CN116083402A - 一种β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种β‑1，3‑葡聚糖酶PeBgl1及其应用。本发明提供了一种β‑1，3‑葡聚糖降解酶PeBgl1，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述β‑1，3‑葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。其中β‑1，3‑葡聚糖降解酶PeBgl1来源于扩展青霉，经鉴定属于糖苷水解酶GH128家族。本发明构建了含β‑1，3‑葡聚糖酶PeBgl1基因的重组载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，同时为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。该酶在55℃和pH 6.0条件下具有较高的催化活性，能够高效水解昆布多糖。

Description

一种β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1及其应用。
背景技术
β-1，3-葡聚糖是一种在自然界中广泛存在的高分子多糖，其主链是由葡萄糖在C1和C3位上通过β-1，3-糖苷键连接而成。β-1，3-葡聚糖酶系主要包括三种酶：内切β-1，3-葡聚糖酶(endo-β-1，3-glucanase；EC 3.2.1.39)、外切β-1，3-葡聚糖酶(exo-β-1，3-glucanase；EC3.2.1.58)以及β-1，3-糖基转移酶(β-1，3-glycosyltransferase；EC2.4.1-)。内切β-1，3-葡聚糖酶又被称为昆布多糖酶，是一种专一性水解β-1，3-葡聚糖中的β-1，3-糖苷键的酶类。内切β-1，3-葡聚糖酶能够从β-1，3-葡聚糖糖链内部随机切断聚糖中的β-1，3-糖苷键，将聚糖水解生成一系列不同大小的寡糖。
昆布多糖又称海带多糖、褐藻淀粉，为海洋褐藻的重要贮藏多糖，约占褐藻干重35％。昆布多糖是一种水溶性多糖，是自然界常见的β-1，3-葡聚糖之一，含有部分β-1，6支链。昆布多糖及其衍生物具有广泛的生物学活性，是一种功能性多糖，在抗肿瘤，改善血脂浓度，早中期肾衰竭防治等方面均有研究报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在解决上述问题之一，提供了一种可以降解昆布多糖产生昆布寡糖的新型降解酶——β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1，弥补了现有酶基因库的不足。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1，所述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1是由SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
一种上述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组表达载体，其携带有上述编码β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的基因；具体是上述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因，利用NcoI和XhoI酶切后，插入质粒pET-30a，得到表达载体pET-30a-PeBgl1。
一种重组工程菌，其基因组中插入有上述编码β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的基因，能表达β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1。所述重组工程菌是将重组载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后，得到的重组菌株。
所述重组工程菌在制备β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1中的应用：一种制备所述的β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的方法：将重组工程菌进行培养，诱导表达获得目的蛋白。
具体步骤为：
(1)将重组工程菌(pET-30a-PeBgl1-Rosetta)涂布在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，挑取LB平板上长出的单克隆重组工程菌接种于(含有50μg/mL卡那霉素)LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养12-16h，得到培养液。
将得到的培养液按照1：100的体积比转接到LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)中，于37℃，180rpm培养3-4h，至OD值达到0.6-0.8之间；然后在LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使培养基中IPTG的终浓度为0.8mM，在16℃培养20h，得到大肠杆菌培养液；
(2)首先大肠杆菌培养液于4℃，8000rpm下进行离心15min，倒掉上清液，保留菌体；然后用pH 7.0的5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液将菌体重悬得到重悬液，再于10000rpm、4℃条件下离心5min，倒掉上清液后，再次加入5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬菌体(缓冲液：菌体2-3ml：1g)，得到细胞悬液；
(3)使用细胞超声破碎细胞仪，对得到的细胞悬液进行细胞破碎处理；将细胞悬液的置于冰中，破碎仪振幅杆深入到细胞悬液中，不要使振幅杆贴壁；工作功率设置为30％，破碎3s，休息3s，持续30min；破碎结束后在11000rpm、4℃条件下离心20min，收集上清液；
(4)上清液用0.22μm的无菌滤头过滤，即获得β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1。
所述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1在降解昆布多糖/制备昆布寡糖中的应用。
一种降解昆布多糖/制备昆布寡糖的方法：采用上述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1降解昆布多糖，得到昆布寡糖产物。
进一步地，所述降解的条件为：昆布多糖溶液的浓度为4mg/mL，温度25-70℃，pH值3.0-10.0，时间30分钟。
优选的，降解条件为：温度55℃，pH值6.0。
本发明的β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1来源于扩展青霉(Penicillium expansum，其来源自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：CGMCC NO.3.15686)，经鉴定属于糖苷水解酶GH128家族。本发明构建了含β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1基因的重组载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，同时为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。该酶在55℃和pH6.0条件下具有较高的催化活性，能够高效水解昆布多糖。
所述编码β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的基因，在制备降解昆布多糖/制备昆布寡糖的酶制剂中的应用。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1为表达产物SDS-PAGE电泳结果；
图2为反应温度对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对活力的影响；
图3为反应pH对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对活力的影响；
图4为PBS浓度对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对活力的影响；
图5为NaCl浓度对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对酶活的影响；
图6为金属离子及螯合剂对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对酶活的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
一种β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1，所述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1是由SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
上述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
一种重组表达载体，其携带有上述编码β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的基因；具体是上述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因，利用NcoI和XhoI酶切后，插入质粒pET-30a，得到表达载体pET-30a-PeBgl1。
一种重组工程菌，其基因组中插入有上述编码β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的基因，能表达β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1。所述重组工程菌是将重组载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后，得到的重组菌株。
所述重组工程菌在制备β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1中的应用：一种制备所述的β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的方法：将重组工程菌进行培养，诱导表达获得目的蛋白。
具体步骤为：
(1)将重组工程菌(pET-30a-PeBgl1-Rosetta)涂布在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，挑取LB平板上长出的单克隆重组工程菌接种于(含有50μg/mL卡那霉素)LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养12-16h，得到培养液。
将得到的培养液按照1：100的体积比转接到LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)中，于37℃，180rpm培养3-4h，至OD值达到0.6-0.8之间；然后在LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使培养基中IPTG的终浓度为0.8mM，在16℃培养20h，得到大肠杆菌培养液；
(2)首先大肠杆菌培养液于4℃，8000rpm下进行离心15min，倒掉上清液，保留菌体；然后用pH 7.0的5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液将菌体重悬得到重悬液，再于10000rpm、4℃条件下离心5min，倒掉上清液后，再次加入5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬菌体(缓冲液：菌体2-3ml：1g)，得到细胞悬液；
(3)使用细胞超声破碎细胞仪，对得到的细胞悬液进行细胞破碎处理；将细胞悬液的置于冰中，破碎仪振幅杆深入到细胞悬液中，不要使振幅杆贴壁；工作功率设置为30％，破碎3s，休息3s，持续30min；破碎结束后在11000rpm、4℃条件下离心20min，收集上清液；
(4)上清液用0.22μm的无菌滤头过滤，即获得β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1。
本发明的β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1来源于扩展青霉(Penicillium expansum，其来源自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：CGMCC NO.3.15686)，经鉴定属于糖苷水解酶GH128家族。本发明构建了含β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1基因的重组载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，同时为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。该酶在55℃和pH6.0条件下具有较高的催化活性，能够高效水解昆布多糖。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
实验材料和试剂：
1.菌株及质粒：E.coli DH5α、宿主菌Rosetta(DE3)、质粒pET-30a，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
2.酶类及其他生化试剂：限制性内切酶XhoI、NcoI，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
3.溶液及培养基：
(1)LB液体培养基的制备：溶解10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠于1000mL蒸馏水中，120℃高温灭菌20min。
(2)LB固体培养基的制备：于1000mL LB液体培养基中加入15g琼脂粉。将上述溶液120℃高湿灭菌20min后，使之降温直至50℃-55℃时，加入抗生素，摇晃均匀，倒入平皿中(切勿温度过低)即含有抗性的固体LB培养基，放入4℃保存。
(3)卡那霉素：称取0.5g卡那霉素溶于10mL蒸馏水中，配置成浓度50mg/mL的母液，2.2μm无菌滤膜过滤除菌，分装至1.5mL EP管中储存于-20℃冰箱备用。
(4)IPTG溶液：称取2.4g异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)溶于10mL蒸溜水中，配置成浓度为1M母液，无菌滤膜过滤除菌后，分装储存于-20℃冰箱备用。
(5)扩展青霉(Penicillium expansum)其来源自中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为：CGMCC NO.3.15686。
实施例1：
(1)β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1基因的PCR扩增
经预实验得知，当在苹果中接种P.expansum，在3h时，测得PeBgl1基因的表达水平最高；因此本实施例选择以接种苹果3h的P.expansum的cDNA为模板；
利用引物EX-F(5'-CGACCATGGTCTCTTTCACCAAGCTTTTC-3')和EX-R(5'-CGACTCGAGCGCAGAGACGTAAGCTTG-3')进行PCR扩增，扩增条件为94℃10min；94℃40s，61℃40s，72℃40s，34次循环；72℃10min；4℃保温；利用凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化，获得β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1基因。
(2)重组表达载体pET-30a-PeBgl1-Rosetta的构建
将步骤(1)得到的β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1基因利用NcoI和XhoI酶切后，插入质粒pET-30a，得到重组表达载体，记为pET-30a-PeBgl1；
(3)表达载体pET-30a-PeBgl1转化大肠杆菌Rosetta
将pET-30a-PeBgl1转化宿主Rosetta(DE3)感受态细胞后，得到重组菌株；
将重组菌株涂布在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，对阳性克隆进行测序，得到含有pET-30a-PeBgl1的Rosetta(DE3)外源表达转化子，记为pET-30a-PeBgl1-Rosetta。
(4)β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1的表达
将鉴定成功的阳性克隆pET-30a-PeBgl1-Rosetta涂布在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，挑取LB平板上长出的单克隆pET-30a-PeBgl1-Rosetta接种于5mL(含有50μg/mL卡那霉素)LB液体培养基中，37℃，180rpm振荡培养12-16h(依据菌体生长状况选取合适的培养时间，避免大肠杆菌活力下降)，得到培养液。
将得到的培养液按照1：100的体积比转接到装有50mL LB液体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)中，于37℃，180rpm培养3-4h，至OD值达到0.6-0.8之间；然后在LB液体培养基中加入浓度为1M的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使培养基中IPTG的终浓度为0.8mM，在16℃培养20h，得到大肠杆菌培养液。
诱导表达结束后，进行菌体的收集和重组蛋白的获得，具体操作按以下步骤进行：
①首先大肠杆菌培养液于4℃，8000rpm下进行离心15min，倒掉上清液，保留菌体；
②用pH 7.0的5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液将菌体重悬，10000rpm，4℃，离心5min，倒掉上清液后，再次加入5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬菌体，得到细胞悬液；
③使用细胞超声破碎细胞仪，对细胞悬液进行细胞破碎；将细胞悬液的置于冰中，破碎仪振幅杆深入到细胞悬液中，注意不要使振幅杆贴壁；工作功率设置为30％，破碎3s，休息3s，持续30min；破碎结束后11000rpm，4℃下离心20min，收集上清液。
④上清液用0.22μm的无菌滤头过滤，获得β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1。
SDS-PAGE进行目的蛋白的检验。考马斯亮蓝染色可见蛋白条带，如图1；结果显示重组蛋白分子量大小和预测结果保持一致，即获得了目的蛋白。
性能验证：
1、β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1的底物特异性
通过使用3，5-二硝基水杨酸(DNS)方法测量昆布多糖释放的还原糖量来测定β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1的活性。
在50μL含4.0mg/mL昆布多糖的5mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 7.0)中加入150μLβ-1，3-葡聚糖酶PeBgl1酶液，在55℃孵育30min后，加入300μL DNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温后，记录540nm处的吸光度，并换算为酶活力单位。1个酶活力单位(U)定义为在该反应条件下每分钟释放1μmoL还原糖所需的酶量。
分别用5mmol/L、pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制浓度为4mg/mL的昆布多糖、昆布二糖、昆布六糖、羧甲基纤维素钠、龙胆二糖、麦芽糖、水杨苷、木寡糖、几丁质，各取50μL作为底物，加入150μL酶液，55℃反应30min后，加入300μL DNS试剂，沸水浴5min终止反应，以提前灭活的酶液作为空白对照，测定540nm处吸收值。
昆布多糖(Laminarin)是一种水溶性多糖，是自然界常见的β-1，3-葡聚糖之一，主要含有β-1,3和部分β-1,6-糖苷键。
表1为PeBgl1的底物特异性测定；
Figure BDA0004058651060000071
结果如表1所示，PeBgl1主要作用于含有β-1，3糖苷键的底物，表明PeBgl1是一种β-1,3-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)。在标准测定条件下，该酶对只含有β-1，3糖苷键的底物昆布二糖酶活力是最高的，但是对既含有β-1，3糖苷键又含有β-1，6糖苷键(β-1，3糖苷键居多)的底物昆布多糖活力却相对较低。
2、β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1的最适温度和最适pH
采用5mmol/L、pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配置4mg/mL的昆布多糖溶液作为反应底物。取50μL昆布多糖溶液，加入150μL酶液，混匀，分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、70℃条件下反应30min，煮沸5min灭活，以灭活的酶液加昆布多糖溶液作为对照，DNS法测定还原性糖。最高酶活定义为100％。
分别用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(pH 3.0-5.0)、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 6.0-8.0)和Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.0-10.0)配制相应pH下的4mg/mL的昆布多糖溶液作为底物，并采用pH计校准。分别取50μL不同pH的昆布多糖溶液，加入150μL酶液，混匀，55℃反应30min后，加入300μL DNS试剂，沸水浴5min终止反应，以提前灭活的酶液加底物溶液作为对照，测定540nm处吸收值，最高酶活定义为100％。
图2为反应温度对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对活力的影响；对在不同温度下酶活性的测定结果表明，当反应温度在20℃-55℃范围内时，酶的活力都会随着温度上升逐渐升高；当反应温度在55℃-70℃范围内时，酶的活力都会随着温度上升逐渐下降。而一旦反应温度到达70℃，酶的活力会迅速下降到只有最高活力的20％，可见PeBgl1的最适反应温度为55℃。
图3为反应pH对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对活力的影响；通过PeBgl1在不同pH条件下水解昆布多糖的反应，可以得到该酶进行反应的最适pH为6.0，并且在pH 5.0-9.0的反应体系内PeBgl1的酶活力都可以达到最大活力的50％以上，说明该酶偏好较为碱性的反应环境，在偏酸的反应条件下(pH 3.0-4.0)，PeBgl1的酶活力只能达到最大活力的5％左右。
3、底物溶液中Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液浓度对重组酶酶活影响
分别用5、50、100、200mmol/L，pH 6.0的Na2HPO4-NaH2PO4的缓冲液配制4mg/mL的昆布多糖溶液。分别取50μL底物，加入150μL酶液，混匀，55℃反应30min后，加入300μL DNS试剂，沸水浴5min终止反应。以未处理的酶液的酶活为100％，提前灭活的酶液加底物溶液作为对照，测定540nm处吸收值。
图4为PBS浓度对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对活力的影响；从图4中可以看出用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配置4mg/mL的昆布多糖底物溶液，对酶活是有一定的抑制作用的。当加入Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液时，浓度为5mmol/L时酶活最高，随着浓度的升高，酶活在逐渐下降。当Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液的浓度达到200mmol/L时酶活降低到60％以下。
4、底物溶液中NaCl浓度对重组酶酶活的影响
分别用5、50、100、200mmol/L的NaCl缓冲液配制4mg/mL的昆布多糖溶液。分别取50μL底物，加入150μL酶液，混匀，55℃反应30min后，加入300μL DNS试剂，沸水浴5min终止反应。以未处理的酶液的酶活为100％，提前灭活的酶液加底物溶液作为对照，测定540nm处吸收值。
图5为NaCl浓度对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对酶活的影响；在昆布多糖底物溶液中加入NaCl，在NaCl浓度为100mmol/L时酶活显示最高，随着浓度的增加酶活有一定损失但总的来说适当的NaCl浓度对酶活有提升作用。
5、金属离子和表面活性剂对重组酶酶活的影响
分别配制浓度为50mmol/L的CuSO4、CaCl2、BaCl2、MgSO4、ZnSO4的水溶液。配制浓度为1.0％的SDS、TritonX-100、Tween-20的水溶液。取上述溶液将昆布多糖溶液稀释至相同浓度，至终浓度为5mM。分别取50μL底物，加入150μL酶液，混匀，55℃反应30min后，加入300μL DNS试剂，沸水浴5min终止反应。以水溶液稀释的酶液的酶活为100％，以各自溶液加底物溶液为对照，测定540nm处吸收值。
图6为金属离子及螯合剂对β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1相对酶活的影响；通过在标准反应体系中加入相同浓度的金属离子和化学试剂，结果显示PeBgl1的酶活会受一些金属离子和化学试剂的影响而发生显著的变化。
具体看来，一些表面活性剂不会对重组酶活力产生明显的影响，而有的则会有产生非常显著的影响；其中Zn2+的存在可显著抑制重组酶的活力，仅5mM的浓度就使重组酶活力下降了90％；Mg2+、Ca2+、Ba2+、Cu2+对重组酶的活力有不同程度的抑制作用，这表明重组酶对这部分金属离子和化学试剂表现出高度的敏感性。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的氨基酸序列；
SEQ ID NO.1：
MVSFTKLFTAGLVATSAMAAPMQAKRTTSGKRGAAYNDITTVSALTSGGTVSWAYNWAGSLSDSLPSDIEFVPMLWGTNFFGAWVTAIETALSSGSSYILGFNEPDMTSQANMSPADAASYYQTYITPYSGQAKLISPAVTSSTETGLGLDWFESFIGSCSSCGISGLAVHWYGDNADDFKTFVTKAVNTAAQYSLSEVWITEFALNADVNGSADPATTAAFLDEVLPWLDAQTGVTRYSYFMCAENYLLSGSTLNAAGQAYVSA
编码β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的基因的核苷酸序列；
SEQ ID NO.2：
5’-ATGGTCTCTTTCACCAAGCTTTTCACTGCCGGCCTCGTCGCCACCTCGGCTATGG CCGCCCCCATGCAGGCCAAGCGCACTACCTCTGGTAAGCGCGGTGCTGCCTACAACGATATCACCACCGTGTCTGCTCTGACCAGTGGTGGCACCGTCTCGTGGGCCTACAACTGGGCCGGCTCCCTCTCTGGTTCTCTCCCCTCAGACATCGAATTCGTTCCCATGCTCTGGGGCACCAATTTCTTTGGTGCCTGGGTGACCGCCATCGAGACCGCTTTGTCCAGCGGCAGTAGCTACATTCTGGGATTCAACGAGCCCGACATGGCTTCCCAGGCTAACATGAGCCCCGCGGATGCTGCCAGCTACTACCAGACCTACATCACCCCGTATTCCGGCCAGGCGAAGCTGATTTCCCCCGCCGTAACCTCCTCCACCGAGACCGGACTCGGTCTCGACTGGTTCGAGTCTTTCATCGGTAGCTGCAGCAGCTGTGGTATCTCCGGCCTCGCCGTTCACTGGTACGGTGACAATGCCGACGATTTCAAGACCTTCGTCACCAAGGCCGTCAACACTGCTTCCCAGTACAGTCTGTCCGAGGTCTGGATCACCGAGTTTGCTCTCAACGCTGATGTCAACGGCTCTGCGGACCCCGCTACTACTGCTGCTTTCCTTGACGAGGTTCTCCCTTGGTTGGATGCGCAGACTGGTGTCACTCGCTACTCTTACTTCATGTGCGCTGAGAACTACTTGCTCTCTGGCAGCACTCTCAACGCGGCTGGCCAAGCTTACGTCTCTGCGTAA-3’。

Claims (10)

1.一种β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1，其特征在于，所述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1是由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.如权利要求1所述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，携带有权利要求2所述β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因。
4.如权利要求3所述重组表达载体，其特征在于，步骤为：将β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的编码基因，利用NcoI和XhoI酶切后，插入质粒pET-30a，得到表达重组表达载体，记为pET-30a-PeBgl1。
5.一种重组工程菌，其特征在于，重组工程菌是将权利要求4所述的重组载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后，得到重组工程菌，记为pET-30a-PeBgl1-Rosetta。
6.一种制备所述的β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的方法，其特征在于，将重组工程菌进行培养，诱导表达获得目的蛋白。
7.如权利要求6所述的制备β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将重组工程菌涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基上，其中卡那霉素的终浓度为100μg/mL；经培养后挑取LB平板上长出的单克隆重组工程菌接种于LB液体培养基中，培养基中含有50μg/m的卡那霉素；于37℃，180rpm振荡培养12-16h，得到培养液；
将得到的培养液按照1：100的体积比转接到LB液体培养基中，培养基中含有50μg/m的卡那霉素；于37℃，180rpm培养3-4h，至OD值达到0.6-0.8之间；然后在LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使培养基中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的终浓度为0.8mM，在16℃培养20h，得到大肠杆菌培养液；
(2)首先大肠杆菌培养液于4℃，8000rpm下进行离心15min，倒掉上清液，保留菌体；然后用pH 7.0的5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液将菌体重悬得到重悬液，再于10000rpm、4℃条件下离心5min，倒掉上清液后，再次加入5mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液重悬菌体，其中缓冲液与菌体的用量比为2-3ml：1g，得到细胞悬液；
(3)使用细胞超声破碎细胞仪，对得到的细胞悬液进行细胞破碎处理；将细胞悬液的置于冰中，破碎仪振幅杆深入到细胞悬液中，不要使振幅杆贴壁；工作功率设置为30％，破碎3s，休息3s，持续30min；破碎结束后在11000rpm、4℃条件下离心20min，收集上清液；
(4)上清液用0.22μm的无菌滤头过滤，即获得β-1，3-葡聚糖酶PeBgl1。
8.如权利要求1所述的一种β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1在降解昆布多糖制备昆布寡糖中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，β-1，3-葡聚糖降解酶PeBgl1降解昆布多糖的降解条件为：温度25-70℃，pH值3.0-10.0，时间30分钟。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，温度55℃，pH值6.0。
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