CN116077731A - 一种基于鲵皮肤分泌物的组织修复材料及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学材料领域，具体涉及一种基于鲵皮肤分泌物的组织修复材料及其应用。本发明提供了一种鲵皮肤分泌物冻干粉在制备用于封堵屏障组织缺损的试剂盒中的用途，所述屏障组织缺损导致流体的快速泄露，其特征在于，所述试剂盒包括：(a)鲵皮肤分泌物冻干粉，所述鲵皮肤分泌物冻干粉的粒度包括60‑300目，所述鲵皮肤分泌物冻干粉用于施用至所述屏障组织缺损处并与所述屏障组织缺损处的自带体液反应，形成鲵皮肤分泌物水凝胶；所述自带体液因所述流体的快速泄露而产生，或因受损而产生，或是在所述屏障组织未受损时即已存在的体液；(b)补片，所述补片包括脱细胞生物补片或高分子材料补片，所述补片用于覆盖在所述鲵皮肤分泌物水凝胶上。
Description
优先权申请
本申请要求2021年11月05日提交的中国发明专利申请【CN2021113047716】、名称为“一种含鲵皮肤分泌物的自粘补片、制备方法及其应用”的优先权，该优先权发明专利申请以引用方式全文并入。
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，具体涉及一种基于鲵皮肤分泌物的组织修复材料及其应用。
背景技术
湿粘附(wet-adhesive，还可以理解为“湿粘结”)一直是科学界的一个研究难点，因为很多材料可以粘结干燥界面，但无法粘附湿润界面。而生物医药领域对湿粘附的需求很大，其中涉及通过湿粘附的方式进行组织修复(封堵)的领域包括组织缺损修复、疝修复和止血。此外，生物医药领域不仅要求材料能够湿粘附，还要求材料无毒。目前，许多潜在的湿粘附材料被研究出来，但它们往往需要特殊步骤(例如，需要额外的辐照来触发、使用前需要将不同液体成分混合等)来形成具有粘附性的水凝胶，这限制了其实际使用。
早产胎膜早破(Preterm premature rupture of membrane，PPROM)是指妊娠37周前发生的胎膜破裂，其与30-40％的早产有关，并且在所有妊娠中约有1-3％发生。此外，胎膜破裂仍然是胎儿手术的薄弱环节，在激光介入治疗双胎输血综合征(twin-twintransfusion syndrome，TTTS)中约有28％发生，在胎儿镜腔内气管闭合术(fetoscopicendoluminal tracheal occlusion，FETO)治疗先天性膈疝(congenitaldiaphragmatic hernia，CDH)中约有47％发生。PPROM导致的妊娠早期破水可以导致重大问题，包括婴儿出生过早以至于无法存活、肺部不成熟以及严重感染。因此，胎儿镜手术后对胎膜的密封，对获得良好的妊娠结果非常重要。
由于胎膜无血管分布，胎膜破裂后其自然修复能力极其有限，因此一般无法在自然状况下实现胎膜破裂的封堵和修复。此外，胎膜所处的体内环境较为特殊：流动的液体环境(羊水)和生命体的存在(胎儿)。具体地，胎膜所处的体内环境要求密封材料在液体环境中与胎膜实现良好粘附(即湿粘结)；流动且高压的液体环境可能会对胎膜，以及胎膜上的密封材料起到冲击作用；密封材料还可能对胎儿产生毒害作用。
众多体外和体内修复胎膜缺损的结果已被报道，使用各种密封剂和塞，包括基于纤维蛋白的产品、Ⅰ型胶原蛋白、注入血小板和冷冻沉淀、明胶/胶原塞和脱细胞组织支架。目前，这些材料都没有在临床上取得突出成绩。例如，在目前的一些研究中，贻贝仿生组织粘附剂(Mussel mimetic tissue adhesive)有被用来封闭胎膜缺损，因为贻贝仿生组织粘附剂可以粘附到潮湿的组织。但是，贻贝仿生组织粘附剂需要花费30秒才能在液体中形成胶水，这对封闭胎膜缺损是不方便的，因为流动的羊水随时可以从缺损处流出并冲走液体胶水。由于来自胎膜缺损的不可预测的流动液体和狭窄的操作空间，现有的需经过特殊步骤形成粘附性的湿粘附材料可能在辐照或添加第二种成分之前被洗掉，不适用于胎膜缺损等组织缺损的封堵修复。此外，虽然许多补片已被开发出来用于封堵组织缺损，但通常需要用缝合的手段来将补片固定在缺损处，这不仅会对组织造成新的组织损伤，还可能由于闭合不全或组织张力过大等原因，可能因为缝线脱落而导致损伤处流体渗漏。
发明内容
本发明提供了一种鲵皮肤分泌物冻干粉在制备用于封堵屏障组织缺损的试剂盒中的用途，所述屏障组织缺损导致流体的快速泄露，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)鲵皮肤分泌物冻干粉，所述鲵皮肤分泌物冻干粉的粒度包括60-300目，所述鲵皮肤分泌物冻干粉用于施用至所述屏障组织缺损处并与所述屏障组织缺损处的自带体液反应，形成鲵皮肤分泌物水凝胶；所述自带体液因所述流体的快速泄露而产生，或因受损而产生，或是在所述屏障组织未受损时即已存在的体液；
(b)补片，所述补片包括脱细胞生物补片或高分子材料补片，所述补片用于覆盖在所述鲵皮肤分泌物水凝胶上。
在一些实施例中，所述脱细胞生物补片包括脱细胞羊膜、脱细胞肠系膜、脱细胞心包膜、脱细胞腹膜和脱细胞小肠粘膜中的一种或多种。
在一些实施例中，所述高分子材料补片包括选自由以下组成的纤维：聚乙二醇、聚己内酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)烯、或其组合。
在一些实施例中，所述鲵包括大鲵属、隐鳃鲵属、山溪鲵属、小鲵属、巴鲵属、爪鲵属、肥鲵属、拟小鲵属、北鲵属和极北鲵属中的一种或多种。
在一些实施例中，所述流体包括气体、血液、肠液、胃液、尿液和胆汁中的一种或多种。
在一些实施例中，所述屏障组织包括胎膜、肺、胃、小肠、大肠、血管、心脏、肝脏、肾脏、胰腺、胆、甲状腺、胸腺、前列腺、脑、膀胱、脊髓和子宫中的一种或多种。
在一些实施例中，所述试剂盒用于封堵漏气的肺叶。
在一些实施例中，所述试剂盒用于封堵胎膜或胃或小肠的所述缺损。
在一些实施例中，所述补片为生物相容性的。
在一些实施例中，被所述补片覆盖的所述鲵皮肤分泌物水凝胶能够承受所述流体的快速泄露而产生的压力。
有益技术效果：
本发明提供的试剂盒形成的密封材料具有以下特点：
(1)本发明提供的试剂盒形成的密封材料在潮湿的屏障组织(例如胎膜、肺、胃、小肠)表面具有强粘附性，可以抵抗屏障组织缺损处的高压；
(2)本发明提供的试剂盒形成的密封材料可以简单、快速地将屏障组织缺损密封，一定程度上避免了在密封材料封堵完成前，屏障组织缺损处的流体将密封材料冲走的问题；
(3)本发明提供的试剂盒形成的密封材料无细胞毒性、生物相容性好，甚至可以促进屏障组织缺损的愈合。
(4)本发明提供的试剂盒形成的密封材料适用于多组织(例如，胃、小肠、肺、血管)、多pH(例如，pH约为2.0的胃液和pH约为7.2的羊水)和复杂环境(例如，蠕动的小肠、高爆破压力的血管)。
如本文所使用，术语“组织”是指活的或死的生物体的组织，或者来源于或设计为模拟活的或死的生物体的任何组织。组织可以是健康的、患病的、受到创伤的、受损的和/或具有遗传突变的。
如本文所使用，术语“屏障组织”是指处于身体内且内侧环境和外侧环境存在差异的组织。所述屏障组织的内侧环境通常存在流体而具有高于外侧环境的压力。在正常状态下，存在于内侧环境的流体因所述屏障组织的分隔而不会泄露至外侧环境。当所述屏障组织发生缺损时，存在于内侧环境的流体会从缺损处快速泄露，因此缺损处的压力可能比正常状态下的内侧环境更高。示例性屏障组织包括胎膜、肺、胃、小肠、大肠、血管、心脏、肝脏、肾脏、胰腺、胆、甲状腺、胸腺、前列腺、脑、膀胱、脊髓和子宫。此外，由于所述屏障组织发生缺损，因此所述屏障组织缺损处可能由于液体流体(例如，羊水、肠液、血液、尿液、胃液等)的泄露、受损而产生的组织液、屏障组织表面的潮湿环境自带的体液等原因存在一定的体液。例如，当所述屏障组织为肺时，尽管流体为气体，所述屏障组织缺损处的自带体液可能包括因受损而产生的组织液以及肺表面的潮湿环境自带的体液。
如本文所使用，术语“密封”或“封堵”是指材料阻止存在于内侧环境的流体向外侧环境泄露的状态。
如本文所使用，术语“试剂盒”可以包含一个或多个包装产品。如本文中所使用，“用于封堵屏障组织缺损的试剂盒”包含鲵皮肤分泌物冻干粉和补片。所述补片可以包括脱细胞生物补片或高分子材料补片。所述鲵皮肤分泌物冻干粉用于施用至屏障组织缺损处并与所述屏障组织缺损处的自带体液反应，形成鲵皮肤分泌物水凝胶，而所述补片用于覆盖在所述鲵皮肤分泌物水凝胶上。被所述补片覆盖的所述鲵皮肤分泌物水凝胶可以看作成一种密封材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为源自SSAD的粉末和水凝胶的显微镜和SEM的实验结果图；
图2为展示源自SSAD的水凝胶在水中的凝胶化速度和对组织的瞬间粘附的实验图；
图3为体外爆破压力测试的实验图；
图4为伤口愈合划痕试验和迁移试验的实验图；
图5为无菌破裂膜的临床前模型的实验图；
图6为本发明实施例六的对照组与SSAD+AAMMP组的胎儿的发育情况的实验图；
图7为潜在应用的实验图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围1～6的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
附图详细说明：
图1：a)源自SSAD的粉末(60、100、300目)的显微镜的宏观图；b)源自SSAD的粉末(60、100、300目)的电镜图；c)源自SSAD的水凝胶(60、100、300目)的电镜图；d)源自SSAD的粉末的粒径(μm)；e)源自SSAD的水凝胶的孔径(μm)；f)源自SSAD的水凝胶的孔隙率。
图2：a)源自SSAD的粉末的凝胶化，源自SSAD的粉末在与水接触3秒后成为具有粘性的水凝胶；b)源自SSAD的水凝胶可以在水下与胶原膜实现粘附。
图3：a)爆破装置示意图；b)没有AAMMP的60、100、300目的爆破压力；c)爆破压力测量的示意图；d)有AAMMP的60、100、300目的爆破压力；e)爆破过程中60、100、300目的最大水泡；f)60、100、300目的剪切强度。
图4：a)羊膜间充质干细胞的划痕试验；b)羊膜间充质干细胞的transwell；c)划痕试验的闭合；d)transwell的细胞数。
图5：a)未处理的羊膜的苏木精-伊红染色；b)AAMMP的苏木精-伊红染色；c)SD大鼠的胎膜缺损；d)在胎膜缺损周围喷洒的源自SSAD的粉末；e)源自SSAD的粉末与水混合时形成的源自SSAD的水凝胶；f)AAMMP被施于水凝胶以加固。
图6：a)胎儿的爪子被挤压到腹腔(enterocoelia)，对照组的胚胎停止发育，呈不正常的红色，外观变得模糊；b)水凝胶仍然粘附在胎膜上，SSAD+AAMMP组的胚胎发育正常
图7：a)用商业生物膜与源自SSAD的粉末结合，对漏气、撕裂的离体猪肺进行密封；b)用商业生物膜与源自SSAD的粉末结合，对漏液的离体猪胃进行密封；c)用商业生物膜与源自SSAD的粉末结合，对切开的离体猪小肠进行吻合；d)a)、b)和c)所构建的密封模型示意图；e)对a)所封堵的肺和c)所封堵的小肠的爆破测试。
实施例一：材料与方法
1.1 SSAD粉末的制备：用干净的水清洗，3岁健康雄性中国大鲵(3-6岁，体长65-110cm，体重2.8±0.7kg)。在温和的机械刺激下，诱发背侧皮肤的粘液分泌，并收集在干净的管子里。收集后，用灭菌的PBS洗涤SSAD、震荡、离心。将SSAD溶液冷冻干燥24h，磨成粉末，并分成不同的粒度(例如，60、100、300目)。为了获得相对均匀的块，将粉末通过相应尺寸的筛。没有通过较小尺寸的筛的粉末是本发明所需要的。较高的筛目值对应较小的筛孔尺寸，因此，粒度也较小。源自SSAD的粉末被储存在-20℃，直到进一步使用。皮肤是鲵的重要的呼吸器官，分布着粘液腺和颗粒腺。本发明选择中国大鲵皮肤分泌物(SSAD)的原因在于，其能够代表鲵这类两栖动物受刺激所分泌的粘液。电刺激和皮肤刮擦的方式可促进粘液的分泌。
1.2无细胞羊膜基质补片(AAMMP)的制备：使用通过剖腹产术出生的健康足月新生儿的羊膜来制备无细胞羊膜基质补片。羊膜被储存在-80℃。将冷冻的羊膜在PBS中洗涤3次，切成小块，并再次冷冻于-80℃。将小块进行三次冻融循环，然后在胰蛋白酶-EDTA溶液中4℃孵育过夜。完全DMEM被用来中和胰蛋白酶。在4℃，用细胞刮将细胞从羊膜分离出来。用PBS洗涤3次后，将支架冷冻干燥24h并在-80℃储存3个月。图5a-图5b所示的苏木精-伊红染色图显示，上述操作已经除掉了新鲜羊膜的大部分细胞。无细胞羊膜的厚度(170.3±24.5μm)高于新鲜羊膜(51.4±6.0μm)，这是因为胰蛋白酶-EDTA使组织更松散。
1.3组织粘合强度的体外测试：使用万能试验机(MTS Criterion，Model 43，USA)进行了搭接剪切实验(Lap shear experiments)，以评估SSAD的粘合(bonding)性能。猪皮被用作粘合基质。猪皮被切成1×8cm2的矩形。将源自SSAD的粉末涂抹在猪皮的相关部位，加入少量的PBS，然后将猪皮与另一块猪皮接合以在30s内实现粘合。在粘合后2分钟，使用万能试验机在100-N的负载和1mm/min的速度下评估粘合区域的粘合性。
1.4体外爆破压力测试：源自SSAD的水凝胶的爆破压力，是通过使用外科密封剂爆破强度的标准测试方法(ASTM F2392-04)来测试的。在样品测试前，将套管(40mm×40mm)浸泡在去离子水中。在胶原片的中心创造了一个圆形的缺损(直径3mm)，该缺损被置于2个特氟隆片(35mm×35mm)之间。然后，将胶原套管片放入爆破压力测试系统。测试的粘合剂总共有六类，包括60目、100目、300目的源自SSAD的水凝胶，60目的源自SSAD的水凝胶+AAMMP、100目+AAMMP、300目+AAMMP。为了保持源自SSAD的水凝胶的厚度和粘合面积的统一，源自SSAD的粉末填充了直径为6mm、厚度为2mm的圆形。将去离子水加入粉末中，以形成源自SSAD的水凝胶，然后将AAMMP覆盖该水凝胶。压力测试系统由压力检测和记录单元和注射泵组成，该泵向样品注射水，直到以均匀和稳定的增压速度爆破。每个测试的粘合剂组包含6个样品。
1.5伤口愈合划痕试验和迁移试验：在12孔板中，收获原代人羊膜间充质细胞。汇合时，用200μl的吸头划每个孔的中心。在显微镜下测量伤口的宽度，每个视野有3个点。在每个孔中选择3个不同的视野，并对宽度取平均值。用所示时间的平均宽度除以0h的宽度来计算闭合百分比。本试验制备了源自SSAD的粉末的浸出液(0.5mg/ml)。使用transwell系统，评估了人羊膜间充质细胞在源自SSAD的粉末的浸出液引导下的迁移。
1.6组织学：将标本在10％缓冲福尔马林中固定24h。将石蜡块切成7-μm切片，显示缺损的区域。进行苏木精和伊红(H&E)染色，并计算缺损周围的每个载玻片的3个高倍视野(×40放大率)的平均分，用于多形核细胞(PMN)浸润。进行TUNEL染色(原位细胞死亡检测试剂盒，荧光素：Servicebio，中国)、检测凋亡细胞，以DAPI作为背景染色。TUNEL阳性细胞密度测量是半自动进行的，使用Image J软件(version 1.52，National InstitutesofHealth，USA)。每个载玻片上，以×40放大率记录在密封剂和组织的接触区域的3张随机的非重叠图像(Axioskop；Carl Zeiss)。测定细胞总数以及阳性染色细胞的数量，并将密度表示为百分比(阳性细胞区域/细胞总区域)。TUNEL染色表示为TUNEL阳性细胞/DAPI阳性细胞的百分比。
1.7统计学：统计分析是用
统计软件v21.0.(
Company)进行的。P值<0.05被视为显著。连续变量通过Kolmogorov-Smirnov检验来检验正态分布，并表示为平均值和标准差(SD)。二项式分布变量分别表示为百分比。卡方检验用于二项式分布变量。
实施例二：源自SSAD的粉末和水凝胶的显微镜和SEM观察
用立体显微镜表征源自SSAD的粉末的宏观图。肉眼观察，参见图1a，300目的源自SSAD的粉末明显细于60目和100目。用SEM(SU8010，Hitachi，日本)在5.0kV下，对源自SSAD的粉末和源自SSAD的水凝胶的表面形貌进行了进一步表征。参见图1b，冻干后的通过二次过筛收获的源自SSAD的粉末，在扫描电镜下呈现出相对均匀的块。图1d显示，60、100、300目的源自SSAD的粉末的平均直径分别为226.7±48.4μm、139.3±39.5μm、44.7±15.0μm。参见图1c，当源自SSAD的粉末与水混合时，块中的多肽链可以通过水合和相互渗透而溶胀，以形成具有多孔结构的高度含水的水凝胶。参见图1e，60、100、300目水凝胶的孔径分别为17.1±4.6μm、10.9±2.7μm、4.9±1.8μm。参见图1f，60、100、300目水凝胶的孔隙率分别为24.0％±0.4％、21.5％±0.9％、15.7％±1.3％。来自较细的源自SSAD的粉末的水凝胶具有较小的孔和孔隙率，这是因为越细的粉末具有越小的空隙。
实施例三：源自SSAD的水凝胶在水中的凝胶化速度和对组织的瞬间粘附展示
为了展示源自SSAD的水凝胶的凝胶化速度，将10mg源自SSAD的粉末直接加入水中。如图2a所示，可以观察到源自SSAD的粉末在3秒内凝胶化，并且保持粘附能力。将胶原片浸泡在水中，带有源自SSAD的粉末的手指与水中的胶原片粘合，这展示了源自SSAD的水凝胶可以在水中的组织实现瞬间粘附(图2b)。
实施例四：体外爆破压力测试
本实施例所用的爆破装置结构如图3a所示。为了测试改造的密封剂(密封材料)的爆破压力，对覆盖在基于ASTM F2392-04标准化的胶原片缺损上的密封剂，施加持续增加的水压。用于密封的不同筛目的水凝胶的厚度都保持在2mm，以避免误差。可以发现，平坦的水凝胶在水压作用下变成水泡。水泡变得越来越大，水泡的壁越来越薄，且更多的水以恒定的速度进入。最后，水凝胶组中，水从水凝胶的缺损处喷出，而没有从AAMMP与水凝胶的界面喷出(图3c)。这表明水压超过了水凝胶的强度，但小于爆破发生时AAMMP与水凝胶的粘合强度。由此可以推断，水凝胶的强度小于AAMMP与水凝胶之间的粘合强度。参见图3b，60目源自SSAD的水凝胶(17.8±1.4kPa)、100目源自SSAD的水凝胶(16.8±0.9kPa)和300目源自SSAD的水凝胶(16.5±0.6kPa)的最大爆破压力没有显著差异(P＝0.19)。还可以观察到，300目的水泡的最大直径大于100目，而100目的水泡大于60目(图3e)。不同筛目的水凝胶体积是相同的(直径＝5mm，厚度＝2mm)。300目源自SSAD的水凝胶具有较低的孔隙率，这意味着单位体积有更多的水凝胶。因此，当水凝胶的壁达到爆破的厚度时，300目水凝胶的水泡更大。水凝胶具有高弹性，更多的水进入水泡且水泡发生相应的膨胀，这导致压力在爆破过程的后期稳定，所以300目水凝胶并没有提高最大爆破压力。
密封缺损的胎膜不同于粘附皮肤，胎膜所处的特殊环境并对可操作性提出了更高的要求，而源自SSAD的水凝胶并不能直接用于胎膜缺损的封堵。此外，在复杂的人体环境中，在不同屏障组织表面形成均匀且足够厚度的水凝胶是困难和不方便的，且流体可能会从密封材料的薄弱区域渗漏。
上述实验结果发现，水凝胶的强度小于AAMMP与水凝胶之间的粘合强度。因此，为了提高源自SSAD的水凝胶的密封能力，本实施例提出了在SSAD水凝胶上加入AAMMP来加固的技术方案。AAMMP的加入不仅提高了密封能力，而且还带来了操作上的便利。
源自SSAD的水凝胶的形状变化较小。水从粘合界面的边缘喷出，这表明AAMMP保护水凝胶免于破裂并加强密封，直到水凝胶与AAMMP之间的粘合失败。由于AAMMP与水凝胶之间的粘合强度高于水凝胶的强度，源自SSAD的水凝胶+AAMMP组的最大爆破压力完全超过了源自SSAD的水凝胶组。有趣的是，参见图3d，300目源自SSAD的水凝胶+AAMMP的爆破压力(30.8±3.0kPa)显著高于100目源自SSAD的水凝胶+AAMMP的爆破压力(22.8±0.7kPa)，而100目源自SSAD的水凝胶+AAMMP的爆破压力高于60目源自SSAD的水凝胶+AAMMP(20.5±1.7kPa)(P<0.01)。上述现象的原因可能是300目水凝胶的孔隙率低，所以水凝胶和AAMMP的接触面积更大，进而导致了更高的粘合强度。对猪皮与60目、100目和300目的源自SSAD的水凝胶之间的剪切强度进行了测量，以进一步验证。参见图3f，300目水凝胶的剪切强度最高(8.5±1.4kPa)，100目水凝胶位居第二(11.8±1.5kPa)，60目水凝胶最低(17.1±4.5kPa)。上述结果表明，水凝胶的低孔隙率可以提高粘合强度。
实施例五：伤口愈合划痕试验和迁移试验
源自SSAD的粉末含有多种可以促进干细胞迁移的生长因子。通过伤口愈合分析发现，源自SSAD粉末的浸出液(80.4％±11.7％)促进羊膜干细胞的伤口愈合，快于对照组(28.7％±16.5％，P＝0.015)两倍以上(图4a、图4c)。羊膜干细胞在源自SSAD粉末的浸出液中的transwell的迁移(72±34)，显著多于对照组(112±44，P＝0.030)(图4b、图4d)。
实施例六：无菌破裂膜的临床前模型
所有的SD大鼠由重庆医科大学提供。按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南(NIH Publication No.85-23Rev.1985)，进行了所有的动物实验，并得到了重庆医科大学口腔医学院动物护理和使用委员会的批准(2020061)。
用8只确定时间的、怀孕的Sprague-Dawley(SD)大鼠，来验证源自SSAD的水凝胶和无细胞羊膜基质补片的密封效果和生物相容性。第17-18天，在大鼠的胎膜上创造了穿刺。用戊巴比妥钠(30mg/kg)和赛拉嗪(xylazine，5mg/kg)对大鼠进行麻醉。在腹部中线做了一个4厘米的切口，以暴露怀孕的子宫。为了减少流产的风险，子宫颈以上的孕囊都被排除处理。5只大鼠接受了手术。为防止相互干扰，每只大鼠被随机分为SSAD+AAMMP组或对照组，选择左右各1个胚胎(因为大鼠子宫为Y字型，均选择分叉点第3个胚胎纳入实验)纳入同一组进行手术。其中，3只大鼠被指定为对照组，2只大鼠被指定为SSAD+AAMMP组。中线开腹手术后，进行5mm的子宫切开术并暴露胎膜。
如图5c所示，用1.5mm的穿孔器在胎膜上制造缺损。如图5d所示，在SSAD+AAMMP组中，用10mg源自SSAD的粉末来覆盖缺损，其能与羊水反应以快速形成水凝胶。如果一些源自SSAD的粉末因液体少而保持粉末状，可以向SSAD粉末中加入适合的溶剂以形成水凝胶(图5e)。然后，将无细胞羊膜基质补片放置在源自SSAD的水凝胶上，以加固(图5f)。在手术后3天，收获每组的样本，用于进一步评估。通过对触摸刺激的反应、外观和颜色来评估胎儿的存活率。图6a显示对照组的胎儿的爪子被挤压到腹腔、胚胎停止发育且呈不正常的红色，外观变得模糊。图6b显示源自SSAD的水凝胶仍然可以粘附在胎膜上，SSAD+AAMMP组的胚胎发育正常。示例性的溶剂包括屏障组织缺损处自带体液、生理盐水等缓冲盐溶液、纯水、细胞培养基。
据设想，如果将源自SSAD的粉末施于患者，可以通过使用一个简单的喷雾装置，将SSAD粉末运送到缺损处。无细胞羊膜基质补片可以通过现有的腹腔镜夹持装置输送，并放置在合适的位置。密封的过程不需要额外的光固化或长时间等待。本发明的使用方法简单、可行性高，具有巨大的临床应用潜力。
本发明以无细胞羊膜基质补片为代表，测试了源自SSAD的粉末+脱细胞生物补片来封堵屏障组织缺损的效果。除了无细胞羊膜基质补片(也可以理解为“脱细胞羊膜”)外，还可以选择其他合适的脱细胞生物补片(例如脱细胞肠系膜、脱细胞心包膜、脱细胞腹膜、脱细胞小肠粘膜等)，理由是上述脱细胞生物补片均通过将天然生物膜脱细胞而制得，解剖学结构相似且与缺损处的细胞外基质类似，具有良好的生物相容性和一定的弹性，能够给缺损处提供力学支持和营养支持。
实施例七：其他应用
为了证明源自SSAD的粉末和补片的潜在应用，本实施例使用体外猪模型研究了一系列的原理验证(proof-of-principle)应用(图7d)。
源自SSAD的粉末与商业生物膜(软组织修补片，
4-Layer TissueGraft，C-SLH-4S-4X7，下同)相结合，可以对撕裂的、漏气的肺部形成气密性密封(图7a)，尽管肺部是动态和可变形的。当肺部的压力达到9.7kPa时，仍然没有漏气。这种特性尤其有利于作为肺部密封剂使用，因为肺部组织的合适的密封，要求材料能够承受在有创机械通气过程中不定期地施加于肺部组织上的高压，例如肺复张。在此情景，压力值可以达到肺泡内峰值压力的40cmH2O(3.9kPa)。
此外，源自SSAD的粉末与商业生物膜为充满液体的穿孔胃(有一个1cm宽的孔)提供了流体密封(图7b)，并在12h内仍与胃保持稳健的密封。以及，切开的小肠(图7c)被牢固吻合(anastomosed)，且能承受至少24.5kPa的压力。如图7e所示，进一步测试了通过本实施例密封的肺部和小肠能够承受的最大爆破压力，密封的肺部能够承受的最高爆破压力约为10.5Kpa，密封的小肠能够承受的最高爆破压力可以提高到约25Kpa。
早产胎膜早破(PPPOM)是早产的主要原因之一。胎膜缺损周围的环境是潮湿的，并且常常有羊水流动。具体而言，胎膜缺损处流动且高压的液体环境(即羊水)可能会冲击胎膜上的密封材料，使得现有的密封材料无法瞬时且牢固的粘附。这可能是因为羊水分离了两个表面(即胎膜和密封材料)的分子，阻止其相互作用，进而使得密封材料对胎膜的良好粘附(即湿粘结)难以实现。此外，羊水的复杂环境以及胎儿的存在对密封材料的稳定存在提出了更高的要求。本发明将源自鲵皮肤分泌物的粉末和脱细胞膜片(例如无细胞羊膜基质补片(acellular amniotic membrane matrixpatch，AAMMP)结合，使得SSAD水凝胶的爆破强度从16.5±0.6kPa可以提高到30.8±3.0kPa，有效封堵了Sprague-Dawley(SD)大鼠的胎膜缺损并避免了胎儿死亡。其中，源自鲵皮肤分泌物的粉末可以瞬间吸水形成水凝胶(换句话说，可以去除屏障组织表面的界面液体并引起到表面的快速且强的交联)。此外，本发明还发现联合脱细胞膜片的较小的粉末粒度可以承受更大的爆破压力。
由于羊水的泄露，胎膜缺损处存在流动且高压的特殊液体环境，因此可以作为体内屏障组织缺损处的复杂环境的典型代表之一。本发明还将源自SSAD的粉末+高分子材料补片应用至其他组织(例如，胃、小肠、肺)，结果发现，源自SSAD的粉末+高分子材料补片可以有效封堵漏气的肺、漏液的胃和切开的小肠。因此，本发明提供的上述密封材料还可以用于封堵其他体屏障组织缺损，例如血管、心脏、肝脏、肾脏、胰腺、胆、甲状腺、胸腺、前列腺、脑、膀胱、脊髓和子宫处的缺损。
本发明以聚乙二醇(PEG)为聚合物纤维组分的合成高分子材料补片为代表，测试了源自SSAD的粉末+人工合成的细胞外基质模拟物来封堵屏障组织缺损的效果。除了通过PEG制备得到的高分子材料补片外，还可以选择由本领域已知的聚合物制成的高分子材料补片(例如，以聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)(PDL)等)，理由是上述高分子材料补片可以模拟天然细胞外基质，具有良好的生物相容性和一定的弹性，能够给缺损处提供力学支持。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (10)
1.鲵皮肤分泌物冻干粉在制备用于封堵屏障组织缺损的试剂盒中的用途，所述屏障组织缺损导致流体的快速泄露，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)鲵皮肤分泌物冻干粉，所述鲵皮肤分泌物冻干粉的粒度包括60-300目，所述鲵皮肤分泌物冻干粉用于施用至所述屏障组织缺损处并与所述屏障组织缺损处的自带体液反应，形成鲵皮肤分泌物水凝胶；所述自带体液因所述流体的快速泄露而产生，或因受损而产生，或是在所述屏障组织未受损时即已存在的体液；
(b)补片，所述补片包括脱细胞生物补片或高分子材料补片，所述补片用于覆盖在所述鲵皮肤分泌物水凝胶上。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脱细胞生物补片包括脱细胞羊膜、脱细胞肠系膜、脱细胞心包膜、脱细胞腹膜和脱细胞小肠粘膜中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述高分子材料补片包括选自由以下组成的纤维：聚乙二醇、聚己内酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)烯、或其组合。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述鲵包括大鲵属、隐鳃鲵属、山溪鲵属、小鲵属、巴鲵属、爪鲵属、肥鲵属、拟小鲵属、北鲵属和极北鲵属中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述流体包括气体、血液、肠液、胃液、尿液和胆汁中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述屏障组织包括胎膜、肺、胃、小肠、大肠、血管、心脏、肝脏、肾脏、胰腺、胆、甲状腺、胸腺、前列腺、脑、膀胱、脊髓和子宫中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于封堵漏气的肺叶。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于封堵胎膜或胃或小肠的所述缺损。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述补片为生物相容性的。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，被所述补片覆盖的所述鲵皮肤分泌物水凝胶能够承受所述流体的快速泄露而产生的压力。
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