CN116083572A - 一种检测il18基因启动子甲基化生物标志物的引物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测IL18基因启动子甲基化生物标志物的引物的应用。本发明首次发现了IL18基因启动子甲基化水平与RCC的TNM分期、病理分级以及预后密切相关；与此同时，本发明还首次发现了IL18基因启动子甲基化位点g04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234或cg26534425可作为一种新的RCC生物标志物，通过引物检测该生物标志物的甲基化水平，从而评估RCC患者的预后，这对于评估RCC患者的预后具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物检测技术领域，涉及一种检测IL18基因启动子甲基化生物标志物的引物应用，特别是涉及在评估肾细胞癌患者预后的应用，还涉及评估肾细胞癌患者预后的检测工具及其使用方法。
背景技术
近年来，越来越多的研究表明，异常的DNA甲基化参与了各种疾病和肿瘤的发生和发展。近年来，DNA甲基化水平的检测已逐渐成为评估患者预后的有效方法。目前，越来越多的研究关注DNA甲基化对RCC患者的预后的影响。
肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma，简称RCC)是最常见的肾脏恶性肿瘤。RCC的发病率占所有癌症的3％，尤其是在西方国家。近年来，免疫治疗取得了长足的进步，研究表明肾细胞癌具有高免疫原性，对免疫治疗敏感。然而，仍有部分RCC患者在初诊时已发生转移，免疫治疗效果有限，此类患者的生存率低于其他患者。因此，为提高对RCC患者预后评估的有效性，寻找新的DNA上的生物标志物对评估RCC患者的预后尤为关键。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种检测IL18基因启动子甲基化生物标志物的引物的应用，通过使用该引物检测IL18基因启动子甲基化生物标志物的甲基化水平，这对于评估RCC的TNM分期、病理分级以及RCC患者的预后具有重要意义。
为实现上述发明目的，一方面，本发明提供了检测IL18基因启动子甲基化的生物标志物，所述生物标志物为cg04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234或cg26534425中的任一种。
具体地，IL18基因在genbank中的登记号为3606，在染色体的位置：11号染色体长臂23.1(11q23.1)，由5个内含子和6个外显子组成，其编码区长582bp，编码194个核苷酸。IL18基因启动子区序列全长2000bp(在染色体的位置：chromosome11：112141260-112143259)。
进一步地，所述IL18基因的转录起始点在112143482，所述cg04100971位于IL18基因启动子上游21473bp处；所述cg05687149位于IL18基因启动子上游21739bp处；所述cg04929355位于IL18基因启动子上游20791bp处；所述cg09122223位于IL18基因启动子上游20969bp处；所述cg11304234位于IL18基因启动子上游20595bp处；所述cg26534425位于IL18基因启动子上游20719bp处。
另一方面，本发明提供了一种检测上述生物标志物的引物的应用，用于制备评估RCC患者预后的检测工具。其中，所述引物为任意可用于检测上述生物标志物甲基化水平的引物。
再一方面，本发明还提供了一种评估RCC患者预后的检测工具，包括引物，所述引物用于检测IL18基因启动子甲基化的生物标志物。
进一步地，所述生物标志物为cg04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234或cg26534425中的任一种。
进一步地，所述评估RCC患者预后的检测工具为单独试剂或试剂盒。
还有一方面，本发明还提供了上述检测工具的使用方法，利用所述检测工具，通过焦磷酸测序检测样本的IL18启动子甲基化生物标志物的甲基化水平，并基于所述生物标志物的甲基化水平评估RCC患者的预后。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明首次发现了IL18基因启动子甲基化水平与肾细胞癌的TNM分期、病理分级以及预后密切相关，具有临床诊断和指导意义；
(2)本发明还首次发现了IL18基因启动子甲基化位点g04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234或cg26534425可作为一种新的针对肾细胞癌的生物标志物，对评估RCC患者的预后有重要的价值。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1显示了IL18基因在RCC患者中高度表达且IL18基因与不良预后相关；图1A：TCGA数据库中RCC肿瘤组织和邻近正常组织之间IL18基因的mRNA的相对表达的关系图；图1B：CPTAC数据库中RCC肿瘤组织和邻近正常组织之间IL18基因的mRNA的相对表达的关系图；图1C和图1E：TCGA数据库中RCC患者不同TNM(Tumor Node MetastasisClassification)分期中IL18基因的表达情况的关系图；图1D和1F：TCGA数据库中RCC患者不同病理分级中IL18基因的表达情况的关系图；图1G：通过Kaplan-Meier生存分析，TCGA数据库中RCC患者的总生存期与IL18基因表达的关系图；图1H：通过Kaplan-Meier生存分析，TCGA数据库中RCC患者的总生存期与IL18基因表达的关系图；
图2显示了RCC肿瘤中IL18基因启动子与RCC中的正常邻近组织相比以常甲基化；图2A：TCGA数据库中肿瘤组织和正常组织在CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化差异对比图；图2B：GSE70303数据库中肿瘤组织和正常组织在CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化差异对比图；图2C：GSE105260数据库中肿瘤组织和正常组织在CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化差异对比图；
图3显示了IL18基因启动子甲基化与RCC肿瘤的侵袭性临床表型相关；图3A-3F：TCGA数据库中CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平与RCC患者的TNM分期的关系图；图3G-3L：TCGA数据库中CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平与RCC患者的病理分级的关系；
图4显示了RCC肿瘤组织中IL18基因启动子甲基化与水平与IL18基因表达的相关性；图4A-4F：TCGA数据库中RCC肿瘤组织中的CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平与IL18基因表达的关系图；
图5显示了IL18基因启动子甲基化水平与RCC患者的总生存期的相关性；图5A：TCGA数据库中CpG位点cg04100971的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系图；图5B：TCGA数据库中CpG位点cg05687149的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系图；图5C：TCGA数据库中CpG位点cg04929355的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系图；图5D：TCGA数据库中CpG位点cg09122223的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系图；图5E：TCGA数据库中CpG位点cg11304234的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系图；图5F：TCGA数据库中CpG位点cg26534425的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系图；
图6显示了IL18基因启动子甲基化水平与RCC患者的无病生存期的相关性；图6A：TCGA数据库中CpG位点cg04100971的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系图；图6B：TCGA数据库中CpG位点cg05687149的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系图；图6C：TCGA数据库中CpG位点cg04929355的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系图；图6D：TCGA数据库中CpG位点cg09122223的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系图；图6E：TCGA数据库中CpG位点cg11304234的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系图；图6F：TCGA数据库中CpG位点cg26534425的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例仅用于说明本发明，不用于限制本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
IL18是一种内毒素诱导的血清因子。它是IL1家族的成员之一，由24Kda前体产生，然后被caspase-1切割成成熟形式。人体中的大多数正常细胞，尤其是巨噬细胞和树突状细胞，都可以产生IL18。有趣的是，在不同的细胞环境中，IL18可以是抗肿瘤因子，也可以是致癌因子。最近已有越来越多的研究集中在IL18对癌症的影响上。迄今为止，关于IL18在肿瘤中作用的研究主要集中在IL18通过调节相关信号通路促进或已知肿瘤发展或免疫浸润。然而，IL18基因启动子甲基化对肿瘤尤其是肾细胞癌的发生、发展以及预后的影响仍然不清楚。本发明人通过研究肾细胞癌IL18基因以及IL18基因启动子甲基化状态对RCC患者的预后的影响，在此基础上完成了本发明。
如本文所用，术语“IL18基因”是指表达IL18血清因子的脱氧核苷酸序列。本领域的普通技术人员可以使用常规方法获得IL18基因的序列，如从NCBI获得。
如本文所用，“启动子甲基化”是指甲基与DNA的特定核苷酸的生物化学偶联或化学偶联。在本发明的上下文中，“DNA甲基化”指的是位于CpG-二核苷酸区段中的一个胞嘧啶(5-甲基胞嘧啶)的第五碳原子存在甲基基团。
启动子甲基化的分析方法属于现有技术，这些方法在本领域相关文献是已知的，本发明具体采用焦磷酸测序对样本进行检测，所述的焦磷酸测序包括以下步骤：
S1：提取DNA样本；
S2：对步骤S1提取的DNA进行转化、纯化；
S3：以步骤S2转化、纯化得到的DNA样本为模板，利用引物进行PCR扩增；
S4：对PCR产物，采用焦磷酸测序对样本进行测序分析，得到样本的甲基化水平。
如本文所用，术语“预后”是指描述患有恶性疾病的患者的健康状况或患者的健康状况将来的变化，其既可包括在没有治疗干预的情况下患者的健康状况，也可以包括患者正在接受或已经接受治疗后的健康状况,还包括患者将来接受治疗后的关于健康状况或健康状态变化的描述。本发明中的“预后”包括总生存期(Overall survival,OS)和无病生存期(disease-free survival，DFS)两项指标。
总生存期：是指从随机化(random assignment)开始至因任何原因引起死亡(death)的时间(失访患者为最后一次随访时间；研究结束时仍然存活患者，为随访结束日)。
无病生存期：是指从随机化开始至第一次肿瘤复发/转移或由于任何原因导致受试者死亡的时间(失访患者为最后一次随访时间；研究结束时仍然存活患者，为随访结束日)。通常作为根治术后的主要疗效指标。
如本文所用，“TNM分期”中TNM全称是Tumor Node Metastasis，其中，T(Tumor)指肿瘤原发灶的情况，随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加，依次用T1～T4来表示；N(Node)指区域淋巴结(regional lymph node)受累情况。淋巴结未受累时，用N0表示。随着淋巴结受累程度和范围的增加，依次用N1～N3表示；M(Metastasis)指远处转移(通常是血道转移)，没有远处转移者用M0表示，有远处转移者用M1表示。在此基础上，用TNM三个指标的组合划出特定的分期。
实施例1
本实施例研究IL18基因在RCC患者中的表达情况。
本发明人基于TCGA(癌症基因组图谱数据门户)数据库和CPTAC(美国国家癌症研究所的临床蛋白质组学肿瘤分析联盟)分析IL18基因在RCC肿瘤组织和配对的正常相邻组织中的表达，结果发现，与正常组织相比，IL18在RCC肿瘤组织中高度表达。其中，图1A示出TCGA数据库中RCC肿瘤组织和邻近正常组织之间IL18基因的mRNA的相对表达。图1B示出CPTAC数据库中RCC肿瘤组织和邻近正常组织之间IL18基因的mRNA的相对表达。同时，本发明还发现IL18基因的表达在不同病理分级和GRADE分级的肾细胞中存在差异表达，且IL18基因的表达与病理分级呈正相关。其中，图1C和图1E示出TCGA数据库中RCC患者不同TNM分期中IL18基因的表达情况。图1D和1F示出TCGA数据库中RCC患者不同病理分级中IL18基因的表达情况。
本发明基于对TCGA数据库中RCC患者的预后信息的分析，发现IL18基因的高表达与RCC患者的不良预后相关，这里的预后具体指患者的总生存期和无病生存期。其中，图1G示出TCGA数据库中RCC患者的总生存期与IL18基因表达的关系。图1H示出TCGA数据库中RCC患者的总生存期与IL18基因表达的关系。
本实施例的结果表明：IL18基因在RCC患者中高度表达并与不良预后相关。
实施例2
本实施例研究IL18基因启动子甲基化的位点。
本发明人通过TCGA数据库下载以TPM表示的RNA序列数据，使用R软件包(edgeR)和R版本4.0.3软件对相关数据进行归一化和处理，分析从Infinium人甲基化450珠芯片珠获得的差异甲基化位点对其中317例肿瘤组织进行甲基化和转录组分析，并将其与正常组织IL18基因启动子上甲基化位点进行甲基化程度差异分析比对，鉴定得到cg04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234和cg26534425是甲基化差异程度显著的位点。为了验证肿瘤组织中的IL18启动子甲基化，除TCGA数据库外，本发明还分析另外两个GEO数据集(GSE70303和GSE105260)中IL18基因启动子中的cg04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234和cg26534425这6个甲基化位点。其中，在不同数据库中取样数量以及分析方法如下方表1所示：
表1
结果发现，与正常组织相比，CpG位点cg04100971和cg05687149在肿瘤中显着高甲基化；而cg04929355、cg09122223、cg11304234和cg26534425与正常组织相比是低甲基化的。其中，图2A示出TCGA数据库中肿瘤组织和正常组织在CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化差异；图2B示出GSE70303数据库中肿瘤组织和正常组织在CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化差异；图2C示出GSE105260数据库中肿瘤组织和正常组织在CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化差异。
同时，基于TCGA数据库中RCC患者的数据分析还发现，IL18基因启动子的甲基化水平在RCC患者的不同TNM分期和病理分级中存在差异。图3A-3F示出TCGA数据库中CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平与RCC患者的TNM分期的关系。图3G-3L示出TCGA数据库中CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平与RCC患者的病理分级的关系。由图可见，TNM分期越晚、病理分级等级越高，cg04100971和cg05687149的甲基化水平越高，但cg04929355、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平越低。
这些结果表明：IL18基因启动子在RCC患者中异常甲基化，而IL18基因启动子的甲基化水平也与RCC的TNM分期、病理分级密切相关。
实施例3
本实施例研究IL18基因启动子甲基化水平与RCC中的IL18基因表达的关系。
本发明人通过分析TCGA数据库中IL18基因的表达与IL18基因启动子中6个CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平的关系，发现除了cg05687149位点外，其他5个位点与IL18基因的表达有关。其中，图4A-4F示出TCGA数据库中RCC肿瘤组织中的CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平与IL18基因表达的相关性。由图4A-4F可见，发现除了cg05687149位点外，其他五个甲基化位点也与IL18表达有关。其中，cg04100971的甲基化与IL18基因表达呈正相关，表明cg04100971甲基化水平越高，IL18基因表达程度越高；cg04929355、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化与IL18基因呈负相关，表明cg04929355、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平越低，IL18基因表达程度越高。
这些结果表明：IL18基因启动子的异常甲基化可能导致RCC中IL18基因的异常高表达。
实施例4
本实施例研究IL18基因启动子甲基化水平与RCC患者的预后的关系。
本发明人通过分析TCGA数据库中IL18基因启动子中6个CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234和cg26534425的甲基化水平与RCC患者总生存期和无病生存期的关系发现：
CpG位点cg04100971的高甲基化与较差的总生存期和较差的无病生存期相关；其中，图5A示出CpG位点cg04100971的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系；图6A示出CpG位点cg04100971的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系。
CpG位点cg05687149的高甲基化与良好的总生存期和良好的无病生存期相关；其中，图5B示出CpG位点cg05687149的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系；图6B示出CpG位点cg05687149的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系。
CpG位点cg04929355的低甲基化与较差的总生存期和较差的无病生存期相关；其中，图5C示出CpG位点cg04929355的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系；图6C示出CpG位点cg04929355的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系。
CpG位点cg09122223的低甲基化与较差的总生存期和较差的无病生存期相关；其中，图5D示出CpG位点cg09122223的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系；图6D示出CpG位点cg09122223的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系。
CpG位点cg11304234的低甲基化与较差的总生存期和较差的无病生存期相关；其中，图5E示出CpG位点cg11304234的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系；图6E示出CpG位点cg11304234的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系。
CpG位点cg26534425的低甲基化与较差的总生存期和较差的无病生存期相关；其中，图5F示出CpG位点cg26534425的甲基化水平与RCC患者总生存期的关系；图6F示出CpG位点cg26534425的甲基化水平与RCC患者无病生存期的关系。
这些结果表明：IL18基因启动子的甲基化水平与RCC患者的预后密切相关。因此，可以推论：IL18基因启动子的甲基化水平是评估RCC患者预后的潜在生物标志物，这意味着通过检测IL18基因启动子的CpG位点cg04100971、cg04929355、cg05687149、cg09122223、cg11304234或cg26534425中任一个位点的甲基化水平可以判断RCC患者的总生存期和无病生存期。
进一步地由图5B可见，在上述这6个CpG位点中，cg04929355是最显着的位点(P<0.0001)，而由图3B和3H可见，cg04929355在所有TMN晚期和病理等级中均显着低甲基化。因此，可以推论：cg04929355的甲基化水平是RCC患者的重要预后预测因子，意味着通过检测IL18基因启动子中的CpG位点cg04929355的甲基化水平可更有效地评估RCC患者的总生存期、无病生存期、肿瘤的病理分级和TNM分期。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(3)本发明首次发现了IL18基因启动子甲基化水平与RCC的TNM分期、病理分级以及预后密切相关，具有临床诊断和指导意义；
(4)本发明还首次发现了IL18基因启动子甲基化位点g04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234或cg26534425可作为一种新的肾细胞癌生物标志物，对RCC患者的预后有重要的价值。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，则本发明也意图包含这些改动和变形。
Claims (8)
1.一种检测IL18基因启动子甲基化生物标志物的引物的应用，其特征在于：用于制备评估RCC患者预后的检测工具。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述生物标志物为cg04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234或cg26534425中的任一种；
通过所述引物分析所述生物标志物的甲基化水平，并基于所述生物标志物的甲基化水平评估RCC患者的预后。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述cg04100971位于IL18基因启动子上游21473bp处；
所述cg05687149位于IL18基因启动子上游21739bp处；
所述cg04929355位于IL18基因启动子上游20791bp处；
所述cg09122223位于IL18基因启动子上游20969bp处；
所述cg11304234位于IL18基因启动子上游20595bp处；
所述cg26534425位于IL18基因启动子上游20719bp处。
4.一种评估RCC患者预后的检测工具，其特征在于：包括引物，所述引物用于检测IL18基因启动子甲基化的生物标志物。
5.根据权利要求4所述的检测工具，其特征在于：所述生物标志物为cg04100971、cg05687149、cg04929355、cg09122223、cg11304234或cg26534425中的任一种。
6.根据权利要求5所述的检测工具，其特征在于：
所述cg04100971位于IL18基因启动子上游21473bp处；
所述cg05687149位于IL18基因启动子上游21739bp处；
所述cg04929355位于IL18基因启动子上游20791bp处；
所述cg09122223位于IL18基因启动子上游20969bp处；
所述cg11304234位于IL18基因启动子上游20595bp处；
所述cg26534425位于IL18基因启动子上游20719bp处。
7.根据权利要求4所述的检测工具，其特征在于：所述检测工具为单独试剂或试剂盒。
8.一种基于权利要求4～7任一所述的检测工具的使用方法，其特征在于：利用所述检测工具，通过焦磷酸测序检测样本的IL18基因启动子甲基化生物标志物的甲基化水平，并基于所述生物标志物的甲基化水平评估RCC患者的预后。
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