981860000101
在本发明中，所述的小分子化合物可以是纯净形式存在的化合物，或纯度大于85％(较佳地大于90％，例如大于95％，98％，99％)的化合物。在得知其化学结构的情况下，所述的小分子化合物可通过化学合成的方式获得。本发明还包括化合物的前体，所述的“前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成具有活性的该化合物。
本发明还包括所述小分子化合物的异构体、溶剂合物，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与DC-Gonib32具有相同或基本相同的功能。所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
作为本发明的一种优选的方式，可采用CRISPR/Cas(如Cas9)系统进行靶向的基因编辑，从而在特定区域敲除RNF130基因。常见的敲除RNF130基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9 mRNA或能形成所述Cas9 mRNA的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9 mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9 mRNA。
作为本发明的一种可选的方式，可采用同源重组的方法，特异性地靶向于RNF130，使之发生表达缺陷或缺失表达。也可应用Cre和loxp方法使动物或细胞的基因组中相关基因选择性的敲除，表达降低或失活。
作为本发明的一种可选的方式，所述的下调剂可以是RNF130特异性的干扰RNA分子(如siRNA、shRNA、miRNA等)，本领域人员可以理解到，根据本发明中提供的RNF130序列信息，可以制备获得此类干扰RNA分子。对干扰RNA分子的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法等。所述的干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。在一些实施例中，RNAi用于抑制RNF130。RNAi是一种进化上保守的细胞防御机制，用于控制包括人在内的大多数真核生物中外源基因的表达。RNAi通常由双链RNA(dsRNA)触发，并引起单链靶RNA的序列特异性mRNA降解。mRNA降解的介体是小干扰RNA双链体(siRNAs)，通常由长dsRNA在细胞内酶切产生。siRNAs的长度通常约为21个核苷酸(例如21-23个核苷酸)。在将小RNA或RNAi导入细胞后，据信该序列被传递到称为RISC(RNA诱导沉默复合物)的酶复合物。RISC识别目标并用核酸内切酶切割它。值得注意的是，如果较大的RNA序列被传递到细胞，RNA酶III酶(Dicer)会将较长的dsRNA转化为21-23nt的ds-siRNA片段。
在可选的实施例中，利用shRNA技术进行干扰作用。shRNA是一种RNA序列，它可以使一个紧密的发夹旋转，可以用来沉默基因表达通过RNA干扰。shRNA使用导入细胞的载体并利用启动子(如U6)来确保shRNA始终被表达。这种载体通常传递给子细胞，使基因沉默得以遗传。shRNA发夹结构被细胞机制切割成siRNA，然后与RNA诱导沉默复合物(RISC)结合。这种复合物结合并切割与它结合的siRNA相匹配的mRNAs。shRNA由RNA聚合酶III转录。
作为可选的实施方式，使用与编码RNF130的一个或多个核酸特异性杂交的反义化合物来调节RNF130表达。寡聚物与其靶核酸的特异性杂交干扰了核酸的正常功能。这种通过与靶核酸特异性杂交的化合物对靶核酸功能的调节通常被称为“反义”。
以上为一些代表性的下调RNF130功能活性的方式，应理解，本发明提供了一种全新的靶点，尽管本发明提供了优选的方案，但在本领域技术人员了解了本发明的总体方案后，还可以采取本领域已知的其它方法或正在发展的方法来对RNF130进行调控，这些方法也包含在本发明中。
RNF130作为药物筛选靶点
在得知了所述的RNF130的功能和作用机制后，可以基于该特征来筛选抑制RNF130的物质，所述物质可对缓解或治疗自身免疫性疾病具有积极作用。
基于本发明人的新发现，一方面，本发明提供一种筛选缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达环指蛋白130；和(2)检测所述体系中环指蛋白130的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调环指蛋白130的表达或活性，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。
作为本发明的优选方式，在检测RNF130的同时，还包括检测选自下组的特性：候选物质对于CD4+T细胞的增殖的影响作用，候选物质对于高脂诱导的糖酵解水平的影响作用，候选物质对于血清中抗双链DNA、抗单链DNA、抗组蛋白或抗核抗体的含量的影响作用，候选物质对于肾脏中IgG沉积的影响作用，测候选物质对于CD4+T细胞中NF-AT入核水平或NF-AT信号的影响作用，候选物质对于USP9X的泛素化的影响作用或候选物质对于CaN的去泛素化的影响作用等；从而进一步判断该候选物质是否为缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。
在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到RNF130的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达RNF130的体系。
所述的表达RNF130的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达RNF130和/的细胞；或可以是重组表达RNF130的细胞。所述的表达RNF130的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于缓解或治疗自身免疫性疾病真正有用的物质。
本发明对于RNF130的表达、活性、存在量的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的基因/蛋白定量或半定量检测技术、酶催化反应等，例如(但不限于)：免疫共沉淀、SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA，聚合酶链式反应技术(PCR)，Northern印迹法等等。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的化合物、生物大分子、组合物或药物，或一些潜在物质。一些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于缓解或治疗自身免疫性疾病等真正有用的物质，从而用于临床。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的0.0001-10wt％)的所述的RNF130或其编码基因的下调剂，以及药学上可接受的载体。
在本发明的优选方式中，所述的下调剂包括但不限于：针对RNF130的化学小分子拮抗剂或抑制剂，敲除或沉默RNF130的试剂，特异性与RNF130结合的结合分子(如抗体或配体)，等等。在更具体的方式中，所述的下调剂包括但不限于：DC-Gonib32，针对RNF130的CRISPR基因编辑试剂，特异性干扰RNF130的编码基因表达的干扰分子，针对RNF130或其效应分子的同源重组试剂或定点突变试剂，所述同源重组试剂或定点突变试剂将RNF130进行功能丧失性突变。
在得知了所述RNF130或其编码基因的下调剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的下调剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物或人。
优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将RNF130的下调剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带RNF130的下调剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或siRNA)递送到靶点上，并使之表达活性的RNF130下调剂，具体情况需视所述的下调剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。
本发明所述的RNF130或其编码基因的下调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的RNF130或其编码基因的下调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W2/3)/10,000。式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解的是，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。
本发明还提供了含有所述的药物组合物或直接含有所述的RNF130或其编码基因的下调剂的药盒。此外，所述的药盒中还可包括说明药盒中药物的使用方法的说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、CD4+T细胞中E3泛素连接酶RNF130对肥胖相关自身免疫性疾病的调节作用
1.1.RNF130调节CD4+T细胞NF-AT信号通路的活化
实验方法：
利用8-10周龄野生型(wild-type,WT)和T细胞特异性敲除RNF130(利用同源重组结合Cre-LoxP技术去除环指蛋白130基因第三个外显子，进而导致基因功能丧失)的小鼠(RNF130-TKO)，分离CD4+T细胞，然后利用抗CD3/CD28抗体或PMA/ionomycin刺激(促进T细胞的增殖)或不刺激，以及分离WT和RNF130-TKO正常饮食和高脂饮食的小鼠的CD4+T细胞，同样利用PMA/ionomycin刺激或不刺激，利用蛋白免疫印记技术(Western Blot)检测细胞内信号转导的情况。
实验结果：
如图1A和图1B所示，CD4+T细胞在抗CD3/CD28抗体或者PMA/ionomycin刺激下，RNF130缺失后并不影响大多数的信号分子的活化，而只有NF-AT入核水平显著被抑制，说明RNF130对于CD4+T细胞中NF-AT信号通路的活化至关重要。
1.2.RNF130调节USP9X和CaN的泛素化修饰
实验方法：
利用8-10周龄野生型(wild-type,WT)和T细胞特异性敲除RNF130的小鼠(RNF130-TKO)，分离CD4+T细胞，随后用抗CD3/CD28抗体刺激或不刺激，并收集细胞裂解液，然后利用蛋白免疫印记技术(Western Blot)检测去泛素化酶USP9X、钙调磷酸酶CaN的泛素化修饰情况，以及CaN与USP9X和NF-AT信号蛋白的结合情况。
实验结果：
如图1C-1E所示，RNF130缺失后显著抑制了抗CD3/CD28抗体刺激诱导的USP9X的泛素化，说明RNF130对于CD4+T细胞中USP9X具有活化作用。进一步地，RNF130缺失也抑制了抗CD3/CD28抗体刺激诱导的CaN的去泛素化。对应地，RNF130缺失抑制了CaN与USP9X和NF-AT信号蛋白的结合。
这些结果解释了RNF130缺失导致NF-AT信号被抑制的原因。
1.3.RNF130对CD4+T细胞的增殖的调节作用
实验方法：
利用8-10周龄野生型(wild-type,WT)和T细胞特异性敲除RNF130的小鼠(RNF130-TKO)，分离CD4+T细胞，随后将细胞铺在没有包被或有包被不同浓度的抗CD3/CD28抗体的96孔板中，刺激72小时，在培养结束前16小时加入3H标记的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(3H-thymidine，加入后终浓度为5μCi/mL)。培养结束后用抽滤法将细胞收集至玻璃纤维膜上，然后用液体闪烁仪检测3H的掺入情况，检测细胞的增殖情况。
实验结果：
如图1F所示，RNF130缺失后显著抑制了抗CD3/CD28抗体刺激的CD4+T细胞的增殖。
1.4.高脂饮食诱导的肥胖对CD4+T细胞中RNF130的表达影响
实验方法：
将小鼠从6-8周开始喂养高脂饲料约4个月左右，小鼠体重显著增加，称为高脂饮食小鼠(high fat diet,HFD)。同时设置正常饮食的小鼠，年龄、性别与高脂饮食小鼠一致，称为正常饮食小鼠(normal diet,ND)。将上述两组小鼠脱颈椎处死后取其脾脏和淋巴结，研磨得到单细胞悬液，然后使用CD4+T细胞分离试剂盒，获得CD4+T细胞，利用免疫荧光技术检测两组小鼠CD4+T细胞中RNF130的表达情况。
实验结果：
如图2A，图2B所示，高脂饮食小鼠的CD4+T细胞中RNF130蛋白的表达增强，说明肥胖可以诱导CD4+T细胞中RNF130蛋白水平的表达。
1.5.RNF130调节了肥胖诱导的CD4+T细胞糖酵解代谢
实验方法：
利用野生型(wild-type,WT)和T细胞特异性敲除RNF130的小鼠(RNF130-TKO)的正常饮食和高脂饮食小鼠，分离CD4+T细胞，利用PMA/ionomycin(P/I)刺激或不刺激，然后采用蛋白免疫印记技术(Western Blot)检测细胞内信号转导的情况。此外，将分离的CD4+T细胞铺在包被有抗CD3/CD28抗体的96孔板中，刺激24小时后，利用seahorse检测细胞的糖酵解水平。
实验结果：
如图2C所示，高脂饮食小鼠的CD4+T细胞在抗CD3/CD28抗体刺激下，NF-AT的活化显著升高，而RNF130缺失后则抑制了高脂诱导的NF-AT信号活化的升高，说明RNF130调控了高脂诱导的CD4+T细胞中NF-AT信号的活化。由于NF-AT信号对于CD4+T细胞的糖酵解(Glycolysis)代谢至关重要，本发明人进一步检测了细胞的糖酵解水平的变化。与NF-AT信号的改变一致的是，如图2D、图2E所示，高脂饮食小鼠的CD4+T细胞在抗CD3/CD28抗体刺激下，糖酵解水平显著升高，而RNF130缺失后则抑制了高脂诱导的糖酵解水平的升高，说明RNF130调控了CD4+T细胞中肥胖诱导的糖酵解代谢水平。
1.6.CD4+T细胞中RNF130对肥胖相关的自身免疫性疾病的调节作用
实验方法：
利用野生型(wild-type,WT)和T细胞特异性敲除RNF130(RNF130-TKO)的正常饮食(normal diet,ND)和高脂饮食(High-fat diet,HFD)小鼠，分离CD4+T细胞并静脉注射至BM12/SJL小鼠(该小鼠购自Jackson Lab，其MHC II分子较传统C57BL/6小鼠的相比有三个氨基酸发生突变)中，诱导系统性自身免疫炎症模型。具体如下，分上述四组的CD4+T细胞，然后分别将7.5×106的细胞静脉注射至BM12/SJL小鼠中，同天需采血，收集血清，随后每周需采一次血，收集血清。3周后，处死小鼠，取脾脏制备单细胞悬液，用流式细胞术检测滤泡样辅助性T细胞(Tfh)、生发中心B细胞(GC B)以及浆细胞(plasma cell)的比例。取小鼠肾脏，OCT包埋并进行冷冻切片，切片后利用免疫荧光检测抗鼠IgG的含量。利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清中抗双链DNA抗体、抗单链DNA抗体和抗组蛋白抗体的含量以及用Hep-2抗核抗体检测试剂盒(Hep-2 ANA Kits)检测血清中的抗核抗体。
实验结果：
如图3A-图3C所示，WT高脂饮食小鼠CD4+T细胞诱导的自身免疫性炎症的发病更严重。主要表现在脾脏中含有更高比例的滤泡样辅助性T细胞(Tfh)、生发中心B细胞(GC B)以及浆细胞(plasma cell)以及抗核抗体，抗双链DNA抗体、抗单链DNA抗体和抗组蛋白抗体的含量。而T细胞特异性敲除RNF130的高脂饮食小鼠组的自身免疫性炎症发病并没有加重。
这些实验结果进一步明确了T细胞中的RNF130在调节肥胖相关的自身免疫性疾病的关键作用。
实施例2、小分子化合物DC-Gonib32与RNF130蛋白的相互作用
2.1.表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)分析DC-Gonib32与RNF130蛋白结合情况
实验方法：
SPR实验在Biacore T200(GE Healthcare)上进行，缓冲液为HBS(10mM HEPES[pH7.4]、150mM NaCl)。在10mM醋酸钠(pH 4.5)的条件下，通过标准氨基偶联程序，将RNF130蛋白(aa28～304)共价偶联在CM5芯片上。将DC-Gonib32用HBS缓冲液逐级稀释后以30μl/min的流速进样120秒，解离120秒，记录该过程中响应信号随时间的变化。实验结束后用Biacore T200evaluation软件(GE Healthcare)中稳态分析模块，计算DC-Gonib32与RNF130蛋白的平衡解离常数(KD值)。
实验结果：
如图4A所示，SPR实验表明小分子化合物DC-Gonib32与RNF130蛋白发生直接结合，其平衡解离常数(KD值)为1.37μM。
2.2.细胞内热迁移实验(Cellular Thermal Shift Assay,CETSA)分析DC-Gonib32与RNF130蛋白结合情况
实验方法：
HEK293T细胞转染Flag-RNF130质粒24小时后，弃去细胞培养液上清，用PBS缓冲液洗涤细胞两次后，收集细胞并用RIPA裂解缓裂解细胞，超声并离心后收集细胞裂解液。将细胞裂解液一分为二，一份加入DMSO孵育，另一份加入小分子化合物DC-Gonib32孵育，孵育时间为30分钟。孵育结束后，将细胞裂解液平均分配到11个0.2mL PCR管中(每管约80ul)。其中一份作为Input对照，不需要放入PCR仪器中进行变性。剩余10份样品在PCR仪器(Eppendorf)上梯度升温(50.5～69.5℃)变性3分钟。变性结束后，将样品12000g离心3分钟后，收集上清进行蛋白质印迹分析RNF130蛋白含量。
实验结果：
如图4B所示，CETSA实验表明，小分子化合物DC-Gonib32作用后，在51.7℃至68.3℃的变性温度下可溶性RNF130蛋白的含量显著升高。该结果提示，DC-Gonib32可以使RNF130蛋白热稳定性增加，说明DC-Gonib32可以直接和RNF130蛋白结合。
实施例3、小分子化合物DC-Gonib32对细胞凋亡和活力分析
3.1.细胞凋亡分析
实验方法：
利用8-10周龄WT小鼠，分离小鼠的脾脏和淋巴结，获得CD4+T细胞，将细胞铺在包被有抗CD3和抗CD28抗体的96孔板中，同时加入DMSO或利用DMSO溶解的不同浓度的小分子化合物DC-Gonib32，24小时后，利用凋亡检测试剂盒分析细胞的凋亡。
实验结果：
如图5A和图5B所示，小分子化合物DC-Gonib32在1μM及以下浓度处理CD4+T细胞时，没有表现出明显的细胞凋亡，在其浓度达到2μM时，细胞出现轻微的凋亡，而直到DC-Gonib32在4μM的浓度处理CD4+T细胞时，细胞才出现明显的凋亡现象。
3.2.细胞活力分析
实验方法：
利用8-10周龄WT小鼠，分离CD4+T细胞，随后将细胞铺在包被有抗CD3和抗CD28抗体的96孔板中，同时加入DMSO或不同浓度的小分子化合物DC-Gonib32，24小时后，利用CellCounting Kit-8(CCK-8)试剂盒分析细胞的活力。
实验结果：
如图5C所示，小分子化合物DC-Gonib32在1μM及以下的浓度处理CD4+T细胞时，细胞表现出与对照DMSO组同等的活力。
实施例4、小分子化合物DC-Gonib32对CD4+T细胞糖酵解、增殖与信号的调节
4.1.小分子化合物DC-Gonib32对CD4+T细胞中RNF130蛋白表达的影响
实验方法：
分离正常饮食成年小鼠CD4+T细胞，利用溶剂DMSO或小分子化合物DC-Gonib32处理细胞12h，然后利用免疫荧光技术检测两组细胞中RNF130的表达情况。
实验结果：
如图6A和图6B所示，小分子化合物DC-Gonib32处理CD4+T细胞后，RNF130的蛋白表达水平并没有显著的变化，说明小分子化合物DC-Gonib32并不影响CD4+T细胞中RNF130的蛋白表达。
4.2.小分子化合物DC-Gonib32对RNF130功能活性的抑制作用
实验方法：
利用8-10周龄野生型小鼠，分离CD4+T细胞，利用DC-Gonib32或同等体积的DMSO预处理细胞4个小时，然后利用PMA/ionomycin或抗CD3/CD28抗体刺激或不刺激，利用蛋白免疫印记技术检测细胞内USP9X和CaN的泛素化、CaN与USP9X及NF-AT信号分子的结合、以及NF-AT信号活化的情况。
实验结果：
如图7A-7E所示，CD4+T细胞在PMA/ionomycin或抗CD3/CD28抗体刺激后，USP9X的泛素化修饰显著增强，而小分子化合物DC-Gonib32处理后则完全抑制了PMA/ionomycin或抗CD3/CD28抗体诱导的USP9X泛素化，进而导致PMA/ionomycin诱导的CaN去泛素化修饰被抑制，表现出与RNF130缺失同样的效应，说明DC-Gonib32处理确实可以完全抑制CD4+T细胞中RNF130的生物学功能。对应的，DC-Gonib32处理后显著抑制了CaN与USP9X及NF-AT信号分子的结合，从而抑制了PMA/ionomycin诱导的NF-AT信号的活化。
4.3.小分子化合物DC-Gonib32抑制了肥胖诱导的糖酵解代谢
实验方法：
利用正常饮食瘦(Lean,LN)和高脂饮食诱导的肥胖(Obese,OB)小鼠，分离CD4+T细胞，随后将细胞铺在包被有抗CD3/CD28抗体的96孔板中，同时加入RNF130抑制剂DC-Gonib32或同等体积的DMSO，刺激24小时后，利用seahorse检测细胞的糖酵解水平，或利用实时定量PCR方法检测细胞中糖酵解相关基因的表达情况。
实验结果：
如图8A-8C所示，OB小鼠的CD4+T细胞在抗CD3/CD28抗体刺激条件下糖酵解得到了显著的提高，而小分子化合物DC-Gonib32则抑制了肥胖诱导的CD4+T细胞糖酵解的提高，使得LN小鼠的CD4+T细胞与OB小鼠的CD4+T细胞的糖酵解没有区别，表现为糖酵解的ECAR水平与相关基因的表达都被显著抑制。
4.4.小分子化合物DC-Gonib32对CD4+T细胞的增殖的调节作用
实验方法：
利用正常饮食瘦(Lean,LN)和高脂饮食诱导的肥胖(Obese,OB)小鼠，分离CD4+T细胞，将细胞标记CFSE，随后将细胞铺在包被有抗CD3和抗CD28抗体的96孔板中，同时加入不同浓度的RNF130抑制剂DC-Gonib32或同等体积的DMSO，刺激72小时后，利用流式细胞术检测细胞的增殖情况。
实验结果：
如图9A和图9B所示，小分子化合物DC-Gonib32显著抑制了的CD4+T细胞的增殖，随着药物的浓度的升高，对CD4+T细胞增殖的抑制作用越强。此外，如图9C和图9D所示，OB小鼠的CD4+T细胞的增殖能力也得到了显著的提升，而DC-Gonib32则抑制了肥胖引起的T细胞增殖的提升，使得OB小鼠的CD4+T细胞与LN小鼠的CD4+T细胞的增殖没有区别。
4.5.小分子化合物DC-Gonib32对肥胖相关的自身免疫性疾病的调节作用
实验方法：
取正常饮食瘦(Lean,LN)和高脂饮食诱导的肥胖(Obese,OB)小鼠，分离获取7.5×106的CD4+T细胞静脉注射至BM12/SJL小鼠体内诱导系统性自身免疫性疾病模型。对诱导的自身免疫性疾病模型分为三组，分别为：①LN小鼠CD4+T细胞诱导，注射溶剂(5％DMSO+生理盐水)组；②OB小鼠CD4+T细胞诱导，注射溶剂组；③OB小鼠CD4+T细胞诱导，注射DC-Gonib32组。溶剂和小分子抑制剂从模型诱导第一天开始注射，50mg/kg每天注射一次。每周采集血样，收集血清。利用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清中抗双链DNA抗体、抗单链DNA抗体和抗组蛋白抗体的含量以及Hep-2抗核抗体检测试剂盒(Hep-2 ANA Kits)检测血清中的抗核抗体。诱导模型3周后，处死小鼠，取小鼠肾脏OCT包埋并进行冷冻切片，切片后利用免疫荧光检测抗鼠IgG抗体的含量。
实验结果：
如图10A-图10C所示，在上述几组CD4+T细胞免疫后的自身免疫性疾病模型中，OB小鼠注射溶剂组的发病较LN小鼠注射溶剂组显示出更严重自身免疫性症状，主要表现在血清中有更高水平的抗双链DNA、抗单链DNA和抗组蛋白抗体以及抗核抗体，且肾脏中有更多的IgG沉积。而在OB小鼠注射DC-Gonib32组中，DC-Gonib32治疗显著抑制了OB小鼠来源的CD4+T细胞诱导的自身免疫性炎症的发病，主要表现为血清中抗双链DNA、抗单链DNA、抗组蛋白和抗核抗体的含量的降低，以及肾脏中IgG沉积的显著减少。
实施例5、小分子化合物DC-Gonib32对老年个体来源CD4+T细胞诱导自身免疫性疾病的抑制作用
实验方法：
利用8-10周年青(Young)和13月老年(Aged)小鼠，分离获取7.5×106的CD4+T细胞静脉注射至BM12/SJL小鼠体内诱导系统性自身免疫性疾病模型。对诱导的自身免疫性疾病模型分为四组，分别为：①Young小鼠CD4+T细胞诱导，注射溶剂(5％DMSO+生理盐水)组；②Aged小鼠CD4+T细胞诱导，注射溶剂组；③Aged小鼠CD4+T细胞诱导，注射DC-Gonib32组；③Aged小鼠CD4+T细胞诱导，注射糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose,2-DG)组。溶剂和小分子抑制剂从模型诱导第一天开始注射，50mg/kg每天注射一次。每周采集血样，收集血清。利用Hep-2抗核抗体检测试剂盒(Hep-2 ANA Kits)检测血清中的抗核抗体。诱导模型3周后，处死小鼠，取小鼠肾脏OCT包埋并进行冷冻切片，切片后利用免疫荧光检测抗鼠IgG抗体的含量。
实验结果：
如图11A和图11B所示，在上述几组CD4+T细胞免疫后的自身免疫性疾病模型中，Aged小鼠注射溶剂组的发病较Young小鼠注射溶剂组显示出更严重自身免疫性症状，主要表现在血清中有更高水平的抗核抗体，且肾脏中有更多的IgG沉积。而在Aged小鼠注射DC-Gonib32组或注射2-DG组中，这两种化合物都显著抑制了Aged小鼠来源的CD4+T细胞诱导的自身免疫性炎症的发病，主要表现为血清中抗核抗体的含量的降低，以及肾脏中IgG沉积的显著减少。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (12)

1.环指蛋白130的应用，用于作为缓解或治疗自身免疫性疾病的靶标；或，作为筛选缓解或治疗自身免疫性疾病的药物的靶标。
2.环指蛋白130的下调剂的应用，用于制备缓解或治疗自身免疫性疾病的组合物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的组合物还用于包括以下方面：
抑制CD4+T细胞的增殖；
降低高脂诱导的糖酵解水平；
减少血清中抗双链DNA、抗单链DNA、抗组蛋白或抗核抗体的含量；
减少肾脏中IgG沉积；
降低CD4+T细胞中NF-AT入核水平，或抑制NF-AT信号；
抑制USP9X的泛素化；和/或，
抑制CaN的去泛素化。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述环指蛋白130的下调剂包括：下调环指蛋白130活性的物质，减少环指蛋白130有效作用时间、下调环指蛋白130的表达、或稳定性的物质。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述下调剂包括选自：
针对环指蛋白130的化学小分子拮抗剂或抑制剂；
干扰或敲除环指蛋白130的试剂；
特异性与环指蛋白130结合的结合分子；或
干扰环指蛋白130与效应分子的相互作用的试剂。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述针对环指蛋白130的化学小分子拮抗剂或抑制剂包括DC-Gonib32：1-[(1-丁基-1H-1,2,3,4-四唑-5-基)甲基]-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶，或其盐、水合物、异构体、类似物或衍生物。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述干扰或敲除环指蛋白130的试剂包括(但不限于)：
特异性干扰环指蛋白130的编码基因表达的干扰分子；
针对环指蛋白130的基因编辑试剂；
针对环指蛋白130的同源重组试剂或定点突变试剂；
较佳地，所述基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂将环指蛋白130进行功能丧失性突变，如靶向于其关键结构域进行功能丧失性突变；更佳地，所述同源重组试剂为结合Cre-LoxP技术去除环指蛋白130基因第三个外显子、进而导致基因功能丧失的试剂。
8.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的自身免疫性疾病是以CD4+T细胞过度增殖与活化为特征(由CD4+T细胞过度增殖与活化诱导)的自身免疫性疾病。
9.一种用于缓解或治疗自身免疫性疾病的药物组合物或药盒，包括：环指蛋白130的下调剂；
较佳地，所述下调剂为针对环指蛋白130的化学小分子拮抗剂或抑制剂，包括DC-Gonib32：1-[(1-丁基-1H-1,2,3,4-四唑-5-基)甲基]-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶，或其盐、水合物、异构体、类似物或衍生物；
较佳地，所述下调剂为基因敲除试剂，其敲除环指蛋白130基因第三个外显子以导致基因功能丧失。
10.一种筛选缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质的方法，所述方法包括：
(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达环指蛋白130；和
(2)检测所述体系中环指蛋白130的表达或活性；若所述候选物质在统计学上下调环指蛋白130的表达或活性，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(2)中或之后，还包括选自下组的检测筛选：
(a)检测候选物质对于CD4+T细胞的增殖的影响作用，若CD4+T细胞的增殖显著降低，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；
(b)检测候选物质对于高脂诱导的糖酵解水平的影响作用，若糖酵解水平显著降低，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；
(c)检测候选物质对于血清(如动物模型的血清)中抗双链DNA、抗单链DNA、抗组蛋白或抗核抗体的含量的影响作用，若含量显著降低，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；
(d)检测候选物质对于肾脏中IgG沉积的影响作用，若IgG沉积显著降低，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；
(e)检测候选物质对于CD4+T细胞中NF-AT入核水平或NF-AT信号的影响作用，若显著降低，则该候选物质是缓解或治疗的自身免疫性疾病的潜在物质；
(f)检测候选物质对于USP9X的泛素化的影响作用，若显著降低其泛素化，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质；和/或
(g)检测候选物质对于CaN的去泛素化的影响作用，若显著降低其去泛素化，则该候选物质是缓解或治疗自身免疫性疾病的潜在物质。
12.一种制备环指蛋白130的化学小分子抑制剂1-[(1-丁基-1H-1,2,3,4-四唑-5-基)甲基]-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶的方法，包括：
(1)1-溴-2,4,6-三甲氧基苯(1)在干燥四氢呋喃(THF)中，经碘的活化，再与镁相互作用，得到中间产物；
(2)将(1)的中间产物与酮类化合物
Figure FDA0003364981850000031
加成反应得到中间产物；
(3)将(2)的中间产物在TFA作用下脱水得到中间产物；
(4)将(3)的中间产物在碱性条件下与
Figure FDA0003364981850000041
经亲核取代反应得到最终产物1-[(1-丁基-1H-1,2,3,4-四唑-5-基)甲基]-4-(2,4,6-三甲氧基苯基)-1,2,3,6-四氢吡啶；
较佳地，
Figure FDA0003364981850000042
由N-丁基-氯乙酰胺在PCl3及NaN3作用下获得。/>
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