CN116120414A - 番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用 - Google Patents

番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116120414A
CN116120414A CN202310008452.3A CN202310008452A CN116120414A CN 116120414 A CN116120414 A CN 116120414A CN 202310008452 A CN202310008452 A CN 202310008452A CN 116120414 A CN116120414 A CN 116120414A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
slcsn5a
chloroplast
slcv
tomato
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310008452.3A
Other languages
English (en)
Inventor
刘玉凤
鹿嘉智
富宏丹
孙周平
齐明芳
李天来
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenyang Agricultural University
Original Assignee
Shenyang Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenyang Agricultural University filed Critical Shenyang Agricultural University
Priority to CN202310008452.3A priority Critical patent/CN116120414A/zh
Publication of CN116120414A publication Critical patent/CN116120414A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明提供了番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用，涉及生物学技术领域。所述应用包括(a)调控叶绿体内蛋白的泛素化水平或稳定性；(b)调控叶绿体囊泡化蛋白SlCV的泛素化水平或稳定性；(c)调控番茄对低温胁迫的响应。本发明发现LNT胁迫处理导致番茄叶片中SlPsbS蛋白丰度和NPQ水平下降，而SlCSN5A可与SlPsbS相互作用并促进其泛素化和降解，可用于调控叶绿体内SlPsbS蛋白及其他蛋白的泛素化水平或稳定性。此外，SlCSN5A还参与了CV介导的PsbS降解，并调控番茄对夜低温胁迫的响应。本发明揭示了SlCV和SlCSN5A共同介导的依赖于泛素化的叶绿体蛋白的降解途径。

Description

番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用
技术领域
本发明涉及生物学技术领域，尤其是涉及一种番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用。
背景技术
低温胁迫可以破坏几乎所有主要的光合作用成分，包括类囊体电子传递、碳固定、叶绿体形态和光抑制(Lu等，2020；Zhang等，2014；Liu等，2012)，这反过来又影响作物的产量和品质。
低温通过Calvin-Benson-Bassham(CBB)循环和其他耗能过程减缓NADPH和ATP的代谢消耗，导致ATP和NADPH在光反应结束时过度积累(Gan等，2019)。因此，低温破坏了氧化还原和能量动态平衡，并导致较高的光系统II(PSII)激发压力。植物已经进化出快速响应逆境的策略，例如，PSII可通过将多余的激发能量以热的形式耗散并通过非光化学猝灭(NPQ)减少向反应中心的能量转移来迅速保护(Gao等，2022；
Figure BDA0004036716300000011
等，2017)。NPQ被广泛认为是快速调节光捕获以保护PSII反应中心免受导致光抑制的主要因素(Ruban，2016；Demmig-Adams等，2014)。光保护机制的核心在于对跨膜pH梯度(ΔpH)的反应(Krishnan-Schmieden等，2021)。PsbS蛋白已被鉴定为植物NPQ激活的主要诱导蛋白，组成性的存在于类囊体膜上，是更大的LHC超家族的成员，但与该家族的所有其他蛋白不同的是，它不特异性地结合任何叶绿素或叶黄素色素(Li等，2000)。PsbS蛋白含有可质子化的氨基酸，可以感知来自ΔpH和类囊体腔酸化的信号并将信号传输到天线，从而能够通过天线-光系统重新排列切换到光保护状态(Ruban，2018；Sacharz等，2017)。PsbS蛋白在逆境下快速而短暂地积累，而长期或严重的胁迫会加速PsbS的降解(Redekop等，2020；Wang等，2018；Tibiletti等，2016；Redekop等，2020；Wang等，2018)。同时，PsbS突变植株的NPQ能力降低，更容易受到高光胁迫的影响(Acebron等，2021)。综上所述，PsbS蛋白的稳定性在植物对非生物胁迫的响应中起着重要作用。然而，目前对PsbS蛋白的降解机制仍知之甚少。
叶绿体对冷胁迫高度敏感，已被认为是低温的中心传感器和响应者(Gao等，2022)。在胁迫条件下，有效的光合作用和其他代谢反应需要整个受损的叶绿体及其特定成分的正常周转。因此，受损的叶绿体或其特定成分需要被有效降解，以确保正常的细胞功能(Yang等，2019)。最近的研究强调了泛素化与叶绿体相关蛋白降解的关系。在中等胁迫条件下，PPI1位点1(SP1)E3连接酶的抑制子与Omp85型桶通道蛋白SP2和细胞分裂周期48(CDC48A)相互作用，通过26S蛋白酶体介导叶绿体(TOC)复合体外膜转位蛋白的特定成分的降解，而在严重胁迫条件下，U-Box 4(PUB4)E3连接酶介导叶绿体膜蛋白的泛素化和随后受损的整个叶绿体的降解(Ling等，2019)。在最近的一项研究中，CDC48A及其辅助因子泛素融合降解1(UFD1)-核蛋白定位4(NPL4)参与了叶绿体内蛋白rbcL和AtpB的泛素化和降解(Li等，2022)。
COP9信号体(CSN)是一种进化上保守的多亚基蛋白质复合体，由8个亚基(CSN1-CSN8)组成(Singh等，2019)。CSN是一种金属蛋白酶，它能从Cullin环E3泛素连接酶(CRLS)复合体中切割共价连接的RUB1(Related Ubiquitin 1)/NEDD8(neural precursor cellexpressed,developmentally down-regulated 8)(Lyapina等，2001年；Schwechheimer等，2001)，并在蛋白质降解的泛素蛋白酶体途径中发挥作用(Barth等，2016)。这种催化活性位于CSN5亚基的JAMM(JAB1/MPN/Mov34金属酶，也称为MPN)基序中(Cope等，2002)。CSN5参与了广泛的生物过程(Jin等，2014)。在拟南芥中，CSN5由两个基因CSN5A和CSN5B编码(Jin等，2014)。csn5a突变体表现出生长、侧根形成、根毛形成和花大小的减少，而csn5b突变体没有表现出任何可检测到的生长异常，基本上与野生型无法区分(Gusmaroli等，2007)。当csn5a突变体显示出显著的neddylated CUL1积累时，csn5b在去除neddylation方面没有任何缺陷(Tomoda等，1999)。因此，在植物发育中起主要作用的是CSN5A，而不是CSN5B(Jin等，2014)。此外，CSN5通过调节生长素、茉莉酸和花青素的生物合成在植物的生物和非生物胁迫反应中发挥关键作用(Luo等，2021；Singh等，2019；Sang等，2019；Schwechheimer等，2001)。在高温胁迫下，拟南芥csn5a突变体表现出叶绿素含量、二氧化碳同化速率和光合作用活性的增加(Singh等，2019)。这些研究表明，CSN可能通过调节光合作用活性而参与植物对非生物胁迫的响应。然而，CSN5在低温胁迫下的作用及其与叶绿体蛋白稳定性的关系尚未见报道。
叶绿体内的蛋白质是如何泛素化的，这个问题仍然不明确。一种可能性是泛素化可能发生在叶绿体内部，但尚未在叶绿体中发现E3泛素连接酶。或者，叶绿体内的蛋白质在以未知的机制转运到叶绿体外后，被叶绿体外的E3泛素连接酶修饰(Li等，2022)。核编码的叶绿体囊泡(CV)蛋白参与了细胞器外的叶绿体降解。胁迫诱导的CV以叶绿体为靶标，并与定位于类囊体、基质和被膜中的蛋白质相互作用。这种相互作用导致光系统的不稳定和含有CV的囊泡(CCV)的形成，CCV将基质和类囊体蛋白转移到中央液泡进行降解(Wang和Blumwald，2014)。CV参与了叶绿体蛋白的外排，为叶绿体内蛋白与细胞质成分之间的接触提供了可能，但CV是否与叶绿体蛋白的泛素化有关？以及CV是否参与了胁迫条件下的光保护机制，目前还不清楚。番茄(Solanum Lycopersicum L)是世界上广泛种植的园艺作物，但其对低温胁迫的耐受性较差(Lu等，2021)。目前对于番茄在低温胁迫下的光保护机制相关的报道也很少。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的新应用。本发明揭示了SlCV和SlCSN5A共同介导的依赖于泛素化的叶绿体蛋白的降解途径，表明SlCV和SlCSN5A在调节非生物胁迫(特别是低温胁迫)下叶绿体蛋白稳定性方面发挥了关键作用，为叶绿体质量控制提供了一条潜在的新途径。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用，所述应用包括以下一个或多个方面：
(a)调控叶绿体内蛋白的泛素化水平或稳定性；
(b)调控叶绿体囊泡化蛋白SlCV的泛素化水平或稳定性；
(c)调控番茄对低温胁迫的响应。
本发明通过实验发现LNT胁迫处理导致番茄叶片中SlPsbS蛋白丰度和NPQ水平下降，而COP9信号体亚基5A(SlCSN5A)与SlPsbS相互作用，促进其泛素化和在细胞质中的降解。SlCSN5-RNAi植株在LNT胁迫下表现出更高的耐受性和SlPsbS蛋白的稳定性。因此，SlCSN5A可用于调控叶绿体内蛋白(尤其是SlPsbS)的泛素化水平或稳定性。
在一个实施方案中，所述应用为调控LNT胁迫下叶绿体内蛋白的泛素化水平或稳定性以及叶绿体囊泡化蛋白SlCV的泛素化水平或稳定性。
所述SlCSN5A基因的核苷酸序列和氨基酸序列是现有技术已知的，可从常用网站(如GENE BANK)中下载获得。
在一个实施方案中，所述应用为通过使所述SlCSN5A蛋白失活或敲除所述编码基因或降低所述编码基因的表达水平进行调控。所述调控是通过RNAi、基因敲除或基因失活的方法降低番茄调控基因SlCSN5A编码蛋白的表达或活性。具体地，可以通过重组载体、含有重组载体的转基因细胞系或重组菌进行转化来抑制SlCSN5A和/SlCV或蛋白蛋白表达。
在一个实施方案中，所述应用为番茄SlCSN5A基因或蛋白在提高番茄低温抗性中的应用，具体地包括使所述所述编码基因表达降低或不表达，采用的方法包括：突变或敲除所述编码基因的全部或部分序列；或者构建干涉载体干扰所述编码基因的表达；或者使用基因沉默系统使所述编码基因的表达沉默。
在一个实施方案中，所述叶绿体内蛋白包括叶绿体SlPsbS蛋白。
CSN是否参与叶绿体蛋白的泛素化一直未被清楚研究，本发明通过酵母双杂交(Y2H)实验研究了SlCSN5A是否能与SlPsbS相互作用，首次发现SlCSN5A可以在酵母细胞中与SlPsbS相互作用，且SlCSN5A上的SlPsbS结合位点位于MPN而不是ICA结构域。此外，萤火虫荧光素酶(LUC)互补成像(LCI)检测和免疫共沉淀实验也显示了二者之间的互作。进一步分析SlCSN5A对SlPsbS蛋白稳定性的影响，证实SlCSN5A导致SlPsbS泛素化和降解。
因此，番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因可用于调控叶绿体内蛋白的泛素化水平或稳定性，将该编码基因(SlCSN5A)敲除或降低其表达水平，将降低叶绿体内蛋白的泛素化水平，维持其稳定性。本发明的实验显示，与WT植株相比，SlCSN5-RNAi#1和SlCSN5-RNAi#3植株在LNT胁迫下具有更高的Fv/Fm、Pn和NPQ水平，而ROS含量显著降低。在LNT胁迫下，SlCSN5-RNAi#1和SlCSN5-RNAi#3植株的SlPsbS蛋白丰度高于WT植株。
在本发明之前，关于叶绿体囊泡(CV)蛋白是否与叶绿体蛋白的泛素化以及CV是否参与了胁迫条件下的光保护机制并不清楚。本发明通过实验研究证明SlCV参与叶绿体SlPsbS的转运，促进SlCSN5A与底物(SlPsbS)的接触。SlCV也与SlCSN5A相互作用(SlCV在酵母细胞和植物中与SlCSN5A相互作用)，并被泛素化和降解。当SlCV-GFP和SlCSN5A-HA共表达时，SlPsbS蛋白的泛素化水平被增强。而SlCV沉默降低LNT胁迫下番茄叶片的光损伤，SlCV过表达抑制LNT胁迫下番茄叶片NPQ的产生，并且导致LNT胁迫下番茄叶片叶绿体和类囊体膜蛋白降解。因此，番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因可用于调控叶绿体囊泡化蛋白SlCV的泛素化水平或稳定性。
在一个优选的方案中，所述叶绿体内蛋白还包括类囊体蛋白SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12中的一种或多种。
本发明的研究还发现SlCSN5A调控多个叶绿体内蛋白的泛素化水平，本发明研究了SlCSN5A对SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12蛋白稳定性和泛素化水平的影响，表明SlCSN5A能够促进SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12的降解。并且SlCV也能与多种叶绿体蛋白(SlPsbO、SlPsaD、SlFd、SlCP12)相互作用。SlCSN5A似乎调节每个SlCV相互作用的叶绿体内蛋白的泛素化水平。
在一个实施方案中，所述番茄SlCSN5A蛋白通过与叶绿体内蛋白直接相互作用来介导叶绿体内蛋白的泛素化和降解。
在一个实施方案中，所述番茄SlCSN5A蛋白在细胞质中与叶绿体囊泡化蛋白SlCV相互作用，促进叶绿体囊泡化蛋白SlCV和叶绿体内蛋白的降解。
本发明研究表明，LNT胁迫激活了SlCV的表达，SlCV蛋白以叶绿体为靶标与叶绿体蛋白(SlPsbS)相互作用，诱导含有叶绿体蛋白(SlPsbS)的CCV的形成，然后CCV从叶绿体中释放出来。在细胞质中，SlCV和SlPsbS通过膜外区域与SlCSN5A和未知的E3泛素连接酶接触，然后被UPS泛素化和降解。
在一个实施方案中，所述番茄SlCSN5A蛋白调节番茄在低夜温胁迫下的光系统能力耗散。
在一个实施方案中，所述应用包括通过沉默SlCSN5基因提高低夜温胁迫下番茄叶片中SlPsbS蛋白的稳定性和NPQ值，降低ROS积累，提高植物的抗低温性。SlCSN5参与了胁迫条件下的光保护机制。
由于在LNT胁迫下，随着胁迫时间的延长，番茄植株逐渐萎蔫，SlPsbS蛋白丰度显著下降，Fv/Fm降低，O2 -和H2O2水平增加，LNT应激24h后NPQ显著降低。此外，Slpsbs突变体在正常和LNT条件下都具有极低的NPQ水平。因此，SlPsbS在番茄对LNT胁迫响应中发挥重要作用。SlPsbS蛋白丰度高，则可具有更高的PsbS介导的非光化学淬灭(NPQ)，能减少低夜温胁迫下的光系统能力耗散。而SlCSN5A蛋白又能促进SlPsbS蛋白的泛素化和降解。本发明实验也表明SlCSN5沉默能够增加LNT胁迫下番茄叶片的NPQ，减少低夜温胁迫下的光系统能力耗散，提高低温抗性。SlCSN5A可通过调节叶绿体蛋白在LNT胁迫下的稳定性来影响光保护机制。沉默SlCSN5基因能够降低光系统能力耗散，增强光保护。
在一个实施方案中，所述番茄SlCSN5A和叶绿体囊泡化蛋白SlCV共同调节番茄在低温胁迫下叶绿体蛋白的稳定性。
本发明表明，LNT激活番茄叶绿体囊泡蛋白(SlCV)，SlCV蛋白靶向叶绿体与SlPsbS相互作用，诱导含有SlPsbS的囊泡(CCV)的形成，然后在LNT胁迫下从叶绿体中输出CCV。随后，SlCV和SlPsbS在细胞质中与SlCSN5A相互作用，它们的相互作用促进了SlCV和SlPsbS的降解。可见，SlCSN5A和SlCV共同介导了依赖于泛素化的叶绿体蛋白的降解途径，共同调节番茄在低温胁迫下叶绿体蛋白的稳定性。
在另一个方面，本发明提供了一种提高番茄抗低温性的方法，所述方法包括使番茄中SlCSN5A基因表达水平下降的步骤；优选地，利用RNAi、CRISPR/Cas9基因敲除或敲低方法降低番茄中SlCSN5A基因的表达水平。
一种提高番茄抗低温性的方法，包括以下步骤：(1)设计基因SlCSN5A的靶序列sgRNA，构建CRISPR/Cas9载体；(2)构建含所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；(3)将所述基因工程菌转化番茄子叶，获得稳定遗传的纯合突变体株系。
在一个实施方案中，所述方法还包括通过基因敲除或敲低方法降低番茄中SlCV基因的表达水平，使番茄突变体低温抗性增强。
在一个实施方案中，采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除番茄中的SlCSN5A基因和/或SlCV基因，最终筛选获得抗低温番茄植株。
在一个实施方案中，通过敲除SlCSN5基因(包括SlCSN5A和SlCSN5B，由于SlCSN5A和SlCSN5B具有很高的序列相似性，因此不可能在番茄中独立沉默)和/或SlCV基因基因获得突变体，或者将突变体进行杂交获得纯合双突变体，使番茄突变体的抗低温性提高。
有益效果：
本发明首次研究发现番茄SlCSN5A在通过UPS调节叶绿体蛋白稳定性中的作用，特别是通过参与SlCV和SlPsbS的泛素化降解，调控番茄对低温胁迫的反应；通过沉默番茄SlCSN5A可以提高夜低温胁迫下的番茄叶片中SlPsbS蛋白的稳定，进一步提高植物的抗逆性，也可用于促进低温胁迫下番茄作物的的产量和品质。
本发明提供了番茄SlCSN5A蛋白以及番茄叶绿体囊泡蛋白(SlCV)在调控番茄抗低温性中的机制，为培育番茄抗低温种质资源以及提高番茄耐低温能力提供了重要的方向。
本发明证实了SlCV和SlCSN5A在叶绿体内蛋白质的泛素化和降解中起关键作用，SlCV和SlCSN5A通路似乎对叶绿体内蛋白质的稳定性有广泛的影响，这也为理解叶绿体蛋白质质量控制的调控机制提供了基础。
本发明研究并证实了在低温逆境下调控番茄叶绿体蛋白稳定性的基因，通过降低或消除目的番茄中SlCSN5A和/SlCV或蛋白含量得到转基因番茄可为提高低温下番茄培育产量提供新的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的LNT抑制了番茄叶片的NPQ并促进PsbS降解结果；
图2为本发明提供的SlPsbS沉默增加番茄对LNT胁迫的敏感性结果；
图3为本发明提供的SlCSN5A导致SlPsbS泛素化和降解结果；
图4为本发明提供的SlCSN5沉默增加了LNT胁迫下番茄叶片的NPQ结果；
图5为本发明提供的SlPsbS and SlCSN5A的亚细胞定位结果；
图6为本发明提供的LNT胁迫下SlCV的表达量和SlCV的亚细胞定位结果；
图7为本发明提供的SlCV与SlPsbS相互作用并促进SlPsbS降解结果；
图8为本发明提供的SlCV与SlPsbS和液泡前体AtRab2a共定位分析结果；
图9为本发明提供的SlCSN5A导致SlCV泛素化和降解结果；
图10为本发明提供的LNT胁迫下SlCV与SlCSN5A的共定位分析结果；
图11为本发明提供的SlCV沉默降低LNT胁迫下番茄叶片的光损伤结果；
图12为本发明提供的SlCV超表达抑制LNT胁迫下番茄叶片NPQ的产生结果；
图13为本发明提供的SlCV超表达对LNT胁迫下番茄叶片叶绿体超微结构和类囊体蛋白复合体的影响结果；
图14为本发明提供的SlCV和SlCSN5A与多个类囊体蛋白相互作用结果；
图15为本发明提供的SlCSN5A对类囊体蛋白的泛素化和降解分析结果；
图16为本发明提供的SlCSN5A调控SlCV超表达植物中SlPsbS的稳定性结果；
图17为本发明提供的SlCSN5A通过泛素-蛋白酶体系统调节LNT胁迫下SlPsbS蛋白的稳定性示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、实验材料与方法
1.1植物材料和生长条件
按照Shimatani等人(2017)的方法，用CRISPR/Cas9技术获得了Slpsbs和Slcv突变体。为了获得转基因番茄SlCV过表达植株(SlCV-OE)，将SlCV的全长编码区(不含终止密码子)插入到pHSN6A01载体中(含有4×最小的VP16激活域)。SlCSN5-RNAi植株由王涛涛(华中农业大学，中国)老师慷慨提供(Luo等,2021)。采用Singh等人(2022)的方法，利用pTRV1/2载体对番茄SlCSN5A基因进行了病毒诱导的基因沉默(VIGS)。本发明所用的野生型(WT)番茄植株为‘Ailsa Craig’生态型，通过农杆菌介导法获得转基因番茄植株。对番茄Slpsbs和Slcv突变体进行了PCR鉴定，并进行了DNA测序。利用qRT-PCR对CV-OE、SlCSN5-RNAi和pTRV-SlCSN5A植株进行了定量检测。番茄种子在28℃：18℃(昼夜)、相对湿度60％(北京库兰)，冷白荧光灯(600μmol m-2s-1，光周期12h)的条件下萌发并生长。
将五叶一心的番茄幼苗转移到空气温度为4℃的黑暗生长室中，进行LNT处理24h(18：00-18：00[翌日])，并以18℃为对照。在试验期间，所有的测量都在第四片完全展开的功能叶上进行。处理后立即采集番茄叶片进行生理实验，剩下的叶片收集在液氮中，储存在-80℃下进行生理和分子生物学实验。实验进了五个独立的生物学重复。
1.2Pn、Fv/Fm和NPQ的测量
使用GFS-3000和Dual-PAM-100同步测量系统(Effeltric,HeinzWalz，德国)测定了光化光(228μmol m-2s-1,635nm)下的净光合速率(Pn)。CO2浓度为600ppm，温度约为25℃(Lu等,2020)。黑暗30min后，使用MAXI-Imaging-PAM(Heinz Walz，Effeltrich，德国)测量Fv/Fm和NPQ。测量开始后，施加饱和脉冲(10,000μmol m-2s-1,300ms)以获得最大荧光(Fm)。在光化光(228μmol m-2s-1,635nm)下，用饱和脉冲获得了暗适应和光适应的最大荧光(FM和FM‘)。用弱调制光(<0.1μmol m-2s-1，频率0.6kHz)测量暗适应和光适应的初始荧光(Fo和Fo‘)。计算公式为Fv/Fm＝(Fm-Fo)/Fm，NPQ＝(Fm-Fm‘)/Fm’。
1.3过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2 -)染色和活性氧(ROS)荧光分析
用Nitroblue tetrazolium(NBT)和Diaminobenzidine(DAB)染色检测细胞内O2 -和H2O2的积累。新鲜番茄叶片分别浸泡在含10μg·mL-1的DAB和0.2％的NBT溶液中，室温孵育12h，95％乙醇煮沸脱水，扫描观察。
在共聚焦显微镜(LSM880NLO，Zeiss，德国)下，使用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA，10InvM，Invitgen)观察ROS荧光(Yu等，2022)。ROS荧光的激发波长为488nm，吸收波长为525nm。
1.4叶绿体超微结构的分析
在处理结束时，随机选择植株顶部第四片完全展开的叶片，并进行电子显微镜观察。不包括主脉和叶缘的叶组织被切除并固定在McDowell‘s溶液中(McDowell和Trump，1976)，并按照前面描述的方式制备(Hricová等，2006)。用透射电子显微镜(H7650型，Hitachi，75千伏，日本)观察样品。使用ImageJ(版本2.0.0)软件从图像中获得相关测量。
1.5总RNA提取和qRT-PCR
根据制造商的说明，使用植物总RNA提取试剂盒(Tiangen，北京，中国)提取番茄叶片总RNA。使用PrimeScriptTMRT试剂盒(Takara，大连，中国)合成第一链互补DNA。使用SYBR@PreMix ExTaqTM(Takara，大连，中国)，ABI7500实时聚合酶链式反应系统(AppliedBiosystems,Foster City,CA)和软件7500V2.0.6进行定量RT-PCR和基因表达分析。
1.6亚细胞定位
克隆SlPsbS、SlCSN5A和SlCV的编码区(无终止密码子)，并将其插入pCAMBIA1300载体GFP上游的BamHI和SalI位点。将SlPsbS、SlCSN5A、AtHPR2(细胞质定位蛋白)(Ye等，2014)和AtRab2a(prevacuolar compartment rab5 GTPase Rha1)连接到pCAMBIA1300-mCherry表达载体中。然后将构建的重组载体转化到农杆菌EHA105菌株中，并渗透到3周龄的烟草植株的叶片中。渗入后，烟草植株在黑暗中保存48h。以室温为对照，对部分植物进行低夜温(4℃)处理24小时。用共聚焦激光扫描显微镜(TCS SP8，Leica Wetzlar，德国)检测荧光信号。GFP观察的激发波长为488nm，发射波长为520～540nm；mCherry观察的激发波长为561nm，发射波长为610～630nm。
1.7酵母双杂
将SlCSN5A和SlCV编码序列分别插入到pGBKT7载体中，将SlPsbS和SlCSN5A基因片段分别克隆到pGADT7载体中。将该融合表达载体共转化Y2H Gold菌株。转化后的酵母细胞在SD-Trp-Leu(DDO)培养基上培养3d。然后转移到含有X-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside)的SD-Trp-LeuHis-Ade(QDO)培养基上，用于显色。QDO培养液中含有40μg-α-Gal和100ng-1金担子素A(ABA)。
1.8双分子荧光互补
将SlCSN5A和SlCV的CDS连接到pSPYNE-35S载体上。扩增了SlPsbS和SlCSN5A的CDS，并将其克隆到pSPYCE-35S载体中。将构建好的重组表达载体导入农杆菌EHA105菌株，共转化烟草叶片。72小时后在激光共聚焦显微镜(TCS SP8，LeicaWetzlar，德国)下观察YFP荧光。激发波长为488nm，发射波长为520～540nm。
1.9荧光素酶互补实验
将无终止密码子的SlCSN5A和SlCV的编码序列克隆到BamHI和SalI之间的pCAMBIA-NLuc中。利用BamHI和PstI酶切位点将SlPsbS和SlCSN5A CDS插入到pCAMBIA1300-CLuc载体中。农杆菌渗透试验如上进行。用Night SHADELB 985成像系统(BertholdTechnologies)在渗透后72小时检测荧光素酶活性。检测前30分钟，将0.2mM的钾荧光素(Gold Biotech Inc.，StLouis，MO，USA)喷洒到与农杆菌渗透相同的位置。
1.10免疫印迹分析和蓝绿温和电泳(BN-PAGE)
植物叶组织称重，在液氮中冷冻，并在提取缓冲液中研磨(Sang等，2019)。使用BCA蛋白分析试剂盒(Thermo Science，Waltham，MA，USA)测量蛋白质浓度。将50μg总蛋白经10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离后，转移到硝酸纤维素膜(BioRad)上，与抗PsbS抗体(美国PhytoAB)或GFP抗体(Solarbio，中国)孵育。与山羊抗兔或抗鼠辣根过氧化物酶的抗体(Solarbio，中国)孵育后，用增强化学发光法检测标记蛋白。以Actin抗体(CWBIO，中国)作为对照。
对于BN-PAGE，按照Sárvári等人(2022)描述的方法进行。从新鲜采集的番茄叶片中分离出类囊体膜，将提取的类囊体膜蛋白用1％DDM在1mg·ml-1的叶绿素浓度下溶解。在4℃下静置30分钟后，用4％至12％的梯度凝胶进行分离。用图像扫描仪获取BN-PAGE凝胶的图像。
1.11体内蛋白质降解和泛素化检测
将扩增的SlCSN5A和SlCVCDS片段插入带HA标签的植物表达载体pRI101中。将SlPsbS和SlCV编码序列连接到pCAMBIA1300-GFP载体中。将携带E3连接酶、底物和p19基因结构的农杆菌菌株以及内对照质粒共渗入本氏烟草叶片中。渗入3天后，采集标本进行免疫印迹分析。在采集样本前12小时注射50μΜMG132(26S蛋白酶体抑制剂)(Liu等，2019)。
收集共表达SlCSN5A-HA/SlCV-HA和SlPsbS-GFP的烟草叶片进行免疫沉淀分析。总蛋白提取于IP缓冲液中(Solarbio，中国)。然后将细胞裂解物与GFP-Trap磁珠(Sigma，美国)在4℃中孵育4h。分别用HA(Solarbio，中国)和GFP(Solarbio，中国)抗体进行免疫印迹分析。使用抗Ub抗体对泛素化蛋白进行免疫检测(Millipore，美国)(Belda-Palazon等，2016；Luo等，2021)。
1.12体外泛素化检测
连接HA/GFP标签后，将SlCSN5A、SlPsbS和SlCV的全长序列插入到pET-51b载体中。将构建好的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。重组蛋白经BeyotimeHis-Tag纯化树脂纯化。纯化产物与泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素(Ub)共孵育(30℃，1.5h)。在SDS-PAGE凝胶上分离，使用GFP(Solarbio，中国)和HA(Solarbio，中国)抗体进行免疫印迹。用抗Ub抗体(索拉比奥、中国)检测泛素。
1.13统计分析
实验设计为完全随机设计。使用SPSS22软件(IBM SPSS STATISTICS，USA)对数据进行分析。P<0.05被认为具有统计学意义。使用Origin 2022软件(Origin Lab,Northampton,MA,USA)作图。
2结果分析
2.1LNT抑制番茄叶片NPQ并促进SlPsbS降解
在LNT胁迫下，随着胁迫时间的延长，番茄植株逐渐萎蔫(图1中A)，Fv/Fm降低(图1中B)。NBT和DAB组织化学染色显示，与对照相比，LNT处理的植物体内O2 -和H2O2水平增加(图1中C)。在LNT应激12h内，NPQ被显著诱导，而LNT应激24h后NPQ显著降低(图1D)。与NPQ类似，LNT胁迫也导致SlPsbS蛋白丰度显著下降(图1中E)。叶绿体超微结构分析表明，正常条件下生长的番茄叶片叶绿体细长，基粒和基质片层排列整齐、堆积紧密，嗜锇颗粒数量较少。然而，LNT胁迫导致叶绿体肿胀，基粒片层数量减少，基粒直径/高度显著增加，基质片层断裂，嗜锇颗粒积累增多(图1中F)。
2.2SlPsbS沉默增加番茄植株对LNT胁迫的敏感性
为了研究SlPsbS在番茄对LNT胁迫响应中的作用，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了Slpsbs突变株，Western印迹分析表明SlPsbS蛋白在Slpsbs突变体中没有积累(图2中A)。随后，我们对Slpsbs突变体进行了LNT胁迫处理，不出所料，Slpsbs突变体对LNT的耐受性较低。与WT植株相比，Slpsbs突变体植株在LNT胁迫下枯萎更严重，Fv/Fm和Pn显著降低，ROS含量显著积累(图2中B-E)。此外，与在LNT胁迫下具有较高NPQ值的WT植物不同，Slpsbs突变体在正常和LNT条件下都具有极低的NPQ水平(图2中F)。
2.3SlCSN5A导致SlPsbS泛素化和降解
之前的一项研究表明，叶绿体蛋白可以被泛素化和降解(Li等,2022)。CSN被认为调节泛素/蛋白酶体系统(UPS)，CSN是否参与叶绿体蛋白的泛素化是一个有趣的问题。首先，我们用酵母双杂交(Y2H)实验研究了SlCSN5A是否能与SlPsbS相互作用，发现SlCSN5A可以在酵母细胞中与SlPsbS相互作用(图3中A)。此外，我们发现SlCSN5A上的SlPsbS结合位点位于MPN而不是ICA结构域(图3中A)。为了在体内证实这一结果，我们进行了萤火虫荧光素酶(LUC)互补成像(LCI)检测。当含有SlCSN5A的重组载体(SlCSN5A-nLUC)融合到LUC的N端(SlCSN5A-nLUC)，以及标记有LUC的C端的SlPsbS(cLUC-SlPsbS)共渗入烟草叶片时，检测到强烈的发光信号，但在阴性对照中没有检测到(图3中B)。免疫共沉淀实验表明，用GFP抗体对蛋白质提取物进行免疫沉淀时，在SlPsbS-GFP免疫沉淀物中检测到了SlCSN5A-HA，而阴性对照没有(图3中E)。
接下来，我们进一步分析了SlCSN5A对SlPsbS蛋白稳定性的影响。将SlPsbS和SlCSN5A分别连接到pCAMBIA1300-GFP和PRI101-HA载体上，并由CaMV35S启动子驱动表达。将SlPsbS-GFP、SlPsbS-GFP+SlCSN5A-HA载体瞬时转入烟草叶片后，抗GFP抗体几乎检测不到SlPsbS-GFP的蛋白条带。然而，在MG132存在下，SlPsbS-GFP蛋白恢复积累(图3中D)。为了研究SlCSN5A是否影响SlPsbS蛋白的泛素化，我们免疫沉淀了SlPsbS-GFP，在使用抗Ub进行免疫印迹分析后，可以检测到SlPsbS的泛素化(图3中E)。
2.4SlCSN5沉默增加LNT胁迫下番茄叶片的NPQ
LNT胁迫诱导SlCSN5A的表达水平显著增加(图4中A)。为了进一步研究SlCSN5A在番茄对LNT胁迫反应中的作用，我们利用RNA干扰技术下调了稳定转化植株中SlCSN5(包括SlCSN5A和SlCSN5B)的表达(图4中A)。由于SlCSN5A和SlCSN5B具有很高的序列相似性，因此不可能在番茄中独立沉默(Luo等，2021)。SlCSN5-RNAi(SlCSN5-RNAi#1，SlCSN5-RNAi#3)植株对LNT胁迫的敏感性降低。与WT植株相比，SlCSN5-RNAi#1和SlCSN5-RNAi#3植株在LNT胁迫下具有更高的Fv/Fm、Pn和NPQ水平，而ROS含量显著降低(图4中B-F)。此外，在LNT胁迫下，SlCSN5-RNAi#1和SlCSN5-RNAi#3植株的SlPsbS蛋白丰度高于WT植株(图4中G)。
2.5SlPsbS和SlCSN5A在细胞质中相互作用
亚细胞定位分析表明，SlPsbS定位于叶绿体(图5中A)。然而，在野生烟草叶片中瞬时表达的SlCSN5A-GFP的绿色荧光信号与细胞质定位的HPR2-mCherry信号重合(图5中B)，表明SlCSN5A定位于细胞质中。双分子荧光互补(BIFC)分析表明，当SlCSN5A-nYFP和cYFP-SlPsbS在烟草叶片中共表达时，在细胞质中产生了YFP荧光信号(图5中C)。
2.6SlCV与SlPsbS相互作用并介导SlPsbS降解
PsbS位于类囊体膜(Daskalakis andPapadatos，2017)，而CSN5A定位于细胞质(Mo等人，2021)。由于叶绿体是被双层膜包围的细胞器，SlPsbS是否以及如何从叶绿体移位并与细胞质中的SlCSN5A和UPS复合体接触是一个神秘的问题。Wang和Blumwald(2014)的研究表明，CV蛋白可以诱导CCV的形成，CCV从叶绿体中释放到液泡进行蛋白质分解。因此，我们推测，含有SlPsbS的CCV从叶绿体中分泌，而在细胞质中，CCV有助于SlPsbS与SlCSN5A的接触。为了证明这一猜想，我们首先检测了LNT胁迫下SlCV的表达水平。正如预期的那样，SlCV的表达水平随着胁迫程度的加剧而显著增加，并在胁迫24小时上调356倍(图6中A)。为了进一步分析SlCV的功能，我们研究了它的亚细胞定位。激光共聚焦扫描显微镜观察发现，由CaMV35S启动子驱动的SlCV-GFP的绿色荧光信号与叶绿体的自发荧光一致，表明SlCV定位于叶绿体中(图6中B)。有趣的是，在LNT处理表达SlCV-GFP的烟草植株后，我们在叶绿体外的一些未知的隔室中发现了绿色荧光信号(图6中C)。
为了确定SlCV在SlPsbS降解中的作用，我们利用Y2H分析了SlCV和SlPsbS之间的相互作用。结果表明，SlCV与SlPsbS在酵母细胞中相互作用(图7中A)。LCI试验也进一步证实了SlCSN5A和SlPsbS在植物中的相互作用(图7中B)。BIFC分析发现，当SlCV-nYFP和cYFP-SlPsbS在烟草叶片中共表达时，在叶绿体中检测到YFP荧光信号(图7中C)。在免疫共沉淀分析中，我们发现SlCV-HA可以与SlPsbS-GFP免疫共沉淀(图7中E)。此外，我们还在野生烟草叶片中瞬时共表达了SlCV-GFP和SlPsbS-mCherry。SlCV-GFP和SlPsbS-mCherry在常温下共定位于叶绿体，而在LNT处理后，我们在叶绿体外检测到SlCVGFP和SlPsbS-mCherry荧光信号(图8中A)。先前的研究表明CCV最终被运输到液泡中(Wang andBlumwald，2014)。因此，我们在野生烟草叶片中分别表达了SlCV-GFP/AtRab2a-mCherry和SlPsbS-GFP/AtRab2amCherry(prevacuolar compartment rab5 GTPase Rha1)(Foresti等，2010)，以评估CCV是否也将SlPsbS移动到中央液泡中。对烟草植株进行LNT处理后，发现SlCV-GFP信号与AtRab2a-mCherry信号一致。同样，我们在液泡前体中也检测到了SlPsbS-GFP信号(图8中B)。这些结果表明SlCV与SlPsbS相互作用，并通过形成CCV改变SlPsbS的亚细胞位置。
此外，我们还研究了SlCV是否直接参与了SlPsbS的泛素化和降解。当SlCV-HA和SlPsbS-GFP共侵染烟草叶片时，SlCV促进了SlPsbS的降解。在MG132存在下，SlPsbS蛋白的积累部分恢复(图7中D)，表明SlCV可能通过UPS降解SlPsbS。然而在SlCV-HA和SlPsbS-GFP免疫沉淀物中未检测到SlPsbS泛素化条带。相反，当SlCSN5A-HA存在时，检测到了SlPsbS的泛素化条带(图7中E)，表明SlCV可以通过SlCSN5A促进UPS介导的SlPsbS降解。
2.7SlCSN5A导致SlCV泛素化和降解
为了更好地了解SlCV、SlCSN5A和SlPsbS之间的关系，我们接下来研究了SlCV和SlCSN5A可能的蛋白质-蛋白质相互作用。我们通过Y2H和LCI试验证明SlCV在酵母细胞和植物中与SlCSN5A相互作用(图9中A-B)。此外，SlCSN5A上的SlCV结合位点位于MPN而不是ICA结构域(图9中A)。在BIFC分析中，SlCV-nYFP与cYFP-SlCSN5A在细胞质中产生YFP荧光(图9中C)。SlCV与SlCSN5A在胞质中的相互作用可能与SlCV在胁迫条件下的位置变化有关。因此，我们将SlCV-GFP和SlCSN5A-mCherry共渗透到烟草叶片中，LNT处理后，红色和绿色荧光信号在细胞质中重叠(图10)。此外，我们使用免疫共沉淀实验证实了SlCSN5A和SlCV的相互作用。将SlCSN5A-HA和SlCV-GFP共转化烟草叶片，用GFP抗体进行免疫沉淀，用HA抗体进行免疫印迹分析，SlCSN5A-HA可与SlPsbS-GFP免疫共沉淀，而阴性对照没有(图9E)。
正如预期的那样，当SlCV-GFP和SlCSN5A-HA在烟草叶片中共表达时，没有检测到SlCV-GFP蛋白的积累(图9中D)，但在加入MG132后，SlCV蛋白丰度增加(图9中D)。接着，我们使用Ub抗体检测了SlPsbS的泛素化水平。结果表明，当与SlCSN5A-HA共表达时，SlPsbS蛋白的泛素化水平被增强(图9中E)。
2.8SlCV沉默降低LNT胁迫下番茄叶片的光损伤
我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了Slcv突变植株，以进一步研究SlCV在LNT胁迫中的作用(图11中A)。在LNT胁迫下，SlCV突变植株与WT植株相比，保持了正常的植株形态和较低的ROS水平(图11中B，C)。Slcv突变体在LNT下也表现出Fv/Fm和Pn的增加(图11中D和E)。同时，LNT诱导了Slcv突变体比WT植株更高的NPQ值和SlPsbS蛋白丰度(图11中F)。
2.9SlCV过表达抑制LNT胁迫下番茄叶片NPQ的产生
在CaMV35S组成型启动子的控制下，获得了SlCV超表达(SlCV-OE#91，SlCV-OE#92)转基因番茄植株。在正常情况下，SlCV-OE#91和SlCV-OE#92植株显著矮于WT植株(图12中A)。此外，SlCV-OE#91和SlCV-OE#92表现出对LNT胁迫的敏感性增加，表现为更严重的植株枯萎，Fv/Fm和Pn显著降低，ROS水平大量积累(图12中B-D)。与WT植株较高的NPQ值不同，SlCV-OE#91和SlCV-OE#92植株的NPQ水平较低(图12中E)。此外，我们还分析了SlCV超表达植株中SlPsbS蛋白丰度的变化。在对照条件下，SlCV-OE#91和SlCV-OE#92植株表现出较低的SlPsbS水平，并进一步加剧了LNT处理后SlPsbS蛋白的降解(图12中F)。
2.10SlCV过表达导致LNT胁迫下番茄叶片叶绿体和类囊体膜蛋白降解
为了研究SlCV过表达是否影响叶绿体的细胞器下层组织，用透射电子显微镜研究了WT、SlCV-OE#91和SlCV-OE#92在LNT处理前后叶绿体的超微结构。在常温条件下，SlCV超表达植株的叶绿体明显膨胀变形，但基质和基粒片层仍清晰可见(图13中A)。LNT处理后，与WT植株相比，SlCV超表达植株的叶绿体进一步膨胀(图13中A)，嗜锇颗粒数量显著增加(图13)。叶绿体基粒数和基粒片层数显著降低(图13中A，B)。基粒肿胀成近球形(图13中A，C)，类囊体膜降解，片层模糊，叶绿体处于崩溃和降解的边缘(图13中A)。
叶绿体类囊体含有参与光合作用光反应的大部分蛋白质。为了评估SlCV超表达对LNT胁迫下类囊体蛋白丰度的影响，我们用BN-PAGE分离和检测了类囊体蛋白复合体的水平。在正常条件下，WT和SlCV-OE#91植株的叶绿体蛋白含量没有差异，而SlCV-OE#92植株的PSII二聚体和PSI、ATP合成酶的含量显著降低(图13中C)。在LNT胁迫下，与WT植株相比，SlCV-OE#91和SlCV-OE#92植株中PSII-LHCII超复合体、PSII二聚体和PSI、ATP合成酶、细胞色素b6f复合体以及LCII三聚体和单体的丰度降低(图13中C)，表明SlCV超表达促进了LNT胁迫下番茄叶片叶绿体蛋白的降解。
2.11SlCSN5A调控多个叶绿体内蛋白的泛素化水平
鉴于SlCV对叶绿体结构和类囊体蛋白丰度的影响，我们进一步评估了SlCV与叶绿体内蛋白的关系。Y2H表明SlCV在酵母细胞中可与SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12相互作用(图14中A)。BIFC分析还发现，当SlCV-nYFP分别与cYFP-PsbO、cYFP-PsaD、cYFP-Fd和cYFP-CP12共转化烟草叶片时，在叶绿体中检测到YFP荧光信号(图14中B)。有趣的是，Y2H实验进一步表明，SlCSN5A在酵母细胞中与SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12相互作用，结合部位位于SlCSN5A的MPN结构域(图14中C-F)。
接下来，我们研究了SlCSN5A对SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12蛋白稳定性和泛素化水平的影响。正如预期的那样，SlCSN5A能够促进SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12的降解，而MG132显著增加了叶绿体内蛋白质的丰度。同样，SlCSN5A还调节SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12的泛素化水平(图15)。
2.12SlCSN5A参与了SlCV介导的SlPsbS降解
为进一步研究SlCSN5A和SlCV类囊体蛋白SlPsbS泛素化和降解中的作用，我们在SlCV-OE#91和SlCV-OE#92植物中沉默了SlCSN5A。在LNT胁迫下，SlCV-OE#91和SlCV-OE#92背景中pTRV的Fv/Fm、Pn、NPQ和SlPsbS蛋白丰度显著低于WT背景中的pTRV(图16中A-E)。然而，在SlCV-OE植物中沉默SlCSN5A显著提高了SlCV-OE植物对LNT胁迫的耐受性(图16)。与SlCV-OE#91和SlCV-OE#92背景下的pTRV植株相比，在LNT胁迫下，SlCV-OE#91和SlCV-OE#92背景下的pTRV-SlCSN5A植株具有更高的Fv/Fm、Pnh和NPQ(图16中B-D)。对SlPsbS蛋白水平的分析发现，沉默SlCSN5A基因可以延缓LNT胁迫下SlCV-OE植物中SlPsbS蛋白的降解(图16中E)。
3讨论
叶绿体和光合作用对胁迫条件高度敏感。叶绿体的类囊体膜含有光系统复合体，也称为光合膜，是光合作用光反应的场所。低温下光合膜偶联蛋白的降解和蛋白质合成的抑制破坏了光合膜的完整性，从而损害了光合膜的光反应(Gan等，2019)。PSII分布在类囊体膜上。它对温度极其敏感，很容易失活，光合作用效率迅速下降，这被称为光抑制(Philzenberg等，2020)。LNT胁迫可以破坏叶绿体结构，导致Fv/Fm显著降低，ROS积累，从而影响光系统活性，降低光合作用效率，导致光系统严重光抑制(Lu等，2020；Lu等，2021)。然而，进化带来了一种机制，通过光系统的捕光复合体以热的形式消散多余的光能，以防止ROS损伤，这是最重要的快速光保护机制之一，这个过程被称为NPQ(Ruban，2018)。NPQ的作用机制在于分子对ΔpH的反应。PsbS蛋白被确定为植物中NPQ激活的关键因素(Krishnan-Schmieden等，2021)。胁迫促进PsbS蛋白的积累(Nawrocki等，2022)，但长期或严重的应激导致PsbS蛋白丰度下降(Wang等，2018)。在本发明实验中，LNT胁迫导致NPQ值下降，这可能与胁迫后期SlPsbS蛋白丰度降低有关(图1中D，E)。Slpsbs突变体显示NPQ增加较慢，光抑制严重，更容易受到LNT胁迫(图2)，这与在莱茵衣藻和拟南芥中的发现一致(Acebron等，2021；Redekop等，2020)。这些结果表明，PsbS介导的NPQ在光保护中起着重要作用。因此，通过提高PsbS蛋白的稳定性来提高植物的抗逆性具有重要意义。
UPS是植物选择性蛋白质降解的一种快速调节机制，在生长发育中发挥着至关重要的作用(Xu和Xue，2019)。当叶绿体发育受到影响时，异常细胞器在涉及到叶绿体蛋白泛素化的过程中被降解和再循环(Jeran等，2021)。泛素组研究表明，叶绿体蛋白占各种植物泛素化蛋白质总库的很大一部分(Rosnoblet等，2021；Lu等，2019)。目前的研究认为，位于叶绿体外膜和光损伤叶绿体上的蛋白质的泛素修饰具有重要作用(Jeran等，2021；Ling等，2012年)。最近的一项研究揭示了CDC48A及其辅助因子UFD1和NPL4在控制泛素修饰的拟南芥叶绿体内蛋白降解中的生物和生化功能(Li等，2022)。在这项研究中，我们发现SlCSN5A介导了叶绿体内蛋白质的泛素化和降解，这为理解叶绿体蛋白质质量控制的调控机制提供了新的见解。
CSN是一种进化上保守的蛋白质复合体(Singh et al.,2019)。CSN最为人所知的是CRL家族的调节器，它通过UPS催化蛋白质泛素化和降解的关键步骤(Lyapina等，2001；Schwechheimer等，2001)。CSN几乎参与了植物生长、发育和环境响应的所有过程。CSN5通过促进RGL2和ABI5的蛋白质降解来调节拟南芥种子的萌发(Jin等，2018)。在番茄中，SlCSN5还通过影响SlZF3和SlBBX20的稳定性来调节ASA和花青素的生物合成(Luo等，2021；Li等，2018)。在高温胁迫下，拟南芥csn5a突变体表现出CO2同化速率和光合作用活性的增加，这表明CSN5A参与了叶绿体和光合作用(Singh等，2019)。在本发明研究中，SlCSN5A可以调节SlPsbS泛素化水平并促进其降解(图3)。SlCSN5沉默提高了LNT胁迫下番茄叶片中SlPsbS蛋白的稳定性和NPQ值，避免了ROS的过度积累，提高了植物的抗逆性(图4)，表明SlCSN5A可通过调节叶绿体蛋白在LNT胁迫下的稳定性来影响光保护机制。CSN5A在动植物之间高度保守，拟南芥和人类的同源蛋白有>60％的氨基酸相似性。在植物、动物和真菌中，CSN调节UPS引导泛素化的蛋白质到26S蛋白酶体中降解(Schwechheimer，2001)。我们的结果提供了CSN5A参与叶绿体蛋白质周转的直接证据，揭示了与以往研究不同的叶绿体蛋白质降解途径，并扩展了现有的CSN5A功能模型。
UPS介导的蛋白质降解需要降解机制与其底物之间的物理相互作用。SlCSN5A在体内和体外都与SlPsbS直接相互作用(图3)。然而，现有的研究表明，CSN5A不具有E3泛素连接酶活性。因此，与CSN5A相关的修饰叶绿体蛋白的E3泛素连接酶在很大程度上仍是未知的。重要的是，PsbS结构性地存在于类囊体膜中，并且没有发现它与叶绿体被膜相关的证据(Li等，2000)。大量研究表明，CSN5定位于细胞核和细胞质(Mo等，2021；Luo等，2021；Gusmaroli等，2004)。我们的结果表明，SlPsbS在胞浆中与SlCSN5A相互作用(图3)。底物如何从叶绿体转移到细胞质中与CSN5A接触是一个新的问题。
研究表明，衰老和非生物胁迫激活了CV转录(Umnajkitikorn等，2020；Sade等，2018；Wang和Blumwald，2014)。同样，我们的结果还表明，LNT胁迫诱导了SlCV的高表达，并促进了SlCV从叶绿体的移位(图6)。在拟南芥中，CV破坏叶绿体的稳定性，诱导CCV的形成。CCV携带基质蛋白、被膜蛋白和类囊体膜蛋白，最终从叶绿体释放到细胞质(Wang和Blumwald，2014)。根据这些结果，我们推测SlCV是连接SlPsbS和SlCSN5A的桥梁。因此，我们分析了SlCV、SlPsbS和SlCSN5A之间的关系。我们发现SlCV可以直接与SlPsbS相互作用，并促进SlPsbS的降解(图7)。此外，LNT胁迫后，我们观察到SlCV与SlPsbS在叶绿体外的共定位(图8)。此外，我们在体内和体外检测到SlCV和SlCSN5A的相互作用，并且LNT胁迫后，SlCV-GFP信号与细胞质中的SlCSN5A-mCherry信号重合(图9，10)。这些数据有力地表明，SlCV可以与SlPsbS一起从叶绿体转移到细胞质中，并且SlCV有助于促进底物(叶绿体蛋白)与SlCSN5A和未知的E3泛素连接酶的接触。除SlPsbS外，SlCV还能与多种叶绿体蛋白(SlPsbO、SlPsaD、SlFd、SlCP12)相互作用(图14)。有趣的是，SlCSN5A似乎调节每个SlCV相互作用的叶绿体内蛋白的泛素化水平(图14和15)。这些结果进一步证实了SlCV和SlCSN5A在叶绿体内蛋白质的泛素化和降解中起关键作用，并且SlCV和SlCSN5A通路似乎对叶绿体内蛋白质的稳定性有广泛的影响。
CCV可以将CV和叶绿体蛋白带出叶绿体，聚集在叶肉细胞的细胞质中(Wang和Blumwald，2014)。在本研究中，SlCV不能泛素化SlPsbS(图7)，但SlCSN5A可以调控SlCV和SlPsbS的泛素化水平(图3和9)。因此，SlCSN5A可能参与了含有SlCV和叶绿体蛋白的CCV的泛素化和降解。在CCV形成之前，CV蛋白主要与类囊体膜和被膜结合，而CCV被认为是由被CV破坏的叶绿体膜直接形成的囊泡结构(Wang和Blumwald，2014)。到目前为止测序的所有植物物种中都存在CV同源物，并且包含一个保守的跨膜结构域(Wang和Blumwald，2014)。CCV中SlCV和SlPsbS与SlCSN5A的结合可能与其预测的跨膜结构域有关。正如在拟南芥中观察到的那样，胁迫诱导SlCV和SlPsbS移位到液泡前体，这表明SlCV和SlPsbS也可能被动员到液泡中进行蛋白质分解(图8)(Wang和Blumwald，2014)。最近的研究发现，除了26S蛋白酶体途径外，泛素化介导的液泡降解也参与了ABA信号的调节。ESCRT-I的两个主要成分，空泡蛋白分类23A(VPS23A)和FYVE1/FYVE结构域蛋白(FREE1)，用于识别由E3连接酶RSL1泛素化的PYL4，并促进PYL4运输到液泡中进行降解(Belda-Palazon等，2016；Yu等，2016；Bueso等，2014)。因此，SlCSN5A介导的SlCV和SlPsbS的泛素化和降解与CCV的液泡蛋白降解并不矛盾。相反，这可能表明CCV的液泡蛋白降解可能与泛素化有关。
在衰老和非生物胁迫过程中，CV在光合作用机构的失稳中起着关键作用。CV的过度表达破坏了ROS的动态平衡，导致ROS的过度积累，降低了叶绿体和叶绿体蛋白质的稳定性(Yu等，2022；Wang和Blumwald，2014)，而CV的沉默延缓了非生物胁迫诱导的叶绿体周转和衰老，并增强了来源适合性(即碳和氮的同化)和光呼吸(Umna jkitikorn等，2020；Sade等，2018；Wang和Blumwald，2014)。在LNT胁迫下，SlCV过表达导致NPQ显著下降，SlPsbS降解加速，类囊体蛋白复合体丰度降低(图12)，而Slcv突变体具有更高的NPQ值(图11)，表明CV调节NPQ水平，在光保护响应胁迫中发挥作用。在热胁迫下，CSN5沉默的植物通过调节生长素信号来提高耐热性(Singh等，2019年)。同样，SlCSN5-RNAi植物在LNT胁迫下也表现出增强的抗性和SlPsbS蛋白的稳定性(图4)。这一结果表明，SlCSN5A对叶绿体蛋白的降解比对SlCV的降解更具破坏性。SlCV可能更多地发挥了SlCSN5A与叶绿体蛋白之间连接者的作用。值得注意的是，在番茄SlCV-OE植株中沉默SlCSN5A部分挽救了SlCV-OE植株对LNT敏感的表型，并促进了SlPsbS蛋白的积累(图16)。这些遗传观察表明，SlCV诱导的番茄植株的逆境敏感性和叶绿体蛋白的不稳定性可能部分依赖于SlCSN5A。
基于目前和以前的发现，我们构建了一个模型来描述SlCSN5A在通过UPS调节叶绿体蛋白稳定性中的作用。LNT胁迫激活了SlCV的表达，SlCV蛋白以叶绿体为靶标与叶绿体蛋白(SlPsbS)相互作用，诱导含有叶绿体蛋白(SlPsbS)的CCV的形成，然后CCV从叶绿体中释放出来。在细胞质中，SlCV和SlPsbS通过膜外区域与SlCSN5A和未知的E3泛素连接酶接触，然后被UPS泛素化和降解。SlPsbS蛋白丰度的降低会导致NPQ值的降低，从而加剧光系统的光损伤，降低植物的抗逆性(图17)。总而言之，我们的工作揭示了在胁迫条件下调节叶绿体蛋白稳定性的潜在新途径。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用，其特征在于，所述应用包括以下一个或多个方面：
(a)调控叶绿体内蛋白的泛素化水平或稳定性；
(b)调控叶绿体囊泡化蛋白SlCV的泛素化水平或稳定性；
(c)调控番茄对低温胁迫的响应。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为通过使所述SlCSN5A蛋白失活或敲除所述编码基因或降低所述编码基因的表达水平进行调控。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述叶绿体内蛋白包括叶绿体SlPsbS蛋白；
优选地，所述叶绿体内蛋白还包括类囊体蛋白SlPsbO、SlPsaD、SlFd和SlCP12中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述番茄SlCSN5A蛋白通过与叶绿体内蛋白直接相互作用来介导叶绿体内蛋白的泛素化和降解。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述番茄SlCSN5A蛋白在细胞质中与叶绿体囊泡化蛋白SlCV相互作用，促进叶绿体囊泡化蛋白SlCV和叶绿体内蛋白的降解。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控番茄对低温胁迫的响应为降低番茄在低夜温胁迫下的光系统能力耗散。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为通过沉默SlCSN5基因提高低夜温胁迫下番茄叶片中SlPsbS蛋白的稳定性和NPQ值，降低ROS积累，提高植物的抗低温性。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述番茄SlCSN5A和叶绿体囊泡化蛋白SlCV共同调节番茄在低温胁迫下叶绿体蛋白的稳定性。
9.一种提高番茄抗低温性的方法，其特征在于，所述方法包括使番茄中SlCSN5A基因表达水平下降的步骤；优选地，利用RNAi、CRISPR/Cas9基因敲除或敲低方法降低番茄中SlCSN5A基因的表达水平。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过基因敲除或敲低方法降低番茄中SlCV基因的表达水平，使番茄突变体低温抗性增强。
CN202310008452.3A 2023-01-04 2023-01-04 番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用 Pending CN116120414A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310008452.3A CN116120414A (zh) 2023-01-04 2023-01-04 番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310008452.3A CN116120414A (zh) 2023-01-04 2023-01-04 番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116120414A true CN116120414A (zh) 2023-05-16

Family

ID=86305957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310008452.3A Pending CN116120414A (zh) 2023-01-04 2023-01-04 番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116120414A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118048393A (zh) * 2024-04-16 2024-05-17 山东省果树研究所 苹果MdCSN5B基因在提高苹果花青素含量中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331689A (zh) * 2015-10-27 2016-02-17 河南科技学院 小麦-长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法及其分子标记
CN109628439A (zh) * 2018-12-11 2019-04-16 沈阳农业大学 一种促进番茄叶绿素合成及光合效率的基因及应用
CN110229224A (zh) * 2019-06-28 2019-09-13 浙江大学 SlRALF5基因作为负调控因子在提高番茄低温抗性中的应用
CN114426975A (zh) * 2022-03-31 2022-05-03 河南大学三亚研究院 番茄谷氧还蛋白SlGRXC9基因及应用
CN115161339A (zh) * 2022-06-17 2022-10-11 华中农业大学 一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105331689A (zh) * 2015-10-27 2016-02-17 河南科技学院 小麦-长穗偃麦草抗白粉病易位系选育方法及其分子标记
CN109628439A (zh) * 2018-12-11 2019-04-16 沈阳农业大学 一种促进番茄叶绿素合成及光合效率的基因及应用
CN110229224A (zh) * 2019-06-28 2019-09-13 浙江大学 SlRALF5基因作为负调控因子在提高番茄低温抗性中的应用
CN114426975A (zh) * 2022-03-31 2022-05-03 河南大学三亚研究院 番茄谷氧还蛋白SlGRXC9基因及应用
CN115161339A (zh) * 2022-06-17 2022-10-11 华中农业大学 一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118048393A (zh) * 2024-04-16 2024-05-17 山东省果树研究所 苹果MdCSN5B基因在提高苹果花青素含量中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield
Li et al. A chaperone function of NO CATALASE ACTIVITY1 is required to maintain catalase activity and for multiple stress responses in Arabidopsis
Morrell et al. Dealing with stress: a review of plant SUMO proteases
Liu et al. The RING finger ubiquitin E3 ligase OsHTAS enhances heat tolerance by promoting H2O2-induced stomatal closure in rice
Czarnecki et al. An Arabidopsis GluTR binding protein mediates spatial separation of 5-aminolevulinic acid synthesis in chloroplasts
Myouga et al. A heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis
Wang et al. Stress-induced chloroplast degradation in Arabidopsis is regulated via a process independent of autophagy and senescence-associated vacuoles
Tisi et al. Perturbation of polyamine catabolism can strongly affect root development and xylem differentiation
Wang et al. Overexpression of tomato chloroplast-targeted DnaJ protein enhances tolerance to drought stress and resistance to Pseudomonas solanacearum in transgenic tobacco
Panda et al. Overexpression of alternative oxidase gene confers aluminum tolerance by altering the respiratory capacity and the response to oxidative stress in tobacco cells
Ishida et al. Mobilization of rubisco and stroma-localized fluorescent proteins of chloroplasts to the vacuole by an ATG gene-dependent autophagic process
Wang et al. Chloroplastic Os3BGlu6 contributes significantly to cellular ABA pools and impacts drought tolerance and photosynthesis in rice
Chen et al. Expression of a cloned sweet potato catalase SPCAT1 alleviates ethephon-mediated leaf senescence and H2O2 elevation
He et al. The OsABCI7 transporter interacts with OsHCF222 to stabilize the thylakoid membrane in rice
Kanervo et al. Expression of protein complexes and individual proteins upon transition of etioplasts to chloroplasts in pea (Pisum sativum)
Hu et al. Conserved vacuolar H+-ATPase subunit B1 improves salt stress tolerance in apple calli and tomato plants
Sun et al. The AaCBF4-AaBAM3. 1 module enhances freezing tolerance of kiwifruit (Actinidia arguta)
Sun et al. Exogenous application of xanthine and uric acid and nucleobase-ascorbate transporter MdNAT7 expression regulate salinity tolerance in apple
Wang et al. Regulatory interaction of BcWRKY33A and BcHSFA4A promotes salt tolerance in non-heading Chinese cabbage [Brassica campestris (syn. Brassica rapa) ssp. chinensis]
Cui et al. Tomato methionine sulfoxide reductase B2 functions in drought tolerance by promoting ROS scavenging and chlorophyll accumulation through interaction with Catalase 2 and RBCS3B
Wang et al. ALM1, encoding a Fe-superoxide dismutase, is critical for rice chloroplast biogenesis and drought stress response
Zhang et al. Mutual promotion of LAP2 and CAT2 synergistically regulates plant salt and osmotic stress tolerance
CN116120414A (zh) 番茄SlCSN5A蛋白或其编码基因的应用
Yang et al. MdCCX2 of apple functions positively in modulation of salt tolerance
Basak et al. Plant metacaspases: Decoding their dynamics in development and disease

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination