CN116113711A - 用于核酸质量测定的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于确定样品中核酸质量的组合物和方法，其中包括第一组引物和第二组引物。此外，本文提供了用于确定样品中核酸质量的组合物和方法，其中包括用于扩增重复核酸序列的引物组。

Description

用于核酸质量测定的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35USC§119(e)要求2020年3月31日提交的美国申请序列号63/002,785的权益。该在先申请的公开内容被视为本申请公开内容的一部分并通过引用并入本申请中。

序列表的引入

随附序列表中的材料通过引用并入本申请。随附的序列表文本文件名为PGDX3150-1WO_SL.txt，创建于2021年3月15日，为3,116字节。可以在使用Windows操作系统的计算机上使用Microsoft Word访问该文件。

技术领域

本发明总体上涉及样品中核酸质量的测定，更具体地涉及在文库制备和测序之前测定核酸质量。

背景技术

在广泛的文库制备和测序之前确定核酸样品例如DNA的质量是非常有用的，这样不会将时间和金钱不会浪费在过度法降解而无法成功分析的样品上。目前的测定基于DNA长度或可扩增性。没有一种分析既足够稳健又具有预测性。

原则上，可扩增性最接近核酸的功能评估，但它是用少数特异性片段完成的，这些片段并不总是会提供足够的信息。因此，需要有基于更广泛的核酸大小进行分析并提供可靠和预测性信息的测定法。

发明内容

本发明涉及使用重复核酸序列的扩增来确定核酸质量的组合物和方法。

在一个实施方案中，本发明提供了一种用于确定样品中核酸质量的系统，包括：(a)第一组引物，其包括多个第一正向引物和多个第一反向引物，每个第一正向引物和每个第一反向引物包括：(i)与所述核酸中的重复序列互补并具有第一解链温度的3'末端序列；(ii)不存在于所述核酸中并具有第二解链温度的5'末端共同序列，其中所述第二解链温度高于所述第一解链温度；(b)第二组引物，其包括多个第二正向引物和多个第二反向引物，每个第二正向引物和每个第二反向引物包括5'末端共同序列。在一个方面，所述第二解链温度比所述第一解链温度高约5℃至25℃。在一个方面，所述第一解链温度为约45℃至70℃。在一个方面，所述第二解链温度为约60℃至85℃。在一个方面，所述第一组引物包括相等数量的第一正向引物和第一反向引物。在一个方面，所述第一组引物包括不等数量的第一正向引物和第一反向引物。在一个方面，所述第二组引物包括相等数量的第二正向引物和第二反向引物。在一个方面，所述第二组引物包括不相等数量的第二正向引物和第二反向引物。在一个方面，所述第一组引物包括约1至20种第一正向引物和约1至20种第一反向引物。在一个方面，所述第二组引物包括约1至20种第二正向引物和约1至20种第二反向引物。在一个方面，重复核酸序列包括逆转录转座子。在一个方面，逆转录转座子是L1逆转录转座子。在一个方面，每个所述第一正向引物的5’末端共同序列包括SEQ ID NO:1的序列。在一个方面，每个所述第一反向引物的5’末端共同序列包括SEQ ID NO:2的序列。在一个方面，每个所述第一正向引物的3’末端序列包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或其任意组合的序列。在一个方面，每个所述第一反向引物的3’末端序列包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或其任意组合的序列。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于确定样品中核酸质量的方法，包括：a)制备聚合酶链式反应(PCR)混合物，包括：(i)第一组引物，包括多个第一正向引物和多个第一反向引物，每个第一正向引物和每个第一反向引物包括：(i)与所述核酸中的重复序列互补并具有第一解链温度的3'末端序列；(ii)不存在于所述核酸中并具有第二解链温度的5'末端共同序列，其中第二解链温度高于第一解链温度；ii)第二组引物，包括多个第二正向引物和多个第二反向引物，每个第二正向引物和每个第二反向引物包括5'末端共同序列；(a)对所述样品进行第一聚合酶链式反应(PCR)，其中第一PCR中每个循环的第一延伸步骤在大约第一解链温度的温度下；(b)对样品进行第二聚合酶链式反应(PCR)，其中第二PCR中每个循环的第二延伸步骤在大约第二解链温度的温度下进行；(c)确定扩增子的大小范围。在一个方面，所述第二解链温度比所述第一解链温度高约5℃至25℃。在一个方面，所述第一解链温度为约45℃至70℃。在一个方面，所述第一延伸步骤持续约2分钟。在一个方面，所述第二延伸步骤持续约1分钟。在一个方面，所述第一组引物包括相等数量的第一正向引物和第一反向引物。在一个方面，所述第一组引物包括约1至20种第一正向引物和约1至20种第一反向引物。在一个方面，所述第二组引物包括约1至20种第二正向引物和约1至20种第二反向引物。在一个方面，所述重复核酸序列包括逆转录转座子。在一个方面，所述逆转录转座子是L1逆转录转座子。在一个方面，所述第二PCR包括约10至35个循环。

在又一个方面，所述方法还包括确定扩增子的强度比。在一个方面，预测的扩增子大小的存在与核酸质量相关。在一个方面，每个第一正向引物的5’末端共同序列包括SEQID NO:1的序列。在一个方面，每个第一反向引物的5’末端共同序列包括SEQ ID NO:2的序列。在一个方面，每个第一正向引物的3’末端序列包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：8或其任意组合的序列。在一个方面，每个第一反向引物的3’末端序列包括SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12或其任意组合的序列。

附图的简要说明

图1显示了用于聚合酶链式反应(PCR)的引物和方法的概述。

图2显示了用于确定核酸质量的PCR的代表性LINE序列。

图3显示了用于确定核酸质量的代表性引物和引物组分。

图4显示了预测的扩增子的大小分布。

发明详述

本发明基于如下发现，即使用可以扩增基因组中数百或更多不同位点的少量引物扩增人类基因组中的重复序列提供了关于DNA质量的可靠和准确的信息。例如，此类信息可用于文库制备和下一代测序(NGS)。

本文提供了用于确定核酸质量的寡核苷酸引物系统。本文提供的用于确定核酸质量的寡核苷酸引物系统可以包括第一组寡核苷酸引物。本文提供的用于确定核酸质量的寡核苷酸引物系统还可以包括第二组寡核苷酸引物。

可以使用本文提供的寡核苷酸引物系统确定任何核酸的质量。所述核酸可以来自任何样品或来自任何类型的样品。例如，所述样品可以是血液、唾液、血浆、血清、尿液或其他生物流体。另外的示例性生物流体包括浆膜液、淋巴液、脑脊液、粘膜分泌物、阴道液、腹水、胸膜液、心包液、腹膜液和腹液。在一些方面，所述样品是组织样品。在一些方面，所述样品是细胞样品或单细胞。可以使用新鲜样品或储存样品，包括例如储存的冷冻样品、福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品和通过任何其他方法保存的样品。

所述样品可以来自正常健康受试者。所述样品还可以来自患有疾病或病症的受试者。可以使用本文提供的引物系统确定来自患有任何疾病或病症的受试者的样品中核酸的质量。在一些方面，所述疾病或病症是癌症。在一些方面，所述样品是来自患有癌症的受试者的流体样品。在一些方面，样品是来自健康受试者或者患有或怀疑患有癌症的受试者的组织样品或细胞样品。癌症样品可以是来自实体瘤或液体肿瘤的样品。癌症可以是肾脏癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、口腔癌、咽癌、胰腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、头颈癌、脑癌、造血系统癌、白血病、淋巴瘤、骨癌、肌肉癌、肉瘤、横纹肌肉瘤等。所述疾病或病症可以是传染病，例如病毒、细菌、真菌或寄生虫感染。

可以使用本文提供的用于确定核酸质量的本发明引物系统来确定样品中核酸的质量。在确定核酸质量之前，还可以从样品中提取、分离或纯化核酸。可以使用任何适合的提取、分离或纯化方法。示例性方法包括苯酚-氯仿提取、硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取、凝胶纯化以及柱和珠的使用。商业试剂盒可用于核酸的提取、分离或纯化。

可以使用本文提供的引物系统确定来自任何生物体或物种的核酸的质量。例如，可以使用本文提供的引物系统确定来自任何动物、植物或微生物的核酸的质量。可以确定来自任何哺乳动物的核酸的质量，包括来自人类、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪)等，以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)等的核酸。可以使用本文提供的引物系统确定来自任何其他动物的核酸的质量，包括例如来自爬行动物、鸟类、两栖动物、硬骨鱼、软骨鱼和无脊椎动物的核酸。例如，可以确定来自任何被子植物、任何裸子植物、任何蕨类植物和相关生物、任何金银花、任何地钱、任何苔藓和任何绿藻的核酸的质量。示例性微生物包括任何真核或原核单细胞生物，例如细菌、古细菌、原生生物、原生动物和真菌，以及病毒和类病毒。

可以使用本文提供的引物系统确定任何类型的核酸的质量，包括例如DNA、RNA和核酸片段。DNA来源包括例如染色体DNA、质粒DNA、cDNA、无细胞DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)及其任何片段。可以通过任何合适的方法对RNA进行逆转录以制备DNA，使用本文提供的引物系统确定DNA质量。例如，在确定核酸质量后，核酸可用于制备核酸文库。在一些方面，文库是基因组文库。核酸文库可以通过连接寡核苷酸组或亚组来制备，所述寡核苷酸组或亚组可以包括一个或多个条形码，用于通过例如末端修复、A-加尾和衔接子连接识别核酸分子。例如，可以通过下一代测序(NGS)来分析核酸和核酸文库。可以使用任何合适的测序方法来分析核酸。示例性NGS方法包括Roche 454测序仪、Life Technologies SOLiD系统、Life Technologies Ion Torrent、BGI/MGI系统、Genapsys系统和Illumina系统，例如Illumina Genome Analyzer II、Illumina MiSeq、Illumina HiSeq、Illumina NextSeq和Illumina NovaSeq设备。

本文提供的寡核苷酸引物系统可以包括第一组引物。第一组引物可以包括多个第一正向引物。第一组引物还可以包括多个第一反向引物。如本文所用，术语“正向引物”和“反向引物”可以分别与术语“+链引物”和“-链引物”互换使用，除非上下文另有明确说明。多个第一正向引物和多个第一反向引物中的每个第一正向引物和每个第一反向引物可以包括与使用本文提供的引物系统确定其质量的核酸中的重复序列互补的3'末端序列在此处。多个第一正向引物和多个第一反向引物中的每个第一正向引物和每个第一反向引物还可以包括在被确定质量的核酸中不存在的5'末端共同序列。因此，包括在第一组引物中的引物可以是杂合引物。如本文所用，术语“杂合引物”是指具有与在核酸分子中彼此不毗邻或不相邻的至少两个序列互补的至少两个序列的引物，或者所述至少两个序列中的至少一个序列起初并不存在于所述核酸分子中。例如，当杂合引物包括与一个核酸序列互补的3'末端序列和与所述核酸不具有互补性的5'末端序列时，可以通过聚合酶链式反应(PCR)产生具有与杂合引物的5'末端序列互补的序列的核酸分子，从而例如产生与杂合引物的3'末端和5'末端序列都具有互补性的核酸分子。

如本文所用，术语“互补”和“互补性”是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的多核苷酸链中核苷酸之间的氢键形成。互补的多核苷酸链可以以Watson-Crick方式(例如，A与T、A与U、C与G)或以允许形成双链体的任何其他方式进行碱基配对。正如本领域技术人员所理解的，当使用RNA而不是DNA时，是尿嘧啶而不是胸腺嘧啶被视为与腺苷互补的碱基。

完全或完全互补性或100％互补性是指一条多核苷酸链的每个核苷酸可以与一条反向平行的多核苷酸链的核苷酸形成氢键的情况。不完全互补是指两条链的一些(但不是全部)核苷酸可以彼此氢键结合的情况。例如，对于两个20聚体，如果每条链上只有两个碱基对可以相互形成氢键，则所述多核苷酸链表现出10％的互补性。作为另一个例子，如果每条链上20个核苷酸中的18个核苷酸可以彼此氢键结合，则所述多核苷酸链表现出90％的互补性。“基本互补性”是指多核苷酸链表现出75％或更高的互补性，不包括被选择为非互补的多核苷酸链区域，例如突出端。因此，互补性不考虑选择为与反向平行链上的核苷酸不相似或不互补的突出端，除非上下文另有明确说明。在一些方面，与重复核酸序列互补的3’末端序列表现出与重复核酸序列完全或完美互补。在一些方面，与重复核酸序列互补的3'末端序列表现出与重复核酸序列的基本互补性。

如本文所用，“5’末端共同序列”是指一些或所有正向引物在引物的5’末端包括相同的序列或基本上相同的序列，并且一些或所有的反向引物在引物的5’末端包括相同的序列或基本上相同的序列。例如，第一正向引物和第二正向引物(如下所述)的5'末端共同序列可以包括相同的序列，并且还可以包括位于该5'末端共同序列的5'、3'或5'和3'两者的额外核苷酸。作为另一个实例，第一反向引物和第二反向引物的5'末端共同序列(如下所述)可以包括相同的序列，并且还可以在包括位于该5'末端共同序列的5'、3'或5'和3'两者的额外核苷酸。正向引物的5'末端共同序列可以相同或不同。例如，正向引物可以包括在正向引物之间共享的多于一个5'末端共同序列，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个不同的5'末端共同序列。反向引物的5'末端共同序列可以相同或不同。例如，反向引物可以包括在反向引物之间共享的多于一个5'末端共同序列，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个不同的5'末端共同序列。正向引物和反向引物的5’末端共同序列可以相同或不同。任何不存在于被扩增的核酸中的序列都可以是5'末端共同序列。

如本文所用，当提及引物序列时，“3’末端序列”是指在每个第一正向引物和每个第一反向引物的3’末端的、可以变化的序列。第一正向引物和第一反向引物的3'末端序列可以是任何长度，包括约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约34、约35个核苷酸。在本文提供的第一组引物的第一正向引物和第一反向引物中可以包括任意数量的不同3'末端序列。例如，第一正向引物和第一反向引物可以包括约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20个不同的3'末端序列。

第一正向引物和第一反向引物中可以包括不同数量的3'序列的任何组合。例如，第一正向引物可以有四个不同的3'末端序列。第一正向引物可以包括SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或其任何组合的序列。在一些方面，第一反向引物包括三个不同的3'末端序列。在一些方面，第一反向引物包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12或其任何组合的序列。因此，本文提供的引物系统的第一组引物可以包括不等数量的第一正向引物和第一反向引物。例如，第一正向引物可以包括四个不同的3’末端序列和一个5’末端共同序列，第一反向引物可以包括三个不同的3’末端序列和一个5’末端共同序列。本文提供的引物系统的第一引物组还可以包括相等数量的第一正向引物和第一反向引物。例如，第一正向引物和第一反向引物可以包括相同数量的不同3'末端序列和5'末端共同序列。在一些方面，第一组引物包括约1至20种第一正向引物。在一些方面，第一组引物包括约1至20种第一反向引物。第一组引物可以包括任意数量的第一正向引物和任意数量的第一反向引物。

5’末端共同序列可以是任何长度，包括约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约34、约35个核苷酸。第一正向和第一反向引物的5’末端共同序列可以包括相同或基本相同的序列。第一正向引物和第一反向引物的5'末端共同序列可以包括使用本文提供的引物系统进行质量分析的核酸中不存在的任何序列。在一些方面，第一正向引物的5'末端共同序列包括SEQ ID NO:1的序列。在一些方面，第一反向引物的5'末端共同序列包括SEQ ID NO:2的序列。

本文提供的用于确定核酸质量的引物系统中包括的第一正向和第一反向引物的3'末端序列可以具有第一解链温度。包括在本文提供的用于确定核酸质量的引物系统中的第一正向和第一反向引物的5'末端共同序列可以具有第二解链温度。第二解链温度可以高于第一解链温度。在一些方面，第二解链温度比第一解链温度高约5℃至25℃。第一解链温度可以是约45℃至70℃。第一解链温度可以是约45℃至50℃、约45℃至55℃、约45℃至60℃、约45℃至65℃、约45℃至70℃。在一些方面，例如，第一解链温度为约70℃至65℃、约70℃至60℃、约70℃至55℃、约70℃至50℃、约70℃至45℃。在一些方面，第一解链温度为约50℃至53℃。在一些方面，第一解链温度为约50.7℃至52.5℃。通常，第一正向和第一反向引物的3'末端序列的熔解温度在彼此的0.1℃、0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃内，以及它们之间的任何数量或范围。

第二解链温度可以是约60℃至85℃。在一些方面，例如，第二解链温度为约60℃至85℃、约60℃至80℃、约60℃至75℃、约60℃至70℃、约60℃至65℃。在一些方面，第二解链温度为约80℃至85℃、约75℃至85℃、约70℃至85℃、约65℃至85℃、约60℃至85℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至75℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至73℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至72℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至71℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至70.9℃。

本文提供的第一引物组的第一正向引物和第一反向引物可以包括与使用本文提供的引物系统测定质量的核酸中的重复序列互补的3'末端序列。所述重复核酸序列可以包括逆转录转座子。逆转录转座子，也称为通过RNA中间体的I类可转座元件或转座子，是可以经RNA转座中间体通过逆转录将RNA转化为DNA来将自身复制并粘贴到不同基因组位置的遗传元件。

逆转录转座子的类型包括LTR和非LTR逆转录转座子。LTR逆转录转座子的大小超过5kb。LTR逆转录转座子包括位于逆转录转座子每个末端的长链重复DNA，称为长末端重复序列(LTR)。示例性的LTR逆转录转座子包括Ty1-copia样(假病毒科(Pseudoviridae))、Ty3-gypsy样(转座病毒科(Metaviridae))和BEL-Pao样逆转录转座子组。在动物、真菌、原生生物和植物基因组中，每个单倍体核有数百万个拷贝Ty1-copia样和Ty3-gypsy样逆转录转座子组，而BEL-Pao样元件只能在动物中找到。

非LTR逆转录转座子包括长的散在核元件(long interspersed nuclearelement,LINE)和短的散在核元件(short interspersed nuclear element,SINE)。LINE转录本包括RNA聚合酶II启动子，它允许LINE在插入基因组位点后被复制。LINE转录物是从细胞核移动到细胞质以进行逆转录酶翻译的转座中间体。逆转录酶生成LINE RNA的DNA拷贝，可以整合到基因组的新位点。每个LINE大约有7,000个碱基对(bp)长，估计有100,000个被截断为4,000个全长LINE-1元件存在于人类基因组中。由于突变的积累，许多LINE没有被转录或翻译。五个主要的LINE组包括L1、RTE、R2、I和Jockey组。人类LINE包括LINE-1/L1以及L2和L3的残余物。人类基因组包括约850,000个LINE元素，其中L1元件约516,000个拷贝，L2元件约315,000个拷贝，L3元件约37,000个拷贝。LINE-1/L1元件广泛存在于哺乳动物中，并且在人类基因组中仍然活跃。其他LINE元件包括Tad、CRE、Deceiver和Inkcap样元件。

SINE元件包括约100至700bp的非自主、非编码的可转座元件(transposableelement,TE)。三种类型的SINE元件包括CORE-SINE、V-SINE和AmnSINE。SINE元件由RNA聚合酶III转录，转录区域包括启动子元件。SINE元件不编码蛋白质，可能使用由LINE编码的蛋白质进行逆转录和整合到基因组中。示例性的SINE包括Alu元件，它们是大约300个核苷酸的短的散布核元件，并且可以在人类和其他物种中找到。Alu元件是人类最常见的SINE，在整个人类基因组中有超过1,000,000个拷贝。其他示例性SINE包括犬科动物的SINE_Cf重复序列，以及植物的Au-SINE和Angio-SINE。

第一引物组的第一正向引物和第一反向引物的3'末端序列可以与来自任何生物体的任何逆转录转座子的序列具有互补性。例如，第一正向和第一反向引物的3'末端序列可以基于使用本文提供的引物系统确定其质量的核酸来源来设计。因此，3'末端序列可以与在从中获得其质量要测定的核酸的生物体中发现的逆转录转座子具有互补性，确定的。核酸可以来自人。在一些方面，所述逆转录转座子是L1逆转录转座子。

第一正向和第一反向引物的3'末端序列可以设计为与沿逆转录转座子两条链的交错序列具有互补性。沿逆转录转座子两条链的交错序列可以是不重叠的。在一些方面，每个第一正向引物与每个第一反向引物产生扩增子，并且每个第一反向引物与每个第一正向引物产生扩增子。以这种方式，可以产生某一大小范围内的许多扩增子，包括约50至200bp、约50至300bp、约50至400bp、约50至500bp、约50至600bp、约50至700bp、约50至800bp、约50至900bp、约50至1,000bp、约50至1,500bp、约50至2,000bp、约50至2,500bp、约50至3,000bp、约50至3,500bp、约50至4,000bp、约50至4,500bp、约50至5,000bp。在一些方面，扩增子的范围从大约100到2,000bp。

用于确定样品中核酸质量的引物系统可以包括第二组引物。第二组引物可以包括多个第二正向引物和多个第二反向引物。每个第二正向引物和每个第二反向引物可以包括5'末端共同序列。

包括在第一正向和第一反向引物中的5’末端共同序列可以包括在第二正向和第二反向引物中。例如，每个正向引物可以在引物的5’末端包括相同的序列或基本上相同的序列，并且每个反向引物可以在引物的5’末端包括相同的序列或基本上相同的序列。作为另一个例子，第一正向引物和第二正向引物的5'末端共同序列可以包括相同的序列并且还可以在5'末端共同序列的5'、3'或5'和3'两者包括额外核苷酸。作为另一个例子，第一反向引物和第二反向引物的5'末端共同序列可以包括相同的序列并且还可以在5'末端共同序列的5'、3'或5'和3'两者包括额外核苷酸。正向引物的5'末端共同序列可以相同或不同。反向引物的5’末端常见序列可以相同或不同。正向引物和反向引物的5’末端共同序列可以相同或不同。

在一些方面，第二正向和第二反向引物仅包括包含在第一正向和第一反向引物中的5’末端共同序列，并且不包括其他序列或核苷酸。在一些方面，第二正向和第二反向引物除了包括在第一正向和第一反向引物中的5’末端共同序列之外还可以包括其他序列或核苷酸。例如，第二正向和第二反向引物可以包括在5’末端共同序列上游或5'的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个额外核苷酸。作为另一个实例，第二正向和第二反向引物还可以在5'末端共同序列的下游或3'包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个额外的核苷酸。5’末端共同序列下游或3’末端的额外核苷酸可以包括存在于第一正向和第一反向引物的3’末端序列中的5'核苷酸，而不包括存在于第一正向和第一反向引物的3’末端序列中的所有核苷酸反向引物。因此，包括在第二正向和第二反向引物的5’末端共同序列的下游或3’的附加核苷酸可以延伸到包括在第一正向和第一反向引物中的3’末端序列中。在一些方面，包含在第二正向和第二反向引物中的3’末端序列包括的3'核苷酸比包含在第一正向和第一反向引物中的3'末端序列的3'核苷酸少至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个核苷酸。因此，第一正向和第一反向引物的3’末端序列可以包括比在第二正向和第二反向引物中的3'末端序列多至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个的3'核苷酸。

第二正向和第二反向引物的任何组合可以包括在第二组引物中，包括包括5'末端共同序列的第二正向引物、包括5'末端共同序列的第二正向引物和任意数量的附加核苷酸、包含5'末端共同序列的第二反向引物和包含5'末端共同序列和任意数量的附加核苷酸的第二反向引物。因此，第二组引物可以包括相等数量的第二正向和第二反向引物。第二组引物还可以包括数量不等的第二正向和第二反向引物。在一些方面，第二组引物包括约1至20种第二正向引物。在一些方面，第二组引物包括约1至20种第二反向引物。第二组引物可以包括任何数量的第二正向引物和任何数量的第二反向引物。

第二正向和第二反向引物的解链温度可以高于第一正向和第一反向引物的3'末端序列的第一解链温度。第二正向和第二反向引物的解链温度可以与第一正向和第一反向引物的5'末端共同序列的第二解链温度相似或对应。例如，在第二正向和第二反向引物不包括除了5'末端共同序列之外的序列或核苷酸的情况下，第二正向和第二反向引物的解链温度可以对应于包含在第一正向引物和第一反向引物中的5'末端共同序列的第二解链温度。作为另一个实例，当第二正向和第二反向引物除了5'末端共同序列之外还包括序列或核苷酸时，第二正向和第二反向引物的解链温度可以高于包含在第一正向引物和第一反向引物中的5'末端共同序列的第二解链温度。第二正向和第二反向引物的解链温度可以比第一正向和第一反向引物中包括的5'末端共同序列的第二解链温度高约0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃、5.5℃、6.0℃、6.5℃、7.0℃、7.5℃、8.0℃、8.5℃、9.0℃、9.5℃、10.0℃、10.5℃、11.0℃、11.5℃、12.0℃、12.5℃、13.0℃、13.5℃，14.0℃、14.5℃、15.0℃、15.5℃、16.0℃、16.5℃、17.0℃、17.5℃、18.0℃、18.5℃、19.0℃、19.5℃、20.0℃、20.5℃、21.0℃、21.5℃、22.0℃、22.5℃，23.0℃、23.5℃、24.0℃、24.5℃、25.0℃，以及介于两者之间的任何数量或范围。

在一些方面，本文提供的引物组的第二正向和第二反向引物包括标签或标记。标签或标记可用于检测由例如PCR产生的扩增子。可以使用任何类型的标签或标记，包括颜色标签或标记。示例性颜色标签或标记包括荧光团。可以使用任何荧光团，包括例如荧光镧系元素配合物，包括铕和铽的那些、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、萤光黄、级联蓝、Texas Red(例如可从Invitrogen获得)，以及Richard P.Haugland的第11版Molecular Probes Handbook中描述的其他产品，在此通过引用明确并入其全部内容。其他荧光团包括例如Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(GE Healthcare)、fluorescein-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、Texas

Cascade

FL-14-dUTP、

TR-14-dUTP、罗丹明绿^TM-5-dUTP、

488-5-dUTP、

630/650-14-dUTP、

650/665-14-dUTP、Alexa

488-5-dUTP、Alexa

532-5-dUTP、Alexa

568-5-dUTP、Alexa

594-5-dUTP、Alexa

546-14-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、Texas

Cascade

FL-14-UTP、

TMR-14-UTP、

TR-14-UTP、罗丹明Green^TM-5-UTP、Alexa

488-5-UTP和Alexa

546-1 4-UTP(Invitrogen)、Alexa

350、Alexa

532、Alexa

546、Alexa

568、Alexa

594、Alexa

647、BODIPY 493/503、BODIPYFL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY564/570、BODIPY 576/589、BODIPY581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、CascadeBlue、Cascade Yellow、Dansyl、丽丝胺罗丹明B、Marina Blue、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、Pacific Blue、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红和Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(GE Healthcare)。

在一些实施方案中，本文提供了用于确定样品中核酸的质量的方法。

本文提供的测定样品中核酸质量的方法可以包括制备聚合酶链式反应(PCR)混合物。所述PCR混合物可以包括第一组引物，该第一组引物包括多个第一正向引物和多个第一反向引物。每个第一正向引物和每个第一反向引物可以包括与所述核酸中存在的重复序列互补并具有第一解链温度的3'末端序列。每个第一正向引物和每个第一反向引物还可以包括在所述核酸中不存在的并且具有第二解链温度的5'末端共同序列。第二解链温度可以高于第一解链温度。在一些方面，第一正向和第一反向引物以低或限制性的终浓度包含在PCR反应混合物中，例如约0.05μM、约0.04μM、约0.03μM、约0.02μM、约0.01μM、约0.009μM、约0.008μM、约0.007μM、约0.006μM、约0.005μM、约0.004μM、约0.003μM、约0.002μM、约0.001μM，以及介于两者之间的任何数字或范围。在一些方面，第一正向和第一反向引物的最终浓度相同或相似。如本文所用，“相似的引物浓度”是指差异不超过2倍或更少的引物浓度。

所述PCR混合物还可以包括第二组引物。第二组引物可以包括多个第二正向引物和多个第二反向引物。每个第二正向引物和每个第二反向引物可以包括一个5’末端共同序列。在一些方面，第二正向和第二反向引物以对应于大摩尔浓度过量的终浓度包含在PCR反应混合物中，例如0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM和介于两者之间的任何数字或范围。在某些方面，第二正向和第二反向引物以0.1μM–0.5μM的终浓度包含在PCR反应混合物中。在一些方面，第二正向和第二反向引物的最终浓度相同或相似。

在一些方面，PCR反应混合物中包括的第二正向和第二反向引物的最终浓度大于PCR反应混合物中包括的第一正向和第一反向引物的最终浓度。PCR反应混合物中包含的第二正向和第二反向引物的对应于大摩尔浓度过量的最终浓度可以大于对应于第一正向和第一反向引物的低浓度或极限浓度的最终浓度。在一些方面，PCR反应混合物中包含的第二正向和第二反向引物的最终浓度比第一正向和第一反向引物的最终浓度大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍，至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍、至少95倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1,000倍、至少2,000倍、至少3,000倍、至少4,000倍、至少5,000倍、至少6,000倍、至少7,000倍、至少8,000倍、至少9,000倍、至少10,000倍、至少50,000倍、至少100,000倍，以及介于它们之间的任何数量或范围。

包括在本文提供的引物系统中的任何引物组可以包括在本文提供的用于确定核酸质量的方法的PCR混合物中。

本文提供的用于确定样品中核酸质量的方法的PCR混合物可以包括第一组引物。第一组引物可以包括多个第一正向引物。第一组引物还可以包括多个第一反向引物。多个第一正向引物和第一反向引物的每个第一正向引物和每个第一反向引物可以包括与使用本文提供的方法确定质量的核酸中的重复序列互补的3'末端序列。多个第一正向和第一反向引物中的每个第一正向引物和每个第一反向引物还可以包括在被确定质量的核酸中不存在的5'末端共同序列。因此，包括在第一组引物中的引物可以是杂合引物，如上所述。与重复核酸序列互补的3'末端序列可以与所述核酸中的重复序列完美或完全互补。与重复核酸序列互补的3’末端序列也可以表现出与所述核酸中的重复序列具有实质上的互补性。

每个第一正向引物和每个第一反向引物可以包括相同的5'共同末端序列。每个第一正向引物和每个第一反向引物的3’末端序列可以不同。第一正向引物和第一反向引物的3'末端序列可以是任何长度，包括约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约34、约35个核苷酸。在本文提供的方法的PCR混合物中包括的第一组引物的第一正向引物和第一反向引物中可以包括任意数量的不同3'末端序列。例如，第一正向引物和第一反向引物可以包括约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20个不同的3'末端序列。

在本文提供的方法中制备的PCR混合物的第一正向引物和第一反向引物中可以包括不同数量的3'序列的任何组合。例如，第一个正向引物可以有四个不同的3’末端序列。在一些方面，第一正向引物包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8或其任何组合的序列。在一些方面，第一反向引物包括三个不同的3’末端序列。在一些方面，第一反向引物包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12或其任何组合的序列。因此，在本文提供的方法中制备的PCR混合物的第一组引物可以包括不等数量的第一正向引物和第一反向引物。例如，第一正向引物可以包括四个不同的3’末端序列和一个5’末端共同序列，第一反向引物可以包括三个不同的3’末端序列和一个5’末端共同序列。在本文提供的方法中制备的PCR混合物的第一组引物还可以包括相等数量的第一正向引物和第一反向引物。例如，第一正向引物和第一反向引物可以包括相同数量的不同3’末端序列和一个5’末端共同序列。在一些方面，第一组引物包括约1至20种第一正向引物。在一些方面，第一组引物包括约1至20种第一反向引物。第一组引物可以包括任意数量的第一正向引物和任意数量的第一反向引物。

5’末端共同序列可以是任何长度，包括约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约34、约35个核苷酸。第一正向和第一反向引物的5’末端共同序列可以包括相同或基本相同的序列。第一正向引物和第一反向引物的5'末端共同序列可以包括在使用本文提供的方法分析质量的核酸中不存在的任何序列。在一些方面，第一正向引物的5'末端共同序列包括SEQ ID NO:1的序列。在一些方面，第一反向引物的5'末端共同序列包括SEQ ID NO:2的序列。

本文提供的用于确定核酸质量的方法的PCR混合物中包括的第一正向和第一反向引物的3'末端序列可以具有第一解链温度。包括在用于确定核酸质量的方法的PCR混合物中的第一正向和第一反向引物的5’末端共同序列可以具有第二解链温度。所述第二解链温度可以高于所述第一解链温度。在一些方面，所述第二解链温度比所述第一解链温度高约5℃至25℃。第一解链温度可以是约45℃至70℃。在一些方面，第一解链温度为约45℃至50℃、约45℃至55℃、约45℃至60℃、约45℃至65℃、约45℃至70℃。在一些方面，例如，第一解链温度为约70℃至65℃、约70℃至60℃、约70℃至55℃、约70℃至50℃、约70℃至45℃。在一些方面，第一解链温度为约50℃至53℃。在一些方面，第一解链温度为约50.7℃至52.5℃。在一些方面，第一解链温度为约50.7℃至52.5℃。通常，第一正向和第一反向引物的3'末端序列的解链温度彼此之间在0.1℃、0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃内，以及它们之间的任何数量或范围。

第二解链温度可以是约60℃至85℃。在一些方面，例如，第二解链温度为约60℃至85℃、约60℃至80℃、约60℃至75℃、约60℃至70℃、约60℃至65℃。在一些方面，第二解链温度为约80℃至85℃、约75℃至85℃、约70℃至85℃、约65℃至85℃、约60℃至85℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至75℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至73℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至72℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至71℃。在一些方面，第二解链温度为约70℃至70.9℃。

PCR混合物中包括的第一引物组的第一正向引物和第一反向引物可以包括与使用本文提供的测定样品中合适质量的方法测定其质量的核酸中的重复序列具有互补性的3'末端序列。所述重复核酸序列可以包括逆转录转座子。3’末端序列可以与任何逆转录转座子互补，包括LTR和非LTR逆转录转座子。示例性的逆转录转座子包括逆转录转座子的Ty1-copia样(假病毒科(Pseudoviridae))、Ty3-gypsy样(转座病毒科(Metaviridae))和BEL-Pao样组；LINE的任何组，包括L1、L2、L3、RTE、R2、I和Jockey，以及Tad、CRE、Deceiver和Inkcap样元件；和SINE，例如CORE-SINE、V-SINE和AmnSINE。

在本文提供的方法中制备的PCR混合物的第一引物组的第一正向引物和第一反向引物的3'末端序列可以与来自任何生物体的任何逆转录转座子的序列具有互补性。例如，第一正向和第一反向引物的3'末端序列可以基于使用本文提供的方法确定其质量的核酸的来源来设计。因此，3'末端序列可以与从中获得确定其质量的核酸的生物体中发现的逆转录转座子具有互补性。所述核酸可以来自人。在一些方面，所述逆转录转座子是L1逆转录转座子。

第一正向和第一反向引物的3'末端序列可以被设计成与沿逆转录转座子两条链的交错序列具有互补性。沿逆转录转座子两条链的交错序列可以是不重叠的。在一些方面，每个第一正向引物可以与每个第一反向引物产生扩增子，并且每个第一反向引物可以与每个第一正向引物产生扩增子。以这种方式，可以产生许多大小范围内的扩增子，包括约50至200bp、约50至300bp、约50至400bp、约50至500bp、约50至600bp、约50至700bp、约50至800bp、约50至900bp、约50至1,000bp、约50至1,500bp、约50至2,000bp、约50至2,500bp、约50至3,000bp、约50至3,500bp、约50至4,000bp、约50至4,500bp、约50至5,000bp。在一些方面，扩增子的范围从大约100到2,000bp。

在本文提供的用于确定样品中核酸质量的方法中制备的PCR混合物可以包括第二组引物。所述第二组引物可以包括多个第二正向引物和多个第二反向引物。每个第二正向引物和每个第二反向引物可以包括一个5’末端共同序列。

包括在第一正向和第一反向引物中的5’末端共同序列可以包括在第二正向和第二反向引物中。在一些方面，第二正向和第二反向引物仅包括包含在第一正向和第一反向引物中的5'末端共同序列，并且不包括其他序列或核苷酸。在一些方面，第二正向和第二反向引物除了包括在第一正向和第一反向引物中的5’末端共同序列之外还可以包括其他序列或核苷酸。例如，第二正向和第二反向引物可以包括5’末端共同序列上游或5'的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个额外核苷酸。作为另一个实例，第二正向和第二反向引物还可以包括位于5'末端共同序列的下游或3'的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个额外的核苷酸。5’末端共同序列下游或3’端的额外序列或核苷酸可以包括在第一正向和第一反向引物的3’末端序列中存在的5'核苷酸，而不包括存在于第一正向引物和第一反向引物的3’末端序列中的所有核苷酸。因此，包括在第二正向和第二反向引物的5’末端共同序列的下游或3’的附加核苷酸可以延伸到第一正向和第一反向引物中包括的3’末端序列。在一些方面，包含在第二正向和第二反向引物中的3’末端序列比包含在第一正向和第一反向引物中的3'末端序列少至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个。因此，在一些方面，第一正向和第一反向引物的3’末端序列比第二正向和第二反向引物中包括的3'末端序列多至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个3'核苷酸。

第二正向和第二反向引物的任何组合可以包括在本文提供的用于确定核酸质量的方法中制备的PCR混合物的第二组引物中，包括包含5'末端共同序列的第二正向引物，包括5'末端共同序列和任意数量的额外核苷酸的第二正向引物，包括5'末端共同序列的第二反向引物，以及包括5'末端共同序列和任意数量的额外核苷酸的第二反向引物。因此，第二组引物可以包括相等数量的第二正向和第二反向引物。第二组引物还可以包括数量不相等的第二正向和第二反向引物。在一些方面，所述第二组引物包括约1至20种第二正向引物。在一些方面，所述第二组引物包括约1至20种第二反向引物。第二组引物可以包括任何数量的第二正向引物和任何数量的第二反向引物。

第二正向和第二反向引物的解链温度可以高于第一正向和第一反向引物的3'末端序列的第一解链温度。第二正向和第二反向引物的解链温度可以与第一正向和第一反向引物的5'末端共同序列的第二解链温度相似或对应。例如，当第二正向和第二反向引物不包括除5'末端共同序列之外的序列时，第二正向和第二反向引物的解链温度可以对应于包括在第一正向和第一反向引物中的5'末端共同序列的第二解链温度。作为另一个实例，当第二正向和第二反向引物除5'末端共同序列之外还包括核苷酸时，第二正向和第二反向引物的解链温度可以高于包括在第一正向和第一反向引物中的5'末端共同序列的第二解链温度。第二正向和第二反向引物的解链温度可以比第一正向和第一反向引物中包括的5'末端共同序列的第二解链温度高约0.5℃、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃、4.5℃、5.0℃、5.5℃、6.0℃、6.5℃、7.0℃、7.5℃、8.0℃、8.5℃、9.0℃、9.5℃、10.0℃、10.5℃、11.0℃、11.5℃、12.0℃、12.5℃、13.0℃、13.5℃、14.0℃、14.5℃、15.0℃、15.5℃、16.0℃、16.5℃、17.0℃、17.5℃、18.0℃、18.5℃、19.0℃、19.5℃、20.0℃、20.5℃、21.0℃、21.5℃、22.0℃、22.5℃、23.0℃、23.5℃、24.0℃、24.5℃、25.0℃，以及介于两者之间的任何数量或范围。

在一些方面，本文提供的方法中使用的引物组的第二正向和第二反向引物包括标签或标记。例如，标签或标记可用于检测由PCR产生的扩增子。可以使用任何类型的标签或标记，包括颜色标签或标记。示例性的颜色标签或标记包括荧光团。可以使用任何荧光团，包括例如荧光镧系元素配合物，包括铕和铽的那些、荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、萤光黄、级联蓝、Texas Red(例如可从Invitrogen获得)，以及Richard P.Haugland的第11版Molecular Probes Handbook中描述的其他产品，在此通过引用明确并入其全部内容。其他荧光团包括例如Cy3-dCTP、Cy3-dUTP、Cy5-dCTP、Cy5-dUTP(GE Healthcare)、荧光素-12-dUTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、Texas

Cascade

罗丹明绿^TM-5-dUTP、

4-dUTP、Alexa

488-5-dUTP、Alexa

532-5-dUTP、Alexa

568-5-dUTP、Alexa

594-5-dUTP、Alexa

546-1 4-dUTP、荧光素-12-UTP、四甲基罗丹明-6-UTP、Texas

Cascade

FL-14-UTP、

TMR-14-UTP、

TR-14-UTP、罗丹明Green^TM-5-UTP、Alexa

488-5-UTP和Alexa

546-1 4-UTP(Invitrogen)、Alexa

350、Alexa

532、Alexa

546、Alexa

568、Alexa

594、Alexa

647、BODIPY 493/503、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY 530/550、BODIPY TMR、BODIPY 558/568、BODIPY 558/568、BODIPY564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、Cascade Blue、Cascade Yellow、Dansyl、丽丝胺罗丹明B、MarinaBlue、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、Pacific Blue、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红和Cy2、Cy3.5、Cy5.5和Cy7(GE Healthcare)。

本文提供的确定样品中核酸质量的方法可以包括对样品进行第一聚合酶链式反应(PCR)。在一些方面，第一PCR中每个循环的第一延伸步骤的温度约为本文提供的PCR反应混合物中包含的第一正向和第一反向引物的3'末端序列的第一解链温度。在一些方面，第一延伸步骤在比第一解链温度低约5℃至比第一解链温度高5℃的温度下进行。在一些方面，第一延伸步骤在比第二解链温度低至少5℃的温度下进行。在一些方面，第一延伸步骤在比第一解链温度低约5℃至比第一解链温度高约5℃且比第二解链温度低至少5℃的温度下进行。在一些方面，第一延伸步骤在约45℃至70℃。在一些方面，第一延伸步骤在约45℃至50℃、约45℃至55℃、约45℃至60℃、约45℃至65℃、约45℃至70℃。在一些方面，例如，第一延伸步骤在约70℃至65℃、约70℃至60℃、约70℃至55℃、约70℃至50℃、约70℃至45℃。在一些方面，第一延伸步骤在约50℃至53℃。在一些方面，第一延伸步骤在约50.7℃至52.5℃。在一些方面，第一延伸步骤在约50℃。

第一延伸步骤可以具有任何合适的时间长度。例如，第一延伸步骤可以持续约30秒、约40秒、约50秒、约1分钟、约1分10秒、约1分20秒、约1分30秒、约1分40秒，约1分50秒、约2分、约2分10秒、约2分20秒、约2分30秒、约2分40秒、约2分50秒、约3分钟，以及其间的任何数字或范围。在一些方面，第一延伸步骤持续约2分钟。

第一PCR可以包括任何合适数量的循环。通常，第一PCR的循环数低于10个循环，但也可以执行更多的循环数。第一PCR可以进行约1个循环、约2个循环、约3个循环、约4个循环、约5个循环、约6个循环、约7个循环、约8个循环、约9个循环、约10个循环。在一些方面，第一PCR包括约3-5个循环。

本文提供的确定样品中核酸质量的方法可以包括对样品进行第二聚合酶链式反应(PCR)。在一些方面，第二PCR中每个循环的第二延伸步骤的温度约为本文提供的PCR反应混合物中包含的第二正向和第二反向引物的5'末端共同序列的第二解链温度。在一些方面，第二延伸步骤在比第二解链温度低约5℃至比第二解链温度高约5℃的温度下进行。在一些方面，第二延伸步骤在比第一解链温度高至少5℃的温度下。在一些方面，第二延伸步骤在比第二解链温度低约5℃至比第二解链温度高约5℃且比第一解链温度高至少5℃的温度下进行。在一些方面，第二延伸步骤在约60℃至85℃进行。在一些方面，举例来说，第二延伸步骤在约60℃至85℃、约60℃至80℃、约60℃至75℃、约60℃至70℃、约60℃至65℃。在一些方面，第二延伸步骤在约80℃至85℃、约75℃至85℃、约70℃至85℃、约65℃至85℃、约60℃至85℃进行。在一些方面，第二延伸步骤在约70℃至75℃进行。在一些方面，第二延伸步骤在约70℃至73℃进行。在一些方面，第二延伸步骤在约70℃至72℃进行。在一些方面，第二延伸步骤在约70℃至71℃。在一些方面，第二延伸步骤在约70℃至70.9℃。在一些方面，第二延伸步骤在约70℃。

第二延伸步骤可以具有任何合适的时间长度。例如，第二延伸步骤可以持续约30秒、约40秒、约50秒、约1分钟、约1分10秒、约1分20秒、约1分30秒、约1分40秒，约1分50秒、约2分、约2分10秒、约2分20秒、约2分30秒、约2分40秒、约2分50秒、约3分钟，以及其间的任何数字或范围。在一些方面，第二延伸步骤持续约1分钟。

第二PCR可以包括任何合适数量的循环。通常，第二PCR的循环数大于10个循环，但也可以执行更少的循环数。第二PCR可以进行约10个循环、11个循环、约12个循环、约13个循环、约14个循环、约15个循环、约16个循环、约17个循环、约18个循环、约19个循环、约20个循环、约21个循环、约22个循环、约23个循环、约24个循环、约25个循环、约26个循环、约27个循环、约28个循环、约29个循环、约30个循环、约31个循环、约32个循环、约34个循环、约35个循环、约36个循环、约37个循环、约38个循环、约39个循环、约40个循环、约41个循环、约42个循环、约43个循环、约44个循环、约45个循环、约46个循环、约47个循环、约48个循环、约49个循环、约50个循环或更多个循环。在一些方面，第二PCR包括约10-35个循环。在一些方面，第二PCR包括约15-25个循环。

本文提供的用于确定样品中核酸质量的方法可以包括确定扩增子的大小范围。如本文所用，“扩增子”是指作为扩增或复制事件(例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)或基因复制)的产物的核酸。在提及扩增反应如PCR的产物时，术语“扩增子”和“PCR产物”可以互换使用，除非上下文另有明确说明。

第一正向和第一反向引物可以被设计为在它们的3’末端与沿逆转录转座子两条链的交错和/或非重叠序列具有互补性。因为每个第一正向引物通常可以与每个第一反向引物产生扩增子，并且每个第一反向引物通常可以与每个第一正向反向引物产生扩增子，所以可以使用本文提供的方法产生一系列大小的扩增子，包括约50个至200bp、约50至300bp、约50至400bp、约50至500bp、约50至600bp、约50至700bp、约50至800bp、约50至900bp、约50至1,000bp、约50至1,500bp、约50至2,000bp、约50至2,500bp、约50至3,000bp、约50至3,500bp、约50至4,000bp、约50至4,500bp、约50至5,000bp。在一些方面，扩增子的范围从大约100到2,000bp。通过本文提供的方法产生的任何扩增子的大小范围可用于核酸质量分析。

本文提供的确定核酸质量的方法可以包括确定扩增子的强度比。任何合适的方法都可用于确定扩增子大小和扩增子强度比，包括Agilent 4200 TapeStation系统、Agilent2200 TapeStation系统、Agilent 2100 Bioanalyzer系统、Agilent DNA ScreenTapeAnalysis、Agilent D1000和High Sensitivity D1000 Screen Tape Assays、Lab901TapeStation和Shimadzu MCE-202 MultiNA等。在一些方面，预测的扩增子大小的存在与核酸质量相关。在一些方面，预测的扩增子大小的存在与核酸大小相关。在一些方面，预测的扩增子强度的存在与核酸质量相关。在一些方面，预测的扩增子强度的存在与核酸质量相关。

如本文所用，单数形式“a”、“an”(一个/种)和“the”(所述/该)包括复数的指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“所述方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，这些是本领域技术人员在阅读本公开等后将显而易见的。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用的“约”在提及诸如量、时间长度等的可测量值时，意在涵盖与指定值±20％或±10％、或±5％、或甚至±1％的变化。与规定值相差1％，这样的变化适用于所公开的组合物或执行所公开的方法。

如本文所用，术语“核酸”是指任何脱氧核糖核酸(DNA)分子、核糖核酸(RNA)分子或核酸类似物。DNA或RNA分子可以是双链或单链的，并且可以是任何大小。示例性核酸包括但不限于染色体DNA、质粒DNA、cDNA、无细胞DNA(cfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、微小RNA(miRNA或miR)、hnRNA。示例性的核酸类似物包括肽核酸、吗啉代和锁核酸、二醇核酸和苏糖核酸。如本文所用，术语“核酸分子”和“核酸”意在包括例如核酸分子和核酸的片段以及任何全长或非片段化的核酸分子和核酸。

如本文所用，术语“核苷酸”包括核糖核酸和脱氧核糖核酸的单个单元以及核苷和核苷酸类似物，以及修饰的核苷酸，例如标记的核苷酸。此外，“核苷酸”包括非天然存在的类似物结构，例如其中糖、磷酸和/或碱基单元不存在或被其他化学结构取代的那些。因此，术语“核苷酸”包括单个肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)(Nielsen等人，Bioconjug.Chem.1994；5(1):3-7)和锁核酸(locked nucleic acid,LNA)(Braasch andCorey、Chem.Biol.2001；8(1):1-7)单位以及其他类似单位。

如本文所用，术语“样品”和“生物样品”是指适用于本文提供的组合物和方法的任何样品。与本发明的组合物和方法一起使用的样品可以从来自受试者的组织样品或体液，或通过活检操作(例如，针活检)或外科操作获得的组织获得。本方法的生物样品可以是体液样品，例如脑脊液(CSF)、血液、血清、血浆、尿液、唾液、泪液和腹水。可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法收集体液样品。

如本文所用，术语“受试者”是指对其执行本文公开的方法的任何个体或患者。术语“受试者”还可以包括作为与本文提供的组合物和方法一起使用的核酸的来源的任何个体或患者。术语“受试者”可以与术语“个体”或“患者”互换使用。受试者可以是人，尽管受试者可以是动物，如本领域技术人员将理解的。因此，其他动物，包括哺乳动物，例如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子，农场动物包括牛、马、山羊、绵羊、猪等，灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)、爬行动物、鸟类、两栖动物、硬骨鱼、软骨鱼和无脊椎动物都包括在受试者的定义内。受试者也可以是植物或微生物。

实施例1

本实施例描述了一种新型测定法的设计，该测定法提供了更广泛的DNA大小范围，用于分析来自单个扩增反应的核酸质量，可以与较低量的DNA一起使用，并且对各位点的DNA变异不太敏感.

例如，用于确定DNA质量的当前方法不足以有效地评估样品是否应该进行文库制备以用于下一代测序(NGS)。具有预测样品是否可以成功转化的成功的功能测定将非常有用。定量功能指数(Quantitative Functional Index,QFI)分析检查几个DNA片段的可扩增性，但片段数量和大小有限，限制了其用途。因此，生成了一种分析方法，可在更相关的大小范围内扩增更多的基因组片段，以提高分析方法的可预测性。

用于确定DNA质量的新测定法依赖于人类基因组中重复序列的扩增，其中少量的引物能够扩增基因组上数百或更多个不同的位点。这些引物可以扩增与NGS相关的区域，以便更准确地了解DNA质量。

引物是基于L1逆转录转座子的高度重复的5’末端的序列设计的。选择沿两条链的交错序列以具有均匀的解链温度并产生107-833bp范围内的片段大小。所选择的七种引物中的每一种都应与相反链上的其他引物产生>68种不同的扩增子。这样产生了在100-2,000bp区域内的多种大小的片段。图1概述了DNA引物和测定方法。

L1结合引物与人DNA中不存在的共同序列融合，其中一个序列添加到+链引物，另一个序列融合到-链引物。选择与融合点相邻的碱基以尽量减少与L1序列的重叠。然后将融合的引物以低浓度添加到扩增混合物中，并用于在L1序列的Tm处扩增基因组DNA，仅进行少量循环(例如3-5个循环，循环数可以优化)。图2显示了初始PCR的代表性LINE序列以及预期的扩增子长度和预测的扩增子数量。

在少量循环之后，将温度升高到5’末端融合序列的Tm，然后大量摩尔浓度过量的融合引物将反应扩增更多循环(例如15-25个循环，循环数可以优化)。这会产生大量的DNA片段，这些片段在标准DNA大小测定仪器(例如TapeStation、DNA测序仪或其他按大小分离DNA的方法)上进行分离。特定大小或大小范围的强度比用于与DNA大小和质量相关联。引物和引物组分如图3所示。预测扩增子的大小分布如图4所示。

对测定进行多种改动是可能的。例如，通用引物可以向L1序列内延伸一个或几个碱基，并用不同的颜色标签进行标记，以便更好地分辨特异性片段。例如，也可以使用不同的引物来提高性能。

该方法的益处源于使用重复DNA作为起始材料。每个基因组存在的DNA拷贝数多100到1000倍，因此可以检测到更少量的DNA，并且可以使用非常少量的起始材料。由于许多DNA片段的大小略有不同，因此与标准QFI检测相比，需要检测更多的大小。此外，由于检查了整个基因组的区域，因此基因组单个区域的变化不会对测定产生实质性影响。

总之，基于重复核酸序列的分析设计了一种用于确定核酸质量的新测定法。所述新的测定法可用于确定核酸质量，例如文库制备和下一代测序(NGS)等应用，以及任何其他对核酸质量很重要的应用。

序列

SEQ ID NO:1

TTCGGAACTCCTACGAGGTCCACT

SEQ ID NO:2

TCGCATCAGAGTCATCGTTGACC

SEQ ID NO:3

GAGATATGTGACCTTTCAG

SEQ ID NO:4

AGGAAACTCAAAGAAATT

SEQ ID NO:5

AGAATCAAGCAgaaattc

SEQ ID NO:6

CAGAAGAAAGAATTAGTGAG

SEQ ID NO:7

CTCACTAATTCTTTCTTCTG

SEQ ID NO:8

TAGAAAATAGCCTCAAAAG

SEQ ID NO:9

CCCAAACCTAGAGAAAG

SEQ ID NO:10

CTTTCTCTAGGTTTGGG

SEQ ID NO:11

AGAAATGCTAAAGGGAG

SEQ ID NO:12

CTCCCTTTAGCATTTCT

在本公开全文中对其他文件(例如专利、专利申请、专利出版物、期刊、书籍、论文、网络内容)的任何和所有提及和引用均通过引用的方式整体并入本文，用于所有目的。

尽管已经参照以上实施例描述了本发明，但是应当理解，修改和变化包括在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅由以下权利要求限制。

序列表

<110> PERSONAL GENOME DIAGNOSTICS INC.

THOMPSON, JOHN F.

<120> 用于核酸质量测定的组合物和方法

<130> PGDX3150-1WO

<140>

<141>

<150> 63/002,785

<151> 2020-03-31

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 1

ttcggaactc ctacgaggtc cact                                             24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 2

tcgcatcaga gtcatcgttg acc                                              23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 3

gagatatgtg acctttcag                                                   19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 4

aggaaactca aagaaatt                                                    18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 5

agaatcaagc agaaattc                                                    18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 6

cagaagaaag aattagtgag                                                  20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 7

ctcactaatt ctttcttctg                                                  20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 8

tagaaaatag cctcaaaag                                                   19

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 9

cccaaaccta gagaaag                                                     17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 10

ctttctctag gtttggg                                                     17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 11

agaaatgcta aagggag                                                     17

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸

<400> 12

ctccctttag catttct                                                     17

Claims (46)

1.一种用于确定样品中核酸质量的系统，包括：

(a)第一组引物，其中包括多个第一正向引物和多个第一反向引物，每个第一正向引物和每个第一反向引物包括：

(i)与所述核酸中的重复序列互补并具有第一解链温度的3'末端序列；和

(ii)所述核酸中不存在且具有第二解链温度的5’末端共同序列，

其中所述第二解链温度高于所述第一解链温度；和

(b)第二组引物，其中包括多个第二正向引物和多个第二反向引物，每个第二正向引物和每个第二反向引物包含5'末端共同序列。

2.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度高约5℃至25℃。

3.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第一解链温度为约45℃至70℃。

4.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第二解链温度为约60℃至85℃。

5.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第一组引物包括相等数量的第一正向引物和第一反向引物。

6.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第一组引物包括不相等数量的第一正向引物和第一反向引物。

7.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第二组引物包括相等数量的第二正向引物和第二反向引物。

8.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第二组引物包括不相等数量的第二正向引物和第二反向引物。

9.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第一组引物包含约1至20种第一正向引物和约1至20种第一反向引物。

10.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述第二组引物包含约1至20种第二正向引物和约1至20种第二反向引物。

11.根据权利要求1所述的引物系统，其中所述重复核酸序列包含逆转录转座子。

12.根据权利要求11所述的引物系统，其中所述逆转录转座子是L1逆转录转座子。

13.根据权利要求1所述的引物系统，其中每个第一正向引物的5'末端共同序列包含SEQ ID NO：1的序列。

14.根据权利要求1所述的引物系统，其中每个第一反向引物的5'末端共同序列包含SEQ ID NO：2的序列。

15.根据权利要求1所述的引物系统，其中每个第一正向引物的3'末端序列包含SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8的序列或其任何组合。

16.根据权利要求1所述的引物系统，其中每个第一反向引物的3’末端序列包含SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12的序列或其任意组合。

17.一种确定样品中核酸质量的方法，其中包括：

(a)制备聚合酶链式反应(PCR)混合物，其中包含：

(i)第一组引物，其包括多个第一正向引物和多个第一反向引物，每个第一正向引物和每个第一反向引物包含：

(i)与所述核酸中的重复序列互补并具有第一解链温度的3'末端序列；和

(ii)所述核酸中不存在且具有第二解链温度的5’末端共同序列，

其中所述第二解链温度高于所述第一解链温度；和

ii)第二组引物，其包含多个第二正向引物和多个第二反向引物，每个第二正向引物和每个第二反向引物包含5'末端共同序列；

(a)对所述样品进行第一聚合酶链式反应(PCR)，其中所述第一PCR中每个循环的第一延伸步骤处于大约第一解链温度的温度；

(b)对所述样品进行第二聚合酶链式反应(PCR)，其中所述第二PCR中每个循环的第二延伸步骤处于大约第二解链温度的温度；和

(c)确定扩增子的大小范围。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度高约5℃至25℃。

19.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一解链温度为约45℃至70℃。

20.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二解链温度为约60℃至85℃。

21.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一延伸步骤在低于所述第一解链温度约5℃至高于所述第一解链温度5℃且低于所述第二解链温度至少5℃的温度下进行。

22.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二延伸步骤在低于所述第二解链温度约5℃至高于所述第二解链温度5.0℃且高于所述第一解链温度至少5℃的温度下进行。

23.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一延伸步骤进行约2分钟。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二延伸步骤进行约1分钟。

25.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一组引物包含相等数量的第一正向引物和第一反向引物。

26.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一组引物包括不相等数量的第一正向引物和第一反向引物。

27.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二组引物包含相等数量的第二正向引物和第二反向引物。

28.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二组引物包括不相等数量的第二正向引物和第二反向引物。

29.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一组引物包含约1至20种第一正向引物和约1至20种第一反向引物。

30.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二组引物包含约1至20种第二正向引物和约1至20种第二反向引物。

31.根据权利要求17所述的方法，其中第二正向引物和第二反向引物的最终浓度大于第一正向引物和第一反向引物的最终浓度。

32.根据权利要求31所述的方法，其中第一正向引物的最终浓度与第一反向引物的最终浓度相同或相似。

33.根据权利要求31所述的方法，其中第二正向引物的最终浓度与第二反向引物的最终浓度相同或相似。

34.根据权利要求17所述的方法，其中所述重复核酸序列包含逆转录转座子。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述逆转录转座子是L1逆转录转座子。

36.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一PCR包括约3至5个循环。

37.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二PCR包括约10至35个循环。

38.根据权利要求17所述的方法，其中所述方法进一步包括确定扩增子的强度比。

39.根据权利要求17所述的方法，其中预测的扩增子大小的存在与核酸质量相关。

40.根据权利要求17所述的方法，其中预测的扩增子大小的存在与核酸大小相关。

41.根据权利要求17所述的方法，其中预测的扩增子强度比的存在与核酸质量相关。

42.根据权利要求17所述的方法，其中预测的扩增子强度比的存在与核酸大小相关。

43.根据权利要求17所述的方法，其中每个第一正向引物的5'末端共同序列包含SEQID NO：1的序列。

44.根据权利要求17所述的方法，其中每个第一反向引物的5'末端共同序列包含SEQID NO：2的序列。

45.根据权利要求17所述的方法，其中每个第一正向引物的3’末端序列包含SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8的序列或其任何组合。

46.根据权利要求17所述的方法，其中每个第一反向引物的3’末端序列包含SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12的序列或其任何组合。

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