CN116139139A - 富马酸卢帕他定在制备抑制分枝杆菌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及富马酸卢帕他定在制备抑制分枝杆菌药物中的应用，本发明首次发现商品化的第二代H1‑抗组胺剂富马酸卢帕他定对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌均表现出优良的抑制作用，最小抑菌浓度达4μg/mL，并且与现有的抗生素如普托马尼(PA824)、氯法齐明、TB47等具有协同抑制分枝杆菌活性的作用。

Description

富马酸卢帕他定在制备抑制分枝杆菌药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及富马酸卢帕他定在制备抑制分枝杆菌药物中的应用。
背景技术
过敏性鼻炎是一种高度流行和世界范围内常见的疾病，至少影响全球10-25％的普通人群，会影响患者的社会生活，且治疗费用巨大。组胺在过敏性鼻炎的发病机制中起着重要作用，主要是通过组胺H1受体发挥作用。血小板活化因子(Platelet-ActivatingFactor，PAF)是另一种重要的炎症因子，组胺和PAF在不同组织和细胞内促进彼此的释放。富马酸卢帕他定(Rupatadine Fumarate，简称RTF，化学结构见图1)，是一种已经商品化的第二代H1-抗组胺剂，临床大多数药物是通过单一抑制一种炎症因子，而RTF同时对组胺H1和PAF受体具有双重亲和力，它适用于12岁及以上患者的季节性变应性鼻炎(SAR)、常年性变应原性鼻炎(PAR)和慢性特发性荨麻疹(CIU)，该药起效快并且作用时间长。第一代H1-抗组胺剂能够引起嗜睡、疲劳、头痛、记忆和学习障碍和视力障碍等副作用，但服用RTF并不会引起这些副作用。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)是分枝杆菌属中致病力最强的一种菌，是引起结核病的病原菌。人类开始研究Mtb已经有一个世纪之久，但是想要彻底根除这种病原菌依旧很困难，尤其是随着抗生素的不规范使用或滥用，使耐药突变株的出现和传播让这种困境变得更加复杂化，传统有效的治疗方案也失去了效力。因此目前治疗结核病最首要的任务就是筛选更加有效的抗Mtb药物，其中老药新用可能是最切实可行的方案，由于这些药物已经在临床上用于治疗其他疾病，这样就可以大大缩短成为抗商品化抗结核病药物的时间。除了Mtb外，约150种非结核分枝杆菌(Non-tuberculousmycobacteria，NTM)也普遍存在，比Mtb的毒性小，是一类条件致病菌，可导致成人肺部疾病和皮肤感染以及儿童颈部淋巴结炎等疾病。NTM的特点是薄薄的肽聚糖层外有一层厚的富含脂质的外层，使NTM能够附着在粗糙的表面上，并对抗生素和消毒剂具有抵抗力，有助于NTM在低氧以及其他不利条件下存活。同时，许多NTM，比如像脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessum，Mab)具有天然耐药性，因此对临床药物具有天然抗性，使NTM的治疗变得棘手，有效药物的筛选和开发是目前面临的最大问题。
发明内容
针对现有技术抗分枝杆菌药物筛选存在的问题，本发明目的在于提供富马酸卢帕他定在制备抑制分枝杆菌药物中的应用，富马酸卢帕他定对分枝杆菌表现出良好的抑制作用，同时与现有抗生素等药物对分枝杆菌具有协同抑制作用。
基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供富马酸卢帕他定在制备抑制分枝杆菌药物中的应用。
本发明首次发现商品化的第二代H1-抗组胺剂富马酸卢帕他定表现出对分枝杆菌尤其是结核分枝杆菌优良的抑制作用，表明RTF作为活性药物，在抗结核分枝杆菌和抗非结核分枝杆菌的药物研发过程中具有较高的应用潜力。
优选地，分枝杆菌包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和非结核分枝杆菌；所述非结核分枝杆菌包括海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessum)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。
优选地，结核分枝杆菌为Mtb H37Ra。
优选地，富马酸卢帕他定对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessum)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的最低抑菌浓度依次为4μg/mL、8μg/mL、32μg/mL和16μg/mL。
第二方面，本发明提供一种抑制分枝杆菌的药物，所述药物包含富马酸卢帕他定。
优选地，分枝杆菌包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和非结核分枝杆菌；所述非结核分枝杆菌包括海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessum)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。
优选地，药物还包括普托马尼(PA824)、氯法齐明、TB47中的一种。
优选地，富马酸卢帕他定与普托马尼、氯法齐明或TB47对抗分枝杆菌具有部分协同作用。
第三方面，本发明提供上述药物在制备治疗结核病药物中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明首次发现商品化的第二代H1-抗组胺剂富马酸卢帕他定对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌均表现出优良的抑制作用，最小抑菌浓度达4μg/mL，并且与现有的抗生素如普托马尼、氯法齐明、TB47等具有协同抑制分枝杆菌活性的作用。
附图说明
图1为富马酸卢帕他定的化学结构式；
图2为富马酸卢帕他定抗Mtb H37Ra的活性曲线；
图3为富马酸卢帕他定抗Mtb H37Rv的活性曲线；
图4为肺组织研磨液发光值变化柱形图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
实验一从抗过敏药物库中筛选具有抗结核分枝杆菌Mtb H37Ra活性的药物实验步骤如下：
利用二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解抗过敏药化合物库中的化合物，配置成浓度为10mg/mL的母液，然后利用DMSO将其稀释至5mg/mL、0.5mg/mL和0.05mg/mL。本实验室之前成功构建了无抗性标记的自主发光Mtb H37Ra(Autoluminescent MtbH37Ra，简称AlRa)，经过实验验证自主发光菌的生长趋势以及对各种临床药物的敏感性与不发光的野生型分枝杆菌一致，所以构建AlRa可以用作抗菌活性化合物的筛选。从平板上挑取单菌落使用发光检测仪检测相对光单位(Relative Light Unit，简称RLU)，将确认发光的单菌落接入5mL 7H9液体培养基(加吐温80)培养。当200μL菌液的RLU达到106时，用7H9液体培养基(无吐温80)稀释菌液，使200μL稀释菌液的RLU在3000-5000的范围内。将4μL药液和196μL稀释好的AlRa加入到96孔板中，所以RTF等药物的终浓度为100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL。同时设置阳性对照(利福平)和阴性对照组(DMSO)，每个浓度做3个平行。将96孔板放置在37℃恒温箱中，在第5天利用发光检测仪检测发光值。MIC定义为能够使发光值降低至DMSO对照组发光值的10％以下的最小化合物浓度。
初步筛选到MIC在1-10μg/mL之间的RTF。然后再将RTF和富马酸盐母液均稀释至0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL和0.05mg/mL。将4μL药液和196μL稀释好的AlRa加入到同一个灭过菌的1.5mL EP管中，RTF和富马酸盐的最终浓度均对应为32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL和2μg/mL，同时设置利福平(Rifampicin，简称RIF)阳性对照和阴性对照组(DMSO)，每个浓度做3个平行。将EP管放置在37℃恒温箱中，在第0、1、3和5天利用发光检测仪检测发光。
实验结果如图2所示，结果可知，RTF抗Mtb H37Ra的MIC为4μg/mL，同时检测到富马酸盐并没有杀菌或抑菌活性，可见RTF中起到杀菌或抑菌活性的为卢帕他定，所以卢帕他定抗Mtb H37Ra的MIC为3.13μg/mL，表现为明显的抑菌活性，具有一定的应用前景。
实验二RTF抗分枝杆菌活性的检测
试验所用分枝杆菌种类如下：
海分枝杆菌(Mycobacterium marinum，Mm)、脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessum，Mab)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis，Ms)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum，Mf)。
实验步骤如下：
本实验室之前成功构建了无抗性标记的自主发光菌Mab、Ms、Mm，经过实验验证自主发光菌的生长趋势以及对各种临床药物的敏感性与不发光的野生型分枝杆菌一致，所以构建的自主发光菌可以用作抗菌活性化合物的筛选。从平板上挑取单菌落使用发光检测仪检测RLU，将确认发光的单菌落接入5mL7H9液体培养基(加吐温80)培养。当200μL菌液的RLU值为107时，用7H9液体培养基(无吐温80)稀释菌液。利用DMSO将浓度为10mg/mL的RTF和富马酸盐母液均稀释至6.4mg/mL、3.2mg/mL、1.6mg/mL、0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL和0.05mg/mL。将4μL药液和196μL稀释好的分枝杆菌菌液加入到同一个无菌1.5mLEP管中，所以最后RTF和富马酸盐的浓度均为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL。同时设置阳性对照(Ms的阳性对照是利奈唑胺，Mab和Mm的阳性对照是克拉霉素)和阴性对照组(DMSO)，每个浓度做3个平行。将EP管放置在37℃恒温箱中，在不同时间点利用发光检测仪检测发光。MIC定义为能够使发光值降低至DMSO对照组发光值的10％以下的最小化合物浓度。
目前实验室没有构建自主发光Mf，所以从平板上挑取Mf单菌落转接到5mL7H9液体培养基(加吐温80)培养；当菌液的OD600达到0.8左右时，用7H9液体培养基(不加吐温80)稀释菌液1000倍；将RTF和富马酸盐母液(50mg/mL)稀释至0.256mg/mL，在透明96孔板的第二列加入200μL浓度为0.256mg/mL的RTF溶液，第三至十一列加入100μL培养基，然后利用二倍稀释法从第二列稀释至第十列，最后每列加入100μL稀释好的菌液。第二列至第十列的RTF药物浓度对应为128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL和0.5μg/mL。第十一列为只加菌的对照。四周加入100μL培养基，防止污染。将96孔板放置在37℃恒温箱中培养3天后观察结果。将肉眼观察不到细菌生长的孔对应的最低浓度定义为RTF的MIC。
实验结果如表1所示，RTF抗Mm、Mab、Mf和Ms的MIC分别为8μg/mL、32μg/mL、128μg/mL和16μg/mL，检测到富马酸盐并没有杀菌或抑菌活性，故而富马酸盐卢帕他定中起到杀菌或抑菌作用的为卢帕他定，经换算，卢帕他定抗Mm、Mab、Mf和Ms的MIC分别为6.25μg/mL、25.02μg/mL、100.08μg/mL和12.51μg/mL，说明RTF作为活性药物，在抗非结核分枝杆菌药物研发过程中具有一定潜力。
表1 RTF抗分枝杆菌活性汇总表
中文名称 学名 MIC(μg/mL)
海分枝杆菌 Mycobacterium marinum 8
脓肿分枝杆菌 Mycobacterium abscessum 32
偶发分枝杆菌 Mycobacterium fortuitum 128
耻垢分枝杆菌 Mycobacterium smegmatis 16
实验三RTF与抗结核分枝杆菌药物组合活性的检测
实验步骤如下：
从平板上挑取AlRa单菌落，使用发光检测仪检测RLU，将确认发光的单菌落接入5mL 7H9液体培养基(加吐温80)培养，加入玻璃珠打散；当200μL菌液的RLU达到106时，用7H9液体培养基(无吐温80)稀释菌液，使200μL稀释菌液的RLU在3000-5000的范围内。用DMSO将RTF和选择的9种具有抗结核活性的药物二倍稀释，每种药物共准备6个不同浓度。不透明96孔板B2-G2～B7-G7共6列加入不同浓度的RTF(浓度从高到低，每列加入相同浓度的RTF溶液)，B2-B7～G2-G7共6行加入不同浓度的具有抗结核活性的药物(浓度从高到底，每行药物浓度相同)。最后每个孔共加入4μL药物和196μL稀释好的待测菌液。同时设置阳性对照(利福平)和阴性对照(DMSO)，37℃培养7天后利用荧光照度计检测RLU，根据所得数据进行分析，判断RTF和9种具有抗结核活性的药物是否具有组合活性。
实验结果如表2所示，RTF与普托马尼、氯法齐明和TB47的FICI分别为0.5625、0.75和0.75，说明RTF与这三种药物具有部分协同作用；而与剩余的6种药物的FICI均大于或等于1，说明两种药物之间是相加或无关作用。说明RTF可能成为抗结核分枝杆菌组合疗法的新选择。
表2 RTF与抗分枝杆菌药物组合活性汇总表
Figure SMS_1
a，RTF；b，抗分枝杆菌化合物；FICI，Fractional Inhibitory Concentration，分级抑菌浓度指数；FICI≤0.5，协同作用；0.5＜FICI＜1，部分协同作用；FICI＝1，相加作用；1＜FICI＜2，无关作用；FICI>2，拮抗作用。
实验四检测RTF抗结核分枝杆菌Mtb H37Rv活性
实验步骤如下：
本实验室之前成功构建了无抗性标记的自主发光Mtb H37Rv(AutoluminescentMtb H37Rv，简称AlRv)，经过实验验证自主发光菌的生长趋势以及对各种临床药物的敏感性与不发光的野生型分枝杆菌一致，所以构建的AlRv可以用作抗菌活性化合物的筛选。将AlRv转接到15mL 7H9(+吐温80)培养基中，放置在37℃恒温摇床中培养至当200μL菌液的RLUs达到106时，用7H9(无吐温80)培养基将其稀释成待测菌液(RLUs/200μL为3000-5000之间)。利用DMSO把RTF和富马酸盐母液(10mg/mL)稀释至0.8mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL和0.05mg/mL。将4μL药液和196μL稀释好的AlRv加入到同一个灭过菌的1.5mL EP管中，使RTF的终浓度为16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL，同时设置阳性对照(利福平，简称RIF)和阴性对照组(DMSO)，每个浓度做3个平行。将EP管放置在37℃恒温箱中，在第0、1、3和5天利用发光检测仪检测发光。
实验结果如图3所示，RTF抗Mtb H37Rv的MIC为4μg/mL，检测到富马酸盐并没有杀菌或抑菌活性，故而富马酸盐卢帕他定中起到杀菌或抑菌作用的为卢帕他定，经换算，卢帕他定抗Mtb H37Rv的MIC为3.13μg/mL，表现为明显的抑菌活性，具有一定的应用前景。
实验五检测RTF在小鼠体内抗Mtb H37Rv活性
实验过程如下：
无抗性标记的自主发光结核分枝杆菌H37Rv(UAlRv)，加入7H9液体培养基培养至OD600值达0.8-1.0且RLU/200μL为2×106；选取4-6周龄的雌性BALB/c小鼠，让其在实验室适应3天。取对数生长后期的UAlRv菌液采用气溶胶感染的方式感染小鼠，其特点是感染均一性非常好，且接近自然感染状态。感染后第16天后，检测小鼠活体发光值，随机分组，每组3只小鼠。准备好浓度为3.84mg/mL的RTF则对应的给药剂量为38.4mg/kg(卢帕他定的浓度为3mg/mL，给药剂量为30mg/kg)以及浓度为1mg/mL的利福平则对应的给药剂量为10mg/kg，灌胃给药5天(每只小鼠200μL/天)。D0和D5天杀小鼠，取肺于2mL的磷酸缓冲液中研磨，取200μL检测发光值。给药剂量和分组等信息如下表3所示。
表3
Figure SMS_2
Figure SMS_3
表4
Figure SMS_4
实验结果如表4所示，将肺组织悬液发光值的数据整理后，制成柱状图如图4所示，图中ns表示无统计学差异；*表示p<0.05；卢帕他定和利福平给药剂量(mg/kg)分别为30mg/kg和10mg/kg。
由表3和表4结果可知，给药5天后卢帕他定治疗组肺组织研磨液的发光值显著低于溶剂组，同时与利福平阳性对照组的发光值无明显差异，说明卢帕他定在体内能够有效抑制Mtb H37Rv的生长。给药剂量为30mg/kg的卢帕他定与给药剂量为10mg/kg的利福平在体内抗Mtb H37Rv的活性相当，具有一定的应用前景。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.富马酸卢帕他定在制备抑制分枝杆菌药物中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述分枝杆菌包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和非结核分枝杆菌；所述非结核分枝杆菌包括海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessum)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述结核分枝杆菌为Mtb H37Ra。
4.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述富马酸卢帕他定对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessum)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的最低抑菌浓度依次为4μg/mL、8μg/mL、32μg/mL和16μg/mL。
5.一种抑制分枝杆菌的药物，其特征在于，所述药物包含富马酸卢帕他定。
6.如权利要求5所述抑制分枝杆菌的药物，其特征在于，所述分枝杆菌包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和非结核分枝杆菌；所述非结核分枝杆菌包括海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessum)和耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。
7.如权利要求5所述抑制分枝杆菌的药物，其特征在于，所述药物还包括普托马尼、氯法齐明、TB47中的一种。
8.如权利要求7所述抑制分枝杆菌的药物，其特征在于，所述富马酸卢帕他定与普托马尼、氯法齐明或TB47对抗分枝杆菌具有部分协同作用。
9.权利要求5～8任一项所述药物在制备治疗结核病药物中的用途。
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