CN116082495A - 一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：S1：预处理，将动物组织用氢氧化钠浸泡，纯化水清洗数遍，进行粉碎；S2：酶解，离心得到胶原蛋白粗提液；S3：盐析，获得胶原蛋白沉淀；S4：透析，除去小分子杂质；S5：冷冻干燥后，采用钴60辐照灭菌；S6：粉碎，分散于磷酸盐生理盐水，并加入添加剂；S7：高压均质，得到可注射的高浓度胶原蛋白，本发明采用预处理‑酶解‑盐析‑透析的方法制备出高纯度的胶原蛋白，通过冷冻干燥得到干态的胶原蛋白，此干态胶原蛋白可辐照灭菌，高压均质后得到一种适用于27G甚至更小规格针头的注射性高浓度胶原蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法。
背景技术
胶原蛋白具有生物相容性、生物可降解性、无毒性及低过敏反应等特性，用途非常广泛，涉及生物医学材料、医疗药品、化妆品、食品及化工原料等。高浓度的胶原蛋白能够按需制备成多种浓度，可适用不同的需求，可注射的高浓度胶原蛋白是一类经济价值很高的产品。
现有技术中，用于医疗材料的胶原蛋白一般需要过滤除菌，高浓度胶原蛋白不能直接过滤除菌，胶原蛋白作为高分子蛋白质只能配制成低至5‰以下的浓度才能通过0.22微米滤孔的滤膜，且过滤效率非常低。低浓度的胶原蛋白溶液一般通过蒸发浓缩或挥发性溶剂浓缩的方式来提高浓度，蒸发浓缩可能导致胶原蛋白热变性，制备步骤复杂，且耗时。挥发性溶剂浓缩则要考虑如何去除溶剂残留。因此，急需开发一种快速、简便且产量高的制备可注射的高浓度胶原蛋白的方法以解决上述技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，采用预处理-酶解-盐析-透析的方法制备出高纯度的胶原蛋白，通过冷冻干燥得到干态的胶原蛋白，此干态胶原蛋白可辐照灭菌，高压均质后得到一种适用于27G甚至更小规格针头的注射性高浓度胶原蛋白。
为了实现上述目的，本发明提供的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1：预处理，将动物组织用氢氧化钠浸泡，纯化水清洗数遍，进行粉碎；
S2：酶解，离心得到胶原蛋白粗提液；
S3：盐析，获得胶原蛋白沉淀；
S4：透析，除去小分子杂质；
S5：冷冻干燥后，采用钴60辐照灭菌；
S6：粉碎，分散于磷酸盐生理盐水，并加入添加剂；
S7：高压均质，得到可注射的高浓度胶原蛋白。
优选地，所述S1中，氢氧化钠的浓度为1M，浸泡时间为30-120min。
优选地，所述S2的具体步骤为：采用磷酸、醋酸或盐酸酸性溶液将注射用水调节pH在2.0-2.5之间，加入动物组织重量1/50-1/100的胃蛋白酶，搅拌72h。
优选地，所述S3的具体步骤为：加入氯化钠，使其浓度达到0.5-0.9M，搅拌，待胶原蛋白析出，离心，弃去溶液。
优选地，所述S4的具体步骤为：将S3得到的胶原蛋白沉淀装入透析袋进行透析7-10天，除去残留的氯化钠小分子杂质。
优选地，所述S5的具体步骤为：冷冻干燥后，采用钴60以12KGy的辐照剂量进行灭菌。
优选地，所述S6的具体步骤为：将灭菌后的胶原蛋白进行粉碎，将胶原蛋白以干品计按照1：15.6-32.3的质量比例加入到磷酸盐生理盐水中，制备出浓度为3-6％的高浓度胶原蛋白混合物，所述磷酸盐生理盐水中含有添加剂，所述添加剂包括0.3％利多卡因，0.1-0.2％甘油，0.1-0.2％透明质酸钠，0.1-0.4％羧甲基纤维素钠，0.1-0.2％明胶，0.4-0.5％磷脂，0.1-0.3％海藻酸钠，所述添加剂的质量百分比为占最终胶原蛋白混合物的质量百分比。
优选地，所述S7的具体步骤为：采用乳化机和高压均质机对混合物进行均质乳化处理。
本发明提供的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，具有如下有益效果。
1.本发明采用对干态胶原蛋白进行辐照灭菌替代低浓度胶原蛋白的过滤除菌，操作简便，效率高。
2.本发明采用将干态胶原蛋白溶解均质制备高浓度胶原蛋白替代低溶度胶原蛋白浓缩制备高浓度胶原蛋白，操作简便，效率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1
一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1：将动物组织用1M氢氧化钠浸泡30min，纯化水清洗数遍，进行粉碎。
S2：用磷酸溶液将注射用水调节pH至2.5，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶的量为动物组织重量的1/50)，搅拌72h。
S3：加入氯化钠，使其浓度达到0.5M，搅拌，待胶原蛋白析出，离心，弃去溶液。
S4：将得到的胶原蛋白装入透析袋进行透析7天，除去残留的氯化钠小分子杂质。
S5：冷冻干燥后，采用钴60以12KGy的辐照剂量进行灭菌。
S6：将灭菌后的胶原蛋白进行粉碎，将胶原蛋白(以干品计)按照1：32.3的质量比例加入到磷酸盐生理盐水(含有一定量的添加剂)中，可制备出浓度为3％的高浓度胶原蛋白混合物。此处添加剂为利多卡因(含量0.3％)、甘油(含量0.2％)、透明质酸钠(含量0.2％)、羧甲基纤维素钠(含量0.1％)、明胶(含量0.2％)、磷脂(含量0.4％)、海藻酸钠(含量0.3％)。添加剂含量是占最终胶原蛋白混合物的质量百分比。
S7：采用乳化机和高压均质机对上述混合物进行均质乳化处理，得到可注射的高浓度胶原蛋白。
实施例2
一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1：将动物组织用1M氢氧化钠浸泡60min，纯化水清洗数遍，进行粉碎。
S2：用醋酸溶液将注射用水调节pH至2.2，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶的量为动物组织重量的1/60)，搅拌72h。
S3：加入氯化钠，使其浓度达到0.6M，搅拌，待胶原蛋白析出，离心，弃去溶液。
S4：将得到的胶原蛋白装入透析袋进行透析8天，除去残留的氯化钠小分子杂质。
S5：冷冻干燥后，采用钴60以16KGy的辐照剂量进行灭菌。
S6：将灭菌后的胶原蛋白进行粉碎，将胶原蛋白(以干品计)按照1：24的质量比例加入到磷酸盐生理盐水(含有一定量的添加剂)中，可制备出浓度为4％的高浓度胶原蛋白混合物。此处添加剂为利多卡因(含量0.3％)、甘油(含量0.2％)、透明质酸钠(含量0.2％)、羧甲基纤维素钠(含量0.1％)、明胶(含量0.1％)、磷脂(含量0.4％)、海藻酸钠(含量0.3％)。添加剂含量是占最终胶原蛋白混合物的质量百分比。
S7：采用乳化机和高压均质机对上述混合物进行均质乳化处理，得到可注射的高浓度胶原蛋白。
实施例3
一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1：将动物组织用1M氢氧化钠浸泡90min，纯化水清洗数遍，进行粉碎。
S2：用盐酸溶液将注射用水调节pH至2.2，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶的量为动物组织重量的1/80)，搅拌72h。
S3：加入氯化钠，使其浓度达到0.7M，搅拌，待胶原蛋白析出，离心，弃去溶液。
S4：将得到的胶原蛋白装入透析袋进行透析9天，除去残留的氯化钠小分子杂质。
S5：冷冻干燥后，采用钴60以18KGy的辐照剂量进行灭菌。
S6：将灭菌后的胶原蛋白进行粉碎，将胶原蛋白(以干品计)按照1：19的质量比例加入到磷酸盐生理盐水(含有一定量的添加剂)中，可制备出浓度为5％的高浓度胶原蛋白混合物。此处添加剂为利多卡因(含量0.3％)、甘油(含量0.1％)、透明质酸钠(含量0.1％)、羧甲基纤维素钠(含量0.3％)、明胶(含量0.1％)、磷脂(含量0.5％)、海藻酸钠(含量0.1％)。添加剂含量是占最终胶原蛋白混合物的质量百分比。
S7：采用乳化机和高压均质机对上述混合物进行均质乳化处理，得到可注射的高浓度胶原蛋白。
实施例4
一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1：将动物组织用1M氢氧化钠浸泡120min，纯化水清洗数遍，进行粉碎。
S2：用磷酸溶液将注射用水调节pH至2.0，加入胃蛋白酶(胃蛋白酶的量为动物组织重量的1/100)，搅拌72h。
S3：.加入氯化钠，使其浓度达到0.9M，搅拌，待胶原蛋白析出，离心，弃去溶液。
S4：将得到的胶原蛋白装入透析袋进行透析10天，除去残留的氯化钠小分子杂质。
S5：冷冻干燥后，采用钴60以25KGy的辐照剂量进行灭菌。
S6：将灭菌后的胶原蛋白进行粉碎，将胶原蛋白(以干品计)按照1：15.6的质量比例加入到磷酸盐生理盐水(含有一定量的添加剂)中，可制备出浓度为6％的高浓度胶原蛋白混合物。此处添加剂为利多卡因(含量0.3％)、甘油(含量0.1％)、透明质酸钠(含量0.1％)、羧甲基纤维素钠(含量0.4％)、明胶(含量0.1％)、磷脂(含量0.5％)、海藻酸钠(含量0.1％)。添加剂含量是占最终胶原蛋白混合物的质量百分比。
S7：采用乳化机和高压均质机对上述混合物进行均质乳化处理，得到可注射的高浓度胶原蛋白。
(1)病毒灭活验证
对上述实施例1-4中制备过程中的NaOH处理过程，通过模拟实验验证病毒灭活效果。
样品加入指示病毒染毒后，经1mol/L的NaOH处理30min、60min、90min、120min后，均未检测出PRV(伪狂犬病毒)、VSV(水疱性口炎病毒)、EMCV(脑心肌炎病毒)和PPV(猪细小病毒)，该处理工艺可使PRV、VSV、EMCV和PPV滴度均下降4logs以上，说明该工艺可以快速灭活病毒，病毒灭活结果如表1所示。
表1病毒灭活结果
(2)透析清除氯化钠
上述实施例1-4中制备过程中将得到的胶原蛋白装入透析袋，将此透析袋置于注射用水，并每隔8h更换注射用水，透析7-10天后，采用硝酸银沉淀滴定法检测溶液中的氯化钠含量，均未检出，说明透析7天后氯化钠小分子杂质已被大量清除，氯化钠含量测定结果如表2所示。
表2氯化钠含量测定结果
| 实施例 | 氯化钠含量(mg/L) |
| 1 | 未检出 |
| 2 | 未检出 |
| 3 | 未检出 |
| 4 | 未检出 |
(3)内毒素含量测定
采用凝胶法对实施例1-4制备的胶原蛋白进行内毒素检测，按照药典以及试剂说明书进行操作。已知胶原蛋白植入剂细菌内毒素含量要求为小于0.5EU/mL，经检测，此方法制备的胶原蛋白内毒素含量已达到植入剂的标准，内毒素含量测定结果如表3所示。
表3内毒素含量测定结果
| 实施例 | 内毒素含量(EU/mL) |
| 1 | ＜0.5 |
| 2 | ＜0.5 |
| 3 | ＜0.5 |
| 4 | ＜0.5 |
(4)推挤力测定
将制备的高浓度胶原蛋白罐装于安装有27G注射针的针管中，以恒定的速度推挤芯杆向下运动，模拟实际使用情况，记录推挤力。一般地，推挤力小于30N就不会影响注射的适手性。此方法制备的高浓度胶原蛋白通过27G注射针的推挤力一般都小于10N，推注顺畅，推挤力测定结果如表4所示。
表4推挤力测定结果
| 实施例 | 推挤力(N) |
| 1 | 4.7 |
| 2 | 5.5 |
| 3 | 5.1 |
| 4 | 6.0 |
本发明采用预处理-酶解-盐析-透析的方法制备出高纯度的胶原蛋白，通过冷冻干燥得到干态的胶原蛋白，此干态胶原蛋白可辐照灭菌，高压均质后得到一种适用于27G甚至更小规格针头的注射性高浓度胶原蛋白。本发明采用对干态胶原蛋白进行辐照灭菌替代低浓度胶原蛋白的过滤除菌，操作简便，效率高。本发明采用将干态胶原蛋白溶解均质制备高浓度胶原蛋白替代低溶度胶原蛋白浓缩制备高浓度胶原蛋白，操作简便，效率高。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：预处理，将动物组织用氢氧化钠浸泡，纯化水清洗数遍，进行粉碎；
S2：酶解，离心得到胶原蛋白粗提液；
S3：盐析，获得胶原蛋白沉淀；
S4：透析，除去小分子杂质；
S5：冷冻干燥后，采用钴60辐照灭菌；
S6：粉碎，分散于磷酸盐生理盐水，并加入添加剂；
S7：高压均质，得到可注射的高浓度胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S1中，氢氧化钠的浓度为1M，浸泡时间为30-120min。
3.根据权利要求1所述的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S2的具体步骤为：采用磷酸、醋酸或盐酸酸性溶液将注射用水调节pH在2.0-2.5之间，加入动物组织重量1/50-1/100的胃蛋白酶，搅拌72h。
4.根据权利要求1所述的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S3的具体步骤为：加入氯化钠，使其浓度达到0.5-0.9M，搅拌，待胶原蛋白析出，离心，弃去溶液。
5.根据权利要求1所述的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S4的具体步骤为：将S3得到的胶原蛋白沉淀装入透析袋进行透析7-10天，除去残留的氯化钠小分子杂质。
6.根据权利要求1所述的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S5的具体步骤为：冷冻干燥后，采用钴60以12-25KGy的辐照剂量进行灭菌。
7.根据权利要求1所述的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S6的具体步骤为：将灭菌后的胶原蛋白进行粉碎，将胶原蛋白以干品计按照1：15.6-32.3的质量比例加入到磷酸盐生理盐水中，制备出浓度为3-6％的高浓度胶原蛋白混合物，所述磷酸盐生理盐水中含有添加剂，所述添加剂包括0.3％利多卡因，0.1-0.2％甘油，0.1-0.2％透明质酸钠，0.1-0.4％羧甲基纤维素钠，0.1-0.2％明胶，0.4-0.5％磷脂，0.1-0.3％海藻酸钠，所述添加剂的质量百分比为占最终胶原蛋白混合物的质量百分比。
8.根据权利要求1所述的一种可注射的高浓度胶原蛋白的制备方法，其特征在于，所述S7的具体步骤为：采用乳化机和高压均质机对混合物进行均质乳化处理。
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