CN116096910A - 低聚糖从细菌细胞中改善的输出 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于生产目标低聚糖的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞具有由重组基因或去调节的内源基因表达的糖转运蛋白和/或孔蛋白，从而促进目标低聚糖从细胞质转运到细胞环境中。还公开了使用所述基因工程化革兰氏阴性细菌细胞生产目标低聚糖的方法。

Description

低聚糖从细菌细胞中改善的输出

本发明涉及在细菌中生产低聚糖，以及用于生产低聚糖的细菌。

背景技术

低聚糖是由少量通过糖苷键彼此连接的单糖部分组成的糖分子。低聚糖具有能量储存、细胞识别和细胞粘附等多种功能，在医学和营养学领域具有重要意义。此外，低聚糖可以作为益生元。

低聚糖可以作为连接到蛋白质或脂质的聚糖存在。天然存在的非糖蛋白或糖脂组分的低聚糖的实例为由微生物分解淀粉产生的麦芽糖糊精。另一个实例为微生物响应渗透压而产生的渗透调节低聚糖。

一些低聚糖是不可消化的低聚糖，即不能在人小肠中消化的低聚糖。这些不可消化的低聚糖最近引起了人们的极大兴趣，因为它们可能具有益生元的作用。因此，它们通过大肠，在那里它们促进双歧杆菌(Bifidobacteria)的生长，双歧杆菌被认为对消化系统有益。这些膳食低聚糖的一个子集，即所谓的人乳低聚糖(HMO)特别令人感兴趣，因为它们仅存在于母乳中，并且经鉴定有助于婴儿健康微生物群、免疫系统及其认知能力的发育。

由于在除了母乳以外的天然来源中仅发现了一些HMO，例如在小须鲸、非洲狮、北极熊、倭黑猩猩、黑猩猩和猩猩的乳汁中发现了最主要的人乳低聚糖2’-岩藻糖基乳糖，但在驯养的产奶动物的乳汁中未发现，因此需要生产这些HMO–而非从自然资源中分离–以使它们可用作营养组合物的成分，所述营养组合物包括但不限于婴儿配方物。理论上，低聚糖可以通过化学合成或体外生物催化生产。低聚糖的化学合成包括在糖链的还原或非还原末端逐步加入单糖部分，所述加入包括引入和除去保护基。进一步考虑到立体化学的特性，结果证明化学合成不适合于以合理的成本向食品工业提供工业规模的低聚糖。或者，低聚糖可通过生物化学反应产生，其中酶在体外催化糖部分之间糖苷键的形成。然而，生物催化也不适合于以合理的成本以工业规模生产低聚糖，使得低聚糖可用于营养组合物中。

为了克服化学法和生物化学法生产低聚糖的缺点，近年来利用重组大肠杆菌(E.coli)细胞发酵生产一些低聚糖。在这些过程中，将能够在细胞内合成目标低聚糖的基因工程化大肠杆菌细胞在培养基中并且在允许大肠杆菌细胞合成目标低聚糖的条件下进行培养。在发酵步骤结束时，从培养基和/或大肠杆菌细胞中回收目标低聚糖。

从培养基中而非从细菌细胞中回收目标低聚糖是有利的，因为前者的回收相比从细胞裂解物中回收包括更少的工艺步骤，成本更低且不太繁琐。此外，使目标低聚糖从细菌细胞输出到培养基中是有益的，因为目标低聚糖的细胞内积累对细菌细胞产生渗透压，并因此影响生产力。因此，期望诱导或增强由微生物生产菌株在细胞内合成的目标低聚糖从细胞质向培养所述细菌细胞的培养基的输出。

国际出版物WO 2015/197082 A1公开了使用基因工程化大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株生产人乳低聚糖，所述菌株表达编码用于蔗糖内化的内膜转运蛋白和外膜孔蛋白的异源scrA和scrY基因等。

国际出版物WO 2018/165072 A1教导了通过表达异源多糖转运蛋白的Komatageibacter菌株生产胞外多糖。

Whitney,J.C.和Howell,P.L.(Synthase-dependent exopolysaccharidesecretion in Gram-negative bacteria；Trends in Microbiology(2003),Vol.21,No.2,第63-72页)综述了细菌细胞表面多糖分泌的机制，并讨论了该途径的关键保守组分(conserved component)。这些组分包括内膜包埋的多糖合成酶、含有周质的三四氨基酸重复基序(TPR)的支架蛋白和外膜β-桶状孔蛋白。

国际出版物WO 2017/042382 A1公开了使用基因工程化大肠杆菌菌株生产人乳低聚糖，所述菌株表达不同的异源低聚糖输出蛋白，包括YjhB、SetA和ProP。

国际出版号WO 2010/142305 A1公开了岩藻糖基乳糖的生产，其中使用表达糖外排转运蛋白(Set)家族成员的基因工程化大肠杆菌。

国际出版物WO 2018/077892 A1公开了使用基因工程化大肠杆菌菌株生产岩藻糖基化低聚糖，所述菌株表达yberc0001_9420伯氏耶尔森菌(Yersinia bercovieri)糖外排转运蛋白以输出2’-岩藻糖基乳糖。

出人意料地发现，糖转运蛋白和/或孔蛋白在能够合成目标低聚糖的革兰氏阴性细菌细胞中的重组表达介导或至少促进所需低聚糖从细胞质转运到培养基中。

发明内容

在第一方面，提供了用于生产目标低聚糖的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞能够在细胞内合成目标低聚糖，并且在其内膜中具有糖转运蛋白和/或在其外膜中具有孔蛋白，用于将目标低聚糖从细胞质转运到培养基中，其中糖转运蛋白和/或孔蛋白由重组基因或去调节的内源基因表达。

在第二方面，提供了基因工程化革兰氏阴性细菌细胞用于生产目标低聚糖的用途，所述细胞能够在细胞内合成目标低聚糖，并且在其内膜中具有糖转运蛋白和/或在其外膜中具有孔蛋白，用于将目标低聚糖从细胞质转运到培养基中，其中糖转运蛋白和/或孔蛋白由重组基因或去调节的内源基因表达。

在第三方面，提供了用于生产目标低聚糖的方法，其中目标低聚糖在根据第一方面的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞中合成，从细菌细胞的细胞质跨过细菌细胞的内膜和外膜转运到培养基中，并且从培养基中回收。

在另一方面，提供了一种用于增强在基因工程化革兰氏阴性细菌细胞中生产的目标低聚糖跨过所述革兰氏阴性细菌细胞的内膜和外膜转运到培养基中的方法。

附图说明

图1示出了柱形图，所述柱形图示出了表达来自重组基因的孔蛋白的细菌细胞的培养基中3-FL的相对量。

图2示出了柱形图，所述柱形图示出了两个大肠杆菌菌株中的糖转运蛋白MdfA的相对表达水平。

图3示出了柱形图，所述柱形图示出了培养基中与以不同水平表达糖转运蛋白MdfA的大肠杆菌细胞的细胞质中的LNT-II或LNT比率。

图4示出了柱形图，所述柱形图示出了培养基中与表达糖转运蛋白MdfA和不同的孔蛋白的大肠杆菌细胞的细胞质中的LNT-II或LNT比率。

图5示出了柱形图，所述柱形图示出了由具有糖转运蛋白和/或孔蛋白的大肠杆菌细胞生产的LNnT的相对胞外量。

图6示出了柱形图，所述柱形图示出了由具有糖转运蛋白和不同的孔蛋白的大肠杆菌细胞生产的胞外LNnT的相对量。

图7示出了柱形图，所述柱形图示出了具有孔蛋白和不同的糖转运蛋白的大肠杆菌细胞生产的胞外LNnT的相对量。

图8示出了柱形图，所述柱形图示出了在具有不同的孔蛋白的大肠杆菌细胞的培养基中的6’-SL含量。

图9示出了柱形图，所述柱形图示出了在具有不同的糖转运蛋白和孔蛋白的组合的大肠杆菌细胞的培养基中的6’-SL含量。

具体实施方式

根据第一方面，提供了用于生产目标低聚糖的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞能够在细胞内合成目标低聚糖，并且在其内膜中具有糖转运蛋白，用于将目标低聚糖从细胞质跨过内膜转运到周质空间中，并且还在其外膜中具有孔蛋白，用于将目标低聚糖从周质空间跨过外膜转运到细菌细胞的环境中，例如培养基。糖转运蛋白或孔蛋白或两者，糖转运蛋白和孔蛋白由重组基因或去调节的内源基因表达。糖转运蛋白和/或孔蛋白从重组基因中的表达使得能够表达异源的(即非内源的)糖转运蛋白和/或异源的孔蛋白，而糖转运蛋白和/或孔蛋白从去调节的内源基因中的表达使得能够在发酵生产目标低聚糖期间过表达内源糖转运蛋白和/或内源孔蛋白。应当理解，去调节的内源基因通常是重组基因，因为基因被基因工程化以去调节/提高其天然表达。

用于生产目标低聚糖的基因工程化细菌细胞为革兰氏阴性细菌细胞。革兰氏阴性细菌是指不保留用于细菌鉴别的革兰氏染色中的结晶紫染色剂的细菌。革兰氏阴性细菌的特征在于它们的细胞被膜，所述细胞被膜由薄的肽聚糖细胞壁组成，所述肽聚糖细胞壁夹在内细胞膜(也称为“内膜”或“细胞质膜”或“细胞膜”)和外膜之间。内膜和外膜之间的所述肽聚糖壁也称为周质空间。

可用于生产目标低聚糖的革兰氏阴性细菌的实例为来自假单胞菌属(Pseudomonas)和埃希氏菌属(Escherichia)的细菌菌株。在一些实施方案中，生产目标低聚糖的革兰氏阴性细菌细胞为大肠杆菌菌株，例如大肠杆菌K菌株或B菌株的后代。

基因工程化革兰氏阴性细菌细胞能够合成目标低聚糖。本文所用的术语“低聚糖”定义了一组具有大量结构不同的化合物的碳水化合物。术语“低聚糖”是指聚合糖分子，其由至少3个单糖部分组成，但不超过12个单糖部分，优选不超过10个单糖部分，它们通过糖苷键彼此连接。因此，目标低聚糖可以由三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二个单糖部分组成。目标低聚糖可以由直链的单糖部分组成，或者它可以由支链的单糖部分组成，其中至少一个单糖部分具有至少三个通过糖苷键与其键合的单糖部分。目标低聚糖的单糖部分可选自醛糖(例如阿拉伯糖、木糖、核糖、脱氧核糖、来苏糖、葡萄糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛糖、阿卓糖、甘露糖等)、酮醣(例如核酮糖、木酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖等)、脱氧糖(鼠李糖、岩藻糖、奎诺糖等)、脱氧氨基糖(例如N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰半乳糖胺等)、糖醛酸(例如半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)和酮醛糖酸(例如N-乙酰神经氨酸)。

在一个实施方案中，目标低聚糖选自中性低聚糖、唾液酸化低聚糖和N-乙酰基乳糖胺，即包含至少一个N-乙酰基-葡糖胺部分的低聚糖。在额外的和/或替代的实施方案中，目标低聚糖选自岩藻糖基化低聚糖，即包含至少一个岩藻糖部分的低聚糖。在额外的和/或替代的实施方案中，目标低聚糖选自酸性糖，即包含至少一个N-乙酰神经氨酸部分的低聚糖。

在某些实施方案中，目标低聚糖是人乳低聚糖。在额外的和/或替代的实施方案中，目标低聚糖选自2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、6’-岩藻糖基乳糖(6’-FL)、3’-半乳糖基乳糖(3’-GL)、4’-半乳糖基乳糖(4’-GL)、6’-半乳糖基乳糖(6’-GL)、3’-唾液酸乳糖(3-SL)、6’-唾液酸乳糖(6-SL)、2’,3-二岩藻糖基乳糖(DiFL)、乳-N-丙糖II(LNT II)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP I)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP IV)、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、乳-N-二岩藻糖基六糖I、乳-N-二岩藻糖基六糖II、乳-N-二岩藻糖基六糖III、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖、唾液酸乳-N-四糖a、唾液酸乳-N-四糖b、唾液酸乳-N-四糖c、二唾液酸乳-N-四糖、人血型抗原A型1、人血型抗原B型1、人血型抗原A型2或人血型抗原B型2。

基因工程化革兰氏阴性细菌细胞能够通过其细胞内生物合成生产低聚糖。因此，基因工程化革兰氏阴性细菌细胞具有通过将单糖部分从供体底物转移到受体分子来催化受体分子转化为目标低聚糖所必需的酶。

在一些实施方案中，受体分子为转化成三糖的二糖。在其他实施方案中，受体分子为转化成四糖的三糖。在其他实施方案中，受体分子为转化为五糖的四糖。在一些实施方案中，受体分子为转化为己糖的五糖。受体分子可被细菌细胞内化，优选地通过利用特异性导入物。额外地和/或替代地，受体分子可由细菌细胞在细胞内合成。

在具体的实施方案中，受体底物为被细菌细胞内化的单糖，并且由单糖部分延长以获得二糖，其中所述二糖通过加入额外的单糖部分而进一步被延长，使得合成由三个、四个、五个、六个或更多个单糖部分组成的目标低聚糖。例如，细菌细胞内化葡萄糖，其通过加入半乳糖部分转化为乳糖。然后所述乳糖可以转化为目标低聚糖，例如2’-FL、3-FL、LNT-II、LNT、LNnT、3’-SL、6’-SL或任何其他人乳低聚糖。

革兰氏阴性细菌细胞可以被基因工程化以具有介导受体分子(即单糖、二糖或低聚糖)通过将单糖部分从供体底物转移至受体分子而转化为目标低聚糖的酶。因此，革兰氏阴性细菌细胞可以含有至少一种重组基因，其编码介导受体分子转化为目标二糖或低聚糖的酶。

赋予革兰氏阴性细菌细胞将单糖部分添加到已内化或细胞内合成的受体分子上的酶促能力的基因或等同功能性核酸序列可以为同源核酸序列或异源核酸序列。异源核酸序列可来源于植物、动物、细菌、古菌、真菌或病毒。

催化单糖部分转移到受体分子的酶为糖基转移酶或转糖苷酶。在一些实施方案中，糖基转移酶催化作为供体底物的核苷酸活化糖中的单糖部分转移到受体。糖基转移酶可以选自半乳糖基转移酶、葡糖胺转移酶、唾液酸转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶、葡糖醛酸基转移酶、甘露糖基转移酶、木糖基转移酶和岩藻糖基转移酶。在额外的和/或替代的实施方案中，糖基转移酶选自α-1,2-甘露糖基转移酶、β-1,4-木糖基转移酶、β-1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶、β-1,6-N-乙酰葡糖胺转移酶、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺转移酶、α-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶、β-1,4-半乳糖基转移酶、β-1,6-半乳糖基转移酶、α-1,3-葡糖基转移酶、α-1,4-葡糖基转移酶、α-2,3-唾液酸转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶、α-2,8-唾液酸转移酶、α-1,2-岩藻糖基转移酶和α-1,3/1,4-岩藻糖基转移酶。

在一些实施方案中，单糖部分的供体底物为核苷酸活化糖。通常，核苷酸活化糖被糖基转移酶用作单糖部分的供体底物。核苷酸活化糖可以选自GDP-L-岩藻糖、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、CMP-N-乙酰神经氨酸、GDP-甘露糖、UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-N-乙酰葡糖胺。应当理解，岩藻糖基转移酶使用GDP-L-岩藻糖作为供体底物，而唾液酸转移酶使用CMP-N-乙酰神经氨酸作为供体底物，等等。

核苷酸活化糖可以由基因工程化细菌细胞以从头途径(de novo pathway)合成。额外地和/或替代地，细菌细胞使用补救途径来提供核苷酸活化糖。

在其中供体底物通过从头途径合成的实施方案中，细菌细胞具有核苷酸活化糖的从头生物合成所必需的酶。在一些实施方案中，细菌细胞已被基因工程化以具有至少一种编码核苷酸活化糖的从头生物合成途径所必需的酶的重组基因。在从头生物合成途径中，核苷酸活化糖由“简单”碳源(如葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油等)合成。

编码核苷酸活化糖的从头生物合成途径所必需的酶的基因可以是细菌细胞内源的，或者它们可以从外源引入细胞中以功能性方式转录和翻译。内源基因编码的蛋白质的功能性生物合成可通过基因工程化细菌细胞来修饰。例如，内源基因表达的改变可通过修饰基因的转录启动子、修饰基因的核糖体结合位点和/或修饰基因的蛋白质编码区的密码子使用来实现。此外，可以修饰基因的蛋白质编码核苷酸序列，使得所编码的酶的活性和/或特异性变得有利于所需的生物合成途径。本领域技术人员将知道需要在基因修饰的生物体中表达哪些基因以从头合成核苷酸活化糖供体分子。

在其中补救途径用于核苷酸活化糖供体底物的生物合成的实施方案中，细菌细胞包含催化核苷酸和单糖连接的酶。所述酶的一个实例是来源于脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)的双功能岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-磷酸-鸟苷酰转移酶FKP，其催化激酶反应和焦磷酸酶反应以形成GDP-岩藻糖。所述酶的另一个实例是来源于脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶NeuA，其形成CMP-神经氨酸。

在补救途径中用作形成核苷酸活化糖的底物的单糖可以被细菌细胞利用转运蛋白内化。此类转运蛋白的实例是岩藻糖通透酶FucP和来自大肠杆菌的唾液酸转运蛋白NanT。转运蛋白可以由内源基因编码并表达，或者可以由重组基因编码并表达。

在某些实施方案中，细菌细胞的至少一个内源基因缺失或功能性失活，所述内源基因编码防止或干扰目标核苷酸活化糖和/或低聚糖的生物合成的酶或蛋白质。

基因工程化革兰氏阴性细菌细胞在其内膜中具有糖转运蛋白。糖转运蛋白将目标低聚糖从细菌细胞的细胞质跨过其内膜转运到周质空间。

介导碳水化合物(例如目标低聚糖)跨内膜转运的糖转运蛋白可由单个多肽组成或可由多个多肽(每一个多肽被认为是亚基)组成，其形成跨内膜转运碳水化合物的同聚或异聚复合物。

在一些实施方案中，糖转运蛋白选自表1所列的转运蛋白。在额外的和/或替代的实施方案中，糖转运蛋白为主要易化因子超家族(MFS)的成员、糖:阳离子同向转运体家族的成员、核苷特异性转运蛋白家族的成员、ATP结合盒(binding cassette)超家族的成员或磷酸转移酶系统家族的成员。

在某些实施方案中，糖转运蛋白由功能性重组基因编码并表达。因此，在所述实施方案中，革兰氏阴性细菌细胞包含编码糖转运蛋白或糖转运蛋白复合物的至少一个亚基的功能基因或操纵子，其促进细胞内生产的目标低聚糖跨过细菌细胞的内膜转运到其周质中。

本文所用的术语“操纵子”是指包含两个或更多个蛋白质编码序列的核苷酸序列，其从相同的调节元件中转录，用于介导和/或控制细菌细胞中的表达。

本文所用的术语“功能基因”是指包含编码蛋白质或多肽的核苷酸序列的核酸分子，并且其还包含与所述编码蛋白质的核苷酸序列(开放阅读框)可操作地连接的调节序列，使得编码蛋白质或多肽的核苷酸序列可以在携带所述功能基因的细胞中表达/由携带所述功能基因的细胞表达。因此，当在允许功能基因表达的条件下培养时，所述功能基因表达，并且表达所述功能基因的细胞通常包含由功能基因的蛋白质编码区编码的蛋白质或多肽。如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限制，包括以类似于天然存在的核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。

本文所用的关于内源基因的术语“去调节”是指与基因在基因工程化细菌细胞的天然祖细胞中的表达相比，所述内源基因的蛋白质编码区的表达改变。基因的表达可以通过本领域技术人员已知的不同方法去调节。去调节基因表达的实例包括改变基因启动子的天然核苷酸序列、改变基因核糖体结合位点的天然核苷酸序列。

术语“去调节”包括基因表达的提高以及基因表达的减少或受损。

本文所用术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子、信号序列或转录因子结合位点阵列)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。因此，术语“启动子”是指在DNA聚合物中通常位于基因“之前”并提供转录成mRNA的起始位点的DNA序列。“调节子”DNA序列——在给定DNA聚合物中通常也位于基因的“上游”(即，之前)——与决定转录起始频率(或速率)的蛋白质结合。统称为“启动子/调节子”或“控制”DNA序列，这些在功能性DNA聚合物中位于选定的基因(或一系列基因)之前的序列共同确定是否会发生基因的转录(和最终表达)。在DNA聚合物中位于基因“之后”并提供终止转录成mRNA的信号的DNA序列称为转录“终止子”序列。

本文所用的术语“重组体”表示通过基因工程化方法产生的多核苷酸，例如基因或操纵子。因此，重组基因、操纵子或多核苷酸不是天然存在于与用于生产目标低聚糖的革兰氏阴性细菌细胞相同物种的细胞中。重组多核苷酸可以含有异源核苷酸序列，或表达由异源核苷酸序列编码的肽或蛋白质(即，“所述细菌细胞外源的”核苷酸序列)。重组细菌细胞可含有在其天然(非重组)前体中未发现的基因。重组细胞还可以含有在重组细胞的天然前体中发现的基因变体，其中所述基因通过技术手段被修饰并重新导入细胞中。术语“重组体”还包括含有核苷酸序列的细菌细胞，所述核苷酸序列对于细菌细胞是内源的，并且已被修饰而没有从细菌细胞中除去携带所述核苷酸序列的核酸分子。所述修饰包括通过基因替代、位点特异性突变和相关技术获得的修饰。因此，“重组多肽”是由重组细胞生产的多肽。

本文所用的“异源核苷酸序列”或“异源核酸”是来源于特定宿主细胞的外源(例如来自不同物种)的序列，或者如果来自相同来源，则是对其原始形式进行修饰的序列。因此，异源核苷酸序列可以是如下所述的核苷酸序列，其中异源蛋白质编码核苷酸序列与启动子可操作地连接，其中蛋白质编码核苷酸序列和启动子的核苷酸序列获自不同来源的生物体，或者，如果获自相同来源的生物体，则蛋白质编码核苷酸序列或启动子已经从其原始形式被修饰。异源核苷酸序列可以稳定地引入细菌细胞的基因组中，例如通过转座、转染、转化、接合或转导。可应用的技术可以取决于细菌细胞和待导入细菌细胞的核酸分子的特异性。各种技术是本领域技术人员已知的并且是例如公开于Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989)中的技术。因此，“基因工程化细菌细胞”或“基因工程化微生物细胞”应理解为已被外源多核苷酸序列转化或转染，或能够被外源多核苷酸序列转化或转染的细菌细胞。因此，用于本发明的核苷酸序列可以是，例如，包含在载体中，所述载体将被稳定地转化/转染或以其他方式引入宿主微生物细胞中。大量表达系统可用于生产多肽。所述载体尤其包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒的载体，以及衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒。表达系统构建体可以含有调节以及产生表达的控制区。通常，适于在细菌宿主细胞中维持、增殖或表达多核苷酸和合成多肽的任何系统或载体可用于所述方面的表达。合适的核苷酸序列可以通过各种公知和常规技术中的任何一种技术插入表达系统中，例如上文Sambrook等人中列出的技术。优选地，含有重组核苷酸序列的多核苷酸被稳定地导入革兰氏阴性细菌细胞的基因组中。基因组整合可通过重组或转座实现。

编码促进目标低聚糖跨内膜转运的转运蛋白或转运蛋白复合物的功能基因对于基因工程化细菌细胞可以是内源的或外源的。

在本发明的一个实施方案中，转运蛋白基因对于基因工程化细菌细胞是内源的。影响由转运蛋白基因的开放阅读框编码的蛋白质合成的功能元件可以被修饰，使得导致转运蛋白合成的开放阅读框的转录水平或mRNA的翻译水平不同于在前体细胞中天然存在的水平。与未修饰的状态相比，功能元件的修饰可以提高转录和/或翻译水平或者降低转录和/或翻译水平。修饰可以是单核苷酸修饰或完整功能元件的交换。在任一种情况下，转录和/或翻译的非天然水平被优化以转运目标胞内低聚糖跨过内膜。

在另一个实施方案中，所述基因或编码转运蛋白或转运蛋白复合物的基因对于基因工程化细菌细胞是外源的。在所述实施方案中，蛋白质编码区可操作地连接到天然存在的或人工的功能元件(例如启动子或核糖体结合位点)，其连接方式使得转运蛋白的转录水平和翻译水平对于目标低聚糖跨过内膜的转运被优化。

编码糖转运蛋白或糖转运蛋白亚基的基因的转录可以是组成型或调节型。本领域技术人员将知道如何选择和使用启动子和/或启动子与其他转录调节子的组合以实现编码糖转运蛋白的基因的最佳表达。

在其中编码糖转运蛋白的基因对于用于生产目标低聚糖的细菌细胞是外源性的实施方案中，基因的核苷酸序列与天然存在的核苷酸序列相比可以被修饰，但是可以编码具有未改变的氨基酸序列的多肽。

用于目标低聚糖跨内膜转运的糖转运蛋白可以具有其天然氨基酸序列，即天然存在的氨基酸序列。或者，糖转运蛋白的氨基酸序列与其天然氨基酸序列相比可以被修饰，使得所得变体在目标低聚糖的转运方面具有增强的活性和/或可具有其他有益特征，例如增强的蛋白质稳定性或可更稳定地整合到内膜中。

在具体的实施方案中，编码糖转运蛋白的核苷酸序列是人工的，因此，作为转运蛋白将目标低聚糖从细胞质输出到周质中的所得蛋白的氨基酸序列在自然界中是不存在的。

本文所用的术语“变体”是指分别不同于参考多核苷酸或多肽，但保留参考多核苷酸或多肽的基本(酶)性质的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变体在核苷酸序列上不同于另一参考多核苷酸。变体核苷酸序列的改变可以改变或不改变参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸的改变可以导致参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短，如下所述。多肽的典型变体在氨基酸序列上不同于另一参考多肽。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽可以通过一个或多个取代、添加、缺失的任意组合而在氨基酸序列上有所不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是遗传密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或者可以是未知天然存在的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可通过诱变技术、直接合成和本领域技术人员已知的其他重组方法制备。

在本发明的范围内，核酸/多核苷酸和多肽多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物也包括在这些术语中，其具有与野生型蛋白质编码的多肽具有大于约60％的氨基酸序列同一性，70％、75％、80％、85％、90％，优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，优选在至少约25、50、100、200、500、1000或更多个氨基酸的区域上。

因此，本文公开的任何基因/蛋白质的“功能性变体”是指仍保留与其所衍生的相应片段的基因或蛋白质活性相同或稍低的基因/蛋白质的序列变体。

合适的糖转运蛋白和/或其基因在表1中提供。

表1：糖转运蛋白及其在革兰氏阴性细菌细胞中表达时跨内膜转运低聚糖的基因。

革兰氏阴性细菌细胞在其外膜中具有孔蛋白，用于将目标低聚糖从周质空间跨过外膜转运到培养基中。

介导目标低聚糖跨过细菌细胞外膜转运的孔蛋白通常是在外膜中形成孔的“β桶状”蛋白。所述孔蛋白由β折叠组成，β折叠包括i)面向外侧的非极性氨基酸残基，因此允许孔蛋白整合到外膜的脂质层中，和ii)面向“桶”内侧的极性残基，因此产生水通道。

编码促进所需低聚糖跨外膜转运的孔蛋白的功能基因对于重组细胞可以是内源的或外源的。

在本发明的一个实施方案中，孔蛋白基因对于生产所需低聚糖的重组细胞是内源的。可以修饰影响开放阅读框转录的功能元件，使得开放阅读框的转录水平或导致孔蛋白合成的mRNA的翻译水平不同于细胞中天然存在的水平。与未修饰的状态相比，功能元件的修饰可以提高转录或翻译水平，或者降低转录或翻译水平。修饰可以是单核苷酸修饰或完整功能元件的交换。在任一种情况下，转录或翻译的非天然水平被优化以跨外膜转运目标低聚糖。

在另一个实施方案中，编码孔蛋白的基因对于重组细胞是外源的。所述蛋白质编码区与天然或人工的功能元件(如启动子或核糖体结合位点)可操作地连接，所述连接方式使得孔蛋白的转录水平和翻译水平对于目标低聚糖跨外膜的转运是最优化的。

编码孔蛋白的基因的转录可以是组成型或调节型。本领域技术人员知道如何选择和使用启动子和/或启动子加转录调节子以实现编码孔蛋白的基因的最佳表达。

在编码孔蛋白的基因对于低聚糖生产细胞是外源性的情况下，与编码相同氨基酸序列的天然核苷酸序列相比，所述基因的核苷酸序列可以被修饰。

用于跨外膜转运目标低聚糖的孔蛋白可以具有天然存在的氨基酸序列，或者可以修饰天然存在的氨基酸序列，使得孔蛋白的变体在低聚糖转运方面具有改善的特性。

在另一个实施方案中，编码孔蛋白的核苷酸序列可以是完全人工的，因此，作为碳水化合物孔蛋白的所得蛋白质的氨基酸序列是非天然存在的。

在一些实施方案中，孔蛋白选自表2中列出的孔蛋白。

表2：跨革兰氏阴性细菌细胞外膜转运低聚糖的孔蛋白和孔蛋白基因。

在某些实施方案中，孔蛋白由功能重组基因编码并表达。因此，在所述实施方案中，革兰氏阴性细胞包含编码孔蛋白的功能基因或操纵子，所述孔蛋白转运目标低聚糖跨过细菌细胞的外膜到细胞环境中。

编码用于跨外膜转运目标低聚糖的孔蛋白的功能基因对于基因工程化细菌细胞可以是内源的或外源的。

在本发明的一个实施方案中，孔蛋白基因对于基因工程化细菌细胞是内源的。影响由孔蛋白基因的开放阅读框编码的蛋白质合成的功能元件可以被修饰，使得导致孔蛋白质合成的开放阅读框的转录水平或mRNA的翻译水平不同于在前体细胞中天然存在的水平。与未修饰的状态相比，功能元件的修饰可以提高转录和/或翻译水平或者降低转录和/或翻译水平。修饰可以是单核苷酸修饰或完整功能元件的交换。在任一种情况下，转录和/或翻译的非天然水平被优化以跨外膜转运目标低聚糖。

在另一个实施方案中，编码孔蛋白的基因对于基因工程化细菌细胞是外源的。在所述实施方案中，蛋白质编码区可操作地连接到天然存在的或人工的功能元件(例如启动子或核糖体结合位点)，其连接方式使得孔蛋白的转录水平和/或翻译水平对于目标低聚糖跨过外膜的转运被优化。

编码糖孔蛋白的基因的转录可以是组成型或调节型。本领域技术人员将知晓如何选择和使用启动子和/或启动子与其他转录调节子的组合以实现编码糖转运蛋白的基因的最佳表达。

在其中编码孔蛋白的基因对于用于生产目标低聚糖的细菌细胞是外源性的实施方案中，基因的核苷酸序列与天然存在的核苷酸序列相比可以被修饰，但是可以编码具有未改变的氨基酸序列的多肽。

用于跨外膜转运目标低聚糖的孔蛋白可以具有其天然氨基酸序列，即天然存在的氨基酸序列。或者，孔蛋白的氨基酸序列与其天然氨基酸序列相比可以被修饰，使得所得变体在目标低聚糖的转运方面具有增强的活性和/或可具有其他有益特征，例如增强的蛋白质稳定性或可更稳定地整合到外膜中。

在具体的实施方案中，编码孔蛋白的核苷酸序列是人工的，因此，用于将目标低聚糖从周质空间转运到环境中的所得蛋白质的氨基酸序列在自然界中不存在。

所述基因工程化革兰氏阴性细菌细胞适合于并预期用于以工业规模生产目标低聚糖。本文所用的术语“工业规模”是指经济上可行的低聚糖生产。此外，术语“工业规模”是指在单次分批发酵(single batch fermentation)或单次补料分批发酵(single fedbatch fermentation)步骤和/或单次纯化操作中生产几千克低聚糖，优选几百千克，更优选几吨低聚糖的生产体积。

如果在培养基中且在允许大肠杆菌细胞合成目标低聚糖的条件下进行培养，则细菌细胞能够在细胞内合成目标低聚糖。在一些实施方案中，革兰氏阴性细胞是基因工程化的细菌细胞，其已被基因工程化以具有细胞内合成目标低聚糖以及细胞内合成和/或输入用于细胞内合成目标低聚糖的前体分子所必需的所有基因。

在一些实施方案中，目标低聚糖为3-岩藻糖基乳糖，糖转运蛋白为糖外排转运蛋白，以及孔蛋白选自OmpF、LamB和OmpC。

在一些实施方案中，低聚糖为乳-N-四糖，糖转运蛋白为MdfA，以及孔蛋白选自LamB、OmpC和OmpG。

在一些实施方案中，目标低聚糖为乳-N-新四糖，糖转运蛋白选自TP29、TP46、TP55、TP56和TP72，以及孔蛋白选自por01、por08、por09、por10和por15。

在一些实施方案中，目标低聚糖为6’-唾液酸乳糖，糖转运蛋白选自MdfA、MdTM和MdTL，孔蛋白选自OmpG、ScrY、OmpA、OmpF和CymA。

在本发明的一个实施方案中，目标低聚糖为6’-唾液酸乳糖。所述基因工程化细菌具有合成核苷酸活化糖CMP-唾液酸所必需的基因和功能性表达的2,6-唾液酸转移酶。通过表达编码外膜孔蛋白的基因，促进细胞内生产和细胞内积累的带电三糖分泌到发酵培养基中。

在另一个实施方案中，生产6’-唾液酸乳糖的基因工程化细胞表达编码促进细胞内合成低聚糖跨细胞质膜转运的转运蛋白的基因和编码外膜孔蛋白的基因。因此，酸性糖从细胞质到周质和到发酵培养基中的转运增强，其反映于发酵培养基中唾液酸乳糖浓度的提高。

在一个优选的实施方案中，跨外膜转运6’-唾液酸乳糖的孔蛋白选自低聚糖转运孔蛋白或属于OmpA-OmpF-porine(OOP)家族的孔蛋白(www.tcdb.org)。

在另一个实施方案中，能够生产6’-唾液酸乳糖的细胞包含编码主要易化因子(MFS)家族转运蛋白的外源基因，所述转运蛋白允许提高低聚糖产量。

在一个具体的实施方案中，6’-唾液酸乳糖合成细菌表达MFS转运蛋白基因和编码孔蛋白的基因。

在一个实施方案中，目标低聚糖为中性四糖乳-N-四糖。能够生产乳-N-四糖的革兰氏阴性细菌表达合成核苷酸活化糖UDP-半乳糖和UDP-N-乙酰葡糖胺所必需的所有基因，其含量足以将提供给细胞或由细胞合成的乳糖转化为乳-N-丙糖II，并在第二步中将乳-N-丙糖II转化为乳-N-四糖，其中使用功能性1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶和功能性β-1,3-半乳糖基转移酶。

在一个实施方案中，用于跨内膜转运乳-N-四糖的糖转运蛋白为MdfA。内源mdfA基因的过表达提高了乳-N-四糖向细胞周围环境的输出。

在一个实施方案中，目标低聚糖为乳-N-新四糖。能够生产乳-N-新四糖的工程化细菌表达合成核苷酸活化糖UDP-半乳糖和UDPN-乙酰葡糖胺所必需的所有基因，其含量足以将提供给细胞或由细胞合成的乳糖转化为乳-N-丙糖II，并在第二步中将乳-N-丙糖II转化为乳-N-新四糖，从而在第一步中使用功能性1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶，在第二步中使用功能性β-1,4-半乳糖基转移酶。

在一些实施方案中，糖转运蛋白基因和/或孔蛋白基因的表达增强了3-岩藻糖基乳糖从细胞质向细胞环境的转运。除编码转运蛋白和孔蛋白的基因外，3-岩藻糖基乳糖生产细胞还表达导致足够量的胞内GDP-岩藻糖和合成活性α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因。

用于生产目标低聚糖的基因工程化细菌细胞(优选地为大肠杆菌细胞)已被基因工程化以

-过表达内源糖转运蛋白，

-过表达内源孔蛋白，

-表达非内源糖转运蛋白，和/或

-表达非内源孔蛋白。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖为3-岩藻糖基乳糖，糖转运蛋白为MdfA多药物转运蛋白，和/或孔蛋白选自大肠杆菌OmpF、肠道沙门氏菌LamB、肠道沙门氏菌OmpC、大肠杆菌ScrY和铜绿假单胞菌AlgE。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖为3-岩藻糖基乳糖，基因工程化细菌细胞为大肠杆菌细胞，内源糖转运蛋白为MdfA多药物转运蛋白，和/或内源孔蛋白选自OmpF和ScrY，和/或非内源孔蛋白选自肠道沙门氏菌LamB、肠道沙门氏菌OmpC和铜绿假单胞菌AlgE。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖选自LNT-II和LNT，糖转运蛋白为MdfA多药物转运蛋白，和/或孔蛋白选自肠道沙门氏菌LamB，大肠杆菌OmpC和大肠杆菌OmpG变体E15H、E174H。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖选自LNT-II和LNT，基因工程化细菌细胞为大肠杆菌细胞，内源糖转运蛋白为MdfA多药转运蛋白，和/或(i)非内源孔蛋白选自肠道沙门氏菌LamB，大肠杆菌OmpC和大肠杆菌OmpG变体E15H、E174H，并且(ii)内源孔蛋白选自肠道沙门氏菌LamB，大肠杆菌OmpC和大肠杆菌OmpG变体E15H、E174H。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖选自LNT-II和LNT，糖转运蛋白选自林可链霉菌LmrC、大肠杆菌MdtM、胡萝卜软腐果胶杆菌SET、鸭源鸡杆菌YdeE、假单胞菌属SET，和/或孔蛋白选自大肠杆菌OmpF、大肠杆菌OmpC、肺炎克雷伯氏菌ScrY、肠道沙门氏菌OmpA、肠道沙门氏菌OmpN–OmpC。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖选自LNT-II和LNT，基因工程化细菌细胞为大肠杆菌细胞，内源糖转运蛋白为大肠杆菌MdtM，或非内源糖转运蛋白选自林可链霉菌LmrC、胡萝卜软腐果胶杆菌SET、鸭源鸡杆菌YdeE和假单胞菌属SET。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖选自LNT-II和LNT，基因工程化细菌细胞为大肠杆菌细胞，内源孔蛋白选自大肠杆菌OmpF和大肠杆菌OmpC，和/或非内源孔蛋白选自肺炎克雷伯氏菌ScrY、肠道沙门氏菌OmpA和肠道沙门氏菌OmpN–OmpC。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖为6’-唾液酸乳糖，糖转运蛋白选自大肠杆菌MdfA、大肠杆菌MdtM和大肠杆菌MdtL，和/或孔蛋白选自大肠杆菌OmpG变体E15H、E174H，大肠杆菌OmpF，肺炎克雷伯氏菌ScrY，肠道沙门氏菌OmpA，产酸克雷伯氏菌CymA。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖为6’-唾液酸乳糖，糖转运蛋白选自MdfA、MdtM和MdtL，和/或孔蛋白选自大肠杆菌OmpG变体E15H、E174H，大肠杆菌OmpF，肺炎克雷伯氏菌ScrY，肠道沙门氏菌OmpA和产酸克雷伯氏菌CymA。

在一些实施方案中，其中目标低聚糖为6’-唾液酸乳糖，基因工程化细菌细胞为大肠杆菌细胞，内源糖转运蛋白选自大肠杆菌MdfA、大肠杆菌MdtM和大肠杆菌MdtL；和/或(i)内源孔蛋白选自大肠杆菌OmpG变体E15H、E174H，大肠杆菌OmpF，或(ii)非内源孔蛋白选自肺炎克雷伯氏菌ScrY、肠道沙门氏菌OmpA和产酸克雷伯氏菌CymA。

根据本发明的一个方面，提供了一种用于生产目标低聚糖的方法，其中所述方法包括以下步骤

a)提供基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞

-具有细胞质、内膜、外膜和内膜与外膜之间的周质空间，

-能够在细胞内合成目标低聚糖，

-具有

(i)在其内膜中的糖转运蛋白，用于将目标低聚糖从细胞质跨过内膜转运到周质空间中，和

(ii)在其外膜中的孔蛋白，用于将目标低聚糖从周质空间跨过外膜进行转运，

其中糖转运蛋白和/或孔蛋白由重组基因表达

b)在允许细菌细胞在细胞内合成目标低聚糖的条件下培养细菌细胞；和

c)从培养基中回收目标低聚糖。

基因工程化细菌细胞可以为本文之前描述的任何基因工程化细菌细胞。

培养所述基因工程化细菌细胞是指在含有碳源和受体底物的培养基中使细胞生长。碳源可选自甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维素、糖原或其组合。

培养所述细胞可以在分批发酵、补料分批发酵系统或连续发酵系统中进行。优选地，培养过程包括细胞在过量碳源下的指数生长期和受碳源限制的细胞生长的第二期。

可以i)在发酵期间进行一次，ii)在发酵过程中进行多次大量(as bolus’)或iii)在整个发酵过程中以连续的方式进行受体底物的添加。

在发酵过程中未转化为低聚糖产物的受体底物可通过加入对剩余的受体低聚糖或/和受体底物的降解产物表现出特异性水解活性的酶来降解。这些酶可以以纯酶、高浓度表达所述酶的细胞的粗提物的形式添加，或者通过添加包含合成所述酶并将其分泌到培养基中的细胞的第二细胞培养物的形式添加。通过水解降解剩余的受体底物，有利于从发酵中纯化目标低聚糖产物，因为仅在单糖单元或两个单糖单元上不同的低聚糖难以通过技术手段大规模分离。

所需的低聚糖产物被分泌到发酵培养基中，并且生产细胞保持完整。在发酵过程结束时，通过离心或过滤将细胞从发酵培养基中分离，并从上清液中纯化所需的低聚糖。

为了从发酵培养基中纯化目标低聚糖，可以应用不同的技术方法。所述工艺包括但不限于：过滤、层析、透析、通过透滤或蒸发浓缩以及结晶。

纯化的目标低聚糖可以液体形式或作为干燥物质储存和使用。为了获得固体形式的目标低聚糖，可以将其冷冻干燥、喷雾干燥、造粒、结晶、在滚筒干燥器或带式干燥器上干燥。

通常，基因工程化细菌细胞用于低聚糖的发酵生产。

能够生产所需低聚糖的基因修饰生物体为革兰氏阴性细菌。

由大肠杆菌生产的低聚糖被认为是GRAS或对人类食用是安全的。

在低聚糖的发酵生产中，在允许低聚糖生产的条件下培养细菌细胞。从细菌细胞的细胞质或发酵液中回收低聚糖。优选地，从发酵液中回收目标低聚糖。将低聚糖分泌到发酵液中具有以下优点：由于溶解度和空间可用性的限制较少，回收所需的步骤较少而具有更高的生产率，因此，更高的回收率实现了更有效的方法。

本发明将参照具体的实施方案并参照附图进行描述，但本发明不限于此，而仅由权利要求书限定。此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二等用于区分相似的元件，而不一定用于描述时间上、空间上、等级上或任何其他方式上的顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文所述的本发明的实施方案能够以不同于本文所述或所示的其他顺序操作。

应当注意，权利要求中使用的术语“包括”不应当解释为限于其后列出的装置(means)；其不排除其他元件或步骤。因此，其应被解释为指定所述特征、整体、步骤或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整体、步骤或组件或其组合的存在或添加。因此，表述“包括装置A和B的设备”的范围不应限于仅由组件A和B组成的设备。这意味着，对于本发明，装置的相关组件仅为装置A和B。

在整个说明书中，对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着结合所述实施方案描述的具体特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书各处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都指同一实施方案，而是可以指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，如本领域普通技术人员根据本公开将显而易见的是，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。

类似地，应当理解，在本发明的示例性实施方案的描述中，本发明的各种特征有时在单个实施方案、附图或其描述中被组合在一起，以便使公开流畅并帮助理解各种特征中的一个或多个创造性方面。然而，这种公开方法不应被解释为反映了所要求保护的发明比每个权利要求中明确记载的特征需要更多的特征的意图。相反，如所附权利要求书所反映的，创造性在于少于单个前述公开实施方案的所有特征。因此，发明内容之后的权利要求在此明确地纳入到该发明内容中，其中每个权利要求本身作为本发明的单独实施方案。

此外，虽然本文所述的一些实施方案包括其他实施方案中所包括的一些特征但不包括其他特征，意味着不同实施方案的特征的组合在本发明的范围内，并且形成不同的实施方案，如本领域的技术人员将理解的。例如，在下文的权利要求中，任何要求保护的实施方案可以以任何组合使用。

此外，一些实施方案在本文中被描述为可以由计算机系统的处理器或由执行该功能的其他装置实现的方法或方法的元件的组合。因此，具有用于执行所述方法或方法的元件的必要指令的处理器形成用于执行所述方法或方法的元件的装置。此外，在本文中描述的设备实施方案的元件是用于执行由元件执行的功能以实现本发明的目的的装置的实例。

在本文提供的说明书和附图中，阐述了许多具体细节。然而，应当理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明的实施方案。在其他情况下，没有详细示出公知的方法、结构和技术，以免模糊对本说明书的理解。

现在将通过本发明的几个实施方案的详细描述来描述本发明。显然，在不脱离本发明的真实精神或技术教导的情况下，可以根据本领域技术人员的知识来配置本发明的其他实施方案，本发明仅由所附权利要求书的条款来限制。

实施例

实施例1：LC/MS分析

使用LC三重-四极杆MS检测系统(Shimadzu LCMS-8050)通过多反应监测(MRM)确定目标低聚糖的同一性。在四极杆1中选择并分析前体离子，然后用氩气进行碰撞诱导裂解(CID)，并在四极杆3中选择碎片离子。中间体和终产物代谢物的选择的跃迁和碰撞能见表3。使用Waters XBridge Amide HPLC色谱柱(3.5μm，

50mm)通过高效液相色谱法(HPLC)分离无颗粒培养物上清液或细胞质组分中的LNT、LNnT、6’-SL和3-FL的中性或酸性糖。中性糖用含0.1％(体积/体积)氢氧化铵的H₂O等度流洗脱。在LC/MS分析前，通过过滤(0.22μm孔径)制备中性低聚糖样品，并在Strata ABW离子交换基质(Phenomenex)上通过固相萃取清除。通过0.22μm过滤器过滤含6’-唾液酸乳糖的样品，在95℃下加热5分钟，并在13.000×g下离心5分钟。酸性糖的HPLC分离通过使用由50％乙腈组成的缓冲液A和由80％乙腈组成的缓冲液B梯度洗脱进行，两者均含有10mM乙酸铵，pH 4.2。HPLC系统包括在8℃下运行的Shimadzu Nexera X2 SIL-30 ACMP自动进样器、Shimadzu LC-20AD泵和在35℃下运行的Shimadzu CTO-20AC柱温箱，用于洗脱中性糖，并调节至50℃用于洗脱酸性糖。对于中性糖分析，注入1μL至仪器中，对于酸性糖测定，注入0.5μL至仪器中。流速设定为0.3mL/min(中性)、0.4mL/min(酸性)，对应于5分钟的运行时间。其中中性糖在负离子模式下分析，酸性糖在正离子模式下检测。质谱仪以单位分辨率运行。针对每种分析物优化碰撞能量、Q1和Q3预偏置。使用市售标准品(Carbosynth和Elicityl)建立定量方法。

表3.Shimadzu LCMS-8050三重四极杆(QQQ)质谱分析仪用于鉴定LNT、LNnT、3-FL和6’-SL(CE＝碰撞能)的诊断MRM跃迁和参数列表

实施例2：培养基

用于生长细菌细胞以生产低聚糖或目标低聚糖的培养基含有：3g/L KH₂PO₄、12g/LK₂HPO₄、5g/L(NH₄)SO₄、0.3g/L柠檬酸、0.1g/L NaCl、2g/L MgSO₄×7H₂O和0.015g/L CaCl₂×6H₂O，补充1ml/L微量元素溶液(54.4g/L柠檬酸铁铵、9.8g/L MnCl₂×4H₂O、1.6g/L CoCl₂×6H₂O、1g/L CuCl₂×2H₂O、1.9g/L MnCl₂×4H₂O、1.1g/L Na₂MoO₄×2H₂O、1.5g/L Na₂SeO₃、1.5g/L NiSO₄×6H₂O)。将培养基的pH值调节至7.0。向培养基中加入浓度为10mM至60mM的乳糖，用于目标低聚糖的细胞内合成。

实施例3：分别编码不同转运蛋白和孔蛋白的重组质粒的构建

质粒pINT(如WO 2017/042382中所述)用作克隆各种孔蛋白的编码序列的载体。所述载体包含ColE 1复制子、氨苄青霉素抗性基因和编码四环素抑制因子的基因。将各种孔蛋白的编码序列置于组成型Ptet启动子下。孔蛋白基因的转录被rrnB终止子终止。孔蛋白与链霉素抗性盒同时表达，允许选择整合外源基因的细胞。构建体P_tet-PORIN-rrnB-smRlox通过重叠延伸PCR与asl基因座(aslA和hemY之间的中间区)同源的大肠杆菌K12 DNA的600bp侧翼融合，并通过Hifi装配克隆到pINT载体骨架中(New England Biolabs,Massachusetts,USA)。

通过PCR扩增各种转运蛋白的编码区。通过反向PCR扩增pINT-aslPtet-PORIN-smRlox-asl质粒作为载体骨架——在四环素启动子处打开质粒。通过Hifi装配插入转运蛋白基因，其方式是将转运蛋白置于功能性四环素启动子之下，并通过其间的核糖体结合位点连接转运蛋白和孔蛋白的编码区。将各种孔蛋白的编码序列与各种转运蛋白基因融合，得到各种质粒，每个质粒含有在四环素诱导型启动子转录控制下的编码糖转运蛋白的基因和编码孔蛋白的基因。

为了将相应基因插入asl基因座中，从相应质粒中扩增asl-P_tet-TP-PORIN-smRlox-asl区域，并用于λ-Red介导的同源重组。为了随机插入P_tet-TP-PORIN-smRlox构建体，通过PCR使用插入了EZ-Tn5转座酶(Lucigen,Middleton,USA)的19bp识别位点的引物扩增该区域。体内EZ Tn5转座酶介导的构建体整合根据制造商的说明书进行。类似地，通过PCR从pINT-asl-P_tet-PORIN-smRlox-asl质粒扩增P_tet-PORIN-smRlox的EZ构建体。此外，通过PCR扩增P_tet-TP-cmRfrt构建体。

实施例4：通过基因工程化大肠杆菌提高3-FL输出

通过以下方式构建用于生产3-FL的细菌菌株：将α1,3-岩藻糖基转移酶基因(fucT)与编码乳糖通透酶的大肠杆菌lacY基因整合，GDP-岩藻糖途径，其包含编码磷酸甘露糖变位酶(manB)、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶(manC)、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)和GDP-岩藻糖合酶(wcaG)的基因以及低聚糖转运蛋白基因setA(糖外排转运蛋白A，记载于专利US 8,652,808中)，在基因lacZ(β-半乳糖苷酶)、ara(阿拉伯糖异构酶)、fucIK(L-岩藻糖异构酶、L-岩藻糖激酶)和wcaJ(UDP-葡萄糖：十一碳二烯磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶)缺失或失活的大肠杆菌BL21菌株中。

通过λ-Red介导的同源重组将基因元件asl-P_tet-TP-PORIN-smRlox-asl整合到aslA(推定(putative)硫酸酯酶)和hemY(蛋白质HemY)之间的区域中，并在含有链霉素的2YT培养基上选择克隆。在深孔板中分析带有编码低聚糖转运蛋白和孔蛋白的重组基因的选定克隆的3-FL生产。对于3-FL生产，将相应的细菌细胞接种于微量滴定板中的200μl矿物盐培养基中。细胞在30℃下以800rpm振荡并在80％湿度下生长。孵育24小时后，将50μl预培养物转移至深孔板中含20mM乳糖的400μl相同培养基中。细胞在相同条件下生长24小时。通过离心收获细胞后，将培养物上清液加热5分钟至95℃，再次离心并在LCMS级水中稀释，以通过LC-MS/MS测定3-FL浓度。

图1示出了与为不表达来自重组基因的孔蛋白的亲本大肠杆菌菌株的对照(A)相比，来自ompF基因的基因组整合重组型的表达或过表达大肠杆菌孔蛋白OmpF的重组大肠杆菌菌株(B)表现出3-FL向含有培养基中提高42％水平的3-FL的培养基中的输出改善。与对照(A)相比，携带和表达编码肠道沙门氏菌孔蛋白LamB(C)或OmpC(D)的重组基因的大肠杆菌菌株，显示3-FL输出进一步提高，因为培养物上清液中的3-FL水平分别提高74％或75％。

与未过量表达大肠杆菌MdfA的前体菌株(图10，■)相比，生产3-FL并过表达大肠杆菌MdfA(UniProt登录号：P0AEY8)的重组大肠杆菌菌株具有向培养基中的提高的3-FL输出(图10，●)。

与为既不携带重组孔蛋白基因也不携带重组低聚糖转运蛋白基因的前体菌株(数据未示出)的对照相比，孔蛋白基因和编码低聚糖转运蛋白的基因共表达，每个基因均由整合到大肠杆菌3-FL生产菌株的基因组中的重组基因表达，增强了3-FL的输出，其可由在这些转化体的培养基中存在的3-FL的量是对照组的约2.5倍来证明。例如，过表达其内源MdfA并表达大肠杆菌ScrY或铜绿假单胞菌AlgE的大肠杆菌菌株与过表达其内源MdfA，但未表达大肠杆菌ScrY和铜绿假单胞菌AlgE的前体菌株相比，导致培养物上清液中存在显著更多的3-FL。

实施例5：通过过表达低聚糖转运蛋白的大肠杆菌提高LNT的输出

使用能够生产LNT的代谢工程化大肠杆菌BL21(DE3)衍生物(A)过表达MdfA糖转运蛋白。因此，通过使用错配寡核苷酸的启动子诱变，mdfA的表达增加了约2.5倍(B)(图2)。条柱示出了通过ΔΔCt比较法定量的相对mdfA表达。将计算的相对表达值归一化(normalized)为GapA并对照菌株表达水平。

为了表达分析和测定培养物上清液以及细胞内的LNT量，将各克隆接种到摇瓶中的25ml无机盐培养基中。各克隆至少重复检测3次。细胞在30℃下以120rpm振荡且在80％湿度下生长。孵育20至24小时后，测定预培养物的光密度以在25ml含有10mM乳糖的相同培养基中以0.05的OD600接种主培养物。细胞在相同条件下再次生长48小时。通过离心收获细胞后，将上清液加热5分钟至95℃，再次离心并在HPLC分级水(HPLC-graded water)中稀释，然后通过LCMS测定LNT浓度。为了测定细胞内含量，离心1.5ml培养物，用500μl 4℃冷的0.9％NaCl洗涤所得沉淀，并再次离心。用-20℃冷的MeOH(50％)直接淬灭所得沉淀。通过离心沉淀细胞碎片，并将含有细胞内代谢物的上清液用于各自的稀释和LCMS定量。

与未过表达MdfA的亲本菌株的培养物上清液中的LNT-II(图3，A)和LNT(图3，A’)的水平相比，MdfA的过表达增强了LNT(图3，B’)以及LNT-II(图3，B)的输出，通过培养物上清液中LNT-II和LNT水平升高所揭示，而LNT-II和LNT的细胞内含量保持不变。

在实验室规模的发酵中分析促进LNT输出的效果，持续时间为96/100小时。在3-L发酵罐中的发酵证实，与对照菌株相比，在96小时的发酵时间，mdfA过表达菌株中的LNT产量增加超过60％。

不同孔蛋白基因在过表达mdfA的大肠杆菌菌株中的表达提高了LNT从细菌细胞的输出，如图4所示。图4示出了与不含用于表达所述三种孔蛋白中任何一种重组孔蛋白基因的亲本菌株(A，B)相比，在表达肠道沙门氏菌LamB(A’，B’)、大肠杆菌BL21 OmpC(A”，B”)或大肠杆菌OmpG的变体E15H、E174H(A”’，B”’)的菌株中，LNT-II(A，A’，A”，A”’)以及LNT(B，B’，B”，B”’)的输出提高。

实施例6：通过基因工程化大肠杆菌增强LNnT的输出

通过在araBA基因座中插入来源于脑膜炎奈瑟氏球菌的1,3-N-乙酰葡糖胺转移酶基因lgtA来制作生产LNT2的基本菌株，在缺失了wcaJ、lacZ、lacA、nagB、waaB、mdoH基因的大肠杆菌DH1菌株中异源表达大肠杆菌lacY。产生核苷酸活化糖UDP-半乳糖的代谢途径通过染色体过表达大肠杆菌pgm、galE和galU而增强。来自惰性凝聚杆菌(Aggregatibactersegnis)的1,4-β-半乳糖基转移酶基因lex-1被置于组成型启动子、rrnB终止子和庆大霉素抗性盒下。用添加Tn 5EZ转座酶识别位点的引物扩增含有核苷酸序列的1,4-β-半乳糖基转移酶基因，以允许转座子在体内随机整合到产生LNnT的大肠杆菌菌株中。

对于LNnT生产，将各克隆接种于微量滴定板中的200μl矿物盐培养基中。细胞在30℃下以800rpm振荡且在80％湿度下生长。孵育24小时后，将50μl预培养物转移至400μl含60mM乳糖的相同培养基中。细胞在相同条件下生长24小时。通过离心收获细胞后，将上清液加热5分钟至95℃，再次离心并在HPLC分级水中稀释，以通过LC-MS/MS测定LNnT浓度。

将EZ整合lex-1后的大肠杆菌产生LNnT的克隆用于进一步调查LNnT的输出。通过EZ Tn5转座酶，将各种tetP-TPPORIN-rrnB-smRlox构建体随机整合到产生LNnT的克隆的基因组中。

图5示出了单个大肠杆菌菌株的培养物上清液中LNnT的相对量，所述大肠杆菌菌株表达糖转运蛋白、孔蛋白、或孔蛋白和糖转运蛋白，并表现出与用作对照的亲本菌株相比输出增加。在图5中，A表示表达糖转运蛋白TP46的大肠杆菌菌株，B表示表达糖转运蛋白TP29和孔蛋白por14的大肠杆菌菌株，C表示表达孔蛋白por09的大肠杆菌菌株，D表示表达孔蛋白por10的大肠杆菌菌株，E表示表达孔蛋白por01的大肠杆菌菌株，F表示表达孔蛋白por15的大肠杆菌菌株，而G表示既不表达来自重组基因的糖转运蛋白也不表达孔蛋白的亲本大肠杆菌菌株。

图6示出了单个大肠杆菌菌株的培养物上清液中LNnT的相对量，所述大肠杆菌菌株表达糖转运蛋白、或孔蛋白和糖转运蛋白，并表现出与用作对照的亲本菌株相比输出增加。在图6中，A表示表达糖转运蛋白TP46和孔蛋白por08的大肠杆菌菌株，B表示表达糖转运蛋白TP46和孔蛋白por09的大肠杆菌菌株，C表示表达糖转运蛋白TP46和孔蛋白por10的大肠杆菌菌株，而D表示表达来自重组基因的糖转运蛋白TP46但不表达孔蛋白的大肠杆菌菌株。

图7示出了单个大肠杆菌菌株的培养物上清液中LNnT的相对量，所述大肠杆菌菌株表达孔蛋白、或孔蛋白和糖转运蛋白，并表现出与用作对照的亲本菌株相比输出增加。在图7中，A表示表达糖转运蛋白TP55和孔蛋白por09的大肠杆菌菌株，B表示表达糖转运蛋白TP56和孔蛋白por09的大肠杆菌菌株，C表示表达糖转运蛋白TP72和孔蛋白por09的大肠杆菌菌株，而D表示表达来自重组基因的孔蛋白por09但不表达糖转运蛋白的大肠杆菌菌株。

实施例7：通过基因工程化大肠杆菌增强6’-SL的输出

通过基因组整合分别编码CMP-唾液酸合成酶和α-2,6唾液酸转移酶的neuA基因和siaT基因，进一步修饰能够生产N-乙酰神经氨酸的代谢工程化大肠杆菌BL 21(DE3)衍生物。两种基因的表达都受组成型启动子的转录控制，得到能够在细胞内合成6’-SL的大肠杆菌菌株。

通过EZ转座将编码孔蛋白的基因整合到来自上述大肠杆菌菌株的克隆的基因组中。因此，从载体pINT-asl-Porin-Smlox中扩增了各孔蛋白基因，其前面是组成型启动子P_tet，后面是链霉素抗性基因。对于低聚糖转运蛋白基因与孔蛋白基因的组合的基因组整合，从pINT-asl-P_tet-TP-PORINsmRlox-asl中扩增各基因，并整合到上述大肠杆菌菌株的另一克隆的基因组中。为此，根据制造商的描述使用EZ-转座酶(Lucigene，Middleton，USA)用转座子转化电感受态大肠杆菌细胞。在含有链霉素的2YT培养基上选择含有染色体整合的细胞。

为了生产6’-唾液酸乳糖，将选择的大肠杆菌细胞接种于微量滴定板中的200μl矿物盐培养基中。对样本进行至少3次重复检测。细菌细胞在30℃下以180rpm振荡且在80％湿度下生长。培养20至24小时后，将50μl预培养物转移至400μl含40mM乳糖的无机盐培养基中。细菌细胞在相同条件下再次生长24小时。通过离心收获细胞后，将上清液加热5分钟至95℃，再次离心并在HPLC分级水中稀释，然后通过LCMS测定6’-唾液酸乳糖浓度。

通过基因组整合编码OmpG变体的孔蛋白基因(图8，B)或编码肺炎克雷伯氏菌的ScrY的孔蛋白基因(图8，C)，培养物上清液中6’-唾液酸乳糖的量提高了两倍。与不表达来自重组基因的孔蛋白的亲本大肠杆菌菌株(图8，A)相比，通过过表达肠道沙门氏菌的ompA(图8D)、大肠杆菌的OmpF(图8E)或产酸克雷伯氏菌的CymA(图8F)，6’-唾液酸乳糖产量提高了20-30％。

通过在生产6’-SL的大肠杆菌菌株中同时表达编码糖转运蛋白和孔蛋白的重组基因，使6’-唾液酸乳糖的产量增加了20至55％，如通过培养物上清液中6’-SL的相对量所测定。在图9中，A表示既不携带重组孔蛋白基因也不携带重组糖转运蛋白基因的对照菌株，B表示携带重组mdfA基因和重组产酸克雷伯氏菌cymA基因的基因工程化后代(descendent)，C表示携带重组mdtM基因和重组大肠杆菌ompF基因的基因工程化后代，以及D表示携带大肠杆菌重组mdtL基因和重组ompG基因的基因工程化后代。

Claims (9)

1.用于生产目标低聚糖的基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞

-具有细胞质、内膜、外膜和内膜与外膜之间的周质空间，

-能够在细胞内合成目标低聚糖，

-具有

(i)在其内膜中的糖转运蛋白，用于将目标低聚糖从细胞质跨过内膜转运到周质空间中，和/或

(ii)在其外膜中的孔蛋白，用于将目标低聚糖从周质空间跨过外膜进行转运，

其中糖转运蛋白和/或孔蛋白由重组基因或去调节的内源基因表达。

2.根据权利要求1所述的基因工程化细菌细胞，其中所述目标低聚糖为人乳低聚糖。

3.根据权利要求2所述的基因工程化细菌细胞，其中所述人乳低聚糖选自中性HMO和唾液酸化HMO，优选地选自2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-丙糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、3’-半乳糖基乳糖、6’-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖、二岩藻糖基-乳-N-新六糖、3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖、乳-N-唾液酸五糖a、乳-N-唾液酸五糖b、乳-N-唾液酸五糖c、岩藻糖基-乳-N-唾液酸五糖a、岩藻糖基-乳-N-唾液酸五糖b、岩藻糖基-乳-N-唾液酸五糖c、二唾液酸-乳-N-四糖、二唾液酸-乳-N-岩藻五糖、二唾液酸-乳-N-岩藻五糖、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖、3-岩藻糖基-6’-唾液酸乳糖和乳-N-新二岩藻六糖I。

4.根据前述权利要求中任一项所述的基因工程化细菌细胞，其中所述糖转运蛋白为内源转运蛋白或非内源转运蛋白，和/或其中所述孔蛋白为内源孔蛋白或非内源孔蛋白。

5.根据权利要求4所述的基因工程化细菌细胞，其中所述细菌细胞已被基因工程化以过表达所述内源糖转运蛋白和/或所述内源孔蛋白。

6.根据权利要求4所述的基因工程化细菌细胞，其中所述细菌细胞已被基因工程化以过表达所述非内源糖转运蛋白和/或所述非内源孔蛋白。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的革兰氏阴性细菌细胞用于生产目标低聚糖的用途。

8.一种生产目标低聚糖的方法，所述方法包括以下步骤

a)提供基因工程化革兰氏阴性细菌细胞，其中所述细菌细胞

-具有细胞质、内膜、外膜和内膜与外膜之间的周质空间，

-能够在细胞内合成目标低聚糖，

-具有

(i)在其内膜中的糖转运蛋白，用于将目标低聚糖从细胞质跨过内膜转运到周质空间中，和

(ii)在其外膜中的孔蛋白，用于将目标低聚糖从周质空间跨过外膜进行转运，

其中糖转运蛋白和/或孔蛋白由重组基因表达

b)在允许细菌细胞在细胞内合成目标低聚糖的条件下培养细菌细胞；和

c)从培养基中回收目标低聚糖。

9.一种用于增强目标低聚糖从革兰氏阴性细菌细胞向培养所述细菌细胞的培养基中输出的方法，其中所述细菌细胞已被基因工程化以在细胞内合成目标低聚糖，所述方法包括在所述细菌细胞中表达来自重组基因的非内源糖转运蛋白和/或非内源孔蛋白，和/或通过去调节内源糖转运蛋白和/或内源孔蛋白基因的表达的步骤。

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